العلاجات الغذائية والتغذوية للadhd

[رافت ابراهيم]

 

http://jmg.bmj.com/content/42/4/289.full


https://translate.googleusercontent....UKSPAj0fHm64Zw


ملخص

وأشارت تقارير الحالة الأخيرة أن علاج العقم مع حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى (الحقن المجهري) قد يزيد من خطر العيوب يطبع مما يؤدي إلى متلازمة أنجلمان (AS). على الرغم من أن يطبع حساب عيوب ل4٪ فقط من المرضى الذين يعانون من AS، فقد وجدنا أربع حالات من بين 16 AS المرضى الذين يولدون لضعيف الخصوبة الأزواج، الذي تصور مع أو بدون علاج العقم (25٪؛ النسبي المخاطر (RR) 6.25؛ فاصل الثقة 95٪ ( CI) 1،68 حتي 16،00). وكان خطر في أزواج غير المعالجة مع مرور الوقت إلى الحمل (TTP) تتجاوز 2 سنة متطابقة إلى أن من أولئك الذين يتلقون علاجا ICSI أو عن طريق التحفيز الهرموني وحده (RR 6.25، 95٪ CI ،70-22،57). كان ضعفي في الأزواج الذين تلقوا العلاج، وكان أيضا TTP> 2 سنوات (RR 12.5، 95٪ CI 1،40 حتي 45،13). نتائجنا تشير الى ان يطبع عيوب وضعف الخصوبة قد يكون سبب شائع، وأن فرط الإباضة بدلا من الحقن المجهري قد يزيد تزيد من خطر إنجاب طفل مع عيب يطبع.

وقدم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية (الحقن المجهري) في 1990s في وقت مبكر لعلاج حالات شديدة عامل العقم عند الذكور. 1 منذ البداية حتى كان هناك قلق إزاء تزايد المخاطر الصحية لدى الأطفال التي وضعتها والحقن المجهري. وقد أظهرت متابعة الدراسات الكبيرة التي من خطر تشوهات كبيرة، وانخفاض الوزن عند الولادة، ومضاعفات الحمل وتزداد بعد الإخصاب في المختبر، ولكن مستقلة عن استخدام الحقن المجهري. 2- 5
وأشارت تقارير الحالة الأخيرة على ثلاثة أطفال كانوا تصوره ICSI ويكون متلازمة أنجلمان (AS) نتيجة لعيب يطبع على الكروموسوم 15 أن التكاثر الاصطناعي قد يزيد من خطر العيوب يطبع. 6، 7 بذلت ملاحظات مماثلة ل الأطفال الذين يعانون من متلازمة بيكويث-Wiedeman. 8، 9، 10
AS هو تناذر نادر العصبية الوراثية التي تتميز microcephalus والحركات متشنج، وغياب الكلام، ونمط EEG غير طبيعي، والتخلف العقلي الشديد، وكثرة الضحك (الإصابة، 1 في 000 15 الأطفال حديثي الولادة). وهو ناتج عن فقدان وظائف للأليل UBE3A الأمهات على الصبغي 15. UBE3A يخضع ليطبع الجينومية و، في الدماغ، ويتم التعبير على كروموسوم الأمهات فقط. ما يقرب من 70٪ من المرضى الذين لديهم حذف على كروموسوم الأمهات و 10٪ لديهم طفرة في الجين UBE3A، 4-7٪ لديهم نسختين من كروموسوم 15 الأب (disomy أحد الأبوين)، و3-4٪ لديهم عيب يطبع (ID ) أن يسكت على UBE3A أليل الأمهات. في الحالات المتبقية، والمرضى الذين لديهم بعض الدول الاخرى، عيب غير معروف حتى الآن. 11 الترددات النسبية للعيوب وراثية مختلفة لا تختلف بين المجموعات العرقية المختلفة.
للتحقيق في وجود ارتباط محتمل بين علاج العقم والعيوب يطبع، أجرينا دراسة الأتراب في ألمانيا باستخدام بيانات من مجموعة دعم متلازمة الألمانية Angelman.

طرق

تم الاتصال بجميع أعضاء Angelman فريق دعم متلازمة الألمانية بكتاب وطلب أن تقدم، على أساس طوعي، بيانات ادكارية وأيضا معلومات عن طريقة الحمل ووقت الحمل (TTP). وتمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس مراجعة أخلاقيات Ärztekammer هامبورغ. المرضى أعطى موافقة خطية مستنيرة. الآباء والأمهات الذين ذكر أن حركة طالبان باكستان تجاوزت 2 سنة و / أو الذين خضعوا علاج العقم طلب منهم تقديم عينة من الدم (10 مل EDTA) أو مسحة الشدق من أنفسهم والطفل.
تم تحديد مركز مثيلة من الجين SNURF-SNRPN عن طريق العلاج ثاني كبريتيت من الحمض النووي الجيني ومثيلة PCR محددة. 12 لتحليل الفصل بين مواضع الصغرية على طول الكروموسوم 15، الموسومة مضان تم تحليل المنتجات PCR على 3100 محلل الوراثية ABI بريزم، وذلك باستخدام GeneScan و برنامج Genotyper (ABI، فوستر سيتي، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). وفقا لمعايير التشخيص المتبعة، تم تصنيف المرضى يحمل unmethylated الأمهات SNURF-SNRPN أليل وجود معرف. في جميع المرضى الذين يعانون من الهوية، تم استبعاد مركز يطبع العائلي (IC) الحذف من قبل الوقت الحقيقي التحليل الكمي PCR من العناصر الحاسمة IC (Buiting وHorsthemke، غير منشورة).

النتائج

من 270 عضوا، 82 (30٪) أجاب. اعتمد طفل واحد. رفض اثنين من الآباء الآخرين لإعطاء معلومات مفصلة. وهكذا، تم إعادة 79 استمارة صحيحة. ولدت ستة عشر طفلا (20٪) إلى ضعيف الخصوبة الأزواج (كما هو موضح بعد أن كان TTP> 2 سنة و / أو علاج العقم). ويعتبر هذا المعدل أعلى من المتوقع في عموم السكان (~10-15٪) ويشير إلى وجود تحيز التقارير. ومع ذلك، هذا التحيز لا يؤثر على نتائجنا، لأن لدينا مقارنة نسبة معرفات في هذه المجموعة مع نسبة معرفات في جميع المرضى الذين يعانون من متلازمة أنجلمان.
تم العثور على أربعة من ستة عشر طفلا (25٪) لديهم هوية متفرقة (الجدول 1). على افتراض أن ID يمثل 4٪ من المرضى AS (انظر أعلاه)، وازداد الخطر النسبي (RR) بشكل كبير في هذه المجموعة من المرضى (الجدول 2). وقد زاد من RR من قبل العامل نفسه في مجموعة فرعية غير المعالجة من الأزواج مع TTP> 2 سنة (ن = 8)، وفي فرعية من الأزواج الذين خضعوا ICSI أو العلاج الهرموني (ن = 8)، على الرغم من أن الزيادة لم تصل دلالة إحصائية . لاحظنا أن هناك طفل واحد ID في كل من الحقن المجهري (ن = 3) والعلاج الهرموني فقط (ن = 5) مجموعات. RR كان أعلى في الأزواج مع TTP> 2 عاما الذين خضعوا أيضا علاج العقم (ن = 4). وكانت هذه الزيادة ذات دلالة إحصائية.

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 1

بيانات المرضى (الأطفال من الأزواج ضعيف الخصوبة فقط)

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 2

الخطر النسبي (RR) وفاصل الثقة 95٪ (CI) أن يكون لها طفل مع عيب يطبع (ID)

مناقشة

في هذه الدراسة وجدنا أن الأزواج ضعيف الخصوبة عرضة لخطر متزايد لإنجاب طفل مع عيب يطبع تسبب AS. زيادة RR في الأزواج غير المعالجة مع TTP> 2 سنة يوحي بأن يطبع عيوب وضعف الخصوبة قد يكون سبب شائع. ويدعم هذه الملاحظة قبل بيانات تظهر أن TTP زيادة وحدها هي عامل خطر كبير لتطوير تسمم الحمل أو تأخر النمو داخل الرحم. 13- 15 هذا خطر حدوث مضاعفات الحمل يرتبط مع زيادة TTP هو مشابهة إلى تلك التي لوحظت في حالة حمل بعد الحقن المجهري 4 أو المساعدة على الإنجاب بشكل عام. 16
ومن المثير للاهتمام، التطور الجنيني المبكرة ونمو الجنين داخل الرحم تعتمد بشكل كبير على وظيفة مناسبة من الجينات مطبوع. 17 وبناء على هذه النتائج، فإننا نقترح أن هناك بعض الاستعداد الوراثي، وربما ذات طبيعة غير متجانسة، إلى عدم الاستقرار جينية من الأمشاج أو الخلايا الجنينية المبكرة. اعتمادا على عدد ونوع من مواضع المتضررين في هذه الخلايا، يمكن عدم الاستقرار جينية تؤدي إلى فشل النمو المبكر، والتي قد تظهر كما ضعف الخصوبة وتأخر النمو داخل الرحم، أو التشوهات الخلقية.
كما كان RR ضعفي بين الزوجين مع TTP> 2 عاما الذين خضعوا التحفيز الهرموني أو الحقن المجهري، قد علاج العقم كذلك تزيد من خطر إنجاب طفل مصاب ID. أحد التفسيرات المحتملة هو أن هؤلاء الأزواج يعانون من شكل أكثر شدة من ضعف الخصوبة التي اوجبت علاج العقم. بدلا من ذلك، التحفيز الهرموني، والذي يستخدم أيضا لICSI، قد تؤدي إلى نضوج البويضات "رداءة" التي من شأنها أن لم يكن مبيض بدون علاج، أو أن نضوج سريع جدا الناجمة عن إجراءات التحفيز الهرموني يزعج عملية مثيلة الحمض النووي في البويضة. وقد سبق واقترح أقل جودة البويضة بعد إجراءات التحفيز المبيض من الدراسات في الماوس. 18
كما لدينا فوج من المرضى لا يحتوي الأطفال تصوره التقليدي الإخصاب في المختبر دون ICSI أو التلقيح داخل الرحم، ونحن لا نعرف ما إذا الأمشاج والأجنة الثقافة أو التلاعب الجنين يزيد من خطر عن هوية، كما ثبت في الدراسات الحيوانية. 19
باختصار، لقد أثبتنا للمرة الأولى أن انتشار يطبع عيوب في المرضى الذين يعانون من AS ولدوا لضعيف الخصوبة الأزواج تزداد بشكل ملحوظ. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن يطبع عيوب وضعف الخصوبة قد يكون سبب شائع، وأن فرط الإباضة، بدلا من الحقن المجهري، قد يزيد تزيد من خطر إنجاب طفل مع عيب يطبع. ومع ذلك، يبقى الخطر المطلق صغير.

شكر وتقدير

وأيد جزء من هذه الدراسة من قبل جمعية الألمانية للبحوث والمنح غير المشروط من سيرونو محدودة، وألمانيا.

الحواشي

• M لودفيغ وA ساتكليف تصميم الدراسة. M لودفيغ تجنيد المرضى. وقدم Katalinic المشورة بشأن تصميم الدراسة، أجرى التحليل الإحصائي. S الإجمالي وR فارون إجراء دراسات الحمض النووي. B Horsthemke جمع العينات وتقييم البيانات الجزيئية. M لودفيغ وB Horsthemke تفسير النتائج وكتب المخطوطة.
• تضارب المصالح: لم يصرح بشىء

مراجع

• ↵
  باليرمو G، H يوريس، Devroey P، فان Steirteghem AC. الحمل بعد الحقن داخل الهيولى من حيوان منوي واحد داخل بويضة انسيت 1992؛ 340: 17 -18.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  Bonduelle M، Liebaers I، Deketelaere V، Derde MP، كامو M، Devroey P، فان البيانات Steirteghem A. حديثي الولادة على لفيف من 2889 الرضع الذين ولدوا بعد الحقن المجهري (1991-1999) والرضع الذين ولدوا بعد 2995 IVF (1983-1999) . همهمة Reprod 2002؛ 17: 671 -94.
  [الملخص / الحرة النص الكامل]
• هانسن M، Kurinczuk JJ، باور C، ويب S. خطر العيوب الخلقية الرئيسية بعد حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى والتخصيب في المختبر ن ي ميد 2002؛ 346: 725 -30.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  . Katalinic A، C روش، لودفيغ M. بالطبع الحمل ونتائج حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى بعد (ICSI) - لذلك، دراسة الأتراب المحتملين تسيطر فرتيل STERIL 2004؛ 81: 1604 -16.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  Schieve LA، ميكل SF، فيري C، بيترسون HB، جنج G، ويلكوكس LS. منخفض ومنخفض جدا الوزن عند الولادة عند الرضع تصور مع استخدام التكنولوجيا المساعدة على الإنجاب ن ي ميد 2002؛ 346: 731 -7.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  كوكس GF، برغر J، الشفاه V، ماو UA، سبيرلنغ K، وو BL. حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى قد يزيد من خطر العيوب يطبع آم J همهمة جينيه 2002؛ 71: 162 -64.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  Orstavik KH، Eiklid K، فان دير هاغن CB، Spetalen S، K كيرولف، Skjeldal O، Buiting K. حالة أخرى من الخلل يطبع في الفتاة مع متلازمة أنجلمان الذي حبل به حقن السائل المنوي داخل الهيولى آم J همهمة جينيه 2003؛ 72: 218 -19.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  ماهر ER، Brueton LA، Bowdin SC، Luharia A، W كوبر، كول TR، ماكدونالد F، سامبسون JR، بارات CL، ريك W، هوكينز MM. . بيكويث-فيدمان متلازمة والتكنولوجيا المساعدة على الإنجاب (ART) J ميد جينيه 2003؛ 40: 62 -4.
  [مجانا النص الكامل]
• ↵
  DeBaun MR، Niemitz EL، فاينبيرغ AP. جمعية التخصيب في المختبر مع متلازمة جينية وبيكويث-فيدمان التعديلات من LIT1 وH19 آم J همهمة جينيه 2003؛ 72: 156 -60.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  جيكيل C، غاستون V، J ماندلباوم، Siffroi JP، Flahault A، لو Bouc Y. التخصيب في المختبر قد تزيد من خطر متلازمة بيكويث-فيدمان المتعلقة يطبع غير طبيعية من الجين KCN1OT آم J همهمة جينيه 2003؛ 72: 1338 -41.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  Lossie AC، ويتني MM، Amidon D، دونغ HJ، تشن P، Theriaque D، هاتسون A، نيكولز RD، زوري RT، وليامز CA، دريسكول DJ. الظواهر متميزة تميز الطبقات الجزيئية للAngelman متلازمة J ميد جينيه 2001؛ 38: 834 -45.
  [الملخص / الحرة النص الكامل]
• ↵
  Zeschnigk M، ليش C، K Buiting، دورفلر W، Horsthemke B. A-أنبوب واحد PCR اختبار لتشخيص Angelman ومتلازمة برادر ويلي على أساس الاختلافات أليلية مثيلة في موضع SNRPN يورو J همهمة جينيه 1997؛ 5: 94 -8.
  [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  باسو O، واينبرغ CR، بيرد DD، ويلكوكس AJ، اولسن J. ضعف الإلقاحية باعتباره المتعلقات من دورية نيو انجلاند الطبية: دراسة داخل الدنماركية الوطنية الفوج الميلاد آم J Epidemiol 2003؛ 157: 195 -202.
  [الملخص / الحرة النص الكامل]
• هنريكسن TB، بيرد DD، اولسن J، هيديجارد M، سيشر NJ، ويلكوكس AJ. الوقت بالحمل والولادة المبكرة أبستت 1997؛ 89: 594 -9.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  Pandian Z، بهاتاشاريا S، تمبلتون A. استعراض العقم غير المفسر ونتائج الولادة: مراجعة 10 سنة هوم Reprod 2001؛ 16: 2593 -7.
  [الملخص / الحرة النص الكامل]
• ↵
  Helmerhorst FM، Perquin DA، Donker D، Keirse MJ. . نتائج الفترة المحيطة بالولادة من سنغلتونس والتوائم بعد الحمل بمساعدة: مراجعة منهجية من الدراسات التي تسيطر عليها BMJ 2004؛ 328: 261.
  [الملخص / الحرة النص الكامل]
• ↵
  ميوزو M، سيموني G. دور الجينات مطبوع في نمو الجنين بيول الوليد 2002؛ 81: 217 -28.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]
• ↵
  Ertzeid G، Storeng R. تأثير تحفيز المبيض على غرس ونمو الجنين في الفئران هوم Reprod 2001؛ 16: 221 -5.
  [الملخص / الحرة النص الكامل]
• ↵
  Niemitz EL، فاينبيرغ AP. . علم التخلق والتكنولوجيا المساعدة على الإنجاب: دعوة للتحقيق آم J همهمة جينيه 2004؛ 74: 599 -609.
  [CROSSREF] [ميدلاين] [شبكة العلوم]

 

[رافت ابراهيم]

 

http://mcb.asm.org/content/19/2/1182.full

https://translate.googleusercontent....kczMpmXk0rsc9g

• ظفر نواز 1،
• ديفيد M. ليونارد 1،
• كارولين سميث 1،
• افرات ليف-ليمان 2،
• صوفيا Y. تساي 1،
• مينغ جيري تساي 1 و
• بيرت دبليو أومالي 1 *

+ الكاتب الانتماءات

• قسم بيولوجيا الخلية و1
• قسم الجزيئية وعلم الوراثة البشرية، 2 كلية بايلور للطب في هيوستون، تكساس 77030

القسم التالي

الملخص

في هذه الدراسة، وجدنا أن البروتين E6 المصاحب (E6-AP / UBE3A) يتفاعل مباشرة مع وcoactivates النشاط النسخي من مستقبلات هرمون البروجسترون البشري (PR) بطريقة تعتمد على هرمون. كما coactivates E6-AP أنشطة النسخي التي تعتمد على هرمون أعضاء آخرين من هرمون النووي مستقبلات الفصيلة. سابقا، فقد تبين أن E6-AP يقدم دور يغاز بتحول والبروتين (E3) في وجود البروتين E6 من أنواع فيروس الورم الحليمي البشري 16 و 18. البيانات المتوفرة لدينا تدل على أن وظيفة يغاز بتحول والبروتين من E6-AP هو الاستغناء عنها لقدرته على coactivate مستقبلات هرمون النووية، وتبين أن E6-AP تمتلك اثنين من وظائف مستقلة للانفصال، على حد سواء coactivator ويغاز بتحول والبروتين. ويرتبط اختلال نسخة الأمهات من E6-AP مع متلازمة أنجلمان (AS)، وهو اضطراب عصبي وراثي يتميز التخلف العقلي الشديد، والمضبوطات، وضعف التعبير، وأعراض أخرى. ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة التي يسبب خلل E6-AP الجينات AS لا تزال مجهولة. لربط وظيفة coactivator وبتحول البروتين E6-AP ظائف يغاز مع AS النمط الظاهري، عبرنا عن أشكال متحولة من E6-AP معزولة عن AS المرضى وتقييم قدرة كل من هذه البروتينات متحولة إلى coactivate PR أو تقديم بتحول البروتين يغاز النشاط. وكشف هذا التحليل أنه في الغالبية العظمى من المرضى AS فحصها، وكانت وظيفة يغاز بتحول والبروتين من E6-AP المعيبة في حين كانت وظيفة coactivator سليمة. وتشير هذه النتيجة إلى أن نتائج النمط الظاهري AS من وجود خلل في بتحول-proteosome تدهور البروتين الطريق.

