#1  
قديم 10-14-2015, 04:24 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي متلازمة أنجلمان: استعراض الجوانب السريرية والجينية

 

http://jmg.bmj.com/content/40/2/87.full




متلازمة أنجلمان (AS) هو اضطراب النمو العصبي تتميز صعوبات تعلم شديدة، وترنح، واضطراب الحجز مع EEG مميزة، ملامح الوجه تشوه خفية، وسعيد، والتصرف مؤنس. معظم الأطفال الموجودين مع تأخير في المعالم التنموية وتباطؤ النمو في الرأس خلال السنة الأولى من الحياة. في معظم الحالات الكلام لا تتطور. المرضى الذين يعانون من AS يكون النمط الظاهري السلوكية مميزة مع الحركات متشنج، والضحك المتكرر وغير مناسب في بعض الأحيان، حب من الماء، واضطراب النوم. ملامح الوجه خفية وتشمل نطاق واسع، يبتسم الفم والذقن البارز وعميقة تعيين العينين. وهو ناتج عن مجموعة متنوعة من التشوهات الجينية التي تنطوي على المنطقة كروموسوم 15q11-13، الذي يخضع ليطبع الجينوم. وتشمل هذه الحذف الأمهات، disomy أحد الأبوين الأب، وعيوب الطباعة، والطفرات نقطة أو الحذف صغيرة داخل الجين UBE3A، التي تقع في هذه المنطقة. يظهر UBE3A يطبع الأنسجة محددة، يجري التعبير عنه حصرا من أليل الأمهات في الدماغ. تم العثور على الآليات الوراثية التي تم تحديدها حتى الآن في AS في 85-90٪ من أولئك الذين لديهم النمط الظاهري السريرية وجميع تتداخل مع UBE3A التعبير.
في عام 1965، هاري Angelman، وهو طبيب أطفال الإنجليزية، حسبما ذكرت والنتائج السريرية في ثلاثة أطفال مع ميزات مشابهة لصعوبات التعلم الشديدة، رنحية والحركات متشنج، وعدم القدرة على الكلام، وسهولة أثار الضحك. الثلاثة جميعهم نوبات الصرع مع ظهور EEG مميزة وملامح الوجه تشوه خفية. 1 هذا الشرط، في الأصل المعروف باسم متلازمة "دمية سعيدة"، ومن المعروف الآن بمصطلح أقل تحقير من متلازمة أنجلمان. على مدى 20 عاما وذلك بالنظر في اضطراب نادر، وعلى الرغم من وقوع الأسر التي لديها sibs المتضررة اقترح المسببات المرضية الوراثية، يمكن أن يكون في البداية تحديد أي سبب معروف. في عام 1987 Magenis آخرون 2 حدد حذف من كروموسوم 15q11-13 في اثنين من المرضى الذين يعانون من متلازمة أنجلمان والأعمال اللاحقة أثبتت أن متلازمة أنجلمان يمكن أن تسببها مجموعة متنوعة من الآليات الوراثية التي تنطوي على هذه المنطقة مطبوع من الجينوم. كل من هذه الآليات تؤثر على التعبير الأمهات من الجينات UBE3A التي تقع في موضع 15q11-13. 3 وفي السنوات الأخيرة أدى ترسيم أكثر وضوحا من النمط الظاهري السريرية لمتلازمة أنجلمان وتحسين الاختبارات التشخيصية لتحسين الاعتراف حالة وقوع Angelman ويقدر الآن متلازمة ما بين 1 في 10 000 و 1 في 40 000. 4- 7
دراسات من السمات المعرفية والسلوكية المحددة المرتبطة AS 8 تحسنت واضطراب الاستيلاء إدارة الحالة وتوفير نظرة ثاقبة في التوقعات على المدى الطويل للمرضى المتضررين. وقد بدأت الدراسات الجينية الجزيئية لتوضيح دور الجينات في المنطقة 15q11-13 في الفيزيولوجيا المرضية لمتلازمة أنجلمان 9 وألقت الضوء على ظاهرة أعم من يطبع الجينومية. 10 ومراجعة المظاهر السريرية، والتاريخ الطبيعي، والتيار إدارة الحالة وتلخص الآليات الوراثية المعقدة المطروحة.
المظاهر السريرية:

المرضى الأصلي أوردته Angelman 1 زيارتها عن العجز الشديد التعلم، ونوبات الصرع، وترنح، والكلام غائبا، وملامح الوجه تشوه مع ذقن بارزة وعميقة تعيين العينين والفم واسعة مع جاحظ اللسان، وصغر الرأس مع قفا شقة. كانت ناقصة الصباغ هم أيضا مع الشعر الأبيض والعيون الزرقاء (الشكل 1). على الرغم من أن العديد من المرضى الذين يعانون من AS يكون لهذه الخصائص، 11 هو عليه الآن واضحا أن الطيف السريري من متلازمة أنجلمان هو أوسع بكثير مما كان يعتقد أصلا. المصطبغة عادة العديد من المرضى وبعضها محيط الرأس الطبيعي. المضبوطات غير موجودة في كل حالة، وربما تكون بعض الكلام الحالي. بعض المرضى قد لا يكون سحنة تشوه مميزة ويكون الحد الأدنى ترنح. العديد من المرضى الذين يعانون من AS قادرين على الكلام، وعلى الرغم من أن الكلام هو دائما محدودة. الميزات السلوكية ينظر في AS ولعل ميزة السريرية أكثر اتساقا. فمن الضروري، بالتالي، أن يكون هناك مؤشر واسعة من الشك السريري في الطفل مع النمط الظاهري السلوكي للحالة كما هو موضح أدناه. ويرد موجز من السمات الرئيسية السريرية وتردداتها في الجدول 1.

الجدول 1
الخصائص السريرية الرئيسية للAS


الشكل 1
(A) AS المريض مع 15q11-13. (B) AS المريض مع disomy أحد الأبوين. (C) AS المريض مع عيب يطبع. (D) AS المريض مع الطفرة UBE3A.

الخصائص السلوكية

الخصائص السلوكية للAS لافتة للنظر وهذه هي التي غالبا الأطباء الفوري للنظر في التشخيص. كانت موجودة في جميع المرضى بغض النظر عن نوع من الشذوذ الجيني. تبدأ نوبة من الضحك أثار بسهولة في غضون الأسابيع القليلة الأولى من الحياة وتقريبا جميع المرضى سعداء وابتسامة في كثير من الأحيان. وعادة ما أثارت الضحك، ولكن التحفيز في كثير من الأحيان الحد الأدنى والضحك يمكن أن تكون غير لائقة. فرط الحركة واضطراب النوم شائعة في مرحلة الطفولة، ويمكن أن تثير مشاكل الإدارية الرئيسية. يمكن تحسين اضطراب النوم عن طريق العلاج السلوكي مع التمسك نظام صارم وقت النوم واستخدام الميلاتونين، وهو فعال في حوالي 50٪ من المرضى. 12 الناس مع Angelman المياه متلازمة الحب ولها سحر لالسطوح العاكسة للمواد البلاستيكية والبالونات. انهم يتمتعون يجري في الشركة من الآخرين، ومشاهدة التلفزيون، وخاصة الفكاهة تهريجية. مع التقدم في مرحلة البلوغ يصبح السلوك زيادات أكثر هدوءا وتركيز العمر. التصرف مؤنس لا تزال قائمة وقد تحدث نوبة من الضحك. وقد أظهرت بعض الكبار الميل إلى السلوك العدواني، وخاصة إذا بالاحباط بسبب صعوبة الاتصالات.

COMMUNICATION SKILLS وSELF HELP

صعوبات في الاتصالات هي سمة بارزة من سمات متلازمة أنجلمان. 13 كلام لا تتطور والأكثر AS المرضى الذين لديهم مفردات سوى اثنين أو ثلاث كلمات. 14 معظم المرضى سوف يكون قادرا على فهم أوامر بسيطة في إطار روتين حياتهم اليومية. وهناك أقلية يمكن الاتصال باستخدام لغة الإشارة الرسمية مثل ماكتون أو نظام الاتصالات تبادل الصور (PECS). آخرون استخدام الإيماءات للتواصل. وكانت بعض المرضى قادرين على استخدام أجهزة الاتصالات المدمجة (على سبيل المثال، شركة دينافوكس) إلى تأثير جيد واكتساب مهارات الاتصال غالبا ما يكون أسهل مع تقدم المرضى من كبار السن ويحسن القدرة على التركيز. صعوبات في التواصل يمكن أن يؤدي إلى الإحباط. الكلام موجود في عدد قليل من المرضى (انظر النمط الظاهري / النمط الجيني الارتباط)، ولكن حتى هذه سوف يجدون صعوبة في فهم الأوامر المعقدة وعدم وجود القدرة على التفكير المجرد.
تختلف مهارات المساعدة الذاتية في متلازمة أنجلمان. معظم المرضى تعلم المشي والتواصل يحب ويكره. ويمكن أن تجعل الخيارات، على سبيل المثال، فيما يتعلق الطعام الذي يأكلونه والملابس التي يرتدينها. هناك حاجة لمساعدة مع خلع الملابس والاستحمام، وعلى الرغم من تعريتها أسهل. التدريب على استعمال المرحاض هو ممكن، وحوالي ثلث المرضى سوف تكون جافة بعد يوم، وأقل ليلا. يمكن للناس مع AS تتغذى عادة أنفسهم باستخدام أواني الأساسية. كلها تتطلب الإشراف وأنها لا تملك الإحساس بالخطر. على الرغم من المرضى غير قادرين على العيش بصورة مستقلة، وكثير ديك نوعية جيدة من الحياة مع وجود شبه مستقلة مع جولة إشراف على مدار الساعة.

المميزات العصبية ANGELMAN SYNDROME

كل AS المرضى لديهم تخلف عقلي شديد والمعالم السيارات تأخر. يجلسون غير معتمد في حوالي 12 شهرا، والزحف (نمط الكوماندوز) أو خلط السفلي في 18-24 شهرا، والسير في متوسط ​​العمر 4 سنوات (المدى 18 شهرا إلى 7 سنوات). 5 ومشية بطيئة، وقاسية الأرجل، و رنحي وتربى في أحضان وعقدت استعرضوا في المعصمين والمرفقين. ترفرف اليد هو شائع عند المشي، وإذا متحمس. العضلات غير طبيعي مع نقص التوتر جذعي وفرط في الأطراف وردود الفعل هي سريعة. يحدث الجنف الصدري في ما يقرب من 10٪ من الأطفال، ولكن مشكلة رئيسية في معظم المرضى البالغين. قد تحتاج إلى علاج العظام عن طريق العلاج الطبيعي أو تستعد وعلى الرغم من أن هذه قد تكون كافية لحل الجنف في بعض المرضى، في المرضى الآخرين التشوه هو تقدمي ومطلوب لعملية جراحية. كثير من المرضى الذين يعانون من AS يكون الحركات متشنج وهزة منفصلة من الأصابع بسبب رمع عضلي القشرية. وتفاقمت هذه الظاهرة بسبب الإجهاد وأكثر وضوحا لدى البالغين، وبعضهم وضع زيادة الزلزال.

المضبوطات في ANGELMAN SYNDROME

تحدث نوبات الصرع في 80٪ من المرضى. العمر عند بداية يتراوح بين سنة وخمس سنوات. العرض الأولي لمرض الصرع هو مع التشنجات الحموية في سن الطفولة. 15، 16 في مرحلة الطفولة مجموعة متنوعة من نوبات يمكن ملاحظتها، بدءا من النوبات التوترية الارتجاجية، الغياب شاذة ومعقدة الجزئي، الرمع العضلي، واهن، والمضبوطات منشط لحالة صرعية. قد يحدث أيضا حالة الغياب ووضع رمعية. وأشارت تقارير سابقة تردد تقليل من نوبات الصرع مع التقدم في السن، 5، 17، 18 ولكن كذلك متابعة أظهرت أنه على الرغم من أن تكون هناك فترة هادئة نسبيا خلال مرحلة الطفولة المتأخرة والمراهقة، وعدد كبير من البالغين لديهم نوبات الصرع، الغياب شاذة ولا سيما أو المضبوطات الرمع العضلي. 19 والصرع من متلازمة أنجلمان هو من الصعب السيطرة عليها بالأدوية المضادة للصرع، وخاصة في مرحلة الطفولة. الأدوية الأكثر فعالية هي فالبروات الصوديوم كعلاج وحيد أو بالاشتراك مع كلونازيبام أو غيرها من البنزوديازيبينات. كاربامازيبين له أحيانا أثر سلبي. 19، 20 في البالغين، الفينوباربيتون فعال أيضا. تجربة مع العقاقير المضادة للصرع أحدث محدودة للغاية.

النتائج EEG في متلازمة أنجلمان

هناك أنماط EEG محددة في AS المرضى التي تظهر في عزلة أو في مجموعات مختلفة. وهي تشبه في المرضى الذين يعانون من نوبات ودون حد سواء. 20، 21 في مرحلة الطفولة أنماط مميزة الثلاثة هي (1) استمرار الإيقاعية 4-6 / ق النشاط تصل إلى أكثر من 200 μV، لا ترتبط مع النعاس، (2) أشواط طويلة من الإيقاعي (ثلاثي الأطوار) 2-3 / ق النشاط مع اتساع 200-500 μV، القصوى فوق المناطق الأمامية ويخلط عادة مع المسامير أو موجات حادة، و (3) المسامير مختلطة مع 3-4 / ق المكونات، عادة أكثر من 200 μV أساسا الخلف ويسرتها أو ينظر إليها فقط على إغلاق العين. في المرضى الذين يعانون أكثر من 10 سنة من العمر إيقاع خلفية أبطأ من المعتاد. قد يكون هناك طفرات التنسيق والنشاط دلتا ثلاثي الأطوار متقطع أو مستمر (الشكل 2)، القصوى فوق المناطق الأمامية. 15 ليست هناك علاقة بين نتائج EEG ونوبة من الضحك ينظر في AS. الميزات EEG هي محددة لAS، وهي ميزة التشخيص الهامة. للأسف، قد لا يكون دائما ينظر إلى هذه العناصر الثلاثة في نفس تسجيل EEG ويمكن أن تحدث في أوقات مختلفة في نفس المريض. 15، 18، 22 وبالتالي يستحق تكرار EEG إذا كان يشتبه في تشخيص AS بقوة ولكن المظاهر التقليدية لا ينظر في البداية.

الرقم 2
EEG Angelman مميزة. arrowed ثلاثي الأطوار دلتا موجة النشاط.

متلازمة أنجلمان في البالغين

النمط الظاهري من متلازمة أنجلمان هو واحد المتطور الذي يتغير مع التقدم في مرحلة البلوغ (الشكل 3). يحدث البلوغ في الوقت الاصلي وهناك الخصائص الجنسية الثانوية العادية. هي أكثر وضوحا خصائص الوجه عند البالغين المصابين فقم الفك السفلي ملحوظ، وأشار الذقن، شدق، وشفة السفلية البارزة. 17، 19، 23، 24 عيون يبدو تعيين أكثر عمقا وعند بعض المرضى القرنية المخروطية (بسبب فرك العين) لوحظ. التنقل النقصان بسبب فرط أطرافهم، وتطوير الجنف الصدري، وعدم الرغبة في المشي. 19 يعاني بعض المرضى من التقلصات وتلك مع انخفاض ترنح التنقل هو أقل وضوحا. كثير من المرضى يصابون قد يحدث ارتداد يعانون من السمنة المفرطة والمريء ويمكن أن تكون شديدة. وعلى الرغم من هذه المشاكل والحفاظ على نوعية جيدة من الحياة حتى سن البلوغ وليس تخفيض غالبية المرضى عمر إلى حد كبير.

الشكل (3)
ملامح الوجه من متلازمة أنجلمان في البالغين الصغار.

جينات ANGELMAN SYNDROME

هناك أربع آليات وراثية الرئيسية التي تعرف الآن أن تسبب متلازمة أنجلمان وAS تم تقسيم المرضى إلى فئات من الأول إلى الرابع على أساس هذه الآليات. 3 مجموعة أخرى من المرضى، والطبقة V المعينة، ويكون المظاهر السريرية لAS لكن لا راثي خلوي إثباته أو الشذوذ الجزيئي للكروموسوم 15q11-13. ويرد موجز لمختلف الآليات الوراثية وتردداتها في الجدول 2 ويرد تمثيل شكلي للمنطقة 15q11-13 في التين 4.

الجدول 2
الآليات الوراثية مما يؤدي إلى متلازمة أنجلمان


الرقم 4
و/ المنطقة برادر ويلي Angelman على الصبغي 15q11-13 الذي يمتد 4 ميجا بايت. وتتمثل نقاط التوقف المشتركة بخطوط متقطعة. وصفت الجينات مطبوع أبويا في الجينات الزرقاء ومطبوع أمهات باللون الوردي. تلك المصورة في الأبيض لا يعرف أن يكون مطبوع. مركز يطبع (IC) هو الثنائي. الجزء القسيم المركزي هو المسؤول عن الأب لمفتاح بصمة الأم والحذف في هذا الجزء السبب AS. لمزيد من التفاصيل انظر النص.