المنشطات، وهرمونات الغدة الدرقية، وفيتامين D، والرتينوئيدات تنظيم العمليات الحيوية المختلفة بما في ذلك النمو، والتنمية، والتوازن من خلال لهم وما شابه ذلك مستقبلات هرمون النووي، التي تشكل الفصيلة من المواد المرتبطة هيكليا العوامل الخلايا تنشيط يجند النسخ (18، 34، 40، 47 ). مستقبلات هرمون النووية تحتوي على زخارف الهيكلية المشتركة التي تشمل الأميني محطة وظيفة التنشيط سيئة الحفظ (عامل تنشيط 1 [AF-1]) الذي يؤثر على كفاءة النسخ، مجال الحمض النووي ملزم المركزي، التي تتوسط مستقبلات ملزمة لتسلسل محددة محسن DNA ويحدد استهداف خصوصية الجينات، وملزم هرمون المجال كربوكسي المحطة. ويتضمن المجال الأخير AF-2، وهي المنطقة التي تتوسط وظيفة التنشيط تعتمد على هرمون مستقبلات (40). وعندما يرتبط هرمون، هذه المستقبلات الخضوع لتغيير متعلق بتكوين، التفكك من بروتينات الصدمة الحرارية، مستقبلات dimerization، الفسفرة، DNA ملزمة في عنصر محسن من الجينات المستهدفة، والتفاعل مع coactivators، والتجنيد لاحق من عوامل النسخ القاعدية لتشكيل التمهيد للبدء مستقر مجمع. يتم اتباع هذه الأحداث سواء صعودا التنظيم أو أسفل تنظيم النسخ الجيني الهدف (40).
هرمون النووي coactivators مستقبلات تمثل فئة متزايدة من البروتينات التي تتفاعل مع مستقبلات بطريقة يجند محددة، وتعمل على تعزيز أنشطة النسخي الخاصة بهم (33). قبل التعرف عليهم، وتوقع coactivators في الوجود على أساس التجارب التي أظهرت أن مستقبلات مختلفة تتنافس على بركة الحد من العوامل المطلوبة لنسخ الأمثل. أدى تحفيز مستقبلات احدة في transrepression من مستقبلات أخرى، مما يدل على استنزاف بركة coactivator المشترك (6، 10، 31، 39). بين coactivators المستنسخة حتى الآن هي الستيرويد مستقبلات coactivator 1 (SRC-1) (33)، TIF2 (GRIP1) (17، 51)، ص / CIP (ACTR / RAC3 / AIB1 / الترام-1) (2، 9، 28 ، 46، 48)، وARA70 (54). وتصور Coactivators أصلا لخدمة دورا سد، وربط مستقبل لآلية النسخ القاعدية (36، 45). في الآونة الأخيرة، واتضح أنها تمتلك أنشطة الأنزيمية التي تسهم في قدرتها على تعزيز بوساطة مستقبلات النسخ؛ SRC-1، P300 / الجمارك وحماية الحدود، وRAC3 / ACTR / AIB1 تمتلك النشاط هيستون أسيتيل (HAT) (2، 9، 28، 32، 41). ويعتقد أن مستقبلات تنشيط يجند لتحقيق هذه التي تحتوي على النشاط coactivators HAT إلى لونين المحيطة مستقبلات، وتعطيل هيكل لونين القمعي المحلي acetylating الهستونات والعوامل المرتبطة لونين ربما غيرها (41). بسبب قدرتها على تعزيز بوساطة مستقبلات التعبير الجيني، ويعتقد coactivators أن تلعب دورا هاما في تنظيم حجم الاستجابة البيولوجية إلى المنشطات، وفيتامين D، والرتينوئيدات في الأنسجة أو الأفراد المختلفين. مستوى coactivator التعبير يمكن أن تسهم في الاختلافات في الاستجابة هرمون ينظر في عدد السكان، واضطراب في coactivator التعبير يمكن أن يؤدي إلى فرط المرضية أو نقص التحسس للهرمونات الستيرويد. مؤخرا، تبين أن أدى خلل في موضع SRC-1 في الفئران في رد الموهنة للهرمونات الستيرويد، وهي نتيجة تتفق مع هذه الفرضية (53).
في هذا التقرير، وصفنا الاستنساخ وتوصيف البروتين E6 المصاحب (E6-AP) (21)، وهو بروتين يرتبط متلازمة أنجلمان (AS) (26، 30، 42)، ومستقبلات هرمون البروجسترون (PR) -interacting البروتين. وE6-AP التي سبق تحديدها باعتبارها بروتين 100 كيلو دالتون والحاضر في كل من السيتوبلازم والنواة (14). E6-AP تتوسط تفاعل من نوع الورم الحليمي البشري 16 و 18 E6 البروتينات مع البروتين p53، وهو بروتين النمو القمعية وورم القمعية (14، 22). واقترح الأولية في الدراسات المختبرية أن المجمع E6-E6-AP يتفاعل على وجه التحديد مع البروتين p53 ويعزز تدهور البروتين p53 عبر بتحول-proteasome وتدهور المسار، ولكن مؤخرا الدراسات المجراة تبين أن E6-AP يمكن أن تتفاعل مباشرة مع البروتين p53 وتعزيز تدهورها حتى في حالة عدم وجود فيروس الورم الحليمي E6 البروتين (11، 20، 38). E6-AP هو عضو في عائلة من البروتينات، المعروفة باسم E3 ligases بتحول والبروتين، والتي تم اقتراحها للعب دور في تحديد خصوصية الركيزة لنظام تدهور بتحول-proteasome و. ينطوي ubiquitination البروتين أيضا اثنين من فئات أخرى من الإنزيمات، وهي E1 الانزيمات تفعيل بتحول وE2 الانزيمات التصريف اليوبيكويتين، التي تنشط الأنصاف بتحول ونقلها إلى استهداف البروتينات وE3، على التوالي (19). الأحماض الأمينية 350-الكربوكسيل محطة (أأ) من E6-AP تشكل وكان الحاخام هيشت (مثلي لE6-AP كربوكسي محطة) النطاقات التي يتم حفظها من بين العديد من E3 ligases بتحول والبروتين والبروتينات ذات الصلة AP-E6 (19). يحتوي هذا الجزء 100-AA-الكربوكسيل محطة المدقع في المنطقة المحفزة للE6-AP، الذي ينقل بتحول إلى البروتين المستهدفة لتدهور (19). يتكون المجال E6 ملزم من منطقة 18-أأ تقع ضمن الجزء المركزي من البروتين E6-AP (22).
مؤخرا، تبين أن اضطراب وراثي، AS، سببه عدم وجود نسخة الأمهات وظيفية من الجينات E6-AP (26، 30، 42). وكما هو اضطراب عصبي يتميز التخلف العقلي الشديد، والمضبوطات، وضعف التعبير، وأعراض أخرى (5). ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة التي يسبب خلل E6-AP الجينات AS لا تزال مجهولة. لدينا تحليل متحولة البروتينات E6-AP من AS كشف المرضى أن وظيفة يغاز بتحول والبروتين من E6-AP كانت معيبة، في حين أن وظيفة coactivator سليمة، في معظم AS فحص المرضى. في هذا التقرير، وتبين لنا أيضا أن النشاط يغاز بتحول من E6-AP غير مطلوب لوظيفة coactivation من E6-AP. وعلاوة على ذلك، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن وظيفة تحفيزية تقع ضمن المجال كان الحاخام هيشت من E6-AP ليست ضرورية لقدرة E6-AP للتفاعل مع وcoactivate الستيرويد وظيفة مستقبلات الهرمونات. وتشير هذه النتائج إلى أن E6-AP تمتلك اثنين من وظائف مستقلة، على حد سواء coactivator ويغاز بتحول والبروتين.

القسم السابق القسم التالي

المواد والأساليب

بناء البلازميد. البلازميد الطعم لالخميرة نظام هجين اثنين (pAS1-PRLBD) (33)، البلازميدات التعبير الثدييات لPR-B (1)، مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) (7)، ومستقبلات الاندروجين (AR) (44 )، E2F مراسل البلازميد UAS4-TATA لوك (لوك يدل luciferase المراسل) (41)، وE2F-، Sp1-، وصحفيين، CREB استجابة (33) وقد وصفت سابقا. لبناء مستقبل جلايكورتيكود (GR) ناقلات التعبير، وهضم ناقلات pSTCGR مع بام مرحبا ثم تم استنساخ جزء بام مرحبا تحتوي على GR كدنا] في المواقع المقابلة البلازميد pCR3.1 (إينفيتروجن). شيدت pPRE / GRE.E1b.LUC وpERE.E1b.LUC عن طريق إدخال شظايا PVU II- سما الأول من pPRE / GRE.E1b.CAT وpERE.E1b.CAT في موقع سما الأول من pGL3-الأساسية (PROMEGA). لبناء البلازميدات التعبير الثدييات لمن النوع البري E6-AP (أأ 1-851)، 76 كيلو دالتون E6-AP (أأ 170-851)، وC833S (تغيير السيستين 833 إلى سيرين) متحولة E6-AP (أأ 1 إلى 851)، تم استنساخ شظايا بام مرحبا هين dIII من pGEM E6-AP (100 كيلو دالتون)، pGEM-E6-AP (76 كيلو دالتون)، وpGEM E6-AP (C833-S) في المواقع المقابلة البلازميد PBK. RSV (Stratagene). جزء-C النهائي للE6-AP (أأ 680-851)، متحولة اقتطاع E6-AP (أأ 1-449)، وكيلو دالتون 98 (أأ 1-834) شكل E6-AP، وجدت في AS ( 25، 29، 41)، وكيلو دالتون 99 (أأ 1-845)، و 86 كيلو دالتون (أأ 1-714)، 47 كيلو دالتون (أأ 450-851)، و 28 كيلو دالتون (أأ 1-240) أشكال من E6-AP تم تضخيمها من قبل PCR مع أزواج التمهيدي التالية: 5'-GCGGATCCACCATGAGGAATTCGGCACGAGATCTAAAGGAA-3 "(حبلا العلوي) و5'-CGGAATTCAAGCTTGTTTTACAGCATGCCAAATCC-3" (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGGAAGCCTGCACGAATGAGTTTTGTGCT-3 "(حبلا العلوي) و5'-CCCAAGCTTGTTTTATGTTTCTACTTTGAAAAAAGTATA-3" (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGAGGAATTCGGCACGAGATCTAAAGGAA-3 "(حبلا العلوي) و5'-CCCAAGCTTGTTTTAAAGTTTTTCTTTGCTTGAGTATTC-3" (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGAGGAATTCGGCACGAGATCTAAAGGAA-3 "(حبلا العلوي) و5'-CCCAAGCTTGTTTTAGGCATACGTGATGGCCTTCAACAA-3" (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGAGGAATTCGGCACGAGATCTAAAGGAA-3 "(حبلا العلوي) و5'-CCCAAGCTTGTTTTACATATGAAAACCTCTCCGAAAAGC (أقل حبلا)؛ 5'-GCGGATCCACCATGTACAGTGAACGAAGAATCACTGTT-3 "(حبلا العلوي) و5'-CGGAATTCGCGGCCGCGTTTTACAGCATGCCAAATCC-3" (أقل حبلا)؛ و5'-GCGGATCCACCATGGAAGCCTGCACGAATGAGTTTTGTGCT-3 "(حبلا العلوي) و5'-GAATTCAAGCTTGTTTTACAAATATACAAGTGCATTGAG-3" (أقل حبلا). تم استيعاب المنتج PCR مع بام مرحبا هين dIII واستنسخ في مواقع المقابلة البلازميد pBK.RSV. ثم بام مرحبا غير I كان subcloned شظايا البلازميد pBK.RSV-E6-AP في مواقع المقابلة البلازميد pCR3.1 (إينفيتروجن). لبناء I804K وF782Δ أشكال متحولة من E6-AP، استخدمنا الطفرات موقع الموجه لخلق طفرات في pCR3.1 E6-AP. لإعادة الطفرة 1-885Δstop 104 كيلو دالتون في E6-AP، تم تضخيم جزء بسه AI- هين dIII من E6-AP بواسطة PCR مع الاشعال 5'-GTTGAAGGCCATCACGTATGCCAAAGG-3 "(أقل حبلا) و5'-GAATTCAAGCTTGTTTTAGTACTGGGACACTATCACCACCA- 3 '(أقل حبلا)، وذلك باستخدام الحمض النووي AS المريض كنموذج. ثم تم استنساخ هذه القطعة بسه AI- هين dIII في مواقع المقابلة من pGEM E6-AP. لإعادة هذه الطفرة في التعبير البلازميد الثدييات، تم استنساخ جزء بام مرحبا هين dIII من E6-AP في مواقع المقابلة البلازميد pBK.RSV. وsubcloned على Bam مرحبا غير أنني جزء من pBK.RSV-E6-AP في بام مرحبا غير المواقع الأول من pCR3.1. لإعادة تشكيل كامل طول E6-AP الجين في الخميرة البلازميد هجين اثنين، هين dIII هضم (وشغل) pGEM E6-AP (100 كيلو دالتون) وredigested مع بام مرحبا. تم إدراج الناتجة بام مرحبا هين dIII (شغل) جزء في بام مرحبا ايكو RI (شغل) مواقع pGAD10 (Clontech). لإعادة تشكيل PR-A الجين في pAS1 الخميرة البلازميد، كان ligated وضابط صف I- سال أنا جزء من PR-A في المواقع المقابلة للناقلات. لدمج E6-AP مع المجال تفعيل VP16 ومجال GAL DNA ملزم (DBD) (بقايا 1-147)، وsubcloned جزء بام مرحبا هين dIII من كامل طول E6-AP وعدة شظايا حذف E6-AP في إطار في البلازميدات pABVP16 وpABGAL (3، 4). لدمج E6-AP مع الجلوتاثيون S -transferase (GST)، وبام مرحبا غير شظايا الأول من كامل طول E6-AP ومختلف أشكال متحولة من E6-AP تم subcloned في الإطار مع GST إلى pGEX4T البلازميد (فارماسيا).

في المقايسات التفاعل الجسم الحي. وأجريت الخميرة اثنين الهجين والثدييات المقايسات التفاعل يومين الهجينة كما هو موضح سابقا (12، 41).

في المختبر فحص التفاعل. وبالنسبة للفي المختبر التفاعل الفحص، وأعرب عن PR-B كما بروتين صاحب الموسومة في نظام التعبير الفيروسة العصوية في وجود أو عدم وجود البروجسترون وتنقيتها باستخدام عمود النيكل تقارب (فارماسيا). وأعرب E6-AP-الموسومة GST في القولونية وتنقيته على حبات الجلوتاثيون سيفاروز. وقد حضنت النقي ومحددة الجلوتاثيون E6-AP مع PR النقاء في NETN العازلة (50 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 20 ملي تريس [الرقم الهيدروجيني 8.0]، 0.5٪ Nonidet P-40) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وبعد ذلك تم غسلها حبات خمس مرات مع العازلة NETN. ومزال PR متجهة الى E6-AP وفصلها على دوديسيل كبريتات الصوديوم 7.5٪ بولي أكريلاميد هلام ومن ثم تحليلها من قبل الغرب النشاف باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف تحديدا PR.

Transfections. واستمرت خلايا هيلا في Dulbecco التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني. قبل ترنسفكأيشن أربع وعشرين ساعة، ومطلي 3 × 10 5 خلايا لكل بئر في فالكون أطباق ستة جيدا في DMEM تحتوي على 5٪ المغلفة ديكستران جردت الفحم المصل. و transfected الخلايا مع السلطات الوطنية المعينة المشار إليها باستخدام Superfect كاشف (QIAGEN) أو Lipofectamine (GIBCO BRL) وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. تم غسلها الخلايا، التي تتغذى على DMEM تحتوي على 5٪ مصل تجريد، وتعامل مع هرمونات مختلفة، وتحصد بعد 24 ساعة. ويعاير مقتطفات خلية لluciferase النشاط، وذلك باستخدام نظام luciferase الفحص PROMEGA، وصححت قيم إما تركيز البروتين أو النشاط β غالاكتوزيداز. وتعرض البيانات كوسيلة لقيم ثلاث نسخ حصل عليها من التجارب التمثيلية.

اليوبيكويتين البروتين النشاط يغاز. لدراسة النشاط يغاز بتحول والبروتين من النوع البري E6-AP ومختلف أشكال متحولة من E6-AP، من النوع البري E6-AP ومختلف أشكال متحولة من E6-AP (الجدول 1 وأعرب عن) وتنقيته من E. القولونية كما GST البروتينات الانصهار. تم قياس الأنشطة بتحول البروتين يغاز من هذه البروتينات باستخدام HHR23A كما بروتين الهدف كما هو موضح سابقا (27، 49).

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 1.

Coactivation وبتحول البروتين الأنشطة يغاز من النوع البري وأشكال متحولة من E6-AP ل

القسم السابق القسم التالي

النتائج

عزل وتوصيف E6-AP باعتباره البروتين التفاعل PR. لتحديد البروتينات الرواية التي تعدل بشكل انتقائي وظائف transactivation أعضاء مستقبلات الفصيلة النووية، ونحن فحص مكتبة هيلا كدنا] باستخدام المجال ملزم يجند العلاقات العامة كطعم في الخميرة اثنين الهجين الفحص الفحص. نحن عزل 13 المستعمرات التي تفاعلت بقوة مع هذا مجال العلاقات العامة. وتضمنت هذه المستعمرات cDNAs مع تسلسل متطابقة. وكشف البحث تشابه تسلسل في قاعدة بيانات بنك الجينات أن جميع المستعمرات المشفرة للكربوكسي محطة أأ 680-851 من E6-AP (انظر الشكل 2 A).
يتفاعل كامل طول E6-AP مع النموذج liganded العلاقات العامة سواء في المجراة في المختبر. كما هو مبين في الشكل. 1 A، في الخميرة اثنين الهجين الفحص، يتفاعل E6-AP مع PR بطريقة تعتمد على هرمون البروجسترون. في غياب يجند أو في وجود RU486 مركب مضاد الهرمون، لاحظنا لا قدر كبير من التفاعل النسبي إلى السيطرة بين E6-AP والعلاقات العامة. لتوثيق أيضا أن التفاعل تعتمد على هرمون البروجسترون لوحظ في الخميرة هو فحص هجين اثنين يرجع إلى جمعية المادية المباشرة لE6-AP والعلاقات العامة، ونحن تنقيته الفيروسة العصوية-أعرب صاحب الموسومة PR على عمود النيكل تقارب ثم حضنت مع GST-E6-AP التي تم تنقيتها، وبعد ذلك ملزمة لحبات الجلوتاثيون سيفاروز في غياب أو وجود هرمون البروجسترون. كما تحكم، وقد حضنت GST تنقيته مع PR. بعد غسل واسعة النطاق، تم تحليل PR متجهة الى E6-AP التي كتبها immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة PR-محددة (الشكل 1 B). ولوحظ وجود قدر كبير من التفاعل E6-AP مع PR في وجود هرمون البروجسترون ولكن ليس في غيابها.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

تين. 1.

(A) تفاعل مع PR-النوع البري E6-AP في الخميرة فحص هجين اثنين. وتنصهر تسلسل الترميز كامل PR-A في الإطار مع الخميرة GAL4 DBD، وGAL الناتجة DBD-PR-A بناء وcoexpressed إما مكافحة ناقلات الأمراض أو GAL4-AD-E6-AP بناء (GAL4 مجال تفعيل تنصهر في الإطار مع من النوع البري E6-AP) جنبا إلى جنب مع البلازميد مراسل في سلالة الخميرة BJ2186. وقد نشر في transformants، وتم تحديد الأنشطة β غالاكتوزيداز من ثلاث مستعمرات مستقلة. تم علاج خلايا الخميرة مع أي مركبة وحدها (-H)، 10 -6 M البروجسترون (+ P)، أو 10 -6 M RU486 (+ RU). يصور كل شريط بمعدل ثلاثة فحوصات. (B) في تفاعل المختبر من E6-AP مع PR. أعرب الفيروسة العصوية-تنقيته وحضنت PR مع تنقيته GST-E6-AP البروتين الانصهار أو مع GST وحدها (مراقبة) منضمة إلى الخرز الجلوتاثيون سيفاروز إما في غياب أو في وجود 10 -6 M البروجسترون. تم تحليل PR متجهة الى E6-AP التي كتبها دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام على هلام 7.5٪ يليه تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف تحديدا PR.

مناطق E6-AP المطلوبة للتفاعل مع PR منذ E6-AP يتفاعل مع PR بطريقة تعتمد على هرمون، حددنا بجوار مناطق E6-AP هامة للتفاعل مع PR. لهذا الغرض، استخدمنا في الجسم الحي الثدييات يومين الهجين نظام التفاعل فحص (41). في هذا الاختبار، وتنصهر كامل طول E6-AP ومختلف شظايا حذف E6-AP إلى المجال تفعيل VP16 (الشكل 2 A)، وقدرة كل من البروتينات الهجين VP16-E6-AP للتفاعل مع PR وقد تقرر في غياب أو وجود هرمون البروجسترون. كما هو مبين في الشكل. 2 B، من النوع البري E6-AP، شظايا الحذف N-محطة (أأ 170-851 و680-851)، وشظايا الحذف C-محطة (أأ 1-714 و1-449) من E6- كانت AP قادرة على التفاعل مع PR، في حين أن ناقلات تحكم تفتقر E6-AP كدنا] وN-المحطة جزء (أأ 1-240) من E6-AP لم تتفاعل، مما يشير إلى أن اثنين على الأقل من مواقع التفاعل PR تقع ضمن E6 -AP البروتين. يقع موقع واحد داخل جزء-C محطة (أأ 680-851؛ 21 كيلو دالتون) من E6-AP، جزء معزول أصلا في الخميرة شاشة يومين الهجينة. يقع ثاني موقع التفاعل PR داخل أأ 240-449 ويتداخل الموقع E6 ملزم. كل من هذه المناطق من E6-AP يتفاعل مع كل من تفعيل عامل النسخي 1 وعامل تفعيل النسخي 2 من العلاقات العامة.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

تين. 2.

(A) تمثيل تخطيطي للE6-AP تظهر مواقف من المنطقة الحفازة (مربع الصلبة)، وكان الحاخام هيشت مجال، مجال transactivation، والمجالات PR-ملزمة. من النوع البري E6-AP هو 100 كيلو دالتون (أأ 1-851) البروتين. 76 كيلو دالتون (أأ 170-851) و 47 كيلو دالتون (أأ 450-851) تمثل E6-AP مع الحذف في N محطة. 21 كيلو دالتون (أأ 680-851) شكل يمثل محطة الكربوكسيل من E6-AP المحددة في الخميرة شاشة يومين الهجينة. 99 كيلو دالتون (أأ 1-845)، و 98 كيلو دالتون (أأ 1-834)، و 86 كيلو دالتون (أأ 1-714)، 53 كيلو دالتون (أأ 1-449)، و 28 كيلو دالتون (أأ 1-240) تمثل E6-AP C طفرات الحذف -terminal. C833S يمثل النموذج متحولة من E6-AP السيستين 833 إلى سيرين. يتم تمثيل المسوخ المرض AS 98 كيلو دالتون (حذف 17 أأ من محطة C) و 53 كيلو دالتون (C-عضال اقتطاع E6-AP) (أأ 1-449)؛ شكل I804K من E6-AP يحتوي يسين في موقف 804 بدلا من آيسولوسين، F782Δ يحتوي على حذف الفينيل ألانين في موقف 782، و104 كيلو دالتون 1-885Δstop شكل E6-AP هو متحولة readthrough. (B) توطين موقع التفاعل PR في E6-AP. لتحديد موقع PR التفاعل على E6-AP، كامل طول E6-AP ومختلف شظايا حذف E6-AP هو مبين في لوحة وكانت تنصهر في إطار مع تفعيل مجال VP16، وقدرة E6-AP للتفاعل مع PR وقد تقرر في الثدييات فحص اثنين من الهجين. تم cotransfected خلايا هيلا مع 0.3 ميكروغرام من PR التعبير البلازميد و 0.3 ميكروغرام من pPRE / GRE.E1b.LUC في غياب (السيطرة) أو وجود التعبير البلازميد pABVP16-E6-AP (0.9 ميكروغرام) (أأ 1-851 [wild- نوع]، 170-851، أأ 680-851، 1-714، أأ 1-449، وأأ 1-240). تم علاج الخلايا مع أي سيارة فقط (□) أو 10 -7 M البروجسترون (■). وتعرض البيانات وحدات الخفيفة النسبية في ميكروجرام من البروتين، ويصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار.

E6-AP باعتباره coactivator لالنووية مستقبلات هرمون الفصيلة. وللتحقق ما إذا كان E6-AP قد تلعب دورا في تنشيط تعتمد على مستقبلات في التعبير الجيني الهدف، أجرينا فحوصات cotransfection عابرة للخلايا هيلا. و transfected خلايا هيلا مع ناقلات التعبير عن العلاقات العامة والبلازميد مراسل تحتوي على عنصر استجابة البروجستيرون مع أو بدون ناقلات التعبير عن E6-AP. في غياب يجند، كان PR تأثير ضئيل على التعبير مراسل الجين إما في غياب أو في وجود E6-AP (الشكل 3 A). إضافة هرمون حققت زيادة بنسبة 8 أضعاف في نشاط العلاقات العامة في غياب E6-AP. عندما coexpressed E6-AP مع العلاقات العامة، وحفز نشاط العلاقات العامة مزيدا من ~5 أضعاف، أي ما مجموعه 40 أضعاف خلال المستوى القاعدي. في المقابل، كان coexpression من E6-AP مع PR أي تأثير كبير على نسخ من الجين مراسل عندما مستقبلات كانت متجهة إلى RU486 مركب مضاد الهرمون (الشكل 3 A). هذه البيانات متسقة مع البيانات المنشورة سابقا والتي تشير إلى أن RU486 يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين متميز في جزيء مستقبلات التي قللت تقارب لcoactivators (1، 33، 50، 52). منذ يتم اشتقاق الخلايا (ط) هيلا من نوع الورم الحليمي 18 إيجابي عنق الرحم المريض سرطان، وبالتالي التعبير عن بروتين E6 و (ب) تم استنساخ E6-AP أصلا باعتبارها بروتين E6-التفاعل، كان من الضروري استبعاد احتمال أن البروتين E6 يؤثر على وظيفة coactivation من E6-AP. كان E6-AP قادرة على تحفيز النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون مستقبلات هرمون الستيرويد في HepG2 E6 سلبية وSK-N-SH خطوط الخلايا (لا تظهر البيانات)، مما يدل على أن coactivation لوحظ في خلايا هيلا لا تعتمد على البروتين E6.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

تين. 3.

(A) E6-AP coactivates النشاط النسخي من PR-B. و transfected خلايا هيلا عابر مع 0.2 ميكروغرام من طاعون المجترات الصغيرة-B التعبير البلازميد و1 ميكروغرام من pPRE / GRE.E1b.LUC في غياب أو وجود E6-AP التعبير البلازميد pBK.RSV-E6-AP (0.250 ميكروغرام). تم علاج الخلايا مع أي سيارة فقط (-H)، 10 -7 M البروجسترون (+ P)، أو 10 -7 M RU486 (+ RU). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وحدد النشاط في وجود هرمون وفي غياب coactivator خارجي إلى 100٪، وتم تحجيمها بيانات الأشرطة الأخرى وفقا لذلك. (B) E6-AP coactivates النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون مستقبلات هرمون النووية. و transfected خلايا هيلا مع البلازميدات مستقبلات التعبير عن العلاقات العامة، ER، AR، وGR والخاصة وما شابه ذلك البلازميدات مراسل هرمون استجابة في غياب وجود E6-AP (0.250 ميكروغرام). تم علاج الخلايا مع الهرمونات المناسبة على النحو التالي: PR والبروجسترون (10 -7 M)؛ ER، استراديول (10 -9 M)؛ AR، R1881 (2.5 × 10 -10 M)؛ وGR، ديكساميثازون (10 -7 M). مدى coactivation التي كتبها E6-AP على الأنشطة التي تعتمد على هرمون النسخي من مختلف مستقبلات يتراوح من أربعة إلى ثمانية أضعاف. مستوى coactivation التي كتبها E6-AP يعتمد على كل نوع من الخلايا وعدد مرور الخلية (لا تظهر البيانات). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وحدد النشاط في وجود هرمون وفي غياب coactivator خارجي إلى 100٪، وتم تحجيمها بيانات الأشرطة الأخرى وفقا لذلك. (C) تأثير E6-AP التعبير عن الأنشطة النسخي من عوامل النسخ المتنوعة. و transfected خلايا هيلا مع البلازميد التعبير E2F (0.05 ميكروغرام) جنبا إلى جنب مع 2.5 ميكروغرام من مراسل البلازميد E2F المراعية أو SP1 استجابة. لاختبار تأثير E6-AP على النشاط النسخي من عامل النسخ CREB، LMTK - و transfected الخلايا مع مراسل البلازميد-CREB استجابة (2.5 ميكروغرام) في غياب أو وجود E6-AP (0.25 ميكروغرام). تم تفعيل عامل CREB النسخ عن طريق علاج الخلايا مع 10 ميكرومتر forskolin (FSK). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار.

وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن E6-AP يحفز النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون العلاقات العامة من خلال العمل باعتباره coactivator. لتحديد ما إذا كان ظائف E6-AP باعتباره coactivator لأعضاء مستقبلات الفصيلة النووية، درسنا تأثير E6-AP التعبير عن أنشطة النسخي التي تعتمد على يجند من مختلف مستقبلات هرمون النووي وعلى عدة عوامل النسخ الأخرى (الشكل 3 B وC). E6-AP تعزز إلى حد كبير على النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون PR، ER، AR، ومستقبلات جلايكورتيكود (GR). كما أنه يعزز النشاط النسخي من حمض الريتينويك (مستقبلات ألفا وهرمون الغدة الدرقية مستقبلات (لا تظهر البيانات). كان E6-AP الحد الأدنى أو لم يكن لها تأثير على النشاط النسخي من E2F وCREB. Coexpression من E6-AP سوى تأثير معتدل على وظيفة تفعيل SP1 (الشكل 3 C). وتشير هذه البيانات إلى أن E6-AP coactivates تفضيلي النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون مستقبلات هرمون النووية ولكنها ليست محددة لهم فريد كما هو الحال بالنسبة لcoactivators أخرى مثل SRC-1 (33).

E6-AP يخفف إسكات بين ER والعلاقات العامة. ولقد ثبت أن ER وحصة PR بعض coactivators منذ محددة هرمون ER يمكن عزل حمامات محدودة من coactivators من العلاقات العامة، وهي ظاهرة تعرف باسم إسكات (10، 31، 39). درسنا ما إذا كان coexpression من E6-AP قادرا على عكس هذه الظاهرة إسكات. تم تخفيض النشاط النسخي التي يسببها هرمون بوساطة PR بنسبة 91٪ عند coexpression من منضم استراديول ER (الشكل 4 A؛ مقارنة الممرات 2 و 3). إضافة E6-AP عكس هذا إسكات من قبل بقدر 9.6 أضعاف (الشكل 4 A؛ مقارنة الممرات 3 و 6) بطريقة تعتمد على الجرعة. على أعلى تركيز E6-AP المستخدمة في هذا الاتجاه المعاكس إسكات التجربة، تم تعزيز النشاط PR فقط 2.6 أضعاف (مقارنة الممرات 2 و 7). ومع ذلك، التحكم في الخلايا التي لا تعبر عن ER، وتعزيز E6-AP النشاط النسخي العلاقات العامة من أربعة إلى خمسة أضعاف (مقارنة الممرات 2 و 8). وتشير هذه البيانات إلى أن E6-AP هو العامل المحدد وهو أمر ضروري لPR كفاءة وER transactivation. وcoactivation أضعاف بحلول E6-AP أقل في هذه التجربة من في هو موضح في الشكل 3 B، بسبب الاختلافات في الظروف التجريبية. في الشكل 4 A (حارة 7)، لوحظ تأثير coactivation من E6-AP على النشاط النسخي العلاقات العامة في وجود ER التعبير البلازميد، بينما في الشكل 3 B، وtransfected فقط مستقبلات احد. وكما كان متوقعا، لم يلاحظ أي إسكات عكسي كبير (الشكل 4 باء؛ مقارنة الممرات 3 و 6) مع جزء C-محطة من E6-AP (أأ 680-851) (الشكل 2 A)، والتي تتفاعل بشكل ضعيف مع ER ( لا تظهر البيانات) وليس لديها وظيفة التنشيط (الشكل 5). ومع ذلك، فإن هذا جزء لا تمتلك النشاط السلبي السائد في ظل الظروف التجريبية لدينا. وأكد تحليل لطخة غربية أن جزء C-محطة من E6-AP (أأ 680-851) وكامل طول E6-AP يتم التعبير على حد سواء (لا تظهر البيانات).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

تين. 4.

(A) E6-AP ولكنها ليست متحولة-C محطة تفتقر إلى مجال التنشيط عكس إسكات النسخي بين العلاقات العامة وER. و transfected خلايا هيلا مع 0.2 ميكروغرام من PR التعبير البلازميد، 0.3 ميكروغرام من ER التعبير البلازميد، 1.0 ميكروغرام من pPRE / GRE.E1b.LUC، وزيادة تركيزات (0، 0.1، 0.5، و 1.0 ميكروغرام) من النوع البري E6- AP. وبعد ذلك تعامل الخلايا مع هرمون البروجسترون (البرنامج) أو البروجسترون واستراديول (E2) معا (كل في 10 -8 M). لين 8 يمثل خلايا السيطرة التي كانت مع transfected فقط العلاقات العامة وE6-AP البلازميدات التعبير. يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وحدد النشاط في وجود هرمون وفي غياب coactivator خارجي إلى 100٪، وتم تحجيمها بيانات الأشرطة الأخرى وفقا لذلك. كان (B) وجزء-C النهائي للE6-AP (أأ 680-851) قادر على عكس التدخل النسخي بين العلاقات العامة وER. و transfected خلايا هيلا مع 0.2 ميكروغرام من PR التعبير البلازميد، 0.3 ميكروغرام من ER التعبير البلازميد، 1.0 ميكروغرام من pPRE / GRE.E1b.LUC، وزيادة تركيزات (0، 0.1، 0.5، و 1.0 ميكروغرام) من جزء C-المحطة من E6-AP. وبعد ذلك تعامل الخلايا مع هرمون البروجسترون (البرنامج) أو البروجسترون واستراديول (E2) معا (10 -8 M). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وحدد النشاط في وجود هرمون وفي غياب coactivator خارجي إلى 100٪، وتم تحجيمها بيانات الأشرطة الأخرى وفقا لذلك.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

تين. 5.

النشاط النسخي من البروتين الانصهار GAL4-E6-AP. الأشكال المشار إليها من E6-AP (الشكل 1 وتنصهر A) إلى DBD الخميرة GAL4. خلايا هيلا ثم تم مع transfected 0.5 ميكروغرام من UAS4-TATA-luciferase المراسل DNA مراسل وGAL4 DBD أو GAL4-E6-AP التعبير البلازميد (1.0 ميكروغرام). يصور كل شريط متوسط ​​لا يقل عن ثلاثة آبار. وتفعيل GAL4 DBD تحديد إلى 100٪، وتعديل نشاط كل GAL4-E6-AP البروتين الانصهار وفقا لذلك.

E6-AP يحتوي على مجال تفعيل الذاتية. لتأكد مما إذا كان E6-AP تمتلك تم تعيين وجوهري، مجال التنشيط للتحويل، من النوع البري وشظايا حذف E6-AP إلى الحمض النووي عن طريق ربطها GAL4 DBD. من النوع البري E6-AP (أأ 1-851) وN-محطة (أأ 170-851، 76 كيلو دالتون) وC-محطة (أأ 1-714، 86 كيلو دالتون) شظايا الحذف حفز النشاط النسخي من الجين مراسل مقارنة لذلك من ناقلات تحكم يحتوي فقط GAL4 DBD (الشكل 5)، في حين أن جزء 21 كيلو دالتون (أأ 680-851) لم يفعل ذلك. وتشير هذه النتيجة إلى أن E6-AP حد ذاته يحتوي على مجال تفعيل النسخي تقع بين أأ 170 و 680.