الآلية الوراثية شيوعا مما أدى إلى متلازمة أنجلمان، وتحدث في حوالي 70-75٪ من المرضى، هو الحذف الخلالي من كروموسوم 15q11-13. غالبية الحذف ذات حجم مماثل، ما يقرب من 4 ميغابايت، ومع نقاط التوقف المشتركة. ويعتقد أنها تحدث بسبب عبور غير المتكافئ بين أكثر من يكرر نسخة منخفضة (duplicons) داخل المنطقة 15q11-13. 25 وduplicons تحتوي على نسخة من هذا الجين HERC2، جين الحفظ جدا والتي عند تحور في الفئران، ويؤثر على التنمية والخصوبة . 26 وتحدث معظم الحذف دي نوفو وهي من أصل الأمهات، وعلى النقيض من 15q11-13 الحذف لوحظت في متلازمة برادر ويلي والتي هي من أصل أبوي. 27 ويمكن الكشف عن الحذف المشتركة من خلال تحليل FISH وعن طريق تحليل الحامض من SNRPN (صغير ببتيد بروتين نووي ريبوزي النووي N) المروج الذي يقع داخل جزيرة الدليل السياسي الشامل في 15q11-13. في وجود الحذف الأمهات فقط الأب، ونمط unmethylated يكون كشفها. 28 نادرا، المرضى الذين يعانون AS سيكون له حذف مختلفة الحجم، وغالبا بالتعاون مع النبات أو كروموسوم غير متوازن إعادة ترتيب. 29، 30 ومن المهم أن نميز هذا مجموعة من المرضى كما يجب على الأم أن تحمل نفس الصبغي إعادة ترتيب، وبالتالي تكون معرضة للخطر من وجود المزيد من الأطفال مع AS. تم الإبلاغ عن العديد من المرضى الذين كان الجرد الحزب الاتحادي الديمقراطي الزائدين (15) الحالي بالإضافة إلى الحذف من جديد من 15q11-13. 31 وقد افترض أن وجود مثل هذه علامة يهيئ ل15q11-13 الحذف. ولذلك ينبغي إجراء تحليل وراثي خلوي وتحليل FISH لاستبعاد النبات خفي على الناس من مع AS حيث طلب الأسر المعنية الاستشارة الوراثية.
الدرجة الثانية من AS المرضى، والطبقة الثانية، disomy أحد الأبوين (UPD) لكروموسوم 15، وبالتالي تفشل في وراثة نسخة الأمهات من UBE3A. وUPD عادة ما يكون لكروموسوم كامل وروبنسون وآخرون 32 درسوا في التفاصيل والآليات التي تنشأ فيها، وخلصت إلى أنه في معظم الحالات الخطأ هو تال للزيجوت، على الرغم من أن ثبت بعض الحالات أن تنشأ من خلال الانتصافي عدم انفصال. الأعمار الأم والأب من المرضى الذين يعانون من UPD هي أعلى بكثير من عامة السكان. 33 ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن أعلى معدل لعدم انفصال في المرضى حيث نشأت UPD بسبب خطأ الانتصافي، ولكن الآلية التي أثارت الأب عمر يساهم في ازدواجية تال للزيجوت من كروموسوم 15 هو واضح. في بعض الحالات UPD (15) ينشأ في رابطة مع النبات روبرتسوني أو النبات المتبادل التي تنطوي على كروموسوم 15. 34، 35 وقوع disomy أحد الأبوين متقطع وحسابات فقط 2-3٪ من حالات AS.
الطبقة الثالثة المرضى هم دون حذف أو محدث، ولكن مع الشاذ كروموسوم 15 مثيلة، مما يدل على وجود خلل في يطبع. حساب عيوب يطبع لمدة 3-5٪ من المرضى الذين يعانون من AS. هذه هي العملية التي جينية وضع علامات على الكروموسومات يحدث في سلالة الجرثومية، بحيث أنها تحتفظ ذاكرة أصلهم الوالدين. 10 Buiting وآخرون 36 حدد مركز يطبع داخل كروموسوم 15q11-13 الذي ينظم هيكل لونين، الحامض النووي، و التعبير الجيني من خلال عناصر التمثيل رابطة الدول المستقلة. هذا المركز يطبع (IC) لديها بنية ثنائية. يظهر جزء واحد أن يشارك في التحول بصمة الأب إلى بصمة الأمهات أثناء عملية تكوين الأمشاج، في حين أن الجزء الآخر هو المسؤول عن الأب إلى التبديل الأمهات. حوالي 50٪ من المرضى يعانون من عيوب يطبع لديها طفرة تعريفية داخل مركز يطبع، ولكن في بقية المرضى لا يمكن تحديد الطفرات. ومن المعتقد التي هي سبب في هذه المجموعة الأخيرة يطبع العيوب الأحداث ما قبل أو تال للزيجوت عفوية. 37 تقرير صدر مؤخرا عن كوكس وآخرون 38 واقترحت أن حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى قد تكون آلية التي تتعارض مع إنشاء بصمة الأمهات في بويضة وبالتالي قد يؤهب لمتلازمة أنجلمان. من بين مجموعة من المرضى حيث تم الكشف عن الحذف مركز يطبع، وهناك العديد من الحالات الأسرية. حيث لم يتم تحديد الطفرات، كما هي عادة حدوث متفرقة. استثناء هي عائلة حيث كان موضوعات المتضررة والأمهات تتأثر انعكاس كروموسوم تحت المجهري في مركز يطبع. 39 للآباء الأطفال الذين يعانون من عيوب يطبع الذين يرغبون في مواصلة اختبارات ما قبل الولادة أثناء فترة الحمل في المستقبل، جلين وآخرون 40 أظهر هذا التحليل مثيلة في SNRPN موضع الحمض النووي المستخرج من زغابة المشيمي أو amniocytes سيعطي نتيجة موثوقة. كما تم افترض أن بعض المرضى الذين يعانون من المظاهر السريرية شاذة قد تكون فسيفساء لعيب مركز يطبع. 41 هذه المجموعة من المرضى غالبا ما تكون موجودة مع نقص التوتر والسمنة، وفي بعض الحالات من متلازمة برادر ويلي ومتلازمة لا Angelman التي يشتبه في البداية .
المرضى الذين يعانون من الدرجة الرابعة هم أولئك الذين ثبت لديهم طفرات في ترميز الجينات البروتين بتحول يغاز، UBE3A. 42، 43 ويمكن تحديد الطفرات في 20٪ من المرضى متفرقة مع الحامض العادي وحوالي 75٪ من المرضى العائلي. 44، 45 هو مطبوع الجين UBE3A في الدماغ ويشفر يغاز البروتين بتحول والتي يعتقد أنها تلعب دورا في ubiquitination من البروتينات في الدماغ، وهي العملية التي يصادف تلك البروتينات الموجهة للتدهور. 46 ويعبر عنه في الغالب داخل الحصين والخلايا العصبية لل يظهر المخيخ ويطبع محددة الأنسجة، يجري التعبير عنه فقط من أليل الأمهات في الدماغ ولكن مع التعبير biallelic في مكان آخر. 47 الفئران من نقص في Ube3a الأمهات لديهم ضعف المهارات الحركية والتعلم المكاني وعرض قراءات EEG غير طبيعية من منطقة قرن آمون. 48 وهناك عدة ركائز لUBE3A، ولكن تلك التي تلعب دورا حاسما في الفيزيولوجيا المرضية لAS لا يزال يتعين تحديدها. 9 يتكون الجين UBE3A 16 الإكسونات مع الترميز المنطقة من الإكسونات 8-16. تم العثور على الطفرات نقطة في جميع أنحاء الترميز المنطقة بأسرها مع مجموعات في الإكسونات 9 و 16، وهذه الأخيرة التي تحتوي على نطاق وكان الحاخام هيشت الحفظ جدا. الشق الحفاز بين اثنين من فصوص المجال وكان الحاخام هيشت هو الموقع العديد من الطفرات عنها. 49 فحص المنطقة الترميز بواسطة SSCP تليها التسلسل المباشر هو وسيلة موثوقة نسبيا للكشف عن الطفرات. وقد تم تحديد انزياح الإطار، هراء، ولصق موقع الطفرات. كما تم الإبلاغ عن بعض الطفرات مغلطة. على الرغم من أنه من الصعب أن تكون على يقين فيما يتعلق بالحالة المرضية لهذه التغييرات الأخيرة، يجب على المرء أن يكون على درجة عالية من الشك حيث وقعت هذه من جديد أو تم الموروثة من الأم. كما تم تحديد العديد من الأشكال المشتركة داخل الجين UBE3A. حيث تم تحديد الطفرات UBE3A، يمكن تحليل الحمض النووي الأبوية لتحديد إذا كانت الأم تحمل نفس الطفرة. ويبدو أن معظم الطفرات تحدث دي نوفو وتشير تجربتنا أنه فقط حوالي 20٪ من الأمهات سيحمل نفس الطفرة. هناك، ومع ذلك، العديد من العائلات التي ذكرت حيث كان أمهات أكثر من الطفل المصاب على الرغم من زيارتها تحليل UBE3A سلبي، ومن المرجح أن يكون الفسيفساء الغدد التناسلية هؤلاء الأمهات. لهذا السبب، ينبغي أن تقدم جميع أمهات الأطفال الذين يعانون من الطفرات UBE3A اختبارات ما قبل الولادة في حالات الحمل المستقبلية. باستثناء عدد قليل من الطفرات التي تم العثور عليها في المريض أكثر من واحد، أكثر فريدة من نوعها. وأخيرا، وإن كان نادرا، برجر وآخرون 50 أفاد المريض مع حذف 570 سنة مضت من UBE3A الذي كان العائلية وتم الكشف من خلال فقدان أليلية في الصغرية مواضع. وهذا النوع من الشذوذ لم يكن للكشف على UBE3A التسلسل.
لا تزال هناك بعض المرضى الذين يعانون من النمط الظاهري السريرية للAS حيث لم يتم التعرف على كروموسوم 15 شذوذ ويتم تعيين هؤلاء المرضى فئة V. على الرغم من أن بعض أزعم أن هؤلاء المرضى يجب أن يكون التشخيص بديلة، تجربتنا الخاصة، وذلك من جماعات أخرى لها خبرة سريرية كبيرة من AS، تشير إلى أن المرضى فئة V موجودة. 8 هذه المجموعة هو، ومع ذلك، من المحتمل أن تكون غير متجانسة وتشمل المرضى الذين يعانون من اضطرابات أخرى. 51- 58 بعض التشخيصات التي يجب استبعادها في هذه المجموعة هي متلازمة ريت، 59، 60 متلازمة التخلف العقلي-الثلاسيميا في α، 61 والحالة التي وصفها موات وآخرون، والذي يعرف الآن أن تكون نتيجة الحذف كبيرة الحجم أو الطفرات نقطة في الجينات على الكروموسوم ZFHX1B 2. 62، 63 تشخيص AS يمكن أيضا النظر في الأطفال الذين يعانون من أعراض مجمعات أوسع، مثل الشلل الدماغي، متلازمة لينوكس غاستو، أو اضطرابات الميتوكوندريا. 15 ، 22، 64 ويليامز وآخرون 65 تلخيص العديد من الظروف التي تحاكي متلازمة أنجلمان ويعطى قائمة شاملة في الجدول 3.

الجدول 3
AS: التشخيص التفريقي

وتشمل تفسيرات أخرى لوجود هذه المجموعة إمكانية تحور UBE3A داخل منطقة غير الترميز أو طفرة داخل جين آخر في مسار بتحول والذي يؤثر UBE3A التعبير. ولم يتم تحديد أي طفرات حتى الآن داخل المنطقة 3 'الرئيسية للUBE3A وليس هناك أي تقارير توثق حتى الآن التعبير عن UBE3A داخل الدماغ للمرضى الدرجة V. وهناك نسخة من العقاقير UBE3A 66 ولكن يتم التعبير عن هذا أبويا وغير معروفة الطفرات في هذا الجين للمشاركة في التسبب في AS. ومن بين المرشحين المحتملين، ومع ذلك، هو جين ATP10C 67 والذي يقع في حدود 200 كيلو بايت من UBE3A ولقد ثبت أن مطبوع للأمهات في الدماغ. حتى الآن، لم يتم تحديد أي طفرات داخل ATP10C في البشر.

COUNSELLING الوراثية

معقد الاستشارة الوراثية في الأسر AS بالنظر إلى تشكيلة واسعة من الآليات الوراثية التي يمكن أن تعطي كل ارتفاع لهذا الشرط. فمن المستحسن أن التحقيق التشخيص يجب أن تبدأ مع 15q11-13 تحليل الحامض، وهي غير مكلفة نسبيا، وسوف يكون غير طبيعي في أغلب الحالات من AS. يمكن للمرء ثم الانتقال إلى اختبارات أخرى لتوضيح آلية جينية محددة المعنيين أو للكشف عن الطفرات UBE3A في المرضى الذين يعانون من ميزات موحية السريرية، EEG، والحامض الطبيعي. وأظهرت خوارزمية للاختبار الجيني في الشكل 5. مخاطر تكرار في AS سيعتمد على آلية الوراثية المعنية وحول ما إذا كان يتم عرض على الأم أن تحمل الشذوذ الجيني لل15q11-13. للمرضى الذين يعانون من جديد الحذف من 15q11-13 وdisomy أحد الأبوين، ومخاطر تكرار منخفضة، وإن كان هناك واحد الإصابة المبلغ عنها من تكرار نظرا لاحتمال الاصباغ الغدد التناسلية. 68، 69 أين هي المعنية الطفرات مركز يطبع والطفرات UBE3A، فإن الوضع تعقيدا من مستويات عالية من الاصباغ الغدد التناسلية التي يبدو أنها موجودة في أمهات. 70، 71 وفي هذه الحالات، حتى إذا كانت الأم اختبارات السلبية لطفرة المحددة في طفل لا يزال هناك خطر ملموس من تكرار بسبب الاصباغ الغدد التناسلية وينبغي أن تقدم اختبارات ما قبل الولادة. إذا كانت الأم تحمل نفس الطفرة، من خطر تكرار هو 50٪. تم الإبلاغ عن تكرار ضمن عائلات المرضى فئة V والاستشارة الوراثية يحتاج لتعكس هذا. ومن المرجح أن تشمل بعض المرضى الذين يعانون من اضطرابات المتنحية X مرتبط أو مقهورة هذه المجموعة. في بعض العائلات وعرضت التشخيص قبل الولادة عن طريق تحديد المفردات الجنين أثناء الحمل في المستقبل لتحديد ما إذا كان الجنين قد ورث نفس الصبغي الأمهات 15 الحلقه الطفل المصاب. ومع ذلك، وهذا لا يمكن إلا أن عرضت في الأسر حيث التشخيص السريري للAS آمن جدا وينبغي بذل الآباء يدرك تماما من القيود المفروضة على هذا النوع من التجارب. 69، 72

الرقم 5
خوارزمية بسيطة لاختبار وراثي في ​​متلازمة أنجلمان.

النمط الظاهري / النمط الجيني CORRELATION

وقد ساعد ترسيم آليات وراثية مختلفة مما أدى إلى AS لشرح بعض الاختلافات المظهرية بين مجموعات المرضى (الشكل 1). 8، 41، 72- 76 فقد تبين، على سبيل المثال، أن المرضى الذين يعانون من كروموسوم 15 الحذف هم في عموما الأكثر تأثرا شديدا. لديهم نسبة أعلى من المضبوطات، وصغر الرأس، ونقص التصبغ، وزيادة تأخير في المراحل الحركية، والكلام غائبا. ويعتقد الميزات أشد أن يكون نتيجة لhaploinsufficiency لعدد من الجينات داخل المنطقة 15q11-13. ميناسيان وآخرون 20 واقترح أن الصرع الحاد الذي تشهده AS المرضى الذين يعانون من الحذف هو نتيجة لعدم وجود نسخة واحدة من جينات مستقبلات GABA. موضع لP الجين الذي تورط في النوع الثاني من المهق عيني جلدي يكمن أيضا في هذه المنطقة. 77 وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن AS المرضى الحذف مع نقص التصبغ يكون في كثير من الأحيان طفرة من P الجينات على الكروموسومات نديد المتبقية 78، 79 وبعض المرضى لديهم نتائج العين مميزة من المهق مع misrouting من ألياف العصب البصري في chiasm البصرية. 80 المرضى الذين يعانون من disomy أحد الأبوين من كروموسوم 15 ديهم تدني نسبة المضبوطات، وصغر الرأس، ونقص التصبغ. العديد من هؤلاء المرضى قادرين أن أقول بضع كلمات والمعلمات نموها هي أيضا أكبر من مجموعة الحذف، ويجري في النصف العلوي من المعدل الطبيعي في كثير من الأحيان. ميزات تشوه أقل وضوحا في هذه المجموعة، على الرغم من أن الخصائص السلوكية هي نموذجية تماما. AS الموضوعات مع يطبع العيوب هي اقل عرضة لصغر الرأس، نقص التصبغ، أو المضبوطات، ومرة ​​أخرى، هم أكثر قدرة من مجموعة الحذف مع أقل تأخير في المراحل الحركية ومهارات التواصل أفضل. نمو أفضل مما كانت عليه في المرضى الحذف والسمنة شائعة نسبيا ضمن هذه المجموعة. قدرات المرضى الذين يعانون من الطفرات UBE3A تقع في مكان ما بين تلك المجموعة الحذف ومجموعة UPD. لديهم في كثير من الأحيان المضبوطات وصغر الرأس ولكن لم يتم ناقصة الصباغ ويكون أفضل المهارات الحركية والاتصالات من المجموعة الحذف. Lossie آخرون 8 أشار إلى أن هذه المجموعة لديها عالية التردد لا سيما من السمنة كما يتقدمون في السن.
وأخيرا، أكثر اعتدالا AS تم الإبلاغ عن الظواهر في المرضى الذين يعانون من عيوب يطبع ناقصة أو الاصباغ. Gillessen-Kaesbach وآخرون 41 وصف النمط الظاهري السريرية في سبعة AS المرضى الذين قدموا في البداية مع ملامح متلازمة برادر ويلي ولكن لم يظهر لاحقا أن يكون لها نمط مثيلة كروموسوم 15 وذلك تمشيا مع AS. هؤلاء المرضى قدم مع نقص التوتر، والسمنة، ودرجة أخف من التخلف العقلي. وأظهر تحليل الحامض في بعض من هؤلاء المرضى نمط شاذة مع وجود فرقة الأمهات باهتة. تكين وآخرون 81 وأفادت أيضا المريض بمظاهر سريرية أكثر اعتدالا من AS الذين ثبت لديها الاصباغ لحذف 15q11-13، الذي كان يمكن كشفها في مضان التهجين في الموقع ولكن أين كان تحليل الحامض ثبت العادية.

MANAGEMENT OF ANGELMAN SYNDROME

إدارة AS تدور حول العلاجات المناسبة لمشاكل جسدية وعصبية واجه في هذه الحالة وتوفير لتلبية الاحتياجات التعليمية الخاصة، نظرا لغاية محددة الملامح المعرفية والسمات السلوكية للحالة. في بعض الحالات AS المرضى لديهم دورات خضعوا لعلاجات مكثفة مماثلة لتعليم موصل التي نفذت في العديد من الأطفال المصابين بالشلل الدماغي. في حين أن بعض الأطفال يخضعون لهذا النوع من العلاج قد أظهرت تحسنا على المدى القصير، على سبيل المثال، في التنقل والاتصالات، 82 لا توجد بيانات حتى الآن تشير إلى أن هذا سوف نقدم الفائدة طويلة الأجل في متلازمة أنجلمان. وهناك أدلة من الآباء والأمهات، وإن كان القولية، ان التدليك والروائح يمكن أن تحسن فرط النشاط والتركيز. اقترحت دراسة بريطانية أن AS تظهر الناس في حاجة إلى التعزيز المستمر لمهاراتهم إذا لم تكن لتفقد لهم. علاج الصرع في AS غالبا ما تكون صعبة، وخاصة في السنوات الأولى، 15، 83 وينبغي التماس المشورة من طبيب أعصاب الأطفال. يمكن أن المضبوطات تتخذ أشكالا عديدة وأخذ مقطع فيديو قصير من المضبوطات المشتبه تظهر للأعصاب مفيد. AS الأطفال لديهم مشاكل التنموية العالمية، ولكن المشكلة أكثر وضوحا هو مع اكتساب اللغة. لا توجد طريقة التواصل واحد يعمل بشكل أفضل في AS ذلك ينبغي بذل كل محاولة لإيجاد نظام الاتصالات الذي يعمل لحساب فرد AS الطفل. لا تزال هناك بعض الأطفال الذين جدا مهارات التواصل مهما المدخلات التي يتلقونها من الآباء والمعالجين محدودة. AS الأطفال لديهم مهارات اجتماعية جيدة نسبيا وتناسب بشكل جيد مع الآخرين ضمن أقرانهم في نفس المجال.يمكن الكامنة الفضول والطفولة فرط النشاط غالبا ما تثير مشاكل الإدارة، واضطراب النوم هي واحدة من أهم القضايا لآباء الأطفال الصغار. العديد من السلوكيات المشكلة المرتبطة حالة يمكن تحسينها من خلال اتباع نهج ثابت، مع مساعدة من المعالج السلوكي إذا لزم الأمر. في البالغين، مع ظهور مؤخرا من مشاكل سلوكية ينبغي النظر في إمكانية ارتداد المريء.

الموارد متلازمة أنجلمان

وقد تم تجميع كمية كبيرة من المعرفة على مدى السنوات ال 10 الماضية حول المظاهر السريرية، والتاريخ الطبيعي، والآليات الجينية التي تساهم في متلازمة أنجلمان. كما تم إجراء دراسات للحالة من قبل مجموعة متنوعة من المهنيين العاملين في إدارة المرضى الذين يعانون من AS. العديد من البلدان في جميع أنحاء العالم الآن لديها مجموعات الدعم لذوي AS وأسرهم، وهذه المجموعات قد أنتجت كمية كبيرة من المعلومات عن مختلف جوانب الوضع ويكون في كثير من الحالات كان فعالا في الجمع بين الوالدين والمهنيين العاملين في مجال رعاية AS الناس . منظمة مظلة دولية موجودة الآن (www.iaso.com) ويمكن أن توجه الآباء والمهنيين لمجموعة متنوعة من AS الموارد والمعلومات حول مواطن الفرد AS المجموعات. ASSERT، فريق الدعم UK، لديها خط هاتف مجاني للآباء والأمهات وخط المساعدة المهنية.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #2  
قديم 10-19-2015, 11:47 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Angelman النمط الظاهري متلازمة المرتبطة الطفرات في MECP2، ترميز الجين البروتين الميثيل الدليل السياسي الشامل ملزم

 

http://jmg.bmj.com/content/38/4/224.full

https://translate.googleusercontent....XA0_cde2z8zshQ


ملخص

متلازمة أنجلمان (AS) هو اضطراب النمو العصبي تتميز التخلف العقلي الشديد، والكلام غائبا، وترنح، ومؤنس تؤثر، وملامح الوجه تشوه. خمسة وثمانين في المئة من المرضى الذين يعانون من AS لديها شذوذ وراثية محددة من الكروموسوم 15q11-13. ترتبط طفرات في X تم تحديدها MECP2 الجينات في المرضى الذين يعانون من متلازمة ريت (RTT)، وهو اضطراب النمو العصبي الذي يصيب الإناث على وجه الحصر تقريبا والتي تشترك التداخل المظهري مع AS. عادة ما يرتبط RTT مع التطور الطبيعي في مرحلة الطفولة يليه فقدان المهارات المكتسبة وتطور مميزة حركات اليد نفرك وحلقات فرط.
وقد فحص فريق من 25 امرأة و 22 مرضى من الذكور مع التشخيص السريري للAS وأي خلل الجزيئي لل15q11-13 للطفرات MECP2 وحددت هذه في أربع إناث وذكر واحد. بعد التشخيص، كان من الممكن أن تثير تاريخ من الانحدار في ثلاثة من هؤلاء المرضى، الذين بحلول ذلك الوقت كانت تظهر ملامح توحي متلازمة ريت. في الموضوعين المتبقية كان لا يزال يعتبر النمط الظاهري الإكلينيكي يمكن أن تكون مثل Angelman.
وتوضح هذه النتائج التداخل المظهري بين شرطين وتشير إلى أن الكشف عن الطفرات MECP2 ينبغي النظر في AS المرضى دون شذوذ الجزيئية أو وراثي خلوي واضح من 15q11-13. منذ الطفرات MECP2 يحدث دائما تقريبا من جديد، وتحديد هويتهم تؤثر بشكل كبير الاستشارة الوراثية للعائلات المعنية.
متلازمة أنجلمان (AS) هو اضطراب النمو العصبي تتميز التخلف العقلي الشديد وعدم القدرة على الكلام، وترنح، وملامح الوجه تشوه، واضطراب الاستيلاء المرتبطة مع ظهور EEG مميزة. 1 2 المواد المتضررة لديها النمط الظاهري السلوكية محدد؛ انهم سعداء ومؤنس مع ميل إلى نوبات من الضحك الناجم عن الحد الأدنى من الاستفزاز. الميزات تشوه خفية المرتبطة AS تشمل تعيين العيون العميقة، واسعة، يبتسم الفم، والذقن البارز. محيط الرأس عادة طبيعي عند الولادة ولكن يتباطأ نمو الرأس أثناء السنوات الأولى من الحياة و 30٪ من المواد تصبح صغر الرأس. 3 4 معظم حالات AS متفرقة، على الرغم من أن تم الإبلاغ عن العديد من الحالات الأسرية. وقد وصفت مجموعة متنوعة من آليات وراثية مختلفة تنطوي على كروموسوم 15q11-13، وهي منطقة معروفة مطبوع، بالتعاون مع AS. 5 ما يقرب من 70٪ من المرضى لديهم من جديد حذف الأمهات من كروموسوم 15q11-13، في حين أن 3٪ disomy الأب أحد الأبوين لكروموسوم 15. في 5٪ من الحالات هناك الميراث متحدر من والدين من كروموسوم 15، ولكن كل من الكروموسومات لديهم نمط التعبير الأب نظرا لالمعيبة يطبع من 15q11-13. أخيرا، حوالي 5٪ من المرضى الذين لديهم فقدان وظيفة الطفرات في الجين UBE3A، ترميز الجينات E6-AP، ويغاز البروتين بتحول. كل نتيجة في نقص في البروتين E6-AP، التي تشارك في عملية ubiquitination. 6 تظل هناك مجموعة من حوالي 15٪ من المرضى AS، سواء متفرقة والعائلية، ومنهم من أي خلل وراثي خلوي أو الجزيئية التي تنطوي على كروموسوم 15q11- 13 يمكن تحديدها. هناك القليل من البيانات توثيق الخصائص السريرية لهذه الفئة من المرضى. 7 ملاحظاتنا الخاصة تشير إلى أن المرضى الذين شخصت إصابتهم AS على أسس سريرية وحدها مزيد من التأخير المحرك، هم أكثر عرضة لبعض الكلام، وأقل عرضة للإصابة المضبوطات و مميزة التغييرات متلازمة EEG Angelman. في حين قد يكون هذه المجموعة الطفرات التي تؤثر على التعبير UBE3A التي لا يمكن تعريفها، لا يزال هناك احتمال أن AS غير متجانسة مع الآخر، والأسباب مجهولة حتى الآن.
متلازمة ريت (RTT) هو اضطراب والتي ينظر إليها على وجه الحصر تقريبا في الإناث. 8 كلاسيكيا، ويتميز هذا التطور الطبيعي ل12-18 شهرا الأولى تليها انحسار النمو وفقدان المهارات المكتسبة، وخصوصا حركة اليد هادفة. العديد من الفتيات تطوير خاصية "غسل اليدين" أو "اليد نفرك" stereotypies وأنماط التنفس بشكل غير طبيعي مع فترات من فرط وانقطاع النفس. الموضوعات مع RTT كثيرا ما تأخر في النمو مع صغر الرأس المكتسبة والصغيرة والقدمين الباردة. بعد فترة من الانحدار والمهارات هضبة ثم هناك عادة تدهور تدريجي مع زيادة إعاقة للجهاز العصبي على مدى سنوات عديدة. وقد وصفت الطيف السريري واسعة من متلازمة ريت من قبل وان آخرون 9 ويشمل أكثر اعتدالا "FORMES frustes" و "البديل خلقي" شديد حيث لا يوجد فترة من التطور الطبيعي. 10 ويتسبب RTT عن طفرات في MECP2 الجين X مرتبطة . 11 هذا بترميز الميثيل الدليل السياسي الشامل البروتين 2، الذي يربط dinucleotides الدليل السياسي الشامل واحد في جميع أنحاء الجينوم ويتفاعل مع مجمع deacetylase هيستون للتوسط القمع النسخي ملزمة. في الماوس، وأعرب عن mecp2 غاية في الدماغ ويبدو أن أهمية عن تمايز الخلايا الجنينية. 12
AS وRTT تظهر تداخل المظهري، كما أشار شيفر وآخرون 13 في عام 1990. وترتبط كل من يعانون من تخلف عقلي شديد، صغر الرأس المكتسبة، وترنح، والمضبوطات، وحركات اليد النمطية. والسمة المميزة الرئيسية هي القصة السريرية كما لا يضطر المرضى لفترة العادية الأولى للتنمية أو فترة متميزة من الانحدار. تاريخ نموذجي في وقت مبكر من الانحدار غير موجود في كل مريض RTT وأنه يمكن أن يكون من الصعب الحصول على. نحن التحقيق في احتمال التي قد تنجم عن خلل في MECP2 AS مع أي خلل يمكن كشفها من 15q11-13 في الواقع.
المرضى والطرق

تم عرض الحمض النووي المستخرج من الخلايا الليمفاوية من 47 مريضا مع التشخيص السريري من متلازمة أنجلمان لكن أي خلل وراثي خلوي أو الجزيئي لل15q11-13 للطفرات في الجين MECP2. كل من هؤلاء المرضى استوفت المعايير التشخيصية توافق في الآراء بشأن متلازمة أنجلمان على النحو المنصوص عليه من قبل ويليامز وآخرون. 14 تم تضخيم مائة نانوغرام DNA من كل مريض باستخدام أزواج التمهيدي التي نشرتها عمير وآخرون، 11 التي تمتد ثلاثة الإكسونات وتغطية المنطقة الترميز من الجين. تمت معالجة كل عينة من خلال 30 دورات من التضخيم تتكون من دقيقة واحدة على 94 ° C (تمسخ)، دقيقة واحدة على 55 ° C (الصلب)، ودقيقة واحدة على 72 ° C (التمديد). وكانت الخطوة تمديد النهائية 10 دقيقة. تم تنفيذ SSCP / تحليل مضاعف متغاير باستخدام كميات متساوية من الناتج PCR والفورماميد صبغ التحميل. تم تشغيل المواد الهلامية في 350 V بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية والفضة ملطخة وفقا لبروتوكولات القياسية. تم فحصها لالمهاجرة بشكل غير طبيعي العصابات التي كانت ثم التسلسل مباشرة باستخدام ABI بريزم صبغ المنهي عدة دورة التسلسل (بيركن إلمر، قسم العلوم البيولوجية التطبيقية، وارينغتون، المملكة المتحدة). وتمت مقارنة النتائج إلى تسلسل مرجعية لMECP2 (البنك الوراثي الانضمام لا X99686.) الطفرات التي تم إنشاؤها أو تأكدت تقييد مواقع ألغى عن طريق تحليل انزيم تقييد الحمض النووي الجيني باستخدام أنزيمات المناسبة. كانت مجزأة منتجات تقييد الهضم عن طريق الكهربائي والمنتجات تصور تحت تضوء UV بعد بروميد إيثيديوم تلطيخ.

النتائج

وقد تم تحديد الطفرات داخل MECP2 في أربعة من 25 إناث واحدة من 22 ذكور فحص. وتتلخص تفاصيل السريرية لهؤلاء المرضى في الجدول 1 وترد تفاصيل الطفرات المحددة في الجدول 2.

الجدول 1
المظاهر السريرية للمرضى الذين يعانون من الطفرات MECP2


الجدول 2
الطفرات MECP2 المحددة في المرضى 1-5

المريض 1 (الشكل 1 و) فتاة. كان هناك قلق حول التنمية العامة لها في السنة الأولى من الحياة كما كانت طفلة بالنعاس وتأخر يجلس حتى 12 شهرا من العمر. وقالت انها المضبوطات الحموية في 6 أشهر وكان يشتبه التهاب السحايا. انها وضعت خمس كلمات التعبير لكنه خسر هذه خلال السنة الثانية من العمر. لها فهم على ما يبدو أفضل من خطابها التعبيري. كان لديها محيط الرأس صغير مع قفا شقة والذقن البارز. ابتسمت في كثير من الأحيان. وقالت انها هزة يستريح والحركات الطوعية متشنج ولكن لا نفرك باليد أو فرط. وكانت ساقيها شرسة مع تشوه حنف القدم واحد.

الشكل 1
(A) 1 المريض يبلغ من العمر 4 سنوات و (B) في سن ال 6 سنوات.

أظهر EEG 03/02 هرتز بطء النشاط موجة في المناطق الزمنية، المركزية، والخلفية وبعض الميزات غير محددة أخرى. وقدم التشخيص السريري من متلازمة أنجلمان. وأظهر تحليل المنطقة 15q11-13 كما هو موضح أعلاه أي شذوذ ولكن أظهر تحليل MECP2 زوج حذف 44 قاعدة داخل اكسون 3 من الجينات التي لم تكن موجودة في أي من الوالدين.
المريض 2 عرضها على طبيب الأمراض العصبية لدى الأطفال في سن 3 سنوات مع تأخر في النمو الشديد والترنح. وقالت إنها تغذي المشاكل وهو رضيع، وقد تم التحقيق لعدم تزدهر في 8 أشهر. جلست في 7 أشهر، وتعتبر والديها أن التنمية لها كانت طبيعية حتى ذلك الوقت. وقالت إنها لم تكن قادرة على الزحف أو المشي. وأشارت إلى أن الهزة التي تحمل أدلة على ترنح. وكانت صغر الرأس مع قفا شقة والذقن البارز ومرول في كثير من الأحيان. وكانت قد وضعت أبدا الكلام أو كان المضبوطات ولكن تم الإبلاغ عن النوم EEG أن يكون غير طبيعي. واقترح تشخيص متلازمة أنجلمان. في سن 6 سنوات، وقالت انها وضعت الجنف. وتابعت أن الحركات مرتجف ولكن لم يكن لديها اليد نفرك stereotypies أو فرط، وكان بعض استخدام اليد هادفة. كان التحليل الجزيئي للكروموسوم 15q11-13 طبيعي ولكن أظهر تحليل MECP2 على C لG الانتقال في موقف النوكليوتيدات 376 مما تسبب في إحلال أرجينين لالبرولين في موقف الأحماض الأمينية 101، والتي تقع ضمن الميثيل مجال MECP2 ملزمة، وبالتالي سيكون من المحتمل أن يكون لها تأثير على وظيفة البروتين.
واعتبر المريض 3 لأول مرة في سن 6 أشهر بسبب التقدم التنموي البطيء؛ على وجه الخصوص أنها لم تمد يدها للعب. في ذلك الوقت كان لها محيط الرأس ضمن المعدل الطبيعي. عندما ينظر إليها في سن 3 سنوات لاحظت أن الضحك المتكرر مع الخفقان اليد واللسان والجة السلوكيات والتململ عرضية من يديها ولكن لا نفرك باليد. كان والداها قد لاحظت الثقيلة في التنفس في مناسبات. وكانت صغر الرأس، وكان قفا شقة والذقن البارز. قد تقدم مع التطور الحركي لها كانت بطيئة. في 6 سنوات كانت تجلس وحدها ولكن ليس المحمول. لم يكن هناك تاريخ من الانحدار. وقالت انها لم يكن لديه أي المضبوطات وأفيد عن EEG كالمعتاد. وأظهرت الاشعة المقطعية كبير الصهريج الكبير مع دودة المخيخ الصغيرة والبطينين كبير قليلا. واقترح تشخيص متلازمة أنجلمان بسبب سعيدة لها تأثير، حركات اليد النمطية، وملامح الوجه. واعتبرت أيضا إمكانيات متلازمة جوبير والكروموسومات الاصباغ. وكان تحليل 15q11-13 طبيعي، ولكن تم العثور عليها أن يكون لها زوج حذف 52 قاعدة داخل اكسون 3 من MECP2.
ولوحظ المريض 4 أن يكون تأخر في النمو من الزائرة الصحية في سن 7 أشهر. وكانت طفلة المرن الذي لم يتمكن من الجلوس دون دعم. وأظهرت السجلات التي في وقت مبكر في الحياة أنها كانت قادرة على تغذية الاصبع والأشياء نقل من يد إلى يد. على مدى السنوات الثلاث المقبلة، وقالت انها محيط الرأس تباطؤ وولوحظ أن يكون قصير الرأس، مع ملامح الوجه والتصرف مؤنس التي كانت توحي متلازمة أنجلمان. لم يكن هناك تاريخ محدد من انحسار النمو. على الاستعراض في 6 سنوات من العمر، وكان يعتقد AS أن يكون التشخيص الأكثر احتمالا، على الرغم من أنها لديها EEG طبيعي وانه لم يتم اكتشاف أي خلل داخل المنطقة 15q11-13. وأظهر تحليل MECP2 على C لG الانتقال في موقف 497 مما أدى إلى الإنهاء المبكر للبروتين في موقف الأمينية حمض 141. تم الإبلاغ عن هذه الطفرة نفسها سابقا في الفتيات المصابين بمتلازمة ريت. 11
وكان المريض 5 الصبي الذي كان المرن وهو رضيع ثم قدم مع التأخر في النمو الحركي خلال السنة الثانية من العمر. مشى في 15 شهرا من العمر ولكن هناك حاجة إلى الكثير من الدعم، وكان غير عادية، على نطاق واسع، مشية أرجل قوية مع ترنح ملحوظ (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك كان لديه اضطراب الاستيلاء وEEG غير طبيعي التي أظهرت "زيادة بطء النشاط موجة". له محيط الرأس يكمن بين 10 و الخطوط المئوية ال25 ولكنه تباطأ نمو الرأس، وكان قصير الرأس. انه مرول في كثير من الأحيان، وكان بعض الحركات خط الوسط اليد المتكررة ولكن لا من جهة نفرك واضح. ولوحظت ترنح والهزة. وقال انه انخفاض كتلة العضلات في أطرافه وضعف الدورة الدموية الطرفية مع الباردة، قدم زرقاء. في سن ال 6، وقال انه بدأ في وضع اعوجاج العمود الفقري. وجاء تشخيص متلازمة أنجلمان بناء على ظهوره في الوجه، ومشية رنحية، التصرف سعيدة، واضطراب الحجز. تم تحديد أي خلل في كروموسوم 15q11-13، ولكن أظهر تحليل MECP2 أن لديه زوج الحذف 2 قاعدة على مواقع 241-242 ضمن اكسون 2، مما أدى إلى انزياح الإطار مع الإنهاء المبكر للبروتين MeCP2. وجود الفرقة العادية على هلام SSCP اقترح إمكانية الاصباغ الجسدية. وقد تم توثيق مزيد من التفاصيل عن هذا التحليل في أي مكان آخر. 15 وكانت التحليلات الأبوية العادية.

الرقم 2
المريض 5 في سن 4 سنوات. ملاحظة الموقف تدب قاسية والصغيرة، وقدم تغير لونها.

مناقشة

حددنا الطفرات MECP2 في 25/4 الفتيات والفتيان 22/01 الذي قدم في البداية مع التشخيص السريري للAS. لم يكن لأي من المواضيع المعنية شذوذ وراثي واضح من 15q11-13. ان تشخيص RTT تم النظر في الحالات 2 و 3، وذلك كجزء من التشخيص التفريقي للAS، ولكن كان لا RTT تشخيص العمل في كلتا الحالتين في وقت الاختبار. على استعراض المظاهر السريرية لهؤلاء المرضى الخمسة بعد تحديد الطفرات MECP2، أربعة من الخمسة كان بعض الميزات المظهرية الكلاسيكية متلازمة ريت التي تطورت مع مرور الوقت. هذه لم تكن دائما نموذجية، ومع ذلك، وعلى وجه الخصوص كانت مميزة stereotypies غسل اليدين وسرعة التنفس ليس من السمات البارزة. كل خمسة مرضى قد عينت الخصائص السريرية أربعة "متسقة" (موجودة في 100٪) في المعايير التشخيصية لAS التي وضعتها ويليامز وآخرون 14 في عام 1995. وهذه هي شديدة تأخر في النمو، لا أو استخدام الحد الأدنى من الكلمات، حركة أو اضطراب التوازن، وتفرد السلوكي. بالإضافة إلى ذلك، كان كل بعض المعايير الأخرى التي وصفها وليامز وآخرون 14 بأنها "متكررة" أو "المرتبطة" في AS وكانت العلامات السريرية كانت مقنعة بحيث كانت تعتبر معقولة لمتابعة UBE3A طفرة الفرز في كل حالة بعد وكان تحليل مثيلة من كروموسوم 15 ثبت العادية.
ومن المسلم به أيضا أن AS وRTT ديك المظاهر السريرية المتداخلة وشيفر وآخرون 13 لفت الانتباه إلى هذه التشابهات السريرية وحذر مما يجعل تشخيص AS في فتاة في سن مبكرة، وخاصة في غياب ظهور EEG نموذجي. LAAN وآخرون 16 درس رسم المخ من المرضى الذين يعانون من متلازمة أنجلمان ومتلازمة ريت في سن مبكرة. واقترحوا أنه في حين أن التغييرات EEG في AS هي اصم من هذا الشرط، تلك التي ظهرت في متلازمة ريت هي أكثر غير محددة ويمكن للEEG في كثير من الأحيان تكون طبيعية في السنوات القليلة الأولى من الحياة. اثنين من لدينا خمسة مرضى كان المضبوطات وعلى الرغم من أن ثلاثة كان لها EEG غير طبيعي، وكان لا شيء EEG عادة ملامح المرتبطة AS. وهذا يدعم القول بأن EEG هو السمة المميزة جيدة. جميع مرضانا كان ملامح الوجه متناسقة مع AS وكان سعيدا، مؤنس المفعول. الضحك العرضية، ليلية في كثير من الأحيان، تم الإبلاغ عن سمة من سمات متلازمة ريت 8 وهذه كانت متكررة في المواد قمنا عنها. ميزة التشخيص الهامة في كل من AS وRTT هو وجود اضطراب الحركة. AS يتميز الجميلة والحركات مرتجف في سن الطفولة، والتي تتطور إلى خشونة والحركات الطوعية رنحية خلال مرحلة الطفولة. ترفرف اليد ويتكلم في اليدين والأشياء الأخرى هي أيضا مشتركة. وعلى النقيض من متلازمة ريت، واستخدام اليد هادف لا متطور في أي مرحلة في AS. فالطفل نموذجي المصابين بمتلازمة ريت تتطور في البداية استخدام اليد هادف وسوف تفقد بعد ذلك خلال الفترة من الانحدار. ومنذ ذلك الوقت، stereotypies اليد المتكررة مثل الربت، ونتف الملابس، والتنصت، واليد العض، واليد نفرك تبدأ في الظهور، ولكن هذه قد تكون بطيئة في التطور. في هؤلاء المرضى حيث فترة الانحدار يحدث في وقت مبكر، قد استخدام اليد هادفة أبدا تطوير وفي هذه المجموعة خصوصا اضطراب حركة قد تكون موحية من AS في المراحل المبكرة. ينظر في نا خمسة مرضى بأثر رجعي، وكانت الخصائص البارزة للاضطراب الحركة التي كانت تمييزها عن تلك التي AS وجود ترنح ورجفة ملحوظ.
وكانت هناك ملاحظة أخرى في تلك الخمسة الذين كانوا متنقل عادة هزاز ببطء وبشكل متوازن من القدم إلى القدم. وكانت ملامح الوجه مشابهة جدا لتلك التي ظهرت في AS الكلاسيكية. ثلاثة من مرضانا كان الباردة بشكل ملحوظ، قدم الزرقاء التي لا تشكل سمة مشتركة بين AS.
في أي حالة تم تشخيصها على أسس سريرية، لا يزال هناك حجة لحدودها بالضبط. ونظرا لتقلب السريري واسع في متلازمة ريت، Hagberg 10 اقترح معايير لتشخيص "متلازمة ريت المتغيرات" لاستخدامها في الفتيات من 10 سنة أو أكثر. كان في السنوات الأولى، مع ذلك، أن الآباء تسعى عادة ما يكون التشخيص والمشورة الوراثية قبل التخطيط مزيد من الأطفال. فمن خلال هذه الفترة أن هناك تداخل أكثر المظهري بين ملامح AS وRTT. في الحالة التي تكون فيها يتم تشخيص AS على أسس سريرية وحده، سيتم نصح الآباء والأمهات أن مخاطر التكرار يمكن أن تصل إلى 50٪، وأنه لا يمكن لاختبار ما قبل الولادة محددة تكون متاحة. إذا كان من الممكن تبين أن الطفل كان طفرة MECP2، فإن خطر تكرار تكون أقل من ذلك بكثير في معظم الحالات لأن معظم تنشأ من جديد. ومن الواضح أنه من الممكن القول بأن المرضى وصفه لا ينبغي أن ينظر اليها الآن لديك متلازمة أنجلمان. ومع ذلك الملاحظات يخدم لتوضيح القيمة السريرية المحتملة النظر فحص MECP2 في الشباب AS مريض مع عدم وجود 15q11-13 شذوذ، حتى لو كان المريض ذكرا.
التداخل المظهري بين المسار السريري لAS وRTT يثير مسألة ما إذا كان الشرطين قد تكون ذات صلة aetiologically من خلال التسبب المشترك. وتشارك MeCP2 في إسكات النسخي. 17 وهو ملزم لdinucleotides الدليل السياسي الشامل واحد في جميع أنحاء الجينوم ومع Sin3A تميم الكاظمة، الذي يربط مجال النسخي قمعها، فإنه يجند deacetylases هيستون. هذه ثم العمل على تغيير التكوين لونين لمنع النسخ. وقد تبين أنه في وجود طفرة MECP2، قد يكون هناك overexpression من الجينات المصب، على الرغم من أن الدراسة التي شيانغ وآخرون 18 لم تظهر زيادة في مستويات بعض النواقل العصبية في أدمغة من الموضوعات مع الطفرات MeCP2، التي من شأنها دعمت هذه الفرضية. overexpression من الجينات داخل المنطقة 15q11-13 لا تؤدي إلى النمط الظاهري محددة. وكان العديد من الموضوعات مع الازدواجية الأمهات في هذه المنطقة ملامح التوحد، وترنح، والصرع، وصعوبات التعلم، وملامح الوجه تشوه خفية. 19 20 فرضية واحدة، ولذلك، هو أن UBE3A هي واحدة من الجينات المستهدفة المصب MECP2 التي تغيير التعبير أمر بالغ الأهمية بشكل خاص. ومزيد من التحقيق في هذه الفرضية تنطوي على دراسة تلك المناطق من الدماغ حيث يعرف UBE3A أن يكون التعبير عنها.