E6-AP يحتوي على اثنين، وظائف للانفصال مستقلة، coactivation والنشاط بتحول يغاز منذ E6-AP هو يغاز بتحول والبروتين، درسنا ما إذا كانت وظيفة coactivation من E6-AP تعتمد على هذه الوظيفة الأنزيمية. وقد تبين أن بقايا C833 المحفوظة في E6-AP تشكل السندات ثيو إستر مع بتحول وضرورية لنقل بتحول إلى البروتين المستهدفة لubiquitination. وقد تبين أن تحور C833 إلى A أو S للقضاء على النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP (19). في التجارب cotransfection، وهو E6-AP تحمل طفرة C-إلى-S في هذا الموقع الحرج كان لا يزال قادرا على coactivate PR (الجدول 1) وER (لا تظهر البيانات) إلى ما يقرب من نفس القدر من النوع البري E6-AP. وعلاوة على ذلك، شكل متحولة C833S من E6-AP أيضا يمكن عكس سحق النشاط النسخي التي تعتمد على هرمون PR إلى حد مماثل من النوع البري E6-AP (لا تظهر البيانات). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP غير مطلوب لوظيفة coactivation من E6-AP. لمزيد من تأكيد أن مسار بتحول-proteasome ولم يشارك في وظيفة coactivation من E6-AP، قمنا بتحليل متحولة حذف E6-AP (أأ 1-845) الذي يفتقر 6 أأ في محطة كربوكسي ولقد ثبت أن تكون معيب للنشاط بتحول البروتين يغاز (19). مثل متحولة C833S، يحتفظ هذا المسخ أيضا القدرة على coactivate النشاط تعتمد على هرمون النسخي العلاقات العامة (الجدول 1)، مما يؤكد أن النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP ليس من الضروري لE6-AP لتكون بمثابة coactivator. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن E6-AP تمتلك اثنين من المستقلين، فصل وظائف، coactivation وبتحول البروتين النشاط يغاز.

نتائج النمط الظاهري AS من العيوب في النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن مجموعة فرعية من AS المرضى التعبير عن أشكال متحولة من E6-AP، بدلا من امتلاك والحذف على نطاق واسع أكثر شيوعا من المنطقة 15q11-Q13 الذي يحتوي E6-AP (26، 30، 42). لتحديد ما إذا كانت وظيفة coactivator من E6-AP ضرورية لتطوير AS النمط الظاهري، ولدت لنا عدة متحولة البروتينات E6-AP المقابلة لتلك التي وجدت في هذه AS المرضى (الجدول 1). أولا، نحن اختبار تأثير على متحولة E6-AP مع حذف الإجمالي الذي النصف-C محطة من البروتين قد تم حذفه بسبب طفرة هراء في كودون 417 (R417X). قدرة هذا البروتين AS متحولة إلى coactivate PR أقل بكثير من النوع البري E6-AP، ولكنها لا تزال تتفاعل مع PR (الشكل 2 B)، مما يدل على أن فقدان coactivation ومن المقرر أن تعطل تفعيل مجال تقع في أأ 170 إلى 680. وعلاوة على ذلك، وفقدان coactivation من قبل متحولة R417X لا يرجع إلى فقدان التعبير من البروتين الطافر، لأن هذا المسخ قادرة على التفاعل مع PR إلى نفس القدر من النوع البري E6-AP في خلايا الثدييات المستخدمة لتقييم coactivation (الشكل 2 B). كان متحولة R417X من E6-AP أيضا غير قادر على coactivate ER وAR (لا تظهر البيانات).
ثم اختبرنا شكل متحولة آخر من E6-AP الذي يحتوي على حذف صغير في المجال وكان الحاخام هيشت بسبب طفرة انزياح الإطار الذي ينتج اقتطاع 17 أأ الأخير من البروتين (أأ 1-834) واستبدال أربعة الأمينية مختلفة الأحماض من إطار القراءة الجديدة. كان هذا المسخ E6-AP قادرة على coactivate PR إلى نفس القدر من النوع البري E6-AP (الجدول 1). وبالمثل، كان متحولة الاصطناعي الذي يفتقر إلى 6 أأ على C محطة القصوى من E6-AP (أأ 1-845) قادرة على أن تكون بمثابة coactivator النشاط PR (الجدول أيضا 1). اختبرنا ثلاث طفرات أخرى لديها القدرة على coactivate PR النسخ: مغلطة طفرة I804K، الذي تم تحور آيسولوسين 804 ليسين. F782Δ، وهو الحذف الداخلي في إطار الفينيل ألانين 782؛ و1-885 Δstop، طفرة readthrough الذي ينتج في شكل يعد متحولة من E6-AP. كل ثلاثة من هذه الأشكال متحولة من E6-AP كانوا قادرين على coactivate النشاط PR، مما يدل على أن وظيفة coactivator من E6-AP لم يشارك في النمط الظاهري الجهاز العصبي المركزي من AS (الجدول 1).
لربط النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP مع AS، اختبرنا الوظائف بتحول يغاز من النوع البري وأشكال AS متحولة من E6-AP. بعض أشكال AS متحولة من E6-AP، مثل جزء تضم أأ 1-834، R417X، وF782Δ، لم يتمكن ubiquitinate بروتين (HHR23A) تورط كهدف من E6-AP بتحول البروتين النشاط يغاز في في المختبر فحص بتحول (27، 49)؛ وتشير النتائج إلى أن فقدان بتحول البروتين النشاط يغاز تساهم في AS النمط الظاهري في هؤلاء المرضى. ومع ذلك، كان 804K AS متحولة مغلطة قادرة على ubiquitinate وHHR23A البروتين المستهدف إلى حد ما مقارنة إلى أن من النوع البري E6-AP (الجدول 1).

القسم السابق القسم التالي

مناقشة

مستقبلات هرمون النووية هي عوامل النسخ التي يسببها يجند. لتفعيل النسخ من الجينات المستهدفة، هذه المستقبلات الخضوع لعملية التنشيط متعددة الخطوات المعقدة (18، 34، 40، 47). هذه الخطوات، على الرغم المطلوبة لوظيفة المستقبل، ليست كافية لتحقيق أفضل وظيفة مستقبلات. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن البروتينات coactivator ضرورية لتنشيط الجينات الاقصى في المستقبلات (40). Coactivators تعزيز وظيفة مستقبلات التي تعمل كجسر بين مستقبلات محددة DNA وعوامل النسخ القاعدية للمجمع التمهيد للبدء أو من خلال توفير النشاط HAT الذي يعطل هيكل لونين القمعي المحلي، والمساهمة في زيادة النشاط النسخي من الجين المستهدف (2، 9، 28 ، 36، 41، 45).
في هذا التقرير، علينا أن نبرهن على البروتين E6-AP يتفاعل فقط مع النموذج liganded العلاقات العامة، سواء في والمجراة في المختبر، وأنه coactivates النشاط النسخي من مستقبلات هرمون ملزمة. ومع ذلك، فشل E6-AP للتفاعل مع PR بحضور RU486، بما يتفق مع البيانات المتوفرة لدينا المنشورة سابقا مشيرا إلى أن coactivators لا تتفاعل بكفاءة مع المستقبلات في وجود مضاد الهرمون سواء في التجارب المختبرية والحية (1، 33، 50، 52 ). مثل coactivators المستنسخة أخرى، E6-AP يحتوي على زخارف LXXLL، والتي يعتقد أنها مهمة للتفاعل مستقبلات (15، 16). وتقع اثنين من هذه الزخارف داخل محطة الأمينية من E6-AP في حين أن ثلث يقع داخل محطة كربوكسي، التي تدعم النتائج التي توصلنا إليها أن E6-AP تمتلك مناطق التفاعل مستقبلات في كل الأمينية وتيرميني كربوكسي.
ويدعم وجود coactivators في مسار نقل الإشارة من مستقبلات هرمون النووية النتيجة أن النشاط نسخ من مستقبل واحد يمكن باحباط من قبل overexpression من مستقبلات أخرى، مشيرا إلى أن كل من مستقبلات تتنافس على العوامل المشتركة. هذه الملاحظة أدت بنا إلى تحديد ما إذا كان E6-AP هو واحد من هذه العوامل التي تحد يمكن أن تلغي هذه الظاهرة إسكات (6، 10، 31، 39). وتظهر دراستنا أن overexpression من E6-AP في خلايا الثدييات عكس تأثير إسكات من ER على PR transactivation بطريقة تعتمد على الجرعة. هذه النتائج مزيد من الدعم ملاحظة أن E6-AP هو coactivator حقيقي لمستقبلات هرمون النووية.
حتى الآن، عدة coactivators، على سبيل المثال، SRC-1 (33)، TIF2 (GRIP1) (17، 51)، وص / CIP (ACTR / RAC3 / AIB1 / الترام-1) (2، 9، 28، 46، 48 )، وقد المستنسخة. هذه coactivators تحتوي على مجالات تنشيط الجوهرية وتعزز transactivation من هرمون النووي مستقبلات الفصيلة. معظم coactivators يحمل أي خصوصية مستقبلات وقادرون على coactivate مجموعة واسعة من مستقبلات هرمون النووية (33). مثل هذه coactivators أخرى، E6-AP ديه مجال تفعيل جوهري وcoactivates جميع مستقبلات هرمون النووي اختبارها.
E6-AP يمثل فئة فريدة من coactivators لأنه يسلك بتحول البروتين النشاط يغاز. ومع ذلك، فإن هذا النشاط يغاز بتحول والبروتين ليست جزءا من وظيفة coactivator من E6-AP. البيانات الواردة في هذا التقرير تشير إلى أن E6-AP تمتلك اثنين من المستقلين، فصل وظائف، coactivation وبتحول البروتين النشاط يغاز. من ناحية أخرى، coactivators المستنسخة سابقا مثل SRC-1، P300 / الجمارك وحماية الحدود، وRAC3 / ACTR / AIB1 تمتلك النشاط HAT وجزء واضح من المفترض بهم في الجسم الحي coactivation وظيفة من خلال هذا النشاط الأنزيمي (2، 9، 28، 32، 41). E6-AP تمتلك بتحول البروتين النشاط يغاز، بدلا من النشاط HAT، وهي ليست شرطا مسبقا لcoactivation. وتشير هذه النتيجة إلى أن E6-AP يعمل رواية البروتين المزدوجة وظيفة، وتنظم كل من هرمون الستيرويد عمل مستقبلات وتدهور بوساطة بتحول-proteasome و-من البروتين p53. coactivator آخر، TRIP230، فقد تبين أيضا أن تشارك في السيطرة دورة الخلية عن طريق عزل شكل hypophosphorylated من البروتين الشبكية (8).
آخر coactivator المحتملة التي تم تحديدها في الخميرة وخلايا الثدييات (RSP5 / hRPF1) وقد تورط باعتباره coactivator من مستقبلات هرمون الستيرويد التي تمتلك نطاق وكان الحاخام هيشت مع٪ 37 الهوية إلى أن من E6-AP (24). UREB1، وهو بروتين ملزمة الحمض النووي الذي يحتوي أيضا على نطاق وكان الحاخام هيشت (32)، هو الأمينية عضال اقتطاع (حوالي 300 أأ) مقارنة E6-AP وليس له أي تأثير على وظيفة transactivation من مستقبلات هرمون النووية (لا تظهر البيانات)، مرة أخرى مما يدل على أن المجال كان الحاخام هيشت وحده ليس كافيا لcoactivation.
النتائج المعروضة هنا لمتحولة البروتينات E6-AP المحددة في AS المرضى تشير إلى أن لا ترتبط وظيفة coactivation من E6-AP مع مظهر المظهري من AS. ومع ذلك، نتائجنا لا تشير إلى أن النتائج AS النمط الظاهري من خلل في النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP. عادة، يتم التعبير فقط نسخة الأمهات من E6-AP في مناطق معينة من المخ، في حين أن الأب نسخة صامتة بسبب يطبع (37). ومع ذلك، فإنه لا يزال من الممكن أن الحذف الجسيمة أو كاملة E6-AP (مثل R417X متحولة) يمكن أن يؤدي إلى خلل coactivation مستقبلات الستيرويد في هذه المناطق من الدماغ أو الأنسجة الأخرى حيث يتم التعبير عن E6-AP بطريقة مطبوع. تحليل أكثر تفصيلا للعلاقات بين AS، E6-AP، وعمليات تنظيم مستقبلات هرمون النووي أخرى ينتظر إجراء مزيد من التحقيقات. ومن المثير للاهتمام، haploinsufficiency من النووي مستقبلات هرمون coactivator، بروتين ملزمة CREB آخر، ويرتبط مع متلازمة روبنشتاين-تيبي، وهو مرض وراثي يتميز أيضا عن عيوب عصبية متنوعة (35).
في الختام، تظهر نتائجنا أن E6-AP، وهو بروتين يرتبط وراثيا لمرض وراثي البشري (AS)، هو coactivator الحقيقيين من مستقبلات هرمون النووية. على الرغم من بتحول-proteasome وبوساطة مسار تدهور عوامل النسخ وقد تبين مؤخرا أنها مهمة لتنظيم النسخي (25، 29، 43)، وتشير تجاربنا التي بتحول البروتين النشاط يغاز E6-AP ليست كافية للتوسط في قدرة E6 -AP إلى coactivate مستقبلات هرمون النووية. ومع ذلك، فمن الممكن أن تدهور مسار بوساطة بتحول (ق) يسهم في بعض جوانب النووية وظيفة مستقبلات الهرمونات في الجسم الحي. E6-AP قد تعدل النشاط النسخي من مستقبلات هرمون النووية من خلال تعزيز تدهور المنظمين السلبية من النسخ مثل corepressors. وتمشيا مع هذه الفرضية، فقد تبين أن واحدا من corepressors مستقبلات النووي، وN-مجلس النواب، ويمكن أن تتحلل من خلال مسار تدهور proteasome و(55). ومن الممكن أيضا أنه بعد تنشيط مستقبلات من النسخ، لا بد من آلية لفصل مجمع التمهيد للبدء السماح باستعادة النسخ واستطالة وبالتالي للتوسط تدهور إما مستقبلات أو عوامل النسخ العامة لممارسة رقابة أشد من النسخ. وقد اقترح مزيدا من الأدلة على وجود صلة بين مسار بتحول والنسخ الجيني عن طريق التقرير أن RSP5 / RPF1 ubiquitinates المجال-C محطة من RNA بوليميريز الثاني (23). يمثل تقريرنا مثال آخر على مجموعة من coactivators لمستقبلات النووية التي تحتوي coactivation متميزة والأنشطة الإنزيمية أعضاء.

 

[رافت ابراهيم]

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/8/6/1025.full


https://translate.googleusercontent....Bzu14qIuDFbEeg

المسببات الأكثر شيوعا لمتلازمة برادر ويلي وAngelmansyndrome هو دي نوفو الحذف الخلالي من كروموسوم 15q11-Q13. وتشمل الحذف وإعادة ترتيب المتكررة الأخرى في هذه المنطقة، ووصف أربعة "النقاط الساخنة" مشتركة لكسر نقاط التوقف 1-4 (BP1-BP4). حددت بناء على ~4 ميغابايت YAC contig هذه المنطقة تسلسل متعددة الموسومة المواقع (STSS) الحالية في كل من BP2 وBP3، توحي حدث الازدواجية الجيني. أظهرت الدراسات FISH البيني 4:57 النسخ على 15q11-Q13، نسخة واحدة على 16p11.1-p11.2 ونسخة واحدة على 15q24 في الضوابط العادية، في حين أظهر التحليل على اثنين من الدرجة الأولى المرضى الحذف فقدان ما يقرب من ثلاث إشارات في 15q11-Q13 على homolog واحد. وقد لوحظت إشارات FISH متعددة أيضا في المناطق orthologous إلى كل من الكروموسومات البشرية 15 و 16 في الرئيسيات غير البشرية، بما في ذلك قرود العالم القديم، مما يشير إلى أن الازدواجية في هذه المنطقة قد وقعت قبل ~20 مليون سنة. أظهر BAC / PAC contig لقطاع الجيني المكررة (duplicon) بحجم ~400 كيلوبايت. والمثير للدهشة، تم العثور على duplicon لاحتواء ما لا يقل عن سبعة مختلف العلامات تسلسل أعرب تمثل متعددة الجينات / الزائفة الجينات. وأظهرت مقارنة تسلسل STSS تضخيمها من الحيوانات المستنسخة YAC تعيين فريد لBP2 أو BP3 نسختين مختلفة من duplicon داخل BP3، في حين تتألف BP2 نسخة واحدة. ومقلوب اتجاه BP2 وBP3 بالنسبة لبعضها البعض، في حين أن النسختين داخل BP3 هي في وقت واحد. وجود قطاعات المكررة كبيرة على الصبغي 15q11-Q13 يوفر آلية لمثلي أحداث إعادة التركيب غير المتكافئة التي قد توسط في إعادة ترتيب متكررة لاحظت لهذا الكروموسوم.