شكر وتقدير

GB هو عالم زميل الطبيب السريري الذي تموله مؤسسة ويلكوم ترست (المرجع 51390 / Z). ويتم تمويل PW من خلال منحة من مؤسسة العيوب الخلقية.

المراجع

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #3  
قديم 10-19-2015, 11:58 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي وAngelman متلازمة بتحول يغاز يموضع إلى المشبك والنواة، والنتائج نقص الأمهات في غير طبيعي التشكل العمود الفقري شجيري

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/17/1/111.full

https://translate.googleusercontent....UmiiO2XTMmzlUA



فقدان وظيفة أليل الموروثة للأمهات لجين UBE3A بتحول يغاز يسبب متلازمة أنجلمان (AS)، الذي يتميز باعتلال عصبي شديد وضعف المحرك. بالإضافة إلى ذلك، UBE3A تقع ضمن المنطقة كروموسوم 15q11-Q13، حيث الأم، ولكن ليس الأب، الازدواجية تسبب مرض التوحد. منتج الجين UBE3A، E6-AP، وقد تبين أن تعمل على حد سواء باعتبارها يغاز E3 في مسار بتحول proteasome وونتيجة لcoactivator النسخي. ومع ذلك، فإن الدور المحدد للE6-AP في الدماغ، أو كيفية فقدان وظائف النتائج E6-AP في AS، غير واضح. هنا، وتبين لنا، وذلك باستخدام الماوس المعدلة وراثيا المؤتلف تعبر عن Ube3a YFP الانصهار الجين، أن الأمهات Ube3a YFP أليل هو upregulated وأعرب تفضيلي في الخلايا العصبية، وهذا البروتين الانصهار، E6-AP: YFP، وأثرى في النواة والتشعبات في الجسم الحي. وتبين لنا أيضا أن E6-AP: YFP يموضع إلى النواة والمقصورات قبل المشبكي وبعد المشبكي في الخلايا العصبية الحصين مثقف. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن عدد الخلايا العصبية للدماغ والمتفرعة شجيري لا تتأثر في Ube3a الفئران الأم التي تعاني من نقص، ولكن هذا التطور العمود الفقري شجيري، بما في ذلك التشكل العمود الفقري، وعدد وطول، وأثرت على الخلايا العصبية للدماغ وعلى الخلايا العصبية الهرمية في قرن آمون و القشرة. بشكل جماعي، وتشير هذه البيانات إلى أن العجز العصبية التي لوحظت في AS المرضى وAS الفئران قد تنجم عن تشوهات معينة في التنمية متشابك و / أو اللدونة.
مقدمة

وتتميز متلازمة أنجلمان (AS) التي تخلف عقلي شديد، وغياب خطاب، وترنح والتصرف سعيد (1، 2). وAS الجينات، UBE3A، بترميز بتحول يغاز E6-AP ويخضع ليطبع الجينومية، مع التعبير الأمهات محددة تفضيلية في الدماغ، وبشكل أكثر تحديدا، في الخلايا العصبية ولكن ليس في الدبقية (3، 4). الازدواجية الخلالي الأب الأم ولكن ليس من كروموسوم 15q11-Q13 سبب مرض التوحد (5). وتشمل هذه الازدواجية جينات متعددة، ولكن UBE3A هي مرشح قوي للمساهمة في النمط الظاهري التوحد في حالات الازدواجية 15q11-Q13 على أساس وضعها مطبوع ودور المسبب للمرض المعروف في AS (6). وتعتبر اضطرابات طيف التوحد يعانون من متلازمة برادر ويلي وAS، والظواهر اثنين المرتبطة الحذف الأب والأم من 15q11-Q13، على التوالي (7، 8).
الفئران مع طفرة اغية الأمهات في Ube3a (AS الفئران) لديها عيوب في التقوية على المدى الطويل (LTP) والحركية واضح والانحرافات السلوكية التي النتائج موازية في AS على الرغم من العمارة الخلوية العادية في الدماغ (9). وقد عجز العصبية في الفئران AS مرتبطة مباشرة بعد المشبكي الكالسيوم / كالمودولين نوع كيناز 2 (كمكي) إشارات الطريق، وAS الفئران ازدادت الفسفرة المثبطة للαCaMKII في الدماغ (10). وعلاوة على ذلك، والتعلم والعجز السلوكية تقدم في AS يمكن انقاذ الفئران من خلال طفرة في كمكي يمنع الفسفرة المثبطة لها (11). وربطت تقارير أخرى E6-AP لمختلف البروتينات ذات الصلة عصبيا بما في ذلك تسلسل تحويل الخلايا الظهارية 2 الجين الورمي (Ect2) (12)، العصبية البروتين التفاعل على وجه التحديد مع TC10 (nPIST) (13) وملزم MYC البروتين 2 (MYCBP2) ( ortholog من ذبابة الفاكهة موقع HighWire) (14)، على الرغم من أهميتها الوظيفية من هذه التفاعلات غير واضحة.
وAS البروتين، E6-AP، ثلاثة إيسفورمس التي تختلف في N-محطة (15)، هو متعدد الوظائف E3 بتحول يغاز ولها نشاط coactivator النسخي (16)؛ ومن المعروف أن بعض أهداف ubiquitination (مثل البروتين p53 oncoprotein)، ولكن لا شيء تسليط الضوء على AS النمط الظاهري أو وظيفة E6-AP في الدماغ. على الرغم من Ube3a يتم التعبير بشكل كبير في الخلايا العصبية على أساس دراسات في الموقع التهجين، وتوطين التحت خلوية من E6-AP يزال غير واضح، ولا سيما ما يتعلق بالأنشطة يغاز coactivator النسخي وبتحول مزدوجة، وكيف يسبب نقصه في AS النمط الظاهري.
هنا، وتبين لنا، وذلك باستخدام الضربة القاضية في Ube3a YFP مراسل الانصهار الماوس، وهذا ما يعبر عنه Ube3a YFP تفضيلي من أليل الأمهات في الخلايا العصبية المركزية وإنما يعبر biallelicly في الخلايا الدبقية، وأن E6-AP: انصهار بروتين YFP يموضع على حد سواء ل نواة والمشبك. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن الفئران يعانون من نقص الأمهات لUbe3a لها الشاذ شجيري التشكل العمود الفقري والكثافة.

النتائج

جيل من Ube3a YFP الفئران مراسل

من أجل دراسة الخلية من نوع أليلية الوالدين تعبير عن Ube3a واستجلاء توطين الخلوية من الجين المنتج Ube3a، E6-AP، أنتجنا الفئران مع الضربة القاضية في الطفرات التفجير YFP إلى C-محطة من E6-AP ( الشكل 1 A-C؛ المستهدفة أليل، Ube3a YFP؛ البروتين الانصهار، E6-AP: YFP). تم تزاوج الفئران Ube3a YFP مع البرية من نوع (WT) الفئران للحصول على ذرية التي ورثت أليل Ube3a YFP إما عن طريق الخط الجرثومي الأم أو الأب. على أساس زيادة الوزن الجزيئي للE6-AP: YFP (E6-AP، 100 كيلو دالتون، E6-AP: YFP، 130 كيلو دالتون)، كنا النشاف الغربي للتمييز التعبير عن أليل Ube3a YFP وفقا لالأصل المنشأ . لست] المخيخ من الفئران وراثة أليل Ube3a YFP أمومي، ولكن ليس أبويا، كشفت زيادة في الوزن الجزيئي للE6-AP، مشيرا إلى التعبير الأمهات تفضيلية للأليل Ube3a YFP (الشكل 1 D). وأكد التعبير الأمهات محددة من Ube3a YFP في المخيخ أيضا مع مضاد-YFP الأضداد (الشكل 1 D). وعلاوة على ذلك، فإن كمية E6-AP: كان YFP انصهار بروتين الكشف عنها من قبل لطخة غربية بما يتفق مع مستويات الذاتية البروتين E6-AP، مشيرا إلى أن التعبير عن Ube3a YFP لم تتغير بشكل فاضح من قبل جيل من البروتين الانصهار (الشكل 1 D ). بالإضافة إلى ذلك، كانت الدراسات مع الأجسام المضادة متعددة لE6-AP في الفئران WT تتفق مع أنماط التوزيع رؤيتها انصهار بروتين (لا تظهر البيانات).

الشكل 1.
جيل من Ube3a YFP الفئران المراسل. (A). توضيح تخطيطي لموضع الجيني Ube3a (أعلى)، Ube3a YFP -targeting بناء (TC، وسط) وUbe3a YFP -targeted أليل (القاع). تم استخدام موقع تقييد SPH I يقع المنبع من وقف كودون متعدية لإزالة كودون وقف وصهر مراسل الجين YFP إلى C-محطة من E6-AP. (B) تحليل لطخة الجنوبي من النوع البري (+ / +) وUbe3a YFP [E6-AP: YFP (EY) EY / +] خلايا ES إيجابية. تم هضمها DNA مع منظمة التعاون الاقتصادي RV وتهجين مع الذراع الأيسر (LA) التحقيق هو مبين في (A). أحجام جزء لنوع البرية (+ / +) وEY (EY / +) الأليلات هي 9.0 و 12.0 كيلوبايت، على التوالي. تم هضمها DNA مع تجربة الاقتراب من الموت أنا وتهجين مع الذراع اليمنى (RA) التحقيق. أحجام جزء لنوع البرية (+ / +) وEY (EY / +) الأليلات هي 7.9 و 10.9 كيلوبايت، على التوالي. (C) تحليل لطخة الجنوبي من النوع البري (+ / +)، Ube3a YFP متخالف (EY / +) وUbe3a YFP DNA الذيل متماثل يتفاعل مع منظمة التعاون الاقتصادي RV وبحث مع لجنة التحقيق LA. تم تنفيذ (D) البقع الغربية مع النوع البري (+ / +)، Ube3a YFP الأم (EY / +) وUbe3a YFP الأب (+ / EY) عصائر وبحث مع المضادة للE6AP (اللوحة اليسرى) أو مكافحة YFP (يمين لوحة) مما يدل التعبير الأمهات من Ube3a YFP في المخيخ. E، ايكو RV؛ N، تجربة الاقتراب من الموت الأول؛ S، SPH I.

تحليل Ube3a YFP التعبير أليلية وتوطين الخلوية في الجسم الحي

بعد ذلك، درسنا نوع من الخلايا في التعبير عن Ube3a YFP وفقا لالوالدين وللأصل، وتوطين التحت خلوية من E6-AP: YFP في الدماغ باستخدام التصوير متحد البؤر. و immunostained أقسام المجمدة من الكبار Ube3a YFP الأم وUbe3a YFP العقول الأب مع مكافحة YFP ومكافحة GFAP، وهي علامة الخلية الدبقية، أو مكافحة YFP ومكافحة calbindin، والمخيخ العصبية خلية علامة. Ube3a YFP الفئران الأمهات أظهرت مستويات عالية التعبير في الخلايا العصبية الهرمية القشرية وقرن آمون (الشكل 2 A و D)، في حين تم الكشف عن التعبير بصوت ضعيف فقط في المناطق المقابلة في Ube3a YFP الفئران الأب (الشكل 2 A). في المخيخ، وأعرب عن Ube3a YFP في الخلايا العصبية والخلايا العصبية في في طبقات الحبيبية والجزيئية، وإن كان بمستويات منخفضة (الشكل 2 B). تم الكشف عن التعبير Biallelic من Ube3a YFP في الخلايا GFAP إيجابية بطانة البطينات الجانبية، على الرغم من وأعرب كل أليل عند مستويات أقل مما ظهر مع التعبير عن أليل الأمهات في الخلايا العصبية في المنطقة CA3 للقرن آمون (الشكل 2 C). تم التعبير Biallelic يقتصر على الخلايا GFAP إيجابي بطانة البطينين، بما في ذلك البطين الثالث (لا تظهر البيانات)، وكان لا يمكن كشفها بسهولة في الخلايا النجمية GFAP إيجابية في مناطق أخرى من الدماغ. تم الكشف عن التعبير عن Ube3a الأمهات المستمدة YFP في معظم مناطق الدماغ بما في ذلك الحصين، القشرة، المهاد، البصلة الشمية والمخيخ. تم الكشف عن Ube3a YFP الأب التعبير بصوت ضعيف فقط في هذه ومناطق أخرى من الدماغ، وبصرف النظر عن التعبير في الكشف عن الخلايا GFAP إيجابية بطانة البطينين. لكل سكان الخلية العصبية، E6-AP: YFP المترجمة في المقام الأول إلى النواة، ولكن بالإضافة إلى ذلك موجود في سوما والتشعبات كما ينظر بشكل واضح في هرمية، العصبية والخلايا العصبية البصلة الشمية (الشكل 2 D، E و F). وتشير هذه البيانات إلى أن Ube3a YFP يخضع التعبير وفيرة تفضيلية للأليل الأمهات حصرا في الخلايا العصبية، والتي E6-AP: YFP يموضع إلى النواة، سيتوبلازم خلايا الجسم والعمليات في هذه الخلايا.

الرقم 2.
Ube3a YFP يخضع التعبير الأمهات محددة تفضيلي في الخلايا العصبية والتعبير biallelic في الخلايا المبطنة GFAP البطينين. تم الكشف عن (A) Ube3a YFP التعبير في الهرمية (السنة التحضيرية) الخلايا العصبية في القشرة (CTX) والمنطقة CA1 من الحصين عندما ورثت من خلال الأمهات (يسار)، ولكن ليس الأب (اليمين)، خط الجرثومية. تم الكشف عن (B) Ube3a YFP التعبير أيضا في طبقة الخلايا العصبية للدماغ (PL) وفي الخلايا العصبية في الطبقة الحبيبية (GR) وطبقة الجزيئية (ML) عندما أمومي، ولكن ليس من الأب، ورثت. تم الكشف عن (C) Biallelic التعبير عن Ube3a YFP في الخلايا GFAP إيجابي يقع بالقرب من البطينات الجانبية (خلايا كبسولة الخارجية). كان التعبير عن أليل الأمهات Ube3a YFP العالي في الخلايا العصبية CA3 (السهم الأبيض) مقارنة مع الخلايا GFAP إيجابية بالقرب من البطين الجانبي. أظهرت أعلى صورة التكبير من المنطقة CA1 في قرن آمون (D) والمخيخ (E) أن الأمهات المستمدة Ube3a YFP وأعرب غاية في الخلايا العصبية. كان YFP تلطيخ على أشده في نوى لكن يمكن كشفها بسهولة في سيتوبلازم خلايا الجسم والتشعبات: E6-AP. في المخيخ، وتلطيخ على أشده في نوى الخلايا العصبية ولكن يمكن كشفها بسهولة في نوى الخلايا العصبية في طبقة الجزيئية (ML)، والطبقة الحبيبية (GL). تم الكشف عن ضعف في تلطيخ العصبية السيتوبلازم الخلية والعمليات. (F) التعبير عن الأمهات Ube3a EYFP تم اكتشاف بالإضافة إلى ذلك في الخلايا العصبية الشمية. المفوضية الأوروبية، كبسولة الخارجية؛ MC، خلية التاجية. YFP، ومكافحة YFP. GFAP، ومكافحة GFAP. CB، ومكافحة calbindin. شريط النطاق: (A) و (B) 100 ميكرون. (C)، (D)، (E) و (F) 20 ميكرون.

E6-AP: YFP يموضع إلى كل من المقصورات قبل المشبكي وبعد المشبكي في الخلايا العصبية الحصين فصلها في الثقافة

منذ E6-AP: أثريت YFP في نوى الخلايا العصبية، وكان حاضرا بالإضافة إلى ذلك في خلايا الجسم والتشعبات، كما رأينا في قرن آمون الخلايا العصبية CA1 الهرمية (الشكل 2، قمنا بتحليل بجانب توطين التحت خلوية من E6-AP D): YFP في الخلايا العصبية الحصين فصلها النامية في الثقافة المستمدة من الفئران مع رثت أمومي Ube3a YFP أليل. الخلايا العصبية قرن آمون في 1-4 أيام في المختبر (DIV) أظهرت مستويات عالية من E6-AP: YFP في المخاريط نمو neurites التي النامية ونواة (الشكل 3 A). في 4 DIV، وكان يستخدم لمكافحة MAP2 وصمة عار التشعبات، ومستويات عالية من E6-AP: تم الكشف عن YFP في المخاريط نمو كل من المحاور والتشعبات (الشكل 3 B). من أجل دراسة ما إذا كانت E6-AP: كان YFP حاضرا في المشبك، قمنا بتحليل الخلايا العصبية Ube3a YFP تربيتها لمدة 25 DIV ومزدوجة ملطخة مكافحة synaptophysin، حويصلة علامة قبل المشبكي، ومكافحة YFP. أثريت YFP غاية في النواة وكانت موجودة على طول المحاور والتشعبات: E6-AP. وأشارت صور من المحاور التي E6-AP: YFP colocalized مع synaptophysin نقاط واضحة على طول المحاور (الشكل 3 C). في التشعبات، لوحظ وجود نمط مختلف من تلطيخ، مع E6-AP: YFP يجري توزيعها منتشرة والتي لا تشكل نقاط واضحة. ومع ذلك، E6-AP: تم الكشف عن YFP في نتوءات تشبه العمود الفقري على طول مهاوي الجذعية، واظهار بعض تلطيخ الإيجابية والسلبية لsynaptophysin (الشكل 3 D). بشكل جماعي، وهذه النتائج تشير إلى أن E6-AP: YFP يموضع بشكل مختلف إلى النواة، مخروط النمو والمشبك، بما في ذلك المقصورات قبل المشبكي وبعد المشبكي في الخلايا العصبية قرن آمون في الثقافة، مما يوحي بأن E6-AP يمكن أن تنظم تطوير و / أو وظيفة نقاط الاشتباك العصبي مباشرة.

الرقم 3.
توزيع داخل الخلايا E6-AP: YFP إلى النواة والمشبك في الخلايا العصبية الحصين فصلها. E6-AP: YFP يخضع الاتجار الفرق بين الخلايا لمخروط النمو، المشبك (قبل المشبكي وبعد المشبكي) ونواة الخلايا العصبية في قرن آمون فصلها. (A) صور متحد البؤر التي اتخذت من Ube3a YFP الخلايا العصبية المشتقة من الأمهات في 1 و 2 و 3 و 4 DIV أثبتت أن E6-AP: YFP أثريت في النواة (السهام البيضاء) والمخاريط نمو neurites التي التطويل الأولية. تم تضخيم نهايات neurites التي الأولية لإظهار إثراء E6-AP: (يتم توسيع متقطع صناديق لوحات أدناه) YFP. (B) الصور الملتقطة من الخلايا العصبية Ube3a YFP 4 DIV ملطخة مكافحة MAP2 ومكافحة YFP أشارت توطين E6-AP: YFP على كل المحاور والتشعبات في الخلايا العصبية النامية. (C) عالية التكبير صور مبائر المتخذة من 25 DIV الخلايا العصبية ملطخة مكافحة synaptophysin (SYP) ومكافحة YFP أظهرت التكتل واضح من E6-AP: YFP مع synaptophysin على طول المحاور. (D) جنبا إلى جنب مهاوي الجذعية، E6-AP: EYFP تم توزيع منتشرة وكان حاضرا في العمود الفقري شجيري (السهام البيضاء). شريط النطاق: 10 ميكرون في (C) و (D).

لا تتأثر المخيخ عدد الخلايا العصبية والمتفرعة شجيري عن فقدان الأم E6-AP

قمنا بتقييم المقبل المخيخ عدد العصبية الخلية وشجيري المتفرعة في Ube3a الفئران الأم التي تعاني من نقص (AS الفئران) (9، 17). قمنا بتحليل سلامة الخلايا العصبية للدماغ في WT وAS الفئران من خلال دراسة منظمة، وعدد الخلايا الجذعية المتفرعة من خلال تلطيخ calbindin، التي immunolabels سوما الخلية العصبية والتشعبات. تم توزيع وتنظيم الخلايا العصبية في الفئران AS مماثلة لWT، مع عدم وجود اختلافات واضحة كونها واضحة على مستوى المجهر الضوئي. وعلاوة على ذلك، ونحن لم يكشف عن أي اختلافات في عدد الخلايا العصبية بين WT وAS الفئران (WT، 11.98 ± 0.83 / 250 طبقة ميكرون PC، AS، 11.64 ± 0.19 / 250 ميكرون؛ P = 0.7)، ولم نكتشف أي اختلافات في calbindin تلطيخ الأشجار الجذعية، وهو مؤشر غير مباشر من الخلايا العصبية الكثافة الشجرية والمتفرعة (الشكل 4 أ) (18). هذه الملاحظات تتفق مع التقارير السابقة (9، 19). في مناطق أخرى في الدماغ، لم يكن هناك أي تشوهات واضحة لوحظ من خلال تحليل المناعى. لذلك، وهذه البيانات تشير إلى أن العجز العصبية التي لوحظت في AS الفئران لا تنشأ من تشوهات التي تنطوي على عدد الخلايا العصبية أو المتفرعة شجيري.

الرقم 4.
فقدان الأم E6-AP لا يؤثر على المخيخ تنظيم الخلايا العصبية أو المتفرعة شجيري. (A) صور الممثل تظهر متحد البؤر تلطيخ calbindin في WT وAS (خالية الأمهات) الفئران. الخلايا العصبية في الفئران AS تشير منظمة مماثلة والمتفرعة مقارنة مع WT. (B) التحليل الكمي للمتحد البؤر تلطيخ calbindin في التشعبات الخلية العصبية كمؤشر غير مباشر من المتفرعة. وكان متوسط ​​calbindin مضان عبر العصبية سوما الخلية والتشعبات لا يعتد به إحصائيا بين WT وAS الفئران، مشيرا العادي شجيري الخلايا العصبية المتفرعة في AS الفئران. موانئ دبي، ونقاط البيانات.

AS الفئران لها العمود الفقري شجيري غير طبيعية في الخلايا العصبية للدماغ والحصين والخلايا العصبية الهرمية القشرية

ونظرا لوجود E6-AP: YFP في التشعبات في الجسم الحي وعند نقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية مثقف، أجرينا جولجي تلطيخ في WT وAS الفئران من أجل دراسة مورفولوجية شجيري العمود الفقري والكثافة. تم استخراج العقول من الكبار WT وAS تتزاحم والمشرب جولجي. تم فحص المقابلة مقاطع من WT وAS الفئران بواسطة المجهر الضوئي. وكشفت الصور التي العمود الفقري شجيري على طول الخلايا العصبية، هرمي الحصين والخلايا العصبية الهرمية القشرية في WT الفئران ظهرت "مثل فطر" مع رؤوس كبيرة ورقيقة، وأعناق قصيرة مرصع على طول التشعبات. في المقابل، العمود الفقري في AS الفئران عرضها على التشكل متناسقة، بما في ذلك التباين الشديد في العمود الفقري طول العنق وحجم الرأس. يبدو أن كثافة العمود الفقري أيضا أقل في AS الفئران مقارنة مع الفئران WT (الشكل 5 A). لأن جعلت كثافة عالية والازدحام في العمود الفقري في الخلايا العصبية تحليل مفصل صعبة، ونحن كميا العمود الفقري شجيري في قرن آمون والخلايا العصبية الهرمية القشرية (الشكل 5 A). وقد تم تحليل التشعبات قمية الثانوية قريبة من سوما الخلية وتمتد أفقيا من الخلايا العصبية الهرمية في المنطقة CA1 لكثافة العمود الفقري شجيري وطول في WT وAS الفئران. كشف الكمي التي AS أظهرت الفئران انخفاضا كبيرا في كثافة العمود الفقري مقارنة مع الفئران WT (WT، 1.614 ± 0.076 العمود الفقري / ميكرون، AS، 1.228 ± 0.055 العمود الفقري / ميكرون؛ P = 0.0003؛ الشكل 5 B). ولوحظ وجود انخفاض في العمود الفقري على طول التشعبات قمية القشرية أيضا في AS الفئران (WT، 1.172 ± 0.044 العمود الفقري / ميكرون، AS، 0.882 ± 0.057 العمود الفقري / ميكرون؛ P = 0.0009؛ الشكل 5 C). نحن كميا بجوار أطوال العمود الفقري في التشعبات الحصين، وAS الفئران أظهرت انخفاض كبير في متوسط ​​طول العام العمود الفقري مقارنة مع WT (WT، 1.16 ± 0.0038 ميكرون، AS، 1.017 ± 0.0454 ميكرون؛ P = 0.03؛ الشكل 5 D). التشعبات الهرمية في AS الفئران أظهرت أيضا دوالي على طول رمح شجيري الثانوي (الشكل 5 A). وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من التشعبات بدا أرق في AS الفئران النسبية على الفئران WT. بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن فقدان النتائج E6-AP الأمهات في غير طبيعية تنمية العمود الفقري شجيري وربما تكمن وراء العجز في اللدونة متشابك وظيفية لوحظ في AS الفئران.

الرقم 5.
غير طبيعي التشكل العمود الفقري شجيري في الفئران يعانون من نقص الأمهات لE6-AP. AS الفئران أظهرت العمود الفقري شجيري غير طبيعية في المخيخ، العصبونات القشرية وقرن آمون، على الرغم من العمارة الخلوية العادية والمتفرعة شجيري. (A) وصور مجهرية ضوئية من جولجي مشربة-العصبية الخلية (PC)، قرن آمون (HP) الخلايا العصبية الهرمية والقشرية الخلايا العصبية (CT) هرمي أظهرت AS الفئران قد خفض كثافة العمود الفقري شجيري والتشكل غير طبيعي في AS الفئران مقارنة مع الفئران WT. وبالإضافة إلى ذلك، كان AS الفئران تورمات (السهام السوداء) على طول التشعبات قمية الثانوية. (B) و (C) كثافة العمود الفقري شجيرى انخفض بشكل كبير على طول التشعبات قمية الثانوية في CA1 الخلايا العصبية الهرمية وعلى طبقة 3-5 الخلايا العصبية الهرمية القشرية في AS الفئران. (D) ويبلغ متوسط ​​طول العمود الفقري شجيري طول التشعبات قمية في CA1 الهرمي تم تخفيض في AS الفئران. شريط النطاق: 10 ميكرون. أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط. * P = 0.03، P = 0.0003 ** ***، P = 0.0009.

مناقشة

في هذه الدراسة، درسنا التعبير الخلية من نوع وتوطين التحت خلوية من E6-AP في الدماغ من خلال Ube3a YFP الضربة القاضية في الانصهار مراسل الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، درسنا أدمغة الفئران لAS الظواهر المورفولوجية حتى الآن لم يتم كشفها المرتبطة العجز العصبية الموجودة في هذه الفئران. نتائجنا تشير الى ان Ube3a ويعبر عن درجة عالية من أليل الأمهات تحديدا في الخلايا العصبية، والتي E6-AP يموضع بشكل مختلف إلى النواة والمشبك، حيث أنها قد تعمل محليا لتنظيم وضع متشابك واللدونة.
وقد أشارت دراسات سابقة إلى أن الجينات الماوس Ube3a يخضع يطبع الجينومية مع التعبير التفضيلي للأليل الأمهات في الخلايا العصبية المركزية في الدماغ (3، 4، 17). نتائجنا تتفق مع هذه الملاحظات السابقة وتبين من خلال التحاليل المجراة أن يتم التعبير عن أليل الأب عند مستويات منخفضة إلى غير قابلة للكشف جدا في الخلايا العصبية، في حين يتم التعبير عن كل من الأليلات بالتساوي تقريبا في الخلايا الدبقية بطانة البطينين. والجدير بالذكر أن لاحظنا upregulation من أليل الأمهات في الخلايا العصبية النسبية للأليل الأمهات أعرب في الخلايا الدبقية مع التعبير biallelic. لاحظنا أيضا أن E6-AP: YFP والمترجمة تفاضلي بين النواة وخلايا الجسم سوما، وتمتد إلى مخروط النمو والمقصورات قبل المشبكي وبعد المشبكي في الخلايا العصبية قرن آمون في الثقافة. هذه النتائج تدعم الدور متنوعة لE6-AP باعتباره يغاز بتحول وcoactivator النسخي.
ملاحظاتنا أن AS الفئران لديها بنية الخلوية العادية في الدماغ ولكن تمتلك العمود الفقري شجيري التي هي على شكل غير طبيعي وانخفاض في حجم وكثافة تشير إلى أن E6-AP لا ينظم تكوين الخلايا العصبية في حد ذاتها، ولكنها قد تعمل محليا لتنظيم وضع العمود الفقري أو اللدونة متشابك . يدعم وجود E6-AP في المشبك المزيد من هذه الفكرة (20)، على الرغم من أننا لا يمكن استبعاد إمكانية مساهمة دورا النووي لE6-AP في تنظيم هيكل و / أو وظيفة المشبك. وقد ثبت بما يتفق مع نماذج الماوس الأخرى للتخلف العقلي، مثل X الهش ومتلازمة ريت، AS الفئران بشكل واضح من امكانات تغيير الأشكال التضاريسية العمود الفقري. Fmr1 الفئران فارغة والمرضى X الهش لامتلاك العمود الفقري شجيري طويلة بشكل غير طبيعي، وكذلك زيادة كثافة العمود الفقري شجيري في مختلف السكان العصبية (+21 - +27). في المقابل، وقد ثبت MeCP2 الفئران -deficient والمرضى ريت لعرض انخفاض كثافة العمود الفقري شجيري (+28 - +30). وتمشيا مع ملاحظاتنا في AS الفئران، Fmr1 وMeCP2 الفئران الخالية تمتلك نضوج الخلايا العصبية على ما يبدو العادي وتشجر لكن اضح التنمية المشبك غير طبيعية.
وإن كانت هناك أهداف محددة من E6-AP ubiquitination تحديدها حتى الآن من شأنها أن تسهم في فهمنا لE6-AP وظيفة متشابك، لا يوجد دليل على تأثيرات على مسار كمكي. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت في AS الفئران أن نقص النتائج Ube3a في زيادة الفسفرة المثبطة وخفضت بعد المشبكي كمكي المرتبطة الكثافة (10). وقد أظهرت دراسات أخرى الإنقاذ من الظواهر السلوكية AS في المسوخ كمكي عن طريق إدخال طفرة إضافية في موقع الفسفرة المثبطة للαCaMKII. لذلك، مما يدل على ديسريغولاتيون من كمكي من المرجح الأساس الجزيئي الكامن وراء العجز LTP (11). وتمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها في العمود الفقري شجيري غير طبيعية في AS الفئران، وقد تبين كمكي للعب دورا هاما في كل من الوظيفية والهيكلية اللدونة متشابك. تحريض النتائج كمكي تفعيلها في نمو أرجل كاذبة خيطية جديد وتشكيل العمود الفقري، في حين أن تثبيط نتائج النشاط كمكي في أرجل كاذبة خيطية وفقدان العمود الفقري (31). ولذلك، فقد E6-AP والتقلبات لاحق من كمكي المرجح أن يؤدي إلى ضعف في كل من الوظيفية والهيكلية اللدونة متشابك.
هناك أدلة أخرى تتسق مع دور هام للE6-AP في المشبك. وقد تبين E6-AP للتفاعل مع MYCBP2، وortholog البشري من ذبابة الفاكهة موقع HighWire والذي يعرف لتنظيم وضع متشابك وظيفة (14، 32، 33). ونظرا لعدم وجود أي عيوب تنظيمية أو الخلوية واضحة في AS الفئران وجود E6-AP في المشبك، نتوقع أن فقدان متشابك E6-AP والتشكل الشاذ الناتج من العمود الفقري شجيري في AS الفئران تساهم جزئيا، إن لم يكن تماما، إلى عجز العصبية التي لوحظت في هذه الفئران، وربما في AS الأفراد.

المواد والأساليب

جيل من Ube3a YFP الفئران

تم استخدام الحمض النووي الجيني من سلالة 129 / SvEv الماوس كقالب لPCR-تضخيم شظية 8.88 كيلو بايت من 3 'نهاية Ube3a بما في ذلك إنترون 8، 9 اكسون، إنترون 9، 10 اكسون و-UTR 3'(F: 5'-GTTTCGTCACTTCTTTCTTCCGCTC؛ R: 5'-TGTTAGTTTCCAATGCCTCCTACGC). وTA-استنساخ جزء PCR في TOPO-XL ناقلات (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). تم هضمها الأسلحة تناظر في موقع SPH أنا موجود ثمانية النيوكليوتيدات المنبع من Ube3a توقف متعدية كودون. A رابط، الذي تضمن 3 'نهاية تسلسل الترميز دون توقف متعدية لكن مع موقع تقييد Xho الأول، كان ligated في موقع SPH I (F: 5'-CTGTTCTCGAGGAATTCCGCGGTCATG؛ R: 5'-ACCGCGGAATTCCTCGAGAACAGCATG). وEYFP: loxP: PGK-النيومايسين: كان ligated كاسيت loxP في الموقع Xho I السماح للانصهار في إطار الجين EYFP لكامل طول Ube3a. تم خطي استهداف بناء Ube3a YFP و electroporated إلى خلايا ES AB2.2 كما هو موضح سابقا (9). تم فحص الحيوانات المستنسخة مقاومة للG418 بواسطة النشاف الجنوبي باستخدام مسبار 5'-PCR (F: 5'-GGACTTTGCTTGGTGTTGGT؛ R: 5'-GGAAGTCAGAAGGGGGAA) و3'-PCR التحقيق (F: 5'-GGGTCTTTTGAGTTGCGGTA؛ R: 5'- TCATCTGTCCCAGGGAAAAC). تم توسيع واحد استنساخ الإيجابي وأكد لإعادة التركيب مثلي قبل الجولة الثانية من النشاف الجنوبي باستخدام نفس 5'- و3'-تحقيقات. تم حقن استنساخ المستهدفة في البيضاء الكيسات الأريمية C57 / BL6 من خلال إجراءات القياسية. كانت ولدت ثلاثة الوهم النسبة المنخفضة والمتوسطة إلى C57 / BL6، وتقرر نقل سلالة الجرثومية للأليل Ube3a YFP التي كتبها آغوطي لون المعطف وصمة عار الجنوبية. واستمر النمط الجيني Ube3a YFP على مختلطة 129 / SvEv وC57 / BL6 الخلفية.

تحليل لطخة غربية

تمت التضحية الفئران والعقول عزل فورا ونقله إلى PBS الجليد الباردة. تم تشريح أنسجة المخ من ونقل على الفور إلى أنابيب تحتوي على الجليد الباردة NP40 / SDS العازلة (1٪ Nonidet P-40، 0.01٪ SDS، 0،1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.2) والكامل مثبط البروتياز كوكتيل (العلوم التطبيقية روش، انديانابوليس ، IN) والمتجانس مع مدقة بمحركات. واستدارة لست] لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، طرد في 14 دورة في الدقيقة 000 لمدة 15 دقيقة لإزالة البروتينات غير قابلة للذوبان، ثم نقل إلى أنابيب جديدة وضعت على الجليد. وقد تكرر هذا وتم الجمع بين supernatants في أنبوب واحد. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام كاشف برادفورد (بيو راد، هرقل، CA).
تم حل الدماغ الخليط الأنسجة على 7.5٪ هلام SDS-PAGE ونقل إلى غشاء النيتروسليلوز TransBlot (بيو راد). وأغلقت الأغشية في 3٪ الحليب الخالي من الدسم في 0.1٪ T-TBS (10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 م م كلوريد الصوديوم و 0.1٪ توين 20) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. حضنت الأغشية في الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم غسلها ثلاث مرات مع T-TBS. ثم حضنت الغشاء في الضد الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وجرفت المياه الأغشية مرة أخرى ثلاث مرات في T-TBS قبل أن يتم تطويرها من قبل تعزيز أسلوب التوهج (أمرشام، بيسكاتواي، NJ). والمخفف لمكافحة GFP في 1: 3000 (8371؛ BD العلوم البيولوجية، سان خوسيه، كاليفورنيا)، ومكافحة E6-AP (611416؛ BD العلوم البيولوجية) والمخفف في 1: 1000. تم المخفف الأجسام المضادة الثانوية في 1: 3000.

ثقافة العصبية الحصين

وقد تم الحصول على الثقافات الأولية من الخلايا العصبية قرن آمون من الجراء P0-P1 من C57 / عبرت الذكور BL6 للإناث Ube3a YFP. تم فصلها الحصين مع غراء والمثقف في المتوسط ​​محددة الصفات كيميائيا (Neurobasal المتوسطة A؛ إينفيتروجن، سان دييغو، CA) تستكمل مع B27 (إينفيتروجن) والبنسلين / الستربتومايسين (إينفيتروجن) على coverslips الزجاج المطلي مع بولي د -Lysine (سيغما) والكولاجين (BD العلوم البيولوجية)، كما ذكرت سابقا (34). والمحافظة على الثقافات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حتى الاستخدام.

المناعية

تم perfused الفئران مع امتصاص العرق والأنسجة الجليد الباردة PBS و 4٪ تحصد كما هو موضح سابقا (35). لأقسام المجمدة، قطعت 45 ميكرون أقسام الاكليلية على ناظم البرد وتخزينها في برنامج تلفزيوني. تم غسلها المقاطع في برنامج تلفزيوني وثم منعت في T-TBS (10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.3٪ TritonX-100) بالإضافة إلى 5٪ مصل الماعز العادي لمدة 1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية. وحضنت المقاطع في الأجسام المضادة الأولية ل48-72 ساعة عند 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب مع الإثارة لطيف. وقد استخدم في 1؛ المضادة للGFP (نوفوس البيولوجية، ليتلتون، CO NB 600-308): 2000 التخفيف، ومكافحة GFAP (MAB360؛ Chemicon، تيميكولا، كاليفورنيا) في 1: 250 ومكافحة calbindin (C9848، سيغما) في 15:00. تم غسلها أقسام ثلاث مرات في T-TBS لمدة 10 دقيقة لكل منهما ثم حضنت مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى (جاكسون ImmunoResearch، غرب غروف، PA) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية في الظلام. تم استخدام 200، ومكافحة فأر اليكسا 557 في 1: المضادة للأرنب كان يستخدم اليكسا 488 في 1 200 (إينفيتروجن). تم غسلها مرة أخرى في أقسام T-TBS لمدة 20 دقيقة لكل منهما والتي شنت على الشرائح الزجاجية مع Vectashield (مختبرات المتجهات، بورلنجام، كاليفورنيا) تركيب كاشف. وقد تم الحصول على الصور مبائر باستخدام LSM زايس 510 المجهر متحد البؤر (زايس، Oberkochen، ألمانيا).

المناعية تحليل البيانات

Ube3a YFP التعبير الوالدين

تم الحصول على جميع الصور على المجهر متحد البؤر زايس LSM 510 مع الهدف المغمورة بالزيت 10 × أو 43 ×. وأبقى ضبط التعرض للكشف عن ومكبر للصوت مكاسب نفسه بين مجموعة عينة. لمضان مكافحة GFP في Ube3a YFP الأم وUbe3a YFP الفئران الأب، تم تصوير مقاطع WT من أجل تحديد الحد الأقصى لكثافة الليزر وكشف تحقيق مكاسب دون مستوى عتبة الكشف عن مضان ثم تم مسحها ضوئيا Ube3a YFP الأم وUbe3a YFP أقسام الأب باستخدام هذه الشروط التصوير.