القسم السابق القسم التالي

تقديم

هي سبب المتلازمات الجينية متجاورة من قبل الحذف أو الازدواجية في مناطق واسعة من الجينوم البشري التي تنطوي على الجينات لا علاقة متعددة متجاورة فعليا على الكروموسوم. واحدة من الأماكن الأكثر شيوعا لإعادة ترتيب هو 15q11-Q13، حيث تشوهات هيكلية متعددة، بما في ذلك الحذف، الكروموسومات علامة الزائدين، الازدواجية، triplications ونقل المواقع، ويلاحظ. الحذف من خلالي حساب 15q الأقرب لل~70٪ من كل من متلازمة برادر ويلي (PWS) ومتلازمة أنجلمان (AS) مريض، مع تردد حذف المقدرة ~1 / 10 000 ولادة حية (مراجعة في المرجع 1). A النتائج حذف الأب في PWS، في حين أن النتائج حذف الأمهات في AS، بسبب يطبع الجينومية في هذه المنطقة (2، 3). بالإضافة إلى الأحداث حذف الترددات العالية، كروموسوم 15 حسابات ~50٪ من مجموع الكروموسومات علامة الزائدة التي لوحظت في الرجل (4). تردد المقدرة للعلامات كروموسوم 15 مشتقة، ويشار إلى الجرد كما الحزب الاتحادي الديمقراطي (15)، هو ~1 / 5000 ولادة حية (4). وتشمل إعادة ترتيب أقل تواترا من هذه المنطقة نفسها من كروموسوم 15 الازدواجية (5 - 9) وtriplications (9 - 11).
تشير أدلة متزايدة على وجود أربعة "النقاط الساخنة" محددة أو مجموعات نقطة توقف تقع في 15q القريبة. باستخدام طول تقييد جزء تعدد الأشكال (RFLP) تحليل، الربوة وآخرون. (12) حددت أول فئتين من AS الحذف (الدرجة الأولى والثانية) على أساس مجموعتين توقف الداني، المرافقة S18، مع التوحيد واضحا في مدى الحذف على القاصي الجانب. Kuwano وآخرون. (13) تستخدم مضان التهجين في الموقع (FISH) التحليل في تحديد نقطة توقف الداني المشتركة ضمن YAC استنساخ واحد (y254B5)، في 10/10 PWS / AS المرضى الحذف، ونقطة توقف البعيدة المتكررة داخل YAC واحد (y93C9)، في 8/9 حالات الحذف، بما يتفق مع وجود "النقاط الساخنة" من إعادة ترتيب في هذه المواقع.
وقد تم إنشاء أول contig الجيل YAC من كروموسوم المنطقة 15q11-Q13 في عام 1993 الذي تضمن العديد من الثغرات وعدد قليل من الواسمات الوراثية متعددة الأشكال مفيدة لرسم خرائط المناطق نقطة توقف (14). وقد وضعت الواسمات الوراثية الإضافية من نهاية القريبة من contig وتستخدم لتحليل المرضى المعروف لاحتواء الحذف من هذه المنطقة التي كتبها FISH (15). وأظهر تحليل الصغرية من 53 PWS و33 مريضا AS حذف 44٪ ليتم حذفه لS542 (الدرجة الأولى)، في حين أن 56٪ لم يتم حذف (الدرجة الثانية) (15). يشار إلى موقع الكسر للمرضى من الدرجة الأولى على أنها نقطة (BP) 1 وموقع الكسر لمن الدرجة الثانية المرضى ويشار إلى BP2. وهكذا، كل PWS وAS حذف الحالات تظهر التناسق الملحوظ في حجم الحذف وتحديد المناطق الساخنة لثلاثة الكروموسومات الكسر في المنطقة the15q11-Q13، يشار إليها فيما BP1، BP2 وBP3.
يبدو ترتبط نقاط التوقف تتفق أيضا مع الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي (15) علامة كروموسوم، وإنتاج صنفين حجم الأولية التي ترتبط withphenotype (+16 - 19). الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي (صغيرة 15) الكروموسومات لا تحتوي على PWS / AS المنطقة الحذف المشتركة، وعادة ما ترتبط مع النمط الظاهري العادي. FISH وتحليل الصغرية من 18 الصغيرة للإستثمار الحزب الاتحادي الديمقراطي (15 أظهر) الكروموسومات أنها تنطوي على إعادة ترتيب في نفس منطقتين توقف القريبة (BP1 وBP2) وجدت في PWS / المرضى AS الحذف (18).
وتقع نقطة ساخنة الرابعة لكسر كروموسوم، BP4، بين S1031 وS1010، وهو نقطة توقف للإستثمار الحزب الاتحادي الديمقراطي (معظم كبيرة 15) الكروموسومات (9)، وكذلك في بعض حالات الازدواجية وtriplication (9؛ بيانات غير منشورة). المرضى الذين يعانون من ثلاثة أو أربع نسخ المستمدة من أمهات / AS المنطقة الحرجة PWS يكون النمط الظاهري الشاذة التي تشمل تأخر في النمو أو التخلف العقلي، والمضبوطات والميزات التوحد مثل (20، 21). نقاط الإيقاف تشارك في تشكيل الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي (كبيرة 15 قد بدأ) الكروموسومات في الآونة الأخيرة إلا أن تتميز وتظهر لإشراك إما BP3 أو BP4 (9، 19، بيانات غير منشورة).
الازدواجية الأمهات بما في ذلك PWS / AS المنطقة ايضا لوحظ في المرضى الذين يعانون من مرض التوحد التأكد نموذجي، في حين تظهر الأفراد وراثة نفس الازدواجية في الأصل لأب أن تكون طبيعية (21). وتوقف البعيدة في الازدواجية الخلالي قد تنطوي إما BP3 orBP4 (+7 - +9). ومن المثير للاهتمام، BP4 كما تورطت في المرضى الذين يعانون من triplications الأم من الأقرب 15q حيث ثلاث نسخ من المنطقة BP1-BP4 موجودة في كروموسوم المستمدة أمومي، موحية آلية مشتركة لإعادة ترتيب (10، 11).
واقترح فرضية أن عدم الاستقرار الجيني في 15q11-Q13 قد يكون راجعا إلى عناصر الحمض النووي تتكرر في هذه المنطقة لأول مرة دونلون وآخرون. (22). في هذه الدراسة، 10 كروموسوم تحقيقات 15 محددة، ووصف في وقت لاحق S9-S18 (23)، وقد وضعت من الحزب الاتحادي الديمقراطي (مرتبة تدفق كبيرة للإستثمار 15) مكتبات التخصيب كروموسوم فج (22). تم تعيين استنساخ S9-S14 في المنطقة BP2-BP3، في حين تم تعيين S15-S18 خارجه (22، 23). تم العثور على ثلاث الحيوانات المستنسخة غير محددة لتكون موجودة في نسخ متعددة، والتي يحتمل أن تشارك في المناطق نقطة توقف (22).
دليل آخر على تسلسل نسخة متعددة يأتي من البيانات لأسرة جين تم تحديدها ضمن 15q11-Q13. استنساخ من مكتبة تسليخ مجهري القريبة 15q، MN7، حددت عائلة جينية مع 4:56 النسخ على 15q11-Q13 ونسخة واحدة على الأقل 16p11.2 (24). وقد تم تحديد اثنين من الحيوانات المستنسخة كدنا]، ورسم الخرائط واحد لكروموسوم 15 واحد لكروموسوم 16، وأشار تحليل الشمالي بحضور كل من 15 ونص 7 كيلو بايت على الصبغي 15 (24). نص 15 كيلوبايت يتوافق مع HERC2 (المعروف أيضا باسم ERY-1) الإنسان genein (25، 26) وRJS (27) أو herc2 (26) الجينات في الماوس، في حين أن كدنا] كاملة تقريبا للكيلو نسخة البشرية 7 (KIAA0393) ومتسلسلة من قبل ناغاسي وآخرون. (28).
في الآونة الأخيرة، وضعنا ~4 ميغابايت YAC contig مفصل توفير أول خريطة كاملة ومتكاملة المادية للمنطقة 15q11-Q13 (29). أحد عشر تسلسل الموسومة المواقع (STSS)، بما في ذلك خمس علامات تسلسل أعرب (التكنولوجيات السليمة بيئيا)، كانت محلية بين S542 و S543، موقع BP2 (13، 15، 29). بشكل غير متوقع، تمديد هذه الخريطة أثبتت الازدواجية في كل STSS 11 بين S542 و S543 لالخميرة البعيدة الكروموسومات الاصطناعية (مراكز أنشطة الشباب) متداخلة y93C9، موقع BP3، وكشف عن جزء المكررة واسع في مواقع نقاط الإيقاف حذف مشتركة في PWS وAS. نحن الآن الحاضر تحليلا مفصلا الجزيئية وFISH من BP2 وBP3 شرائح تكرار المرتبطة نقاط التوقف الحذف المشتركة التي لوحظت في PWS وAS.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

STS استنادا YAC رسم خرائط المحتوى

قدم contig YAC المتكاملة في المنطقة 15q11-Q13 إطار لبدء رسم الخرائط والاستنساخ من المناطق fourbreak نقطة. نحو هذا الهدف، تم إنشاء مسار تبليط الحد الأدنى من مراكز أنشطة الشباب تمتد من علامة معظم الداني، NIB1540، لS144، وتقع البعيدة إلى BP4، (لا تظهر البيانات). بشكل غير متوقع، والعديد من التكنولوجيات السليمة بيئيا تفاصيلها سابقا في هذه المنطقة، بما في ذلك A006B10، A008B26، SHGC15126 وSHGC17218 تم العثور على أن يكون حاضرا في مراكز أنشطة الشباب في مواقع BP2، BP3 وبعض في BP4 (الشكل 1 والبيانات لا تظهر). وعقب هذه النتيجة، جميع الحاضرين STSS في y931C4، موقع BP2، تم اختبار ضد مراكز أنشطة الشباب في BP3 (على سبيل المثال y943D8، y962D11 وy893H9). في البداية، تم العثور على 11 STSS لتعيين مراكز أنشطة الشباب في bothBP2 وBP3 (الشكل 1).
كان معروفا BP2 لتكون مترجمة بين S542 و S543 (15)؛ ومع ذلك، كانت المسافة بين هذه العلامات غير معروفة. تحديد التكنولوجيات السليمة بيئيا متعددة (SGC32610، SHGC15126، SHGC17218، A006B10 وA008B26)، ويحتمل أن تمثل جينات متعددة / الخادعة، سواء داخل المناطق BP2 وBP3 اقترح وجود شريحة كبيرة الجيني المكررة. تضمنت STSS تكرار الآخرين S15، S16 و S17، والتي يمكن أن تمثل تحقيقات multicopy المذكورة في الدراسة في وقت مبكر من دونلون وآخرون (. 22)، MN7، والمعروف أن تكون موجودة في نسخ متعددة على 15q11-Q13 (+24 - 26)، واثنين من YAC ينتهي، 368H3L و166G7R. في الآونة الأخيرة، فإن مصطلح "duplicon" وقد استخدم لوصف الازدواجية في قطاعات الجينوم يحتوي على جينات غير المجهزة (30). على الرغم من أن توصيف التكنولوجيات السليمة بيئيا متعددة في هذه المنطقة محدودة، وسنشير إلى هذا الجزء الجيني المكررة على 15q11-Q13 باعتباره duplicon.
الترتيب الأولي من علامات داخل contigs YAC في كل duplicon نسخة اقترح التوجه المقلوب BP2 نسبة إلى BP3 (الشكل 1). على سبيل المثال، تعيين S17 لy254B5 وy166G7 في النهاية البعيدة من BP2، ولكنها لم تعين y764C6 في النهاية البعيدة من BP3 (الشكل 1). لتأكيد توجه BP2 نسبة إلى BP3، وكان يستخدم S17 لتحديد الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) استنساخ GS124B5 وGS246N13 (الجدول 1). وأشار رسم الخرائط STS هذه البكالوريا التي GS124B5 أظهرت النتائج PCR إيجابية ل166G7R، S17 و S543، ووضع هذه استنساخ على الحدود البعيدة من BP2 (الشكل 1). أظهر BAC GS246N13 النتائج PCR إيجابية لS17 و S931 (اكسون 3 من P الجينات)، ووضع هذه استنساخ على الحدود القريبة من BP3، مما يؤكد التوجه المقلوب من BP2 نسبة إلى BP3 (الشكل 1).

عدد النسخ Duplicon في الضوابط العادية

لتحديد عدد نسخة من duplicon داخل الصبغي 15، وكان أداؤها FISH باستخدام P 1 المستمدة من كروموسوم اصطناعي (PAC) GS7484، حدد مع STS 368H3L (الشكل 1 والجدول 1). أظهر تهجين GS7484 على الثقافات الخلايا اللمفاوية العادية مجموعة كبيرة من الإشارات داخل المنطقة 15q11-Q13 على الكروموسومات الطورية (الشكل 2 A). وقد لوحظت أيضا إشارات ضعيفة على 15q24 و16p11.1-p11.2. في الطور البيني نوى كانت هناك 3-5 إشارات بارزة في كل مجال كروموسوم 15 (الشكل 2 A، أقحم). لتأكيد عدد نسخة من GS7484 داخل 15q11-Q13، تم إجراء التهجين على G 0 / G 1 متزامنة نوى من خطين الليفية الطبيعية. في كل العينات كانت قيمة مشروط ثلاث إشارات مع مجموعة من 1-7 إشارات في كل كروموسوم 15 النطاق، بما يتفق مع النتائج التي لوحظت في الخلايا الليمفاوية (لا تظهر البيانات).

الشكل 1

STS المحتوى خريطة BP2 وBP3 duplicons. تتجه المنطقة من السنترومير (يسار) إلى شريط الحامض النووي (يمين). الأسهم الكبيرة في الجزء العلوي من هذا الرقم تشير إلى توجه اثنين من duplicons بالنسبة لبعضها البعض. وترد STSS عموديا مع التكنولوجيات السليمة بيئيا / أكدت الجينات. تحت STSS خطوط أفقية التي تمثل استنساخ الجينوم الفردية. تبدأ استنساخ YAC مع ذ، استنساخ BAC / PAC مع GS وcosmid مع ج. تمثل دائرة شغل في رد فعل PCR إيجابية للSTS على استنساخ اللزوم. ويمثل x تفاعل PCR سلبي ويمثل ساحة شغل في STS المتقدمة من نهاية استنساخ. المستطيلات أرفق استنساخ المستخدمة في التجارب FISH.

الجدول 1

استنساخ BAC / PAC المستخدمة في الدراسة

فقدان النسخ duplicon في PWS / AS المرضى الحذف

تحليل الصغرية السابق باستخدام علامات S542 S543 والمترجمة موقع الكسر لوحظ في الدرجة الثانية PWS وAS الحذف إلى نفس الموقع مثل duplicon BP2 (15). لمزيد من تقييم الارتباط من duplicons إلى PWS / AS الحذف، وكان يستخدم GS7484 باعتباره التحقيق FISH على اثنين من الدرجة الأولى واثنين من الدرجة الثانية مرضى الحذف. تم تنفيذ المشارك التهجين باستخدام استنساخ GS118I17، تحقيقا نسخة واحدة معزولة مع S1043، علامة تقع البعيدة إلى BP3 (الشكل 1 والجدول 1). يتم تقليل إشارة من GS7484 بشكل كبير في شدة على كروموسوم حذف 15 في اثنين من المرضى حذف الدرجة الأولى (الشكل 2 B). في نوى البيني، وينظر إلى إشارات متعددة (وضع = 4) على الصبغي طبيعي، ولكن واحدا فقط إشارة خافت موجود على الكروموسوم حذف يتفق مع فقدان معظم إشارات GS7484 على homolog حذف (الشكل 2 B). في المقابل، لا تزال هناك عدة إشارات من GS7484 على كروموسوم حذف في الدرجة الثانية مرضى الحذف (الشكل 2 C)، بما يتفق مع وجود نسخة إضافية واحدة على الأقل من GS7484 المتبقية في الدرجة الثانية الحذف الذي هو غائب في الدرجة الأولى بالإضافة إلى أظهر GS118I17 شارك في التعريب مع GS7484 على الكروموسومات الطورية (لا تظهر البيانات)، ولكن إشارة واضحة على البيني النوى (الشكل 2 B و C)، بما يتفق مع وثيقة، ولكن غير متداخلة، توطين GS118I17 نسبة إلى GS7484.

الرقم 2

(A) تحليل FISH على الطورية الطبيعية والخلايا البيني مبينا تسلسل تكرار. هو المسمى GS7484 مع digoxigenin والكشف مع رودامين مكافحة digoxigenin (أحمر)، andpMC15 (D15Z3)، كروموسوم 15 α التحقيق الأقمار الصناعية، وصفت مع البيوتين والكشف مع أفيدين-FITC (الخضراء). Inmetaphase الكروموسومات، ويظهر GS7484 مجموعة كبيرة من الإشارات الحمراء في المنطقة 15q11-Q13 (الأسهم الكبيرة) مع إشارة صغيرة في 16p11.1-p11.2 (الأسهم الصغيرة). جدا لوحظ ضعف التهجين أيضا على 15q24. في نواة الطور البيني (الشكل) ويلاحظ حوالي 3-5 إشارات حمراء سرية (السهام). (B) تحليل FISH على الدرجة الأولى المريض AS الحذف. هو المسمى GS7484 باللون الأحمر وBAC GS118I17، وتقع البعيدة إلى BP3، هو المسمى باللون الأخضر. من أجل الوضوح، وتظهر إشارات خضراء من GS118I17 فقط في نواة الطور البيني. في الطورية، يظهر GS7484 homolog واحدة (يسار) مع مجموعة كبيرة من الإشارات الحمراء وانخفاض ملحوظ شدة إشارة في homolog الثاني (يمين). في نوى البيني، GS7484 يظهر إشارات حمراء متعددة لأحد كروموسوم 15 (شغل في رأس السهم) مع وجود إشارة واحدة على homolog حذف (رأس السهم مفتوح). (C) تحليل FISH على الدرجة الثانية PWS حذف المريض. وصفت تحقيقات كما في (ب). يظهر GS7484 مجموعة كبيرة من إشارات حمراء على كل من الكروموسومات 15؛ ومع ذلك، فإن homolog مع الأقمار الصناعية البارزة (يسار) ويظهر إشارة أقوى من تلك التي على اليمين. في نوى البيني، GS7484 يظهر إشارات متعددة التهجين حمراء على احد كروموسوم 15 (شغل في رأس السهم) وعدد أقل من إشارات حمراء على homolog حذف (رأس السهم مفتوح). (D) الحفظ التطوري من duplicons في الرئيسات الأخرى. التهجين من GS7484 (أحمر) إلى الكروموسومات الطورية من الشمبانزي (P.troglodytes) يظهر إشارات حمراء متعددة في المنطقة pericentromeric من PTR16 (orthologous لالبشري 15q11-Q13) (الأسهم الكبيرة) وإشارات ضعيفة على PTR16 البعيدة (orthologous إلى القاصي 15q الإنسان ). ويلاحظ وجود إشارة ضعيفة إضافية بالقرب من السنترومير من PTR17 (orthologous إلى HSA16p11.2) (السهم الصغير). (E) التهجين من GS7484 (أحمر) لالطورية الكروموسومات من أكل سرطان البحر المكاك (M.fascicularis) إلى إشارات حمراء متعددة على MFA7 (orthologous إلى HSA15). إشارة صفراء واحدة في شريط الحامض النووي من MFA7 (السهام) إلى المشاركة في تهجين PAC GS158H23 (الأخضر) على نسخة التحقيق واحد يحتوي على UBE3A، مع إشارة حمراء من GS7484. لذلك، هذه المنطقة هي telomeric orthologous إلى HSA15q11-Q13. ويلاحظ إشارتين الحمراء إضافية على جانبي السنترومير من MFA7، المناطق orthologous إلى القاصي 15q. (F) البيني قياسات المسافة FISH من BP2 باستخدام الحيوانات المستنسخة المرافقة فريدة من نوعها. Cosmid 512 (الحمراء)، وGS5022 (الأخضر) تم تهجين لالمتعطشة المصل G نوى 0 / G 1 الليفية (السهام). Cosmid 512 أيضا عبر يهجن مع 16p13.1، وتنتج إشارتين إضافية في كل نواة البيني. من قياسات المسافة البيني، وتقدر المسافة الجينومية أن تكون ~250 كيلوبايت بين هذه التحقيقات اثنين. يمثل شريط 5 ميكرون. (G) البيني قياسات المسافة FISH من BP3 باستخدام الحيوانات المستنسخة المرافقة فريدة من نوعها. تم تهجين GS150L13 (الحمراء)، وGS72P22 (الأخضر) إلى مصل تجويع G 0 / G 1 الليفية نوى (السهام). من قياسات المسافة البيني، وتقدر المسافة الجينومية أن تكون ~500 كيلوبايت بين هذه التحقيقات اثنين. يمثل شريط 5 ميكرون.