الخلايا العصبية تشجر شجيري

للخلية العصبية تشجر شجيري، 45 ميكرون cryosections من WT عمره 6 أسابيع (ن = 2) وAS (ن = 2) و immunostained تتزاحم المطابقة الجنس مع مكافحة calbindin (1: 500). تم الحصول على جميع الصور على المجهر متحد البؤر زايس باستخدام الهدف 43 ×. وقد تم تحليل نفس الورقات وعمق تقريبي للقسم لكل حيوان. تم الحصول على صور من الخلايا العصبية سوما تمتد إلى نهاية البعيدة من الفروع الشجيرية في طبقة الخلايا الجزيئية. تم الحصول متتابعة ميكرون خمسة وعشرين، 0.5 الصور الضوئية سميكة وكان من المتوقع باستخدام NIH يماغيج ظيفة Z-الإسقاط المحددة لمتوسط ​​كثافة. لكل نمط وراثي، وقد تم اختيار قسم مستطيلة 20 × 160 ميكرون تركز على سوما PC الأفراد من نفس المنطقة من كل حيوان. تم احتساب ملف كثافة مضان من هذه المنطقة باستخدام ملف المؤامرة في يماغيج. يعني مضان (ن = 5) لقسم البصرية وحسبت كل 2.25 ميكرون على طول سوما PC والتشعبات. تم إجراء الطالب ر -test على مضان يعني للقسم بصري كامل (P = 0.421) وعلى مضان شجيري يعني (P = 0.437).

تحليل العمود الفقري شجيري

تم تنفيذ جولجي التشريب وفقا لبروتوكول الواردة في FD السريع GolgiStain كيت (FD Neurotechnologies، إليكت، MD). قطعت مائة ميكرومتر أقسام المسلسل من المخيخ والحصين وشنت. تم الحصول على الصور باستخدام زايس (زايس تصوير Z.1) مجهر الضوء. لكثافة العمود الفقري وطول القياسات الجذعية، تم الحصول على 30-40 التسلسلية الصور مكدسة ض تغطي التغصنات بأكملها وجاحظ العمود الفقري (0.36 ميكرون / صورة) باستخدام عدسة الغمر 100 × النفط. لالخلايا العصبية الهرمية قرن آمون، تم تصوير ستة إلى سبعة التشعبات الثانوية المتفرعة من التغصنات قمي ومعظم الأقرب إلى سوما خلايا الجسم لكل حيوان. لالخلايا العصبية الهرمية القشرية، 05:55 التشعبات قمية، ~100 ميكرون من سوما خلايا الجسم، تم تصوير لكل حيوان. وقد تم تحليل الصور المتسلسلة باستخدام برنامج NIH يماغيج. وتم قياس كمية كثافة العمود الفقري وطول طريق التركيز من خلال كل صورة المسلسل، وقدمت التهم والقياسات باستخدام وظيفة القياس. للصور، ويتوقع 20-25 الصور مكدسة ض من خلال برنامج deconvolution. ذكر العمر ثمانية أسابيع سبعة إلى وWT الإناث (ن = 3) وAS (ن = 3) كانت تستخدم الفئران littermate للتحليل.

إحصائيات

وقد استخدم Microsoft Excel لتحليل الإحصائي. للمقارنات WT وAS، كان يستخدم الطالب ر -test لتحديد الدلالة الإحصائية. تمثل جميع البيانات ± متوسط ​​الخطأ المعياري للمتوسط. طالب تي -test بقيمة P <0.05 اعتبر كبيرة (يشار فرد -values ​​P بعلامة النجمة في الأرقام).

التمويل

معتمدة SVD وALB من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (F32 HD-049248؛ R01 HD-037283). وأيد هذا العمل من قبل كلية بايلور للطب التخلف العقلي ومركز أبحاث الإعاقة التنموية (MRDDRC) NIH منحة HD-24064.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #4  
قديم 10-20-2015, 12:06 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تحديد C / D الجينات snoRNA-المتكررة tandemly في مطبوع البشري 14q32 مجال تذكرنا تلك في برادر ويلي / Angelman المنطقة متلازمة

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/11/13/1527.full

https://translate.googleusercontent....mLu0am7Ryu4sZQ





A مجال مطبوع البشري في 14q32 يحتوي يومين أعرب المشترك، ومطبوع على أساس المعاملة بالمثل الجينات، DLK1 وGTL2، التي يتم التعبير عنها من الأليلات الموروثة من الأب وأمهات، على التوالي. لقد أظهرنا سابقا أن آخر مكان مطبوع، على الإنسان 15q11-Q13، يحتوي على عدد كبير من C المتكررة tandemly / D الجينات RNA نويي صغيرة (أو C / D snoRNAs) أعرب فقط من أليل الأب. نحن هنا تبين أن منطقة المصب من الجين GTL2 يتميز أيضا من قبل وحدة النسخ التي تغطي العديد من تكرار ترميز إنترون C / D الجينات snoRNA، ومعظمهم من مرتبة إلى قسمين صفائف جنبا إلى جنب من 31 و 9 نسخ. يثير الاهتمام والفضول، وهذه snoRNAs تحيد عن ذكر سابقا الريباسي أو snRNA أدلة مثيلة من قبل التعبير الأنسجة محددة، وبسبب عدم وجود التكامل لالريباسي أو snRNA ضمن تسلسلها. تحليل المنطقة orthologous في الماوس يظهر أن ذكرت سابقا أمهات وأعرب ريان الجينات، وتقع المصب من Gtl2 على القاصي 12 كروموسوم، بترميز لا يقل عن تسعة C / D snoRNAs. من خلال البحث المنهجي في القوارض، فإننا لا يمكن التعرف أخرى C / D الجينات snoRNA في هذا المجال. جميع snoRNAs التعرف على الماوس القاصي ال 12 هي الدماغ محددة، وأعرب فقط من أليل ورثت أمومي. مطبوع الإنسان وبالتالي أسهم 14q32 مجال ميزات الجينومية مشتركة مع مطبوع مواضع 15q11-Q13. هذا الرابط بين المتكررة tandemly C / D الجينات snoRNA ويطبع الجينومية يشير إلى وجود دور لهذه snoRNAs و / أو المضيف غير الترميز جينات الحمض النووي الريبي في تطور و / أو آلية عملية يطبع جينية.
مقدمة

مجموعة فرعية من الجينات الثدييات تخضع يطبع الجينومية، ظاهرة جينية الذي يحدد (يتم التعبير فقط أليل الموروثة من الأب أو من الأم) التعبير الجيني (أو القمع) وفقا لأصل الوالدين. وغالبا ما تتجمع الجينات مطبوع، وتوقع عدة شبكات التعبير الجيني التنظيمي للعمل في نفس مكان مطبوع، التي تنطوي على مثيلة أليل محددة، وتعديل لونين، الرنا العقاقير، والحدود لونين وكواتم الصوت (+1 - +4). ومع ذلك، إذا ميزات الجينومية مشتركة تمنح السيطرة جينية المحلية موجودة ضمن المجالات مطبوع، لم يتم تحديدها بعد.
ومن بين المجالات مطبوع درست بشكل مكثف هي عامل النمو 2 (IGF2) / H19 النطاق الذي يشبه الانسولين وPWS / AS المنطقة تشارك في بيكويث-فيدمان وبرادر ويلي / المتلازمات Angelman، على التوالي. يقع IGF2 / H19 المجال في موضع 11p15.5 البشري (الماوس كروموسوم 7F) وتمتلك اثنين وعلى أساس المعاملة بالمثل، أعرب المشارك الجينات مطبوع تقع 70 كيلو بايت بعيدا في نهاية واحدة من مجموعة كبيرة من الجينات مطبوع. في IGF2 / H19، وتوسط في الدية محددة التعبير الجيني عن طريق المنطقة ميثليته تفاضلي سلالة الجرثومية محددة (DMR) الواقعة بين IGF2 وH19 الذي يعمل كعنصر عازل على ربط CTCF، وهو بروتين ملزمة DNA حساسة للمثيلة ( +5 - +8). يتميز / Angelman المنطقة متلازمة الكروموسومات برادر ويلي في 15q11q13 الإنسان (الماوس كروموسوم 7C) من خلال كتلة أخرى الجينات التي تحتوي على العديد من الجينات التي أعرب عنها أبويا (وbicistronic موضع SNURF-SNRPN وMKRN3، NDN وMAGEL2 الجينات)، في حين أن اثنين من الجينات، UBE3A وATP10C، يتم التعبير عن أليل ورثت أمومي (9). ويتم تنسيق التعبير مطبوع ضمن هذا كبير (حوالي 2-3 ميغابايت) المجال عن طريق العنصر رابطة الدول المستقلة ثنائية -acting مشتملا على DMR ويقع المنبع من أعرب أبويا SNURF-SNRPN الجين (+10 - 13).
نحن وغيرنا أظهرت مؤخرا أن برادر ويلي / Angelman المنطقة متلازمة الكروموسومات ونظيرتها في الماوس أيضا ترميز متعددة، C المتكررة tandemly / صناديق D تحتوي على جينات الحمض النووي الريبي نويي صغيرة (أو C / D snoRNAs) أعرب فقط من كروموسوم الأب ( 14 - 17). C / D snoRNAs دليل تشكيل 2'- O methylations كل من الريباسي وU snRNAs من خلال الطباعة على الوجهين RNA محددة في كل موقع التعديل (18 - 20). ومع ذلك، فإن C / D snoRNAs في PWS تفتقر شريحة العقاقير الكنسي ضد الريباسي و / أو U snRNAs، مما يشير إلى أنها يمكن أن يكون لها وظائف أخرى أو تعديل الرنا الخلوية الأخرى مثل مرنا (14). بشكل ملحوظ، Runte وزملاؤه (21 أظهرت) مؤخرا أن جميع snoRNAs بشر PWS ترميز ومعالجة من واحدة وحدة النسخ أعرب أبويا. ويبدأ في IC والتداخل في UBE3A الجينات أعربت أمهات في اتجاه العقاقير. حذف PWS-IC على أليل الأب في نتائج الماوس في فقدان Ube3a التعبير العقاقير وتفعيل أليل Ube3a الأب (22). على الرغم من وجود آلية لونين-RNA مستقل قد يكون متورطا في هذه اللائحة، هذه الملاحظة تثير احتمال وجود دور لهذا المضيف الجينات snoRNA في إسكات الأب التعبير UBE3A الجين (+21 - 23).
في الواقع، هناك العديد من الأمثلة من مطبوع، الجينات المكودة للبروتين يتم ربط فعليا إلى الرنا غير الترميز واظهار نمط التعبير مطبوع على أساس المعاملة بالمثل. كتب من كروموسوم الوالدي آخر، أعربت هذه monoallelically، وكثيرا ما كتب غير الترميز الرنا كما الرنا العقاقير بالنسبة إلى المعنى، الجينات المكودة للبروتين: Igf2r / الهواء (24)، KVLQT / LIT1 (25)، UBE3A / UBE3A-AS (21، 23) وNesp / Nesp-AS (26). ويمكن أيضا مطبوع على أساس المعاملة بالمثل الرنا غير المكودة أن كتب في نفس الاتجاه كما الجين ترميز البروتين، كما هو موضح لكل من Igf2 / H19 وDlk1 / Gtl2 المجالات مطبوع (3). في معظم الحالات، تبقى وظيفة هذه الرنا التي ستنشأ، ولكن تشير الأدلة المتاحة إلى أن هذا معينة تنظيم الجينات بالنسبة لعناصر التحكم الإقليمية أمر حاسم في تنظيم اثنين من أزواج من الجينات مطبوع على أساس المعاملة بالمثل (3، 27 - 29).
مثل اثنين من مجموعات أفضل-تتميز الجينات مطبوع في الكروموسومات 11p15.5 و15q11q13 والبيانات الأخيرة تشير إلى أن المنطقة DLK1-GTL2 على الصبغي 14q32 / الماوس القاصي 12 قد يكون أيضا جزءا من كتلة أكبر من الجينات مطبوع. وإن كانت لا تزال قيد التحقيق، وقد درس تنظيم الجينات في هذا الموضع في الأغنام والإنسان، حيث اثنين من الجينات المصب GTL2، وهي PEG11 وMEG8، وقد وصفت ويظهر في الأغنام لعرض أليلية الأب محددة والأمهات محددة التعبير، على التوالي (30، 31). في الماوس، ريان، وهو غير المشفر RNA الدماغ محددة أعرب عن أليل الأمهات، كما تم تعيينها إلى هذه المنطقة، على الرغم من موقعها قريب دقيقة لGtl2 لم تحدد (32). تحليل الجينومي المقارن من المجالات مطبوع بين أو داخل الأنواع يمكن تحديد ملامح الجينومية الحفظ التي قد تكون مهمة وظيفيا في السيطرة يطبع (31، 33 - +36). باستخدام هذا النهج، وصفنا هنا تحديد المتكررة tandemly C / D snoRNA الجينات الموجودة في الإنسان 14q32 مكان، المتاخمة للمطبوع مجال DLK1 / GTL2. وإنترون ترميز معظم هذه ومعالجتها من تعيين وحدة النسخ معقدة إلى هذا الجين MEG8. وعلاوة على ذلك، حددنا أخرى المفترض C / D snoRNA الجينات في مواضع orthologous في القوارض. كل هذه C / D snoRNAs هي الدماغ محددة، وأعرب عن أليل الأمهات فقط. وهكذا، مطبوع الإنسان 14q32 سهم مجال ميزات الجينومية مشتركة مع برادر-فيلي / Angelman المنطقة متلازمة الكروموسومات (الشكل 1 A).

الشكل 1. تحديد المتكررة tandemly C / D snoRNA الجينات في الإنسان 14q32 موضع مطبوع. (A) ميزات يطبع الشائعة التي تم تحديدها في مواضع البشري ثلاثة مطبوع في 11p15.5، 14q32 و15q11q13. يتم إظهار موقف واتجاه النسخ من عدة جينات مطبوع في كل مكان الإنسان مطبوع بواسطة الساحات والسهام، على التوالي. يتم التعبير عن جينات زرقاء أبويا في حين يتم التعبير عن تلك الوردي من أليل الأمهات فقط. الوضع يطبع من المربعات البيضاء لا يزال يتم إيداعه الإنسان. وصفت الجينات C / D snoRNA في 14q32 وعلى 15q11q13 بواسطة أشرطة عمودية [نلاحظ أن HBII-13 (14) وHBII-436، HBII-437 وHBII-438A / B snoRNAs (21) غير مبين]، مع يجري وأشار عدد من الجينات snoRNA أدناه. يتم تمثيل العديد من المناطق مميثل تفاضلي تتميز في كل مواضع المجال من قبل الدوائر (شغل والمناطق مثيلة؛ المفتوحة والمناطق unmethylated). IC، يطبع المركز؛ حصيرة وبات، أمهات وأبويا ورثت الكروموسومات. يتم تمثيل تسلسل متكررة من A-نوع (22 نسخة) أو B من نوع (6 نسخ) في تكرار الكتلة (كتلة R) من خلال الأشكال البيضاوية مفتوحة وشغل على التوالي. تتميز منظمة الجينات هيكلية مشتركة بين ومحاصر هذه المكاني مطبوع. (B) C / D snoRNAs في الإنسان 14q32 وإنترون ترميز ومعالجة من نص واحد. التمثيل التخطيطي للمنطقة الجينومية تمتد المجموعات الثلاث للتسلسل المتكررة (مشتقة من AL117190 وAL132709 استنساخ). يشار إلى جينات C / D snoRNA بواسطة أشرطة عمودية [الأحمر، 14Q (0) snoRNA. البني، 14Q (I) snoRNAs. أخضر، 14Q (II) snoRNAs]، في حين الإكسونات الكشف عنها بواسطة الجينومية التكنولوجيات السليمة بيئيا مقارنة / أو التي تنبأ بها في تحليل سيليكون ويتم تمثيل مربعات سوداء أو بيضاء، على التوالي. الخطوط المنقطة وشغل تدل الأحداث الربط التي تم تحديدها من خلال تحليل التكنولوجيات السليمة بيئيا أو التجارب RT-PCR، على التوالي. مواقف النوكليوتيدات الإكسونات داخل AL117190:؛ (-134517؟) (138432-138562). (145574-145640). (146416-146610). (149709-149772). (152908-152998). (154149-؟)؛ ضمن AL132709 (عكس حبلا التكميلية): (5510-5582)؛ (7041-7109)؛ (12940-12993)؛ (14714-14827)؛ (16345-16430)؛ (17822-17898)؛ (19307-19392)؛ (21704-21780)؛ (23751-23814)؛ (25976-26062)؛ (27920-27979)؛ (28466-28538)؛ (29344-29414)؛ (30374-30436)؛ (31363-؟)؛ (32906-32986)؛ (33864-33948)؛ (34827-34891)؛ (37204-37285) (43295-43381)؛ (44257-44334)؛ (45587-45677)؛ (46581-46641)؛ (47590-47666)؛ (48401-48487)؛ (51206-51288)؛ (53068-53145)؛ (54353-54438)؛ (55008-55094)؛ (55897-55983)؛ (56547-56636)؛ (59519-59605)؛ (60516-60602)؛ (61446-61527)؛ (62403-62484)؛ (63290-63376)؛ (64597-64682)؛ (65561-65648)؛ (66486-66572)؛ (68636-68714)؛ (-89220؟)؛ (106288-106357). (-123635؟)؛ (123746-123858). (123948-124126). (130009-130211). (130544-؟)؛ (-148997؟)؛ (149384-؟)؛ (-150933؟)؛ (151301-؟). يشار إلى المواقف النوكليوتيدات الإكسونات توقع بخط مائل. رموز أخرى كما في (A). لا يتم رسم هذه الرسوم على نطاق كبير.

النتائج

البحث عن tandemly المتكررة C / D snoRNA الجينات في الإنسان 14q32

حددنا مؤخرا الفئران C / D snoRNA، RBII-36، المشفرة في جين فرقة البحث (37). تنظيم الجينات ونمط التعبير الأنسجة محددة من RBII-36 تشبه إلى حد كبير تلك من مطبوع C / D snoRNAs في الإنسان مواضع 15q11-13 / الماوس 7C (14، 38). وRBII-36 snoRNA خرائط الجينات ل6q31q32، وهو موضع هذا هو orthologous لكروموسوم الماوس البعيدة 12 والبشري 14q32، التي تؤوي جينات مطبوع. بين الجينات مطبوع الأكثر تتميز جيدا في هذا الموضع هي Dlk1، جين أعرب أبويا ترميز البروتين غشاء سطح الخلية الأسرة الشق دلتا، وGtl2 / Meg3، جين أعربت أمهات تقع 80 كيلو بايت المصب وتفتقر إلى الحفاظ القراءة المفتوحة إطارات (39، 40). لتحديد المتماثلات الإنسان المفترضة الجينات RBII-36 snoRNA، بحثنا في الإنسان 14q32 موضع مطبوع لوجود tandemly المباشر المتكررة C / D snoRNAs. ثلاث مجموعات تكرار المباشر (مجموعتين snoRNA الأول والثاني ومجموعة واحدة من يكرر المباشرة، مجموعة R) تم الكشف في BAC تتابعات AL132709 (الشكل 1 B). المجموعة الأولى (موقف النوكليوتيدات ~3700-24700) والمجموعة الثانية (موقف النوكليوتيدات ~28750-72260)، وتقع على بعد نحو 40 كيلو بايت المصب من PEG11 ويحتوي على 9 و 31 نسخ على التوالي من 70-75 طويلة NT المتعلقة snoRNA الشبيهة تسلسل (الشكل 2 A). نسخ من هذه المتتاليات snoRNA تشبه تحتوي على خاصية C / D '/ C' / D الزخارف (بهذا الترتيب)، وكذلك محطة 5'-3 'هيكل الجذعية اظهار تسلسل الحفاظ 5'-GGACC ... GGTCC-3 ". وعلى الرغم من التشابه العام المرتفع نسبيا من النسخ snoRNA الجينات داخل كل مجموعة، مساحات تسلسلها المنبع من أي مربع D أو مربع D 'المعرض عدد كبير من الخلافات النوكليوتيدات بين النسخ، كما يتضح للحصول على نسخ snoRNA ضمن المجموعة الأولى، ولا تمثل عناصر العقاقير المحتملة ضد الريباسي أو U snRNAs (الشكل 2 A). وعلاوة على ذلك، بالاتفاق مع فشلنا في كشف محددة RBII-36 المتماثلات في الإنسان (37)، فإن أيا من هذه المتتاليات يظهر التشابه مع الفئران RBII-36 snoRNA. وبالتالي تمثل هذه السلاسل البشرية رواية C / D الجينات snoRNA، ونقترح تسميتها 14Q (I) و14Q (II) للsnoRNAs المشفرة في المجموعتين الأولى والثانية، على التوالي. من خلال التركيز على تسلسل الحفظ بين الإنسان والأغنام MEG8، كنا قادرين على تحديد الثالث ترميز إنترون C / D snoRNA الجينات الحاضر كما نسخة واحدة وتسمى 14Q (0) نظرا لأنه لا ينتمي إلى كتلة (الشكل 1) . مرة أخرى، هذا C / D snoRNA، حفظا بين الإنسان والأغنام (الشكل 2 A)، لا تحتوي على أي عنصر العقاقير واضح ضد rRNAs أو U snRNAs. أدى إلى مزيد من التحليل المصب من snoRNAs (موقف النوكليوتيدات ~102260-144600) في تحديد فئتين من ~80-100 يكرر المباشرة الإقليم الشمالي طويلة (22 و 6 نسخ من A- و B-نوع، على التوالي) التي لا تظهر snoRNA بصمات (الشكلان 1 و 2 B). كلها في اتجاه الرأس إلى الذيل، مع تباعد غير منتظم نسبيا بين A يكرر، في حين تتجمع خمسة من ستة يكرر B وفصلها عن بعضها البعض من خلال تسلسل 350-380 هل NT-طويلة. ومن المثير للاهتمام، واحدة من هذه التكرارات، A22، وجزءا لا يتجزأ من داخل جزيرة الدليل السياسي الشامل الحفظ في نهاية المجموعة R (الشكل 1 B).