الجدول 2

جديد كروموسوم 15q11-Q13 STSS

أحداث الازدواجية الحالية في الرئيسيات غير البشرية

للبدء في تقييم أصل تطوري من الازدواجية الجينومية، تم إجراء تحليل FISH باستخدام GS7484 على الاستعدادات الطورية من اثنين من أنواع القردة الكبيرة الأخرى [الشمبانزي، عموم سكنه الكهوف (PTR)، والغوريلا الغوريلا (GGO)] وقرد العالم القديم [ المكاك أكل سرطان البحر، المكاك fascicularis (MFA)]. وشوهدت إشارات متعددة على المناطق الكروموسومات orthologous على الكروموسومات البشرية 15 و 16 (HSA15 وHSA16) في الشمبانزي (الشكل 2 D)، الغوريلا (لا تظهر البيانات) والمكاك (الشكل 2 E).
في الشمبانزي معظم الإشارات GS7484 هي بالقرب من منطقة pericentric من PTR16، orthologous إلى HSA15q11-Q13 (الشكل 2 D). بالإضافة إلى ذلك، كان ينظر ضعيف عبر التهجين عند القاصي وPTR16q في السنترومير من PTR18، orthologous إلى HSA16p11 (31، 32)، بما يتفق مع الإشارات التي لوحظت في الإنسان (الشكل 2 D). أحد السمات المميزة بين الإنسان وP.troglodytes هي انعكاس pericentric على PTR16 (31 - 33)، الذي يضع أكثر من إشارة من GS7484 في PTR16p11-P12. سيكون من المثير للاهتمام أن يتكهن بأن هذا الحدث انعكاس والتي سهلت هذه duplicons لاحقا إلى الاختلاف في الشمبانزي والإنسان.
في الغوريلا، على التوالي، من المعروف أن الكروموسومات orthologous إلى HSA15 وHSA16، GGO15 وGGO17 أن يكون لها ربط والرسم الكروموسومات نمط مماثل لالبشري (31، 32). وأظهر تحليل FISH في غوريلا باستخدام GS7484 نمط مماثل من التهجين لتلك التي لوحظت في الإنسان (لا تظهر البيانات).
المناطق orthologous بين الإنسان وأكل سرطان البحر المكاك تم التعرف بشكل جيد، على الرغم من بعض الاختلافات موجودة (34). على سبيل المثال، فقد تبين الكروموسوم orthologous إلى HSA15 في المكاك، MFA7، من خلال الكروموسوم اللوحة أن يكون التماثل مع كل HSA14 وHSA15 (34). FISH باستخدام GS7484 وGS158H23، تحقيق السيطرة التي تحتوي على UBE3A (35)، ويظهر تهجين قوي إلى التيلومير MFA7، orthologous إلى HSA15q11-Q13، فضلا عن اثنين من المواقع المقابلة لالقاصي HSA15q (الشكل 2 E). وقد لوحظت اشارات ضعيفة أيضا على MFA20، orthologous إلى HSA16p11، بالإضافة إلى العديد من المواقع الأخرى. وجود نسخ متعددة من GS7484 في المناطق orthologous في M.fascicularis لHSA15q11-Q13 غير موحية أن هذه الأحداث الازدواجية الجينومية قد حدثت قبل ~20-25 مليون سنة، قبل أن الاختلاف في قرود العالم القديم (Cercopithecidae) من عظيم القرود (الأناسيات) (36).

حجم تقدير للduplicon عن طريق تحليل البيني FISH

على الرغم من تعدد STSS قد تم تعيينها إلى كل من BP2 وBP3، لا يمكن تقدير أحجام duplicons من البيانات YAC contig (الشكل 1). لذلك، تم الحصول على التقديرات الأولية حجم كل من BP2 وBP3 بواسطة قياسات المسافة البيني بين تحقيقات المرافقة لكل منطقة نقطة توقف. وبالنسبة للمنطقة BP2، GS5022 وcosmid 512 (c512) (18)، وكلاهما ترتكز على STSS خارج المنطقة تكرار (الشكل 1)، وتهجين لG 0 / G تم قياس 1 نوى الخلايا الليفية المتزامنة والمسافة بين الإشارات التحقيق ( الشكل 2 F). على الرغم من أن c512 عبر يهجن ضعيفة مع 16p13.1، كروموسوم 15 إشارات تم تمييزها بسهولة (الشكل 2 F). وبناء على هذه القياسات، وBP2 تشير التقديرات إلى أن ~250 كيلو بايت في الحجم.

الشكل (3)

STS contentmap من 'contig مركب' من BAC واستنساخ PAC عبر BP2. تحت STSS هي خطوط أفقية تمثل استنساخ الجينوم الفردية (مراكز أنشطة الشباب / البكالوريا / PAC وcosmids). تمثل دائرة شغل في رد فعل PCR إيجابية للSTS على استنساخ اللزوم. ويمثل x تفاعل PCR سلبي ويمثل مربع صغير معبأ في STS المتقدمة من نهاية استنساخ. تمثل المسطر STSS التكنولوجيات السليمة بيئيا / الجينات الموجودة في duplicon.

لتقديم تقدير حجم الحد الأقصى لBP3، GS150L13، ترتكز على الجانب القريب للS931، وGS72P22، وتقع البعيدة لBP3 (الجدول 1 والشكل 1)، كانت تستخدم لتحقيقات المرافقة. أعطى كل BAC إشارة التهجين واحدة على الكروموسومات الطورية العادية وتحليل GS150L13 على PWS المرضى / AS حذف أكد الداني موقع لBP3 (الجدول 1 والبيانات لا تظهر). تظهر البكالوريا اثنين للمشاركة في توطين على الكروموسومات الطورية (لا تظهر البيانات)، ولكن في نوى البيني بشكل واضح يفصل (الشكل 2 G). من هذه القياسات، ويقدر الحد الأقصى لحجم BP3 أن تكون ~500 كيلوبايت. وأشارت هذه القياسات المسافة البيني أن duplicon في BP3 قد يكون ضعف كبير مثل duplicon في BP2. ومع ذلك، لا يمكن استبعاد وجود فجوة بين GS72P22 والنهاية البعيدة من BP3.

البناء وتوصيف BAC / PAC contig عبر BP2

وعلى الرغم من ترسو في contigs YAC لكلا BP2 وBP3، لا يمكن تحديد ترتيب علامات داخل المناطق بالنسبة لبعضها البعض بشكل لا لبس فيه (الشكل 1). لذلك، تم بناء BAC / PAC contig لBP2 إلى غرامة رسم خريطة للduplicons. عروض الأولية للمكتبة BAC 2-3 × أثمرت كبيرة الإفراط في التمثيل من الحيوانات المستنسخة إيجابية لجميع duplifcated STSS تحليلها، بما يتفق مع عدة نسخ من هذه المناطق التواجد داخل الجينوم البشري. تم إجراء رسم الخرائط المحتوى STS باستخدام PCR لتحديد استنساخ متداخلة ونهايات والتسلسل BAC لخلق STSS جديد لإكمال "contig comfposite '(الشكل 3 والجدول 2). كما رأينا من وجود نسخ متعددة من GS7484 بواسطة FISH (الشكل 2 أ)، أي من هذه الحيوانات المستنسخة الفردية يمكن أن تنشأ من BP2، BP3 أو نسخ أخرى من duplicon (الشكل 3 والجدول 2). ووصف الجهود المبذولة لتعيين استنساخ فريد لBP2 أو BP3 على أساس الاختلاف nucle-otide أدناه. حددت ترد في قائمة كاملة من البكالوريا الجديدة، الدوريات وSTSS الجدولين 1 و 2. ويرد الحدود القريبة لBP2 داخل PAC GS5022، حدد باستخدام S18 (الشكل 3)، ويرد الحدود البعيدة داخل BAC GS124B5، حدد باستخدام S17 (الشكل 3). وجود BAC متعددة وPAC إنهاء الراسية STSS إلى مراكز أنشطة الشباب في كلا طرفي BP2 يوفر مستوى عال من الثقة في ترتيب العام للSTSS داخل هذه المنطقة.

تقدير حجم المكرر من duplicon BP2

مع الانتهاء من BAC / PAC contig عبر BP2، يمكن أن يتم تقدير حجم مستقلة عن duplicon استنادا إلى حجم مسار تبليط الحد الأدنى من BAC استنساخ / PAC في جميع أنحاء المنطقة (الجدول 1). عدم تداخل البكالوريا GS179K9 (160 كيلوبايت) وGS253A21 (160 كيلوبايت) تغطية المنطقة BP2 مع ثلاث فجوات (الشكل 3)، وتوفير تقدير حجم الحد الأدنى من 320 كيلو بايت. بالإضافة إلى ذلك، يرد الفجوة بين GS179K9 وGS253A21 داخل PAC استنساخ التسلسل تماما، pDJ778A2 (بنك الجينات انضمام رقم AC004583). حجم 85 كيلو بايت في المنطقة بين MN7 (الموجود داخل GS179K9) وGS253A21-T7، جنبا إلى جنب مع كيلوبايت 320 وتقدر أعلاه، يوفر تقدير حجم الحد الأدنى من duplicon من ~400 كيلوبايت. التقدير البيني FISH (~250 كيلوبايت)، لذلك، من المرجح أن يكون أقل من الواقع من الحجم الحقيقي للduplicon، وربما يعود ذلك إلى خصائص كروموسوم التكثيف بالقرب من منطقة pericentromeric.

الجدول 3

EST / الجينات المحددة للBP2 / BP3

الجدول 4

تباين التسلسل STS

تحليل تسلسل cDNAs الحالي ضمن duplicon

تم تعيين خمسة التكنولوجيات السليمة بيئيا في البداية إلى duplicon (الشكل 3). لتحديد ما إذا كان أي من هذه التكنولوجيات السليمة بيئيا يتوافق مع نفس الجين، استنساخ جزئية كدنا] (800-1400 بي بي)، وهو ما يمثل 3'الغايات من النصوص، تم تحديد استخدام قاعدة بيانات Unigene (37) والتسلسل (الجدول 3). ثم تم إجراء مقارنات BLAST2 على جميع أزواج ممكن من تسلسل للكشف عن أي تداخل. تم العثور على كل تسلسل لتكون فريدة من نوعها مما يشير إلى أن تكون ممثلة أن خمسة جينات مختلفة / الكاذبة من قبل هذه التكنولوجيات السليمة بيئيا.
ثم تم إجراء عمليات البحث BLASTN لتحديد ما إذا كانت هذه متواليات [كدنا جزئية مطابقة أي الجينات المعروفة. تسلسل IMAGE استنساخ 321824، تحتوي على EST A006B10 تحديد MN7 واستنساخ [كدنا KIAA0393 (28)، مما يشير إلى أنها تمثل التكنولوجيات السليمة بيئيا مختلفة لنفس الجين (الجدول 3). ومع ذلك، HERC2، لم يكن التعرف على 15.0 كيلوبايت MN7 التي تحتوي على نص. بحث BLASTN من تسلسل KIAA0393 6.7 كيلوبايت لم تحدد HERC2 (26) ولها RJS الماوس homolog اسمه (27) أو herc2 (26) تشير إلى أن استنساخ 321824 ومحددة لنهاية 3'من KIAA0393. بالإضافة إلى ذلك، استنساخ BAC (CIT987-SKA-17E1؛ بنك الجينات انضمام أي AC002041)، متسلسلة من كروموسوم 16p11.2، تم العثور على احتواء جزء من KIAA0393 (قواعد 59639-87 066)، S15 (قواعد 17449-17773، 94٪ الهوية) وGS7483-T7 (قواعد 36259-36507، هوية 93٪). وجود of~65 كيلوبايت التسلسل الجيني في boththe duplicon 15q11-Q13 والمنطقة pericentromeric من 16p11 يتسق مع البيانات FISH مشيرا إلى ازدواجية GS7484 إلى 16p11.1.
بحث BLASTN من IMAGE استنساخ 511845، تحتوي على تسلسل SHGC15126، حدد جين لم ينشر اسمه MYLE (بنك الجينات انضمام رقم AF108145، قواعد 65-1053، 99٪ الهوية) وS16 (بنك الجينات انضمام رقم AF017568 والقواعد 1-332، 94٪ الهوية). وأشارت البحث BLASTN لمدة ثلاث الحيوانات المستنسخة تمثل SHGC17218، SGC32610 وA008B26 thatthese ثلاثة cDNAs representdifferent، النصوص لم تكن معروفة سابقا (الجدول 3).
تم تحديد التماثل تسلسل عالية لاثنين من جينات إضافية باستخدام تسلسل نهاية الدوريات GS7483 وGS7484 (GS7484-T7 وGS7483-SP6؛ الجدول 3). أظهر GS7484-T7 هوية 90٪ لجين uncharacterized تقع ضمن λ المناعي سلسلة ضوء موضع على 22q11 [بنك الجينات انضمام رقم D88269، قواعد 5515-5644 (38)] مع التماثل إلى EST يمثل BEM-1 / BUD5 suppressor- مثل البروتين (بنك الجينات انضمام رقم AA478019). أظهر GS7483-SP6 هوية 92٪ إلى ATP ملزم مرنا البشري البروتين كاسيت المترجمة إلى كروموسوم 1q42 (بنك الجينات انضمام رقم U18237) (39). سوف تكون هناك حاجة مزيد من توصيف هذه التكنولوجيات السليمة بيئيا / cDNAs لتحديد أي من هذه قد تمثل الجينات الوظيفية. بالإضافة إلى ذلك، سوف تحتاج الأشكال الكشف عن هويته للتمييز تعبير ممكن من الجينات الوظيفية من نسخة duplicon أكثر من واحد.

نسختين من duplicon موجودة في BP3

و'contig مركب' إنشاء عبر BP2 (الشكل 3 لم) لا تسمح التعريب لا لبس فيه من 11 BAC استنساخ / PAC الواردة تماما داخل duplicon. استنساخ فقط GS5022 وGS124B5، على الداني والقاصي حدود BP2، على التوالي، يمكن تعيين فريد (الشكل 3). لتحديد ما إذا كانت موجودة اختلاف تسلسل كافية بين BP2 وBP3 للسماح الخرائط الدقيقة لهذا أخرى 11 استنساخ وتسلسل أربعة STSS (S15، S16، S17 وMN7) قد أنجز على مراكز أنشطة الشباب ترتكز على أي BP2 أو BP3. أظهر جميع STSS أربعة اختلاف تسلسل تتراوح من شهر إلى ستة النيوكليوتيدات في BP2 وBP3 مراكز أنشطة الشباب (جدول 4). وجود اثنين من سلاسل مختلفة داخل BP3 مراكز أنشطة الشباب لمدة ثلاثة STSS (S15، S16 وMN7) اقترح وجود نسختين مختلفة من duplicon في BP3. في دراسات سابقة، تم تحديد اثنين من سلاسل مختلفة لMN7 في yA86C1 وy962D11 (24، 25)؛ ومع ذلك، لم يتم تحديد المسافة بينهما. بالإضافة إلى ذلك، أشارت تسلسل فريدة من S16 موجودة في مراكز أنشطة الشباب y962D11 وy764C6 أن هذه مراكز أنشطة الشباب لم تتداخل مع بعضها البعض، وتوفير مزيد من الأدلة على وجود نسختين من duplicon داخل BP3 (التين 1 و 4).

الرقم 4

STS خريطة المحتوى، بما في ذلك التسلسل STSS، لBP2، BP3A وBP3B. تحت STSS هي الخطوط الأفقية التي تمثل الحيوانات المستنسخة الفردية (مراكز أنشطة الشباب / البكالوريا / PAC وcosmids). تمثل دائرة شغل في رد فعل PCR الإيجابي بين STS واستنساخ أشار ويمثل x تفاعل PCR سلبي. يمثل مربع صغير معبأ في STS المتقدمة من نهاية استنساخ والدوائر مفتوحة واسعة تشير STSS التي تم التسلسل. لاحظ أن واحدا فقط BAC استنساخ (GS179K9) من 'contig مركب' (الشكل 3) ينشأ من المنطقة BP2، في حين أن الحيوانات المستنسخة متعددة تنبع من BP3A وBP3B، بما في ذلك GS119F13، الذي يمتد على نسختين داخل BP3. YAC y93C9 هو استنساخ يظهر لاحتواء BP3 بواسطة FISH (13) وحددت yA86C1 وyA168B8 باستخدام MN7 (24).

فرض غرامة على الخريطة البكالوريا لمناطق معينة BP، والتسلسل واحد على الأقل من أربعة STSS (S15، S16، S17 أو MN7) لجميع BAC / الدوريات (جدول 4). وأظهر هذا التحليل أن استنساخ الوحيد GS179K9 نشأت من BP2، في حين أن 10 الحيوانات المستنسخة الأخرى المعينة لاثنين من مواقع مختلفة داخل المنطقة BP3 (الشكل 4 والجدول 4). على الرغم من أن العديد من مراكز أنشطة الشباب أظهرت وجود نسختين من S15 وMN7 (y962D11، y893H9 وA86C1)، أظهرت BAC / استنساخ PAC نسخة واحدة فقط من أي STS الفردية، مشيرا إلى فصل STSS تكرار لمسافة أكبر من حجم BAC استنساخ واحد. تسلسل S16 S17 وفي GS119F13، استنساخ التي لم تعين BP2، أشار موقع الذي يعبر الحدود بين نسختين من duplicon (الشكل 4). وجود اثنين من سلاسل لS15 وMN7 في BP3 مراكز أنشطة الشباب مع تسلسل واحدة في استنساخ الفردية BAC يؤكد وجود نسختين من duplicon داخل BP3، التي سميناها BP3A وBP3B. الربط بين اثنين BP3 وduplicons بطريقة الرأس إلى الذيل في GS119F13 يدل على المباشر (جنبا إلى جنب) التوجه لBP3A وBP3B.

القسم السابق القسم التالي

مناقشة

حتى وقت قريب، كانت قليلة نسبيا البيانات المتاحة على الآليات الجزيئية المتكررة إعادة ترتيب الكروموسومات الدستورية في البشر. وقد أدت خرائط مفصلة المادية من الكروموسومات البشرية إلى الاعتراف بأهمية منظمة الجينوم أو الهندسة المعمارية في آليات بعض الأمراض الوراثية البشرية (40). وجود انخفاض في عدد النسخ، تسلسل كروموسوم معين DNA المتكررة يوفر فرصة للأحداث إعادة التركيب مثلي مما يؤدي إلى إعادة ترتيب الكروموسومات التي أحيلت إليها باسم "اضطرابات الجينوم" (40)، لتمييزها عن آليات طفرية أكثر شيوعا المرتبطة أكثر الأمراض الوراثية المندلية.
هناك الآن العديد من الأمثلة المتكررة شذوذ الكروموسومات، بما في ذلك الحذف، الازدواجية والعكس، بوساطة نسخ متعددة من عنصر DNA مع التماثل تسلسل عالية. في معظم الأحيان، اختلالها من هذه السلاسل المتجانسة داخل منطقة الكروموسومات يؤدي إلى صرف الانتصافي غير المتكافئ. فإن المنتجات من هذه الأحداث إعادة التركيب مثلي أن يعتمد على: (أ) توجيه العناصر DNA. (ب) نوع الصرف حبلا الحمض النووي. و (ج) ما إذا كانت إعادة ترتيب هي أمور أو داخل الصبغي. عناصر الحمض النووي التي تتوسط هذه إعادة ترتيب قد تكون نسخا من الجينات ذات الصلة أو الخادعة (على سبيل المثال غلوبين)، ويتخلل شيوعا يكرر (على سبيل المثال ألو أو عناصر خط) أو غيرها من نسخة منخفضة يكرر كروموسوم معين (40 - 42).
النموذج الكلاسيكي الآن لتكرار كروموسوم معين التوسط إعادة التركيب مثلي غير المتكافئ هو نوع متلازمة شاركو ماري توث 1A (CMT1A) والاعتلال العصبي وراثي مع المسؤولية ليشل الضغط (HNPP) (43). CMT1A وHNPP نتيجة من الازدواجية وحذف الأحداث متبادلة، على التوالي، التي تنطوي على المنطقة ميغابايت 1.5 على 17p11.2 يحيط بها نسختين من سلسلة تكرار 24 كيلو بايت (CMT1A-REP) مرتبة في التوجه المباشر (43، 44). اختلال بين الصبغيات وعبور أكثر داخل يكرر أثناء الانقسام الاختزالي I تنتج هذه الازدواجية وحذف الأحداث متبادلة. تم نقاط الإيقاف المعينة غرامة لمنطقة 557 نقطة أساس في حدود ممثلين CMT1A تحتوي على منطقة 456 نقطة أساس الهوية تسلسل مثالية. ويعتقد أن هذا يمثل شريحة معالجة فعالة الحد الأدنى، المطلوب لإعادة التركيب مثلي ويقع المجاور للعنصر البحار العابر للposon مثل (45). ومثل من كروموسوم معين انخفاض عدد النسخ يكرر المهيئة لإعادة ترتيب الكروموسومات غير أن نقص المرتبطة X السماك بسبب سلفاتاز الستيرويد (SS). ما يقرب من 90٪ من هؤلاء المرضى لديها 1.9 حذف ميغا بايت على Xp22.3 بوساطة يكرر VNTR مثل المرافقة فترة الحذف ويؤدي إلى الحذف التام من الجين SS (46، 47).
في المقابل، عبور أكثر من تسلسل الحمض النووي المكررة التي هي في التوجه المقلوب يتوسط العكس الصبغي. هناك ثلاثة أمثلة مثل هذه متواليات تكرارها على القاصي XQ الذي توسط العكس وترتبط مع مرض وراثي. في الهيموفيليا A، ~45٪ من الطفرات هي نتيجة لحدث انقلاب تنطوي على نسختين من "الجين A '. يقع نسخة واحدة من هذا الجين في العامل الثامن الجينات، في حين تقع نسختين إضافية ~500 القاصي كيلو بايت في XQ (48). وقد تم اقتراح آلية foldback الاقتران لجزء telomeric من XQ باعتبارها بنية وسيطة التي تبعتها الحدث عبر أكثر من بين اثنين من "جينات A 'نسخ (48). وهذا يخلق انعكاس paracentric، مما يعطل العامل الثامن الجين عن طريق فصل الإكسونات 1-22 من الإكسونات 23-26 (48). وبالمثل، فإن الجينات نقص في متلازمة هنتر، وتعطلت iduronate 2-سلفاتاز (IDS)، في ~13٪ من المرضى بسبب حدث انقلاب paracentric التي تنطوي على IDS الزائفة الجين (IDS-2)، وتقع 20 كيلو بايت البعيدة في المقلوب توجه (49). الجين emerin، المسؤولة عن الحجر-دريفوس ضمور العضلات، ويحيط بها نسختين من تكرار 11.3 كيلوبايت في التوجه المقلوب (50). وقد أدى ذلك إلى تعدد الأشكال عكس الشائع، والذي ~33٪ من الإناث العادية هي متخالف لانقلاب paracentric. أكثر نادرا، وقد تم تحديد الحذف التام من الجين emerin بسبب إعادة ترتيب أكثر تعقيدا في هذه المنطقة (50، 51).
أن الصبغي عبور أكثر من duplicons مقلوب على كروموسوم 15 ويتوقع حدث انقلاب paracentric مماثلة لتلك التي لوحظت على Xq28. ومع أنه لم يتم الإبلاغ عن مثل هذه العكس، سيكون من الصعب للكشف من قبل معيار التحليل الصبغي G النطاقات والبحث المنهجي لأمر مقلوب من علامات الحمض النووي عن طريق FISH قد تكون ضرورية لمعالجة هذه المسألة. في المقابل، فإن الصبغيات عبور أكثر من هذه duplicons مقلوب يتوقع تشكيل الحزب الاتحادي الديمقراطي الجرد (15)، بالإضافة إلى جزء لامركزي، وهناك حاجة إلى الأحداث الصرف حبلا DNA بديلة حتى للتوسط في الحذف الخلالي لوحظ في 15q11-Q13.
سيكون نموذج واحد لحدث حذف الصبغي بين duplicons مقلوب يتطلب foldback أو الجذعية حلقة بنية وسيطة، مع استئصال أو حذف جزء DNA "يحلق خارج 'التدخل. أفضل مثال يتميز هذا النوع من إعادة ترتيب هو V (D) J إعادة التركيب لاحظ مع الغلوبولين المناعي سلسلة الجينات الثقيلة والخفيفة (52). بالإضافة إلى ذلك، تم اقتراح عدة أمثلة على الحذف في الإنسان كما يجري بوساطة هذه الجذعية حلقة وسيطة هيكل. في مقهورة الأحداث سحاف الكلية (NPH)، حذف متماثل من منطقة ~250 كيلوبايت على الصبغي 2q13 هي الآلية الأكثر شيوعا لاحظ تحور. ويحيط هذا الجزء المحذوف من قبل نسختين من ~100 كيلوبايت تكرار منطقة مرتبة في التوجه المقلوب (53). وعموما، أظهرت 80٪ من الحالات الأسرية و 65٪ من حالات متفرقة من NPH وجود الحذف متماثل من هذه المنطقة (53). في فرط كوليسترول الدم العائلي، تم الإبلاغ عن الحذف من مستقبلات LDL في الذي توسط في إعادة ترتيب من قبل عناصر ألو ترتيب التوجه inaninverted (54).
الدعم لإعادة التركيب مثلي الصبغي ساطة بعض الحذف في PWS / AS يأتي من دراستين. في دراسة واحدة، تم تحديد أصل grandparental من الحذف في سبع عائلات PWS باستخدام علامات متعددة الأشكال المرافقة حذف (55). وقد لوحظ إعادة التركيب بين الأليلات الكبرى الوالدي المرافقة موقع الحذف في خمس حالات (موح من الأحداث بين الصبغيات)، ولكن أظهر حالتين لا إعادة التركيب (بما يتفق مع حدث الصبغي) (55). وفي دراسة مماثلة، وتحليل الأصل الكبير الوالدي في تسعة PWS / المرضى AS الحذف أظهر خمس حالات مع إعادة التركيب بين الأليلات grandparental وحالتين من دون إعادة التركيب (9). معا، أربع حالات تتسق مع حدث حذف الصبغي، في حين أن 10 حالة توحي تبادل بين الصبغيات. ومع ذلك، في هذه الحالات 10 الأخيرة، لا يستطيع المرء أن يميز بين الصبغيات وحذف المرتبطة إعادة التركيب من حذف الصبغي بعد إعادة التركيب.
أن آلية الحذف بين الصبغيات كما يتوقع تشكيل المنتج ازدواجية المعاملة بالمثل، كما رأينا مع CMT1A / HNPP (43). وقد لوحظ حالتين من حالات الازدواجية الخلالي على 15q11-Q13 التي تنطوي على BP3، بما يتفق مع هذا التوقع (7). ومع ذلك، كما تم تحديد الازدواجية فراغي التي تنطوي BP4 (9)، مشيرا إلى آليات متعددة إنتاج هذه إعادة ترتيب. ارتفاع وتيرة PWS / AS الحذف [~1 / 10 000 (2، 3)] وندرة الحالات المبلغ عنها من ازدواجية فراغي 15 (59) تشير إلى أن آليات الصبغي قد يكون سبب شائع للحذف من 15q11-Q13. ومع ذلك، وعدم التثبت من الازدواجية 15 حالة قد يسهم أيضا في عدد أقل بكثير من الحالات المبلغ عنها.
حاليا، سبعة جينات / الخادعة، وقد تم تحديد والتي هي موجودة في كل من الداني (BP2) والبعيدة (BP3A / BP3B) المناطق. ثلاثة cDNAs (IMAGE 120151، 241447 و346304) تمثل النصوص غير معروفة، في حين أن اثنين آخرين (IMAGE 321824 و511845) تشبه إلى حد كبير إلى MYLE وتسلسل KIAA0393 مرنا، على التوالي. اثنين PAC ينتهي العرض هوية تسلسل عالية إلى BEM-1 / BUD5 القامع مثل البروتين (GS7484-T7) وATP ملزم البروتين كاسيت (GS7483-SP6)، وتقع على الكروموسومات الأخرى، وربما تمثل الكاذبة في-Q13 15q11 duplicons.
وقد تم تحديد واحد الجينات داخل duplicon وصف HERC2 (26) أو ERY-1 (25). ويرد A006B10 ضمن تسلسل KIAA0393، ونسخة 7.0 كيلوبايت تحتوي على MN7 (28)، ولكن ليس هذا الجين HERC2 (26)، مشيرا إلى أن 7.0 و 15.0 كيلوبايت MN7 التي تحتوي على النصوص قد تمثل المنتجات تقسم بدلا من نفس الجين. وhomolog الماوس لHERC2، يطلق RJS (27) أو herc2 (26)، وقد تم مؤخرا تحديد وخرائط لموقع واحد على الماوس كروموسوم 7 orthologous إلى BP3A (28)، مما يوحي بأن BP3A هو duplicon السلفي في الإنسان. البيانات تسلسل [كدنا جنبا إلى جنب مع تحليل BLASTN جميع STSS يوضح وجود جينات متعددة / الخادعة في هذه duplicons مع وضعهم الوظيفي لم يتحدد بعد.
وقد أظهرت بيانات الخرائط المادي الأخيرة لعدة متلازمات microdeletion لوحظت في الإنسان إشراك قطاعات الجينومية المكررة كبيرة في نقاط التوقف حذف مشتركة (40). وهذا يشمل متلازمة سميث Magenis (SMS) في 17p11.2، ومتلازمة وليامز (WS) في 7q11.2 ومتلازمة دي جورج (DGS) / VELO-القلب والوجه (VCFS) في 22q11.2. وأفضل وصف لهذه هو ~5 حذف ميغابايت المرتبطة SMS. تقع القسيم المركزي إلى المنطقة حذف / الازدواجية CMT1A / HNPP، ويحيط المنطقة الحذف SMS كتبها duplicons وصف-ممثلين SMS (56). وقد وضعت contigs cosmid جزئي عبر-ممثلين SMS، وقدر أن يكون> ​​200 كيلو بايت في حجم (40، 56)، ولكن توجه duplicons غير معروف حاليا (56). أربع جينات، SRP، TRE، KER وCLP، وتقع في كل من الداني والقاصي، ممثلين SMS وتحليل المرضى حذف SMS باستخدام مسبار CLP كدنا] التعرف على مفترق جزء 1.2 ميغابايت الرواية في 29 من 31 مريضا تحليل (56).
ويرتبط بمتلازمة وليامز مع الحذف من 7q11، بما في ذلك الإيلاستين وLIMK1 الجينات، في> 90٪ من المرضى (57 - +59). اثنين من الجينات المكررة، PMS2L وGTF2I، على حد سواء
موجودة في المناطق المحيطة في المنطقة الحذف WS، مما يوحي بأن duplicons يمكن أن تشارك في هذه إعادة ترتيب (60 - +62). تم الكشف عن رواية> 3 ميجا بايت تقاطع جزء في المرضى الذين يعانون حذف WS باستخدام مسبار [كدنا لIB291، وتقع ضمن المناطق المحيطة تكرار (62).
ترتبط اثنين الحذف إما 3.0 أو 1.5 ميجا بايت على 22q11.2 مع DGS / VCFS (63). المنطقة نقطة توقف الداني هو نفسه في كل من الحذف. ومع ذلك، لوحظ اثنين من نقاط التوقف البعيدة مختلفة. وقد حدد التوصيف الأولي لحذف كبير ~300 duplicons كيلوبايت ترتيب جنبا إلى جنب في مواقع إعادة ترتيب والتي تحتوي على ما لا يقل عن خمسة جينات / الخادعة (64). ومن المثير للاهتمام، والزائدين علامة 22 الكروموسومات، لوحظت في متلازمة عين القط، وتنطوي على نفس المناطق نقطة توقف لوحظ في الحذف DGS / VCFS (65)، وربما يشير إلى آلية مماثلة لتشكيل مثل الكروموسومات علامة الزائدين الصغيرة والكبيرة المتأتية من 15q11- Q13 (17).
حقيقة أن هذه المتلازمات microdeletion المشتركة الأربعة كلها تقع على مقربة نسبيا في المنطقة pericentromeric من كروموسوم يثير تساؤلات مثيرة للاهتمام بشأن آلية الازدواجية في هذه القطاعات الجينومية كبيرة. تظهر دلائل على أن المناطق pericentromeric، يقع بالقرب من صفائف قمرا صناعيا للالقسيم، تحتوي على نسخ paralogous من المناطق الكروموسومات تتكرر وtranslocated من مواقع أخرى داخل الجينوم البشري (30). ومن المعروف أن منطقة pericentromeric من كروموسوم 15 لاحتواء نسخ جزئية من الغلوبولين المناعي السلسلة الثقيلة V وشرائح D (66، 67)، الخادعة NF1 (+68 - 70) والخادعة GABRA5 (71). بالإضافة إلى ذلك، في حين أن نسخة واحدة من MN7 موجودة في الماوس، وتقع في منطقة syntenic مع موقع BP3A، نسخ متعددة موجودة في الإنسان بالقرب من المناطق pericentromeric على حد سواء 15q11.2 و16p11.2 (24). وD15S543 الصغرية، يقع البعيدة إلى BP2، هي أيضا موجودة على 16p13، مما يدل على أن الحدث الازدواجية الثاني بين كروموسوم 16 و 15q11.2. وتشير هذه البيانات إلى أن الازدواجية في مناطق الجينوم كبيرة بالقرب من المناطق شبه القسيم المركزي، يمكن أن تخلق عدم الاستقرار الجيني، الذي قد يؤهب لمزيد من إعادة ترتيب الكروموسومات.

القسم السابق القسم التالي

المواد والأساليب

استنساخ الجينومية

مراكز أنشطة الشباب المستخدمة في هذه الدراسة هي مستمدة من CEPH MARKI، CEPH مارك الثاني أو مكتبات سانت لويس وتم تعيينها من قبل STS الكتابة كريستيان وآخرون. (29). وقد تم تحديد YAC yA162B8 باستخدام STS MN7 (24). تم الحصول عليها من مراكز أنشطة الشباب إما كلية بايلور لمركز طب الجينوم (هيوستن، TX)، والمعهد القومي للبحوث الجينوم البشري (NIH في بيثيسدا، MD)، أبحاث علم الوراثة (هانتسفيل، AL) أو CEPH (باريس، فرنسا).
وقد تم تحديد PAC GS5022 عن طريق فحص مكتبة P1 البشري الإجمالية باستخدام STS D15S18 (نظم الجينوم، سانت لويس، MO). وهذه نسخة نشرت من قبل هوانغ وآخرون. (18) كما استنساخ 770c6. تم عزل الدوريات GS7483 وGS7484 من المكتبة P1 نفسها باستخدام STS 368H3L. وقد تم تحديد Cosmid 512 (c512) باستخدام STS S543 كما هو موضح سابقا (18). تم تحديد جميع البكالوريا عن طريق PCR فحص مكتبة BAC الإنسان الإجمالية (نظم الجينوم)، وذلك باستخدام STSS المدرجة في الجدول 1. تم عزل الحمض النووي من الحيوانات المستنسخة الجينومية باستخدام اوتوغن 740 (المتكاملة فصل الأنظمة، ناتيك، MA).تم إجراء التحجيم من الحيوانات المستنسخة BAC / PAC من قبل هضم الحمض النووي 1 ميكروغرام مع عدم I لمدة 3 ساعات ويفصل على 1.0٪ SeaKem GTG agarose هلام (FMC المنتجات الاحيائية، روكلاند، ME) باستخدام جهاز بيو راد الشيف مخطط (بيو راد، هرقل، CA) مع وضع صناعة السيارات في خوارزمية تتراوح 5-300 كيلو بايت في 14 ° C. كانت ملطخة المواد الهلامية مع بروميد إيثيديوم، تصور على UVP GDS8000 نظام التوثيق هلام (UVP، المرتفعات، CA) والأحجام التي يحددها الاستقراء مع علامات حجم المعروفة.