الشكل 2. تسلسل محاذاة C البشري المتكررة / الجينات D snoRNA وألف ويكرر B. (A) تسلسل محاذاة بشر 14Q (I) و14Q (II) نسخ الجينات snoRNA ضمن المجموعتين الأولى والثانية على التوالي، و14Q (0) الجينات البشرية / الأغنام snoRNA. مواقف النوكليوتيدات الجينات snoRNA داخل BAC AL117190 [14Q (0)]. AL132709 [14Q (I) و14Q (II)] وAF354168 [الأغنام 14Q (0)] وترد بين قوسين. مربع C / C "ومربع D / D 'ومحاصر الزخارف وأشارت الجذعية محطة 5'-3" من قبل السهام في الاتجاه المعاكس. (B) تسلسل محاذاة A و B يكرر. وتظهر مواقف النوكليوتيدات من هذه التكرارات داخل AL132709 بين قوسين. وتدل الحفاظ على كل موقف النوكليوتيدات بواسطة التظليل وفقا لبرنامج GeneDoc: أسود (100٪)، والرمادي الداكن (80-99٪) والرمادي واضح (60-79٪).

وC / D snoRNAs وإنترون ترميز ومعالجة من غير الترميز RNA MEG8 البشري الأنسجة محددة

لمعرفة المزيد عن تنظيم الجينات snoRNA وطريقة التركيب الحيوي، تم تفتيش بنك الجينات للعلامات تسلسل أعرب (التكنولوجيات السليمة بيئيا) التي تغطي مجموعات الجينات snoRNA. حددنا عدة التكنولوجيات السليمة بيئيا الإنسان تقسم والإكسونات المفترضة تداخل هذه المنطقة، والتي يبدو أن تخلو من مهمة ترميز البروتين إمكانية (الشكل 1 B). كشفت مقارنات تسلسل الجينوم وكدنا] وتحليل RT-PCR أن معظم tandemly المتكررة جينات C / D snoRNA وأيضا يتم وضع عدة يكرر A و B ضمن الإنترونات (الشكل 1 B). ومن المثير للاهتمام، وAW026953 EST يربط بوضوح "جزء من MEG8 RNA مع 5 '3 نهاية الكتلة الجين snoRNA I. الكتل الأول والثاني يبدو أيضا أن كتب من نفس الوحدة، على النحو الذي اقترحه تسلسل منتج RT-PCR 2 (الشكل 1 B) تداخل هذين النوعين من الجينات snoRNA. مجتمعة، تشير إلى هذا التحليل أن أنواع جديدة من ثلاثة snoRNAs بشر تتم معالجة من وحدة واحدة النسخ التي تتضمن MEG8 غير الترميز الجيني RNA. وأظهر تحليل لطخة الشمالي أجريت على الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من لجنة مكونة من أنسجة الإنسان أن ثلاثة C / D snoRNAs، 14Q (0)، 14Q (I) و14Q (II)، يحمل نفس نمط التعبير الأنسجة محددة. وقد لوحظ أقوى تعبير عن الدماغ والأغشية المخاطية الرحم وإلى حد أقل في القلب، بينما يمكن اكتشافه إلا إشارة باهتة جدا لجميع الأنسجة البشرية الأخرى تحليلها (الشكل 3). تم مقارنة هذا نمط التعبير مع أن من snoRNAs المشفرة في 15q11-Q13. بينما HBII-52 snoRNA الكشف فقط في الدماغ، تم الكشف عن HBII-85 عند مستويات مرتفعة نسبيا في الدماغ والأغشية المخاطية الرحم والكلى وعند مستويات منخفضة في العديد من الأنسجة الأخرى (الشكل 3) (14).

الشكل 3. التعبير الأنسجة محددة من snoRNAs رواية تحليلها بواسطة التهجين الشمالي. مجموع الرنا (5 ميكروغرام / حارة) تم شراؤها من Clontech (الممرات 1-6) أو المستخرجة من أنسجة الإنسان البالغ العادي (الحارات 7 و 8) ومجزأة على 6٪ هلام الأكريلاميد / 7 م اليوريا وتحليلها بواسطة لطخة الشمالية مع 32 P وصفت تحقيقات قليل النوكليوتيد ضد 14q32- أو snoRNAs 15q11q13 المشفرة (انظر المواد وطرق). كما تم استخدام A 5.8S الريباسي مسبار للسيطرة هلام التحميل. M، العلامة DNA.

نص ريان أعربت أمهات في الماوس القاصي 12 كروموسوم بترميز لا يقل عن 9 C / D snoRNAs

Hatada وآخرون. (32) وصفه مؤخرا رواية 5.4 كيلوبايت أعربت أمهات غير ترميز الجين RNA الدماغ محددة، واسمه ريان، الذي يرتبط ارتباطا وثيقا الجينات Gtl2 على القاصي كروموسوم الماوس 12. BLAST البحث في قواعد البيانات N حددت عدة التكنولوجيات السليمة بيئيا الماوس إيجابية للريان (لا تظهر البيانات)، من بينها AK017440 كدنا] إيواء أربعة قطاعات اظهار هوية 100٪ للنسخة ريان. وكشف تحليل تسلسل أن هذه القطاعات من التماثل تتوافق مع الإكسونات (الإكسونات لد)، لأنها توقفت بسبب تسلسل عرض المانحة لصق والتوافق متقبل بصمات intronic عند كلا الطرفين (لا تظهر البيانات؛ الشكل 4 A). وعلاوة على ذلك، كما يعرض AK017440 التماثل مع ماوس contig 43 كيلو بايت لمدة 474407. بواسطة مزيد من التحليل تسلسل، فإننا لا يمكن تحديد داخل AK017440 الإكسونات تقسم إضافية (ط ه)، مما يشير بقوة إلى أن هذا الجين ريان، كما هو موضح في الأصل، قد تمثل RNA العمليات: وسيطة. بشكل ملحوظ، كما يشارك AK017440 كدنا] بعض تسلسل وسمات هيكلية مشتركة مع الفئران فرقة البحث كدنا]. أولا، ريان اكسون ج يعرض٪ هوية 80 إلى الإكسونات E1 المتكررة من فرقة البحث RNA (37) (الشكل 4 A). ثانيا، ريان وفرقة البحث cDNAs كل من المعرض سلسلة اكسون E2 الحفظ (هوية 82٪) تليها مباشرة عنصر المتكررة Lx7 / LINE1. ثالثا، متواليات من فرقة البحث وريان إنترونات مشاركة متشابهة جدا من بعضها البعض (مع اثنين من ~264 و 155 قطاعات الإقليم الشمالي طويلة اظهار 72٪ و٪ 76 الهوية؛ الشكل 4 A). ودفعت هذه السمات المشتركة لنا للبحث عن وجود snoRNAs ذات الصلة RBII-36 داخل الجين ريان. نحن يمكن تحديد تسعة جينات C / D snoRNAs، وكلها إنترون ترميز (الشكل 4 A). والمثير للدهشة، فهي لا تعرض تناظر كبير مع RBII-36، وهي متباينة نسبيا من بعضها البعض (الشكل 4 B). C / D snoRNAs تقع ضمن الإنترونات 3 و 6 تتوافق مع الماوس MBII-426 وMBII-343 snoRNAs، على التوالي، وتتميز في السابق من خلال تحليل مكتبة كدنا] (41). أما بالنسبة الآخر C مطبوع / D snoRNAs، ونحن لا يمكن الكشف عن الأهداف المحتملة RNA الخلوية على أساس التكامل المناسب. ومن المثير للاهتمام، عدة نسخ من الكتلة snoRNA ذات الصلة 426 MBII-343 / المعرض تناظر كبير مع عدة نسخ snoRNA ضمن المجموعة البشرية II، مما يدل على أن snoRNAs Rian- المشفرة قد يكون نظرائهم من القوارض البشري 14Q (II) snoRNAs (الشكل 5 الف باء).

الرقم 4. الماوس أعربت أمهات ريان الجين يشفر تسع ذي صلة C / D snoRNAs. (A) التمثيل التخطيطي للجين ريان (contig 474407)، hemiprocessed ريان RNA (AB063319) كما هو موضح في (32)، تقسم بشكل كامل ريان RNA (AK017440 )، وجين فرقة البحث (AB014883) وتقسم فرقة البحث الرنا كما هو موضح في (37). وصفت الإكسونات من قبل صناديق، إنترونات بواسطة خط أفقي سميكة وsnoRNAs بواسطة شريط عمودي. الإكسونات ريان مماثلة ارتباطا وثيقا المتكررة E1 و E2 فرقة البحث الإكسونات (37 تمتلئ) في الرمادي والأسود، على التوالي. هو الرمز العنصر المتكرر Lx7LINE / L1 في نهاية 3 'من كلا تقسم فرقة البحث وريان الرنا التي كتبها مربع فقست. يتم الرمز سلاسل intron المحفوظة بين الماوس ريان والفئران الجينات فرقة البحث من قبل صناديق المنقطة (البيضاوي الأسود بين يصور عنصر ID المتكررة في فرقة البحث INTRON لم يتم العثور داخل الجين ريان). (B) تسلسل محاذاة جينات C / D snoRNA المشفرة في إنترونات ريان. وتظهر مواقف النوكليوتيدات C / D snoRNAs داخل contig 474407 بين قوسين. الرموز كما في الشكل. 2. -encoded نسب متوسط ​​الهوية لتسلسل إجماع ريان snoRNAs وRBII-36 snoRNA هي 70.6٪ و 88.7٪ على التوالي (وفقا لبرنامج GeneDoc).


الرقم 5. تحديد الجينات C / D snoRNA في الثدييات المكاني الكروموسومات orthologous لالبشري 14q32. (A) موقع الجينومي للC / D snoRNAs في عدة مواضع الثدييات. يتم تمثيل الجينات C / D snoRNA بواسطة أشرطة سوداء العمودية. المواقع النسبية للsnoRNAs داخل BAC AC096504 استنساخ (48 قطعة غير مرتبة) ومواقف الماوس contigs 064202871، 116642 474407 وتم اختيارها بشكل تعسفي. تسلسل تناظر بين القوارض وC البشرية / وتدل D snoRNAs من قبل الخطوط المنقطة (تظهر فقط عدة homologies). ضمن AC096504، وتقع snoRNAs ذات الصلة 19 RBII-78 / في 45772-45843، 46637-46708، 77115-77186 77980-78049 و، RBII-49 في 58٬503-58٬566 وRBII 48 في 37٬220-37٬289. ضمن contig 064202871، وتقع snoRNAs ذات الصلة 19 MBII-78 / في 11698-11764، 12553-12625، 13272-13344، 14137-14209 14747-14819 و. ضمن contig 474407، ويقع MBII 48 snoRNA في 17٬568-17٬637 وMBII-49 في 24٬393-24٬459. لا يتم رسم هذه الرسوم إلى مقياس. (B) تسلسل محاذاة المفترض الثدييات C / D المتماثلات snoRNA من 14Q (0) snoRNA (أعلى)، 14Q (1) snoRNA (وسط) و14Q (II) snoRNA (القاع). الرموز كما في الشكل. 2 A. (C) MBII-48، MBII-49 وغيرها المرافقة C / D snoRNAs كما ترميز إنترون داخل الجين ريان. مواقف النوكليوتيدات الإكسونات داخل contig 474407: (1867-1954)؛ (6656-6730)؛ (8603-8708)؛ (15831-15923)؛ (16949-17012)؛ (19394-19481)؛ (24120-24207)؛ (24969-25016)؛ (26817-26872؟)؛ (27404-28312)؛ (30711-30799)؛ (31629-31714)؛ (32570-32656)؛ (33416-33495)؛ (35843-35980)؛ (37406-37491)؛ (38345-38388)؛ (39610-39678)؛ (41280-41364). اكسون شدد قد تمثل تقسم بدلا من ذلك، snoRNA1 التي تحتوي على المنتج. رموز أخرى كما في التين 1 B و 4 A.

تحديد الإضافي C / D snoRNAs في 6q31 الجرذان والفئران كروموسوم القاصي 12

للحصول على مزيد من المعلومات حول الوضع يطبع من الجينات المشفرة snoRNA في الإنسان 14q32، تم تفتيش مواضع الثدييات orthologous منهجي لوجود المفترضة C / D snoRNAs. خلال هذا العمل، تم إيداع جزء من الفئران فرقة البحث موضع الجيني في بنك الجينات (الانضمام لا. AC096504)؛ 33 نسخ من RBII-36 (الشكل 5 تم الكشف عن) فضلا عن 7 جينات C / D snoRNA أخرى في هذا الجزء. أربعة من هذه ترتبط مع بعضها البعض وعلى غرار التي سبق تحديدها الماوس MBII-19 و MBII-78 snoRNAs (41)، والتي يبدو من المحتمل أن تمثل المتغيرات من نفس النوع snoRNA (لا تظهر البيانات). الآخر الفئران C ثلاثة / الجينات D snoRNA عرض التماثل القوي الماوس C / D snoRNA MBII-48 و MBII-49 (الشكل 5) (41)، وكذلك اهتمام إلى عدة 14Q (I) snoRNA نسخ الجينات البشرية (الشكل . 5 B). من خلال عمليات البحث BLAST، فإننا ثم ركز اهتمامنا على منظمة الجينوم من المتماثلات الماوس. ومن المثير للاهتمام، MBII-48 و MBII-49 snoRNAs كان كلا الكشف داخل contig 474407 تحتوي على الجين ريان (الشكل 5 أ)، بالإضافة إلى عدد آخر من C / D snoRNAs التي ترتبط بشكل أخص لبعض 14Q البشرية (I) نسخ snoRNA (الشكل 5 B). باستخدام البحث BLAT الماوس في http://genome.ucsc.edu/، ونديد الماوس المفترضة من 14Q الإنسان (0) snoRNA (الشكل 5 B) تم الكشف أيضا داخل contig 116642 جزءا لا يتجزأ من داخل المنطقة من التماثل القوي ل MEG8 الإنسان. وأكد 064202871. تحليل PCR لتتميز جزئيا BAC تحتوي على Gtl2 (RP23-60E10) وأخيرا، تم العثور على خمس ذات الصلة C / D snoRNAs، بما في ذلك MBII-19 و MBII-78 snoRNAs أيضا داخل الماوس contig أن هذه الجينات snoRNA يتم ترميز بالفعل من قبل الماوس البعيدة 12 منطقة مطبوع (لا تظهر البيانات). وأظهرت التجارب RT-PCR وتحليل التكنولوجيات السليمة بيئيا الماوس تداخل الجينات الماوس snoRNA أن MBII-48، MBII-49 وغيرها المرافقة C / D snoRNAs كما إنترون ترميز ومعالجة من نص مرتبطة فعليا إلى ريان RNA (الشكل 5 C ). العديد من هذه الجينات القوارض snoRNA تحتوي على واحد أو اثنين من التبديلات قاعدة داخل الزخارف C / D (الشكل 5 B)، وربما يمكن أن تكون غير مستقرة أو غير وظيفية. واتساقا مع ذلك، كان تعبيرا عن العديد منهم لا يمكن الكشف عنها على لطخة الشمالية (لا تظهر البيانات).

ومطبوع على C الدماغ محددة / D snoRNAs في الماوس

ويظهر تحليل الشمالي لطخة من الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من الأنسجة الماوس الكبار أن جميع الماوس C / D snoRNAs الموجود في كروموسوم الماوس البعيدة 12 يتم التعبير فقط داخل الدماغ. وتشمل هذه MBII-19، MBII-343 وMBII-426، والتي أبلغ عنها سابقا بتواجد مطلق أعرب، ربما نتيجة التحقيق عبر التهجين (الشكل 6 أ) (41). كما تم دراسة مستويات التعبير عن C / D snoRNAs في كروموسوم الماوس البعيدة 12 أثناء نمو المخ. (الشكل تحليل لطخة الشمالي يؤديها في مراحل النمو المختلفة 6 B) اظهرت ان جميع C / D snoRNAs الموجود في كروموسوم القاصي 12 يتم التعبير داخل الجنين (E11-E15)، الوليد (أيام بعد الولادة P0-P7) والكبار. أثناء تطور الجنين في الدماغ، ومستوى snoRNA التعبير ثابتا تقريبا أو زيادة طفيفة. هذا النمط التنموي التعبير يختلف كثيرا عن تلك التي لوحظت لMBII-52 وMBII-85 snoRNAs (المشفرة في كروموسوم 7C)، التي يتم التعبير عنها بشكل سيئ للغاية بين E11 E15 ولكن upregulated للغاية بعد الولادة.

الرقم 6. C / D الجينات snoRNA المشفرة في كروموسوم الماوس البعيدة 12 هي الدماغ محددة وأعربت فقط من الكروموسومات الأمهات. تم تحميل كل حارة مع 10 ميكروغرام من إجمالي الرنا المستخرجة من مختلف الأنسجة الماوس الكبار على النحو المحدد في الجزء العلوي من كل حارة في (A)، أو من تطوير أجنة الفئران (E11-E15) والوليد (P0-P7) أو العقول الكبار في (B)، أو من الأجنة (E15.5) مع إما الأم أو الأب disomy أحد الأبوين لكروموسوم 12 (matUPD12 وpatUPD12، على التوالي (55)) في (C). كانت مجزأة العينات على 6٪ الأكريلاميد / 7 م اليوريا هلام وتحليلها بواسطة لطخة الشمالية مع 32 تحقيقات قليل النوكليوتيد ف المسمى (انظر المواد وطرق). ولقد تم استخدام 5.8S الريباسي مسبار عن السيطرة هلام التحميل. وتم قياس كمية شدة إشارة (نسبة snoRNA / 5.8S الريباسي إشارة) مع تصوير فوجي-بس-1000. M، العلامة DNA.

نحن بعد ذلك فحص ما إذا كانت C / D snoRNAs تعرضوا ليطبع الجينومية كما تنبأ عن الجينات المشفرة ضمن هذا الفأر القاصي كروموسوم 12 منطقة. كما هو مبين في الشكل 6 C والأجنة E15.5 مع اثنين من الكروموزومات الأمهات 12 (matUPD12) تعبر عن جميع C / D snoRNAs تحليلها. وعلاوة على ذلك، بالنسبة لمعظمها، ومستوى التعبير هو تقريبا ضعف ما ينظر للأجنة طبيعية على النحو الذي يحدده الكمي للإشارة التهجين (لا تظهر البيانات). على العكس من ذلك، تم الكشف عن أي من تلك snoRNAs في الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من الأجنة وجود اثنين من الكروموسومات الأبوية 12 (patUPD12)، وتبين أن كل هذه الجينات snoRNA ومطبوع وأعرب فقط من أليل الأمهات. كعنصر تحكم، ونحن أيضا فحص التعبير عن اثنين C / D snoRNAs تقع في 7C. كما هو متوقع، فإنها لم تتأثر في UPD12 الأجنة.