كروموسوم 15 STSS

وقد وضعت STSS جديدة من خلال تسلسل نهايات البكالوريا GS52I3، GS124B5 وGS229K19 والدوريات GS7483 وGS7484 (الجدول 2). لفترة وجيزة، تم عزل BAC DNA باستخدام اوتوغن 740 وتنقيته باستخدام Microcon 100 microconcentrators وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (المركزي Amicon، بيفرلي، MA). استخدمت واحد ميكروجرام من الحمض النووي BAC و 40 بمول من الاشعال في التسلسل مع مجموعة من ردود الفعل ABI بريزم BigDye المنهي دورة التسلسل جاهزة وتحليلها باستخدام ABI 377 المنظم DNA الآلي (النظم البيولوجية التطبيقية، فوستر سيتي، كاليفورنيا). وقد صممت STS الاشعال باستخدام برنامج Primer3 من معهد وايتهيد، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT؛ http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin...rimer3_www.cgi). وقد قدمت سلاسل كاملة لينتهي BAC لبنك الجينات مع الأرقام الانضمام المدرجة في الجدول 2. وقد beendescribed جميع STSS أخرى سابقا (29).

رسم الخرائط المحتوى STS باستخدام PCR

وقد تم تحليل عشرة ردود الفعل ميكروليتر التي تحتوي على 1.0 ميكرولتر بيركن إلمر 10 × العازلة 1200 μMdNTP خلط، 0.5 ميكرومتر التمهيدي، 0.5 U Amplitaq الذهب (بيركن إلمر، فوستر سيتي، كاليفورنيا) و5-25 DNA قالب نانوغرام لكل STS ضد جميع مراكز أنشطة الشباب، والبكالوريا رسم الخرائط الدوريات في هذه المناطق. تم إجراء تحليل PCR وكما هو موضح سابقا (29).

FISH

وتم التحضير كروموسوم من الدم المحيطي أو خطوط الخلايا lymphoblastoid من الضوابط العادية وPWS / AS المرضى حذف باستخدام أساليب القياسية. وبالإضافة إلى ذلك، أدلى الاستعدادات الطورية من خطوط الخلايا lymphoblastoid من الشمبانزي العادي (P.troglodytes) والغوريلا (G.gorilla)، فضلا عن خط الخلية الليفية من المكاك أكل سرطان البحر (M.fascicularis) (GM03446؛ Coriell معهد للبحوث الطبية، كامدن، NJ). وضع العلامات التحقيق، وأجريت تهجين الحمض النووي والكشف عن الأجسام المضادة من استخدام الأساليب المذكورة سابقا (72). وقد تم تحليل الشرائح FISH باستخدام مجهر زايس Axiophot مع مرشحات للكشف عن دابي، FITC ورودامين على حدة وكذلك ممر الموجة مرشح الثلاثي (أي 83000؛ تقنية كروما، براتلبورو، VT) للكشف عن الإشارات في وقت واحد. وقد تم جمع الصور ودمجها باستخدام كاميرا CCD تبريد (KAF 1400؛ Photometrics، توسن) وIP مختبر الطيف (اشارة تحليلات، فيينا، VA) أو المزح البرامج mFISH (Vysis، داونر غروف، IL). وقد تم تحليل لا يقل عن 10 خلايا المرحلة الفوقية لكل التحقيق للتحقق من موقع التحقيق والكشف عن أي التهجين عبر لالكروموسومات الأخرى. D15Z3 (pMC15)، وهو مسبار قمر صناعي للكروموسوم 15 (73)، وأضيف إلى حل التهجين للمساعدة في تحديد الهوية. إذا ظهر التحقيق لإعطاء إشارات متعددة على الصبغي 15، تم فحص نوى البيني إضافية.

البيني قياسات المسافة FISH

لمسافات الجينومية في نطاق 50 كيلو بايت، 2 ميجا بايت، والمسافة الجسدية بين زوج من تحقيقات في الطور البيني (أي البيني المسافة أو ID) يرتبط المسافة الجينومية (74). تم تهجين تحقيقات المسمى مع أي البيوتين أو digoxigenin في أزواج لG 0 / G 1 تم قياس نوى الخلايا الليفية المتزامنة والمسافة بين الإشارات التحقيق باستخدام الأمر طول مقياس الواردة في IP مختبر الطيف حزمة برامج V.3 (اشارة تحليلات). تم معايرة الأمر طول المقياس باستخدام صور من مرحلة ميكرومتر زايس وقيست لا يقل عن 60 مسافات البيني لكل زوج من تحقيقات. وقدرت المسافة الجينومية من منحنى المعايرة ولدت في مختبرنا باستخدام cosmids من 4p16.3، التي كانت تستخدم سابقا لتوليد العلاقة بين المسافة البيني يعني مربع والمسافة الجينومية (75).

التسلسل من الحيوانات المستنسخة الجينومية

استخدمت ردود الفعل PCR باستخدام أربعة STSS (S15، S16، S17 وMN7) لتضخيم DNA من YAC، BAC واستنساخ PAC. أجريت ردود الفعل في 100 ميكرولتر ردود الفعل عن طريق التوسع في الظروف المشار إليها أعلاه. تم تنقية المنتجات PCR باستخدام Microcon 30 أو Microcon 100 مرشحات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (المركزي Amicon). تم معلق العينات إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر، واستخدمت 5 ميكرولتر التصور على 1.0٪ هلام الاغاروز للتحقق من وجود فرقة واحدة. تم quantitated المنتجات PCR ومن ثم التسلسل باستخدام مجموعة من ردود الفعل ABI بريزم BigDye TerminatorCycle التسلسل جاهزة وABI 377 المنظم DNA الآلي (النظم البيولوجية التطبيقية).

التسلسل من الحيوانات المستنسخة كدنا]

تم الحصول على استنساخ الموافق التكنولوجيات السليمة بيئيا SHGC17218 (IMAGE 346304)، SHGC15126 (IMAGE 511845)، SGC32610 (IMAGE 241447)، A006B10 (IMAGE 321824) وA008B26 (IMAGE 120151) من نوع الثقافة مجموعة أمريكا (روكفيل، MD) أو أبحاث علم الوراثة ( صيد فيل، AL). تم عزل الحمض النووي من 3 مل الثقافات من الحيوانات المستنسخة [كدنا 241447 و321824 باستخدام اوتوغن 740 في الحجم الكلي لل50 ميكرولتر. كان DNA النقي وتتركز باستخدام Microcon 100 مرشحات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (المركزي Amicon). واستخدمت aliquots من 1.5 ميكرولتر من التركيز DNA و 40 بمول من T3 أو T7 التمهيدي لتسلسل كل نهاية استنساخ باستخدام مجموعة من ردود الفعل ABI بريزم BigDye المنهي دورة التسلسل جاهزة وABI 377 الآلية المنظم DNA. تحليل تسلسل باستخدام Sequencher 3.1 (رموز الجينات، آن أربور، MI) لم يشر إلى التداخل في تسلسل، لذلك تم تصميم الاشعال جديدة لنهاية 3'من تسلسل باستخدام برنامج Primer3 من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. تم إجراء جولة ثانية من التسلسل وأكد Sequencher 3.1 التحليل الانتهاء من تمرير تسلسل واحد. تم تنفيذ واحد تمريرة التسلسل على استنساخ 120151، 346304 و511845 من مصدر تجاري (SeqWright، هيوستن، TX).

القسم السابق القسم التالي

شكر وتقدير

ونود أن نشكر جولي Kuc للحصول على المساعدة الفنية للخبراء. تم تزويد cosmids 4p16.3 بسخاء من قبل B. Traskand M. ماكدونالدز. وأيد هذا العمل في جزء من منحة HD36111 المعاهد الوطنية للصحة.

القسم السابق القسم التالي

ملاحظات

• الاختصارات: الاختصارات
  مثل متلازمة أنجلمان BAC كروموسوم اصطناعي البكتيرية BP توقف أسهم دبي للذهب متلازمة دي جورج EST أعرب العلامة تسلسل FISH مضان في الموقع التهجين IDS iduronate 2-سلفاتاز NPH سحاف الكلية PAC المستمدة P1 كروموسوم اصطناعي PWS متلازمة برادر ويلي RFLP تقييد طول القطعة تعدد الأشكال رسالة قصيرة متلازمة سميث Magenis SS سلفاتاز الستيرويد STS تسلسل موقع الموسومة VCFS VELO-القلب والوجه متلازمة WS متلازمة ويليامز YAC الخميرة كروموسوم اصطناعي.

• © 1999 مطبعة جامعة أكسفورد

القسم السابق

المراجع

• 1. ↵
  • يدبيتر DH،
  • Ballabio A.،
  • Scriver CR،
  • Beaudet AL،
  • خبيث WS،
  • فالي D.

  والأيضية والجزيئية أسس ورثت مرض. المجلد. 1. نيويورك، NY: ماكجرو هيل، 1995. علم الوراثة الخلوية الجزيئية من المتلازمات الجينية متجاورة: الآليات والنتائج المترتبة على اختلال التوازن جرعة الجينات. ص 811 - 839.
  منحة جوجل
• 2. ↵
  • نيكولز RD،
  • Saitoh S.،
  • Horsthemke B.

  يطبع في برادر ويلي والمتلازمات Angelman. اتجاهات جينيه. 1998؛ 14: 194 - +200.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 3. ↵
  • جيانغ Y.،
  • تساي TF،
  • Bressler J.،
  • Beaudet AL

  يطبع في Angelman والمتلازمات-برادر ويلي. داء. أوبان. جينيه. ديف. 1998؛ 8: 334 - 342.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 4. ↵
  • ويب T.

  الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي (15) الكروموسومات علامة الزائدين. J. ميد. جينيه. 1994؛ 31: 585 - 591.
  مجانا النص الكامل
• 5. ↵
  • بيتيجرو AL،
  • Gollin SM،
  • غرينبرغ F.،
  • ريكاردي VM،
  • يدبيتر DH

  ازدواجية القريبة 15q كسبب لمتلازمة برادر ويلي. آم. J. ميد. جينيه 1987؛ 28: 791-802.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 6.
  • كلايتون سميث J.،
  • ويب T.،
  • تشنغ SJ،
  • Pembrey ME،
  • مالكولم S.

  ازدواج كروموسوم 15 في المنطقة 15q11-13 في المريض مع تأخر في النمو وترنح مع التشابه لمتلازمة الرجل الملاك. J. ميد. جينيه 1993؛ 30: 529-531.
  الملخص / الحرة النص الكامل
• 7. ↵
  • ريبيتو GM،
  • الأبيض LM،
  • بدر PJ،
  • جونسون D.،
  • الربوة JH

  الازدواجية فراغي من كروموسوم المنطقة 15q11q13: توصيف السريرية والجزيئية صباحا. J. ميد. جينيه عام 1998؛ 79: 82-89.
  CROSSREF ميدلاين الباحث العلمي من Google
• 8.
  • براون CE،
  • دينيس NR،
  • ماهر E.،
  • FL طويلة،
  • نيكلسون JC،
  • Sillibourne J.،
  • حلاق JC

  الازدواجية الخلالي الموروثة من الأقرب 15q: الارتباط الوراثي، النمط الظاهري صباحا. J. هوم. جينيه 1997؛ 61: 1342-1352.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 9. ↵
  • روبنسون WP،
  • Dutly F.،
  • نيكولز RD،
  • برناسكوني F.،
  • Penaherrera M.،
  • ميخاليس RC،
  • Abeliovich D.،
  • Schinzel AA

  آليات تشارك في تشكيل eletions والازدواجية في 15q11-Q13. J. ميد. جينيه عام 1998؛ 35: 130-136.
  الملخص / الحرة النص الكامل
• 10. ↵
  • Schinzel AA،
  • Brecevic L.،
  • برناسكوني F.،
  • BINKERT F.،
  • Berthet F.،
  • Wuilloud A.،
  • روبنسون WP

  triplication الصبغي من 15q11-Q13. J. ميد. جينيه 1994؛ 31: 798-803.
  الملخص / الحرة النص الكامل
• 11. ↵
  • FL طويلة،
  • Duckett DP،
  • Billam LJ،
  • وليامز DK،
  • Crolla JA

  Triplication من 15q11-Q13 مع الحزب الاتحادي الديمقراطي الجرد (15) في الأنثى مع تأخر في النمو. J. ميد. جينيه. 1998؛ 35: 425 - 428.
  الملخص / الحرة النص الكامل
• 12. ↵
  • الربوة JH،
  • نيكولز RD،
  • Magenis RE،
  • جلات K.،
  • غراهام JM الابن،
  • كابلان L.،
  • لند M.

  متلازمة أنجلمان: ثلاث فئات الجزيئية حددت مع علامات الصبغي DNA 15q11q13 محددة. J. همهمة. جينيه. 1990؛ 47: 149 - 155.
  منحة جوجل
• 13. ↵
  • Kuwano A.،
  • Mutirangura A.،
  • ديتريتش B.،
  • Buiting K.،
  • Horsthemke B.،
  • Saitoh S.،
  • Niikawa N.،
  • يدبيتر SA،
  • غرينبرغ F.،
  • Chinault AC،
  • يدبيتر DH

  تشريح الجزيئي للبرادر ويلي / Angelman المنطقة متلازمة (15q11-13) من خلال YAC الاستنساخ وتحليل FISH. همهمة. مول. جينيه. 1992؛ 1: 417 - 425.
  الملخص / الحرة النص الكامل
• 14. ↵
  • Mutirangura A.،
  • جاياكومار A.،
  • ساتكليف JS،
  • ناكاو M.،
  • ماكيني MJ،
  • Buiting K.،
  • Horsthemke B.،
  • Beaudet AL،
  • Chinault AC،
  • يدبيتر DH

  A contig YAC الكامل للويلي برادر / Angelman المنطقة كروموسوم (15q11-Q13) وتوطين المكرر من الجين SNRPN. جينوم 1993؛ 18: 546 - 552.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 15. ↵
  • كريستيان SL،
  • روبنسون WP،
  • هوانغ B.،
  • Mutirangura A.،
  • خط MR،
  • ناكاو M.،
  • Surti U.،
  • Chakravarti A.،
  • يدبيتر DH

  التوصيف الجزيئي للمنطقتين حذف نقطة الداني في كل من برادر ويلي ومرضى متلازمة أنجلمان. آم. J. هوم. جينيه. 1995؛ 57: +40 - 48.
  ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 16. ↵
  • وليانا كوكس J.،
  • جنكينز L.،
  • بالمر CG،
  • بلاتنر R.،
  • شيبارد L.،
  • Flejter WL،
  • Zackowski J.،
  • تسين F.،
  • شوارتز S.

  التحليل الوراثي الخلوي الجزيئي للإستثمار الحزب الاتحادي الديمقراطي (15) الكروموسومات، وذلك باستخدام تحقيقات محددة ل-ويلي برادر / Angelman المنطقة متلازمة: الآثار السريرية. آم. J. هوم. جينيه. 1994؛ 54: 748 - 756.
  ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 17. ↵
  • Crolla JA،
  • هارفي JF،
  • Sitch FL،
  • دينيس NR

  علامة الزائدين 15 الكروموسومات: نهج السريرية، الجزيئي وFISH إلى التشخيص والتشخيص. همهمة. جينيه. 1995؛ 95: 161 - 170.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 18. ↵
  • هوانغ B.،
  • Crolla JA،
  • كريستيان SL،
  • ولف ليدبيتر ME،
  • ماشا ME،
  • Papenhausen PN،
  • يدبيتر DH

  التوصيف الجزيئي المكرر من نقاط التوقف في الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي (صغيرة 15) الكروموسومات. همهمة. جينيه. 1997؛ 99: 7 - 11.
  منحة جوجل
• 19. ↵
  • Wandstrat AE،
  • وليانا كوكس J.،
  • جنكينز L.،
  • شوارتز S.

  دليل الوراثي الخلوي الجزيئي لنقطة مشتركة في أكبر الازدواجية مقلوب ofchromosome 15. آم. J. هوم. جينيه. 1998؛ 62: 925 - 936.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 20. ↵
  • Flejter WL،
  • بينيت بكر PE،
  • Ghaziuddin M.،
  • ماكدونالدز م،
  • شيلدون S.،
  • غورسكي JL

  التحليل الوراثي الخلوي والجزيئي من الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي (15) الكروموسومات لاحظت في اثنين من المرضى الذين يعانون من اضطراب التوحد والتخلف العقلي. آم. J. ميد. جينيه. 1996؛ 61: 182 - 187.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 21. ↵
  • كوك EH الابن،
  • يندغرين V.،
  • يفينثال BL،
  • Courchesne R.،
  • لينكولن A.،
  • شولمان C.،
  • اللورد جيم،
  • Courchesne E.

  التوحد أو مرض التوحد شاذة في أمهات لكن ليس مشتقا أبويا القريبة 15q الازدواجية. آم. J. هوم. جينيه. 1997؛ 60: 928 - 934.
  ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 22. ↵
  • دونلون TA،
  • لند M.،
  • ايمان A.،
  • برونز G.،
  • لات SA

  عزل تحقيقات الجزيئية المرتبطة عدم الاستقرار الصبغي 15 في متلازمة برادر ويلي. بروك. Natl أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 1986؛ 83: 4408 - 4412.
  الملخص / الحرة النص الكامل
• 23. ↵
  • Tantravahi U.،
  • نيكولز RD،
  • STROH H.،
  • المسابقة S.،
  • نفيه RL،
  • كابلان L.،
  • وارتون R.،
  • ورستر هيل D.،
  • غراهام JM الابن،
  • كانتو ES،
  • فرياس JL،
  • Kousseff BG،
  • لات SA

  معايرة الكمية واستخدام مجسات DNA للتحقيق في حالات الشذوذ الصبغي في متلازمة برادر ويلي. آم. J. ميد. جينيه. 1989؛ 33: 78 - +87.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
• 24. ↵
  • Buiting K.،
  • Greger V.،
  • براونستين BH،
  • موهر RM،
  • فويكوليسكو أولا،
  • Winterpacht A.،
  • تسابل B.،
  • Horsthemke B.

  عائلة الجينات المفترضة في 15q11-13 و16p11.2: الآثار المحتملة لبرادر ويلي والمتلازمات Angelman. بروك. Natl أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 1992؛ 89: في مصر 5457 مكتبا - 5461.
  الملخص / الحرة النص الكامل
• 25. ↵
  • Buiting K.،
  • الإجمالي S.،
  • جي Y.،
  • Senger G.،
  • نيكولز RD،
  • Horsthemke B

  . نسخ المعلنة للMN7 (D15F37) خريطة الجينات الأسرة على مقربة من نقاط التوقف حذف مشتركة في برادر ويلي / المتلازمات Angelman. Cytogenet. خلية جينيه. 1998؛ 81: 247 - 253.
  CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من