مناقشة

منظمة الجينومي المقارن والتعبير عن C / D snoRNAs في الإنسان 15q11-Q13 (الماوس 7C) و14q32 (الماوس القاصي 12)

مطبوع DLK1 / GTL2 وIGF2 / H19 المجالات في الإنسان 14q32 و11p15.5، على التوالي، يبدو أن مشاركة العديد من الميزات الجينومية وجينية التي يمكن أن تشارك في تنظيم هذه الأزواج اثنين من الجينات مطبوع على أساس المعاملة بالمثل (3، 35، 36، 39 ، 40، 42). في هذا العمل، وكرر tandemly متعددة الجينات C / D snoRNA في الإنسان مطبوع 14q32 وفي منطقتها orthologous على الماوس القاصي 12 كروموسوم تم تحديدها. هذه C / D snoRNAs لديهم تنظيم الجينات تذكر لافت للنظر من أن ذكرت سابقا لPWS / AS المنطقة (14 - 16) (الشكل 1 والجدول 1). في الواقع، وتتميز كل من مواضع مطبوع من قبل وحدة النسخ معقدة تمتد صفائف المشفرة tandemly C / الجينات D snoRNA، مما أدى إلى طائفة من تقسم بدلا من الرنا غير المكودة، وتتألف في معظمها من الإكسونات قصيرة المتكررة التي لم يتم حفظها بين القوارض البشرية و . تظهر كافة C ترميز 14q32 / D snoRNAs التي يمكن جنيها من وحدة النسخ الفريدة التي تشمل MEG8، على غرار C PWS ترميز / D snoRNA (21) (الشكل 1 B). ومع ذلك، على الرغم من المنظمات الجينات المرتبطة بها، ومواضع اثنين تختلف في كل نمط snoRNA التعبير وميزات الجينومية حول جينات المضيف snoRNA. في حين أن الأنواع الثلاثة المختلفة snoRNA المشفرة في الإنسان 14q32 لها نفس نمط التعبير الأنسجة محددة، وأنماط التعبير من HBII-52 وHBII-85 snoRNAs في PWS / AS المنطقة تختلف كثيرا عن بعضها البعض (الشكل 3). منذ يتم إنتاج snoRNAs PWS ترميز من النسخة الأولية نفسه (21)، وهذا قد يعكس الدماغ محددة تجهيز الفرق من الجزء القاصي أكثر من المضيف نسخة SNRPN-SNURF -snoRNA. على عكس snoRNAs بشر، عن الماوس القاصي 12 المشفرة-C / تم الكشف عن D snoRNAs أساسا داخل المخ، ومستوى التعبير هو متغير وفقا لأنواع snoRNA - ولكن دائما أقل من تلك التي snoRNAs 7C المشفرة، التي تعد من بين الأكثر وفرة C / D snoRNA داخل الدماغ (37، 41). يتم التعبير عن الماوس 7C المشفرة-C / snoRNAs D في الغالب في الكبار من أليل الأب (الشكل 6 B) (14)، في حين كتب الماوس البعيدة 12 snoRNAs من أليل الأمهات وأعرب خلال تطور الدماغ (الشكل 6 B، C). جينات المضيف snoRNA في 14q32 وعلى PWS / AS مجال تختلف بشكل كبير في محتواها من القواسم المشتركة تتخللها يكرر وتكوين قاعدة الإجمالي (الجدول 1). في كلتا الحالتين، لوحظ انتقال حاد في محتوى G + C عند حدود الكتل snoRNA الموافق زيادة مذهلة (14q32) أو نقصان (15q11q13) في تسلسل المرافقة (الشكل 7). قد يعكس التعبير الوالدين المتبادل للمجموعات snoRNA الجينات فيما يتعلق مضمونها G + C للصيانة تطورية أو وظيفة المناطق snoRNA بطرق غير مفهومة حتى الآن.

الرقم 7. DNA isochores تظهر الاختلافات في محتوى G + C داخل وحول التجمعات الجينات snoRNA في اثنين الإنسان مطبوع 15q11q13 و14q32 مواضع. في PWS / AS المنطقة، وأعرب أبويا الجينات snoRNA تكمن داخل (G + C) الغنية البيئة، بينما في 14q32 توجد جينات snoRNA أعربت أمهات ضمن (A + T) الغنية البيئة. يتم إعطاء أرقام انضمام تسلسل في قوس والموقف النسبي للجينات مطبوع (محاصر) وschematized.

C / D وظيفة snoRNA والتباعد التطوري

أدلة مثيلة هي جزيئات القديمة التطورية (الكشف على حد سواء في العتائق والخلايا حقيقية النواة) المطلوبة لتعديل لوحة كبيرة من الرنا الخلوية، بما في ذلك الرنا الريباسي (rRNAs) والرنا نووية صغيرة (snRNAs) (20)، tRNAs (43)، وربما من mRNAs ( 14). وC / D snoRNAs التعرف على اثنين من مواضع مطبوع تحيد عن غيرها من أدلة الحامض الثدييات المعروفة من قبل التعبير الأنسجة الخاصة بها (الشكلان 3 و 6 A). وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من معظم الآخرين C / D snoRNAs، لم ترد أي إحصائية التكامل كبير لالريباسي أو U snRNA داخل snoRNAs من مواضع مطبوع. كان HBII-52 الاستثناء الوحيد لهذا (14). توصيف الرنا الخلوية يحتمل أن تكون مستهدفة من قبل هذه C مطبوع / D snoRNAs يمثل تحديا جديرة بالاهتمام، ومنذ ذلك الحين تم اقتراح عدم وجود HBII-85 snoRNA التعبير للمساهمة في الظواهر PWS (44). على الرغم من أن الإنسان (MEG8)، والماوس (ريان) والفئران (BSR) snoRNA الجينات المضيفة تتقاسم توطين المادي المشترك، لا يتم الحفظ جدا تسلسل الحمض النووي، على غرار الجينات المضيف الإنسان والفأر في PWS / AS المنطقة (14 - 16). ومع ذلك، وعلى النقيض من PWS ترميز نسخ الجين snoRNA التي نسبيا المحفوظة جيدا بين بعضها البعض، -encoded للريان الماوس snoRNA نسخ الجينات، وأيضا إلى حد ما 14Q البشرية (I) و14Q (II) snoRNAs، هي إلى حد أكثر متباينة عن بعضها الآخر (التين 2 ألف و 4 B والجدول 1). عدم وجود ضغط قوي على اختيار شرائح تسلسل snoRNA المنبع من D / D 'بين الثدييات أو حتى بين النسخ snoRNA داخل الكتلة الجينات نفسها قد توحي بأن هذه C مطبوع / D snoRNAs تتطور بسرعة الجزيئات مع أهداف RNA المحتملة متعددة. بدلا من ذلك، وهذا قد يعزز فرضية أنها تمنح وظيفة تنظيمية الجينومية بدلا من البديل الموصوفة سابقا ظائف snoRNA (انظر أدناه).

الجدول 1. الجينات مطبوع snoRNA في الإنسان 15q11q13 و14q32 مواضع
وحسب تعريف برنامج GeneDoc.
ب وحدة تكرار تغطي snoRNA الجينات HBII-52 يحتوي على اثنين من الإكسونات المتكررة مختلفة. قيم جينوم الإنسان كاملة (57 ترد) بين قوسين.

كرر Tandemly C / D snoRNAs ويطبع

ومن المثير للاهتمام، و-3 5''الجذعية محطة معظم tandemly تكرار snoRNAs في 15q11q13 و14q32 مواضع المعرض تسلسل مماثل (الشكل 2 ألف والجدول 1) لا يشاركه فيها أي snoRNA أخرى بين عشرات بتواجد مطلق أعرب، وعدم C المتكررة / ذكرت D snoRNAs للثدييات (18، 41، 45). هذا يمكن أن يشير إلى أن الرواية snoRNAs المتكررة tandemly على اثنين من مواضع مطبوع كلها تطورت من سلف مشترك snoRNA الجينات أثناء تطور الثدييات. وقد اقترح العديد من الملاحظات التي جينات C / D snoRNA قد تمثل العناصر الوراثية المتنقلة (46، 47). وtandemly المتكررة صفائف snoRNA قد يؤدي بشكل جيد من retrotransposition من الجين snoRNA إلى إنترون تليها الازدواجية جنبا إلى جنب من إنترون والمرافقة اكسون. جيل من صفائف snoRNA المتكررة قد حدثت بعد إنشاء مركز مطبوع من هذه المكاني، مجرد يعكس حقيقة أنها تمثل "النقاط الساخنة" للأحداث التكامل DNA في سلالة الجرثومية، فيما يتعلق بنية الكروماتين معين. بدلا من ذلك، يمكن حدوثها قد سبقت يطبع وحتى لعبت دورا في إنشائها وصيانتها.
العديد من مواضع مطبوع تؤوي غير الترميز الرنا وجود تعبير مطبوع عكس ذلك من ربط الجينات المكودة للبروتين على نفس الكروموسومات، مما يزيد من احتمال وجود دور لهذه الرنا في إسكات (3، +27 - 29). ولذلك يمكن أن تشارك C / D snoRNA النصوص المضيف الجين في تنظيم الجينات، وربما بطريقة مماثلة لتلك التي من الرنا الكروموسومات الأخرى المشاركة في تعويض الجرعة أو مثل الهواء RNA، في تنظيم الجينات مطبوع في الماوس كروموسوم 17 (48، 49). ومع ذلك، لا يبدو أن الجينات snoRNA في 15q11q13 للعب دور محوري في عملية جينية، لأن الحذف الأب من Snrpn إلى الجين Ube3A في الماوس لا يؤثر على الوضع مطبوع من ان.دي.ان الجينات المنبع (50). بدلا من ذلك، وقد اقترح أن النسخ في الجزء الأقصى من المضيف الجينات snoRNA قد إسكات في رابطة الدول المستقلة وUbe3A التعبير الأب، إما عن طريق آليات العقاقير RNA أو عن طريق تغيير بنية الكروماتين المحلي (+21 - +23). سواء C / D snoRNA جينات المضيف في 14q32 أيضا التحكم في التعبير عن الجينات مطبوع المجاورة هو فرضية الجذابة التي يمكن اختبارها باستخدام نماذج الماوس.
وأخيرا، فمن الممكن أن وجود هذه snoRNAs يعكس وظيفة الدماغ محددة لهذه الجينات مطبوع. وPWS وAS المكاني، الذي يسبب اضطرابات عصبية واضحة، ترتبط إلى مكان يحتوي على snoRNAs. BWS (المرتبطة الكتلة مطبوع على 11p15.5، حيث لوحظ أي snoRNAs حتى الآن) هي متلازمة فرط جسدية مع عدم وجود دليل على مشاكل عصبية. ويرتبط يطبع الشاذة على الصبغي 14 مع كل من النمو والتشوهات العصبية في mUPD14 وpUPD14 الأفراد. في سن البلوغ المبكر المعرض السابق وهي من تأخر في النمو، في حين أن المرضى pUPD14 يكون عيوب في الهيكل العظمي المحوري والتخلف العقلي (+51 - +53). ومن المغري لجعل الجمعيات وظيفية بين منظمات نمو التنموية على الصبغي 11P وعلى 14Q، وبين الجينات snoRNA العصبية المحددة على الصبغي 15q وعلى 14Q.
في الختام، لقد أظهرنا أن موضع مطبوع الثاني في البشر، 14q32، بالإضافة إلى ذكر سابقا 15q11q13، بترميز صفائف تكرار tandemly C / الجينات D snoRNA، وأن هذه الميزة البارزة للمكان يتم حفظها في القوارض البشرية و. لقد فقط تم الكشف snoRNAs مطبوع ضمن الثدييات eutherian حتى الآن (15، 37). وبالنظر إلى أن يطبع الجينومية قد تقتصر على الجرابيات والثدييات المشيمية (54)، تحليل تسلسل مفصل للorthologous 14q32 و15q11q13 مواضع في الثدييات غير eutherian جنبا إلى جنب مع عمليات البحث تسلسل منهجي من مجموعة كبيرة من مواضع مطبوع في جينوم الثدييات ينبغي توفير مزيد من كررت التبصر في الأهمية المحتملة لهذه الجمعية المثيرة للاهتمام بين يطبع الجينومية وجود هذه tandemly غير عادي الجينات snoRNA.

المواد والأساليب

[أليغنوكليوتيد

كان كل توليفها من قبل هذه Y. دي بريفال (LBME، تولوز) على جهاز PerSeptive النظم البيولوجية تسرع. 14Q (0): 5'-GACCTCAGTGTTTTGTGCAGAAC-3؛ 14Q (I): 5'-TGGACCTCAGAGTTCCAGACACGTATTCA-3؛ 14 (II): TGATTCAGAC / TACCCCAG / CG / AG / ATACTCATC-3؛ MBII-48: 5'-ATAAGGGTTTAATCACTGTCCT CGGTCA-3؛ MBII-49: 5'-AATCCAGTATGTTGTCATCGTCTATG-3؛ MBII-19: 5'-CAGACATCTG TTCTCATGGCT-3؛ MBII-78: 5'-ACCTCAGATATCTGTTCATGTCA-3؛ MBII-52: 5'-CTGACGTAATCCTATTGAGCAT. MBII-85: 5'-ACAGAGTTTTCACTCATTTTGTTC-3؛ MBII-343: 5'-TCTCAG ACTTCCAGACATGTACT-3؛ MBII-426: 5'-TGATCTCAGAATTAAATTTGTCG-3، 5 'RT-PCR-2: 5'-CGCGGATCCGACGAGATTGGATTTGGTCATTTCC-3؛ 3 'RT-PCR-2: 5'-CCGGAATTCCAGGCTCCTACCCAGAGGCAACTG-3؛ 3 'RT-PCR1: 5'-CGCGGATCCTATTTGTCTCTATGCTCCTTACTC-3؛ 5 "RT-PCR1: 5'-GCGGAATTCTACATGGATCCCACTTTGGACAAAG-3؛ 5 "RT-PCR3: 5'-GCGGAAT- TCTGGATGCAATGAGCTGATCA-3؛ 3 'RT-PCR3: 5'-CGCGGATCCTGAGGCTCACAGAGGACGGCAG-3؛ 5 "RT-PCR4: 5'-CCGGAATTCGGATGGTTACTGTCTGAGACTGAG-3؛ 3 'RT-PCR4: 5'-CCGGAATTCTCATCTATCCTCCTGACTCAGGAC-3؛ 5 "RT-PCR5: 5'-CCGGAATTCTTGCATGCAAGCTCTACAGTTATGC-3؛ 3 'RT-PCR5: 5'-CCGGAATTCAGCTGCCGAGCTCCATCCACATGGT-3؛ 5 'MBII-19/78 كتلة: 5'-GGCTTTGATCCTT-CGGTTGGA-3؛ 3 'MBII-19/78 كتلة: 5'-CCCTTCT GCTCCAAGTTTGCCTA-3 ".

البحث عن tandemly تكرار C / D snoRNAs وتحليل تسلسل

وقد تم انتشال تسلسل BAC حول مواقع DLK1 / GTL2 من مشروع الجينوم البشري العامل مشروع (http://genome.ucsc.edu/)، تطهير للمشترك يتخلل يكرر باستخدام كرر المقنع (HTTP: //repeatmasker.genome واشنطن. ايدو / المجموعة الاستشارية لاندونيسيا بن / RepeatMasker) ومقارنة منهجية مع أنفسهم عن طريق تحليل dotplot أجرته PipMaker (http://bio.cse.psu.edu/). وقد تم الكشف عن C / D snoRNA تشبه سلاسل ويكرر أخرى في وقت لاحق من قبل BLAST2 تسلسل (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html). وقد تم تحديد الجزر الدليل السياسي الشامل وفقا لمشروع الجينوم البشري العامل مشروع شروحه. وقد تم الحصول على تسلسل المحاذاة إما عن طريق كلوستال W (http://clustalw.genome.ad.jp/) أو MultiAlin (HTTP: // prodes toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)، وكانت النيوكليوتيدات الحفظ تظلله GeneDoc (HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية Cris.com/~ketchup/genedoc.shtml). وقد تم إجراء تحليل DNA isochores باستخدام Isochore (EMBOSS) في http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/isochore.html.

الفئران مع matUPD12 وpatUPD12

تم إنشاء الأجنة E15.5 مع matUPD12 وpatUPD12 وتتزاحم الضابطة التي كتبها intercrossing الحيوانات الأم لاثنين من خلفيات وراثية مختلفة التي كانت الزيجوت مزدوجة لنقل المواقع روبرتسوني مع التماثل monobrachial لكروموسوم 12، كما هو موضح سابقا (55).

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل لطخة الشمالي

تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من خلال طريقة Chomczynski وساكي (56)، وتكييفها مع الظروف على النحو التالي. الأنسجة القوارض الطازجة وفقا لمبادئ توجيهية الفرنسية HO المؤسسية والمملكة المتحدة جمدت بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C. وكانت العينات المجمدة ثم المتجانس ومعلق في 1: 1 (المجلد: المجلد) خليط من (ط) 4 م guanidinium ثيوسيانات، 25 م سترات م الصوديوم (7.0 درجة الحموضة)، 0.5٪ Sarkosyl 0.1 م 2 المركابتويثانول و (ب) المياه الفينول -saturated. ثم أضيف هذا الخليط مع خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 4.0) إلى 0.1 متر. كانت مختلطة المحللة مع 0.1 حجم الكلوروفورم، بقوة vortexed وحضنت لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وقد عجلت RNA مع 2 حجم الإيثانول وتخزينها في -20 ° C. كانت مجزأة الرنا التي كتبها الكهربائي في 6٪ المواد الهلامية الأكريلاميد-7 م اليوريا، ونقل electrophoretically (120 دقيقة في 0.5 × TBE عند 1.0 A) إلى غشاء نايلون (Hybond N +، أمرشام) وcrosslinked بواسطة أشعة فوق البنفسجية (1200 J / سم 2، Stratalinker، Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا). أجريت التهجين وصمة عار الشمالية في وجود 5'نهاية 32 ف المسمى oligodeoxynucleotide التحقيق (500 000 نسخة في الدقيقة / مل) من خلال الحضانة بين عشية وضحاها في 50 درجة مئوية في 5 × SSPE، 1٪ SDS، 5 × دينهارت، على بعد 150 ميكروغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال الخميرة. وجرفت المياه الأغشية مرتين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 0.1 × SSPE / 0.1٪ SDS.

RT-PCR وكدنا] يستنسخ

عشرة ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع البشرية أو مخ الفأر وكتب العكسية في 42 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة، وذلك باستخدام مرتفع II (GIBCO BRL) مع الاشعال مسدوس عشوائية و1/40 من المنتجات كدنا] تضخيم بنسبة 40 دورات PCR مع طق البلمرة (PROMEGA ). المنتج PCR المستنسخة في في pGEM-T I نظام سهل ناقلات (PROMEGA) وIMAGE التكنولوجيات السليمة بيئيا استنساخ (T85042، AW026953، BF055187، AA451995، AA861571، AA910544، AA680166، AA910544 وAA433836) التي قدمتها المملكة المتحدة HGMP RC (HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية .hgmp.mrc.ac.uk /) تم متسلسلة من قبل نظام تحليل DNA CEQ 2000 (بيكمان).

شكر وتقدير

نشكر A. Hüttenhofer لإجراء مناقشات مفيدة في جميع أنحاء هذا العمل وC. Gaspin وP. Thebault للمساعدة في استخدام تحليل تسلسل التركيبات الناعمة. كما نشكر N. جوزيف لتقديم المساعدة التقنية في تسلسل الحمض النووي وY. دي بريفال لتخليق النوكليوتيد (IEFG 109). ونحن ممتنون لنيل Youngson وشاو بينغ لين للتعليق على المخطوطة. وأيد هذا العمل من جانب صناديق المختبرات من المركز الوطني الفرنسي للبحث العلمي وجامعة بول-ساباتتيه، تولوز، والمنح المقدمة من تولوز Genopole / القطب سانتيه (لJPB)، من La الدوري الفرنسي مناهضة للسرطان / COMITE دي هوت غارون ( لJC) ومن مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (لACFS).

ملاحظات

  • ↵ * لمن ينبغي أن تعالج المراسلات. هاتف: +33 5 61335934؛ فاكس: +33 5 61335886؛ البريد الإلكتروني: cavaille {في} ibcg.biotoul.fr
    المراسلات يمكن أيضا أن تكون موجهة إلى J.-P. Bachellerie.

المراجع

  • ↵
    تيلغمان، SM (1999) خطايا الآباء والأمهات: يطبع الجينومية في التنمية الثدييات الخليوي، 96، 185 -193.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ريك، W. والتر، J. (2001) يطبع الجينومية: تأثير الوالدين على الجينوم نات. القس جينيه.، 2، 21 -32.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    فيرغسون سميث، AC والصوراني، MA (2001) يطبع والتباين الجيني بين الوالدين الجينوم. العلوم، 293، 1086 -1089.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    بولسن، M. وفيرغسون سميث، AC (2001) الحامض النووي في يطبع الجيني، والتنمية، والمرض. J. Pathol.، 195، 97 -110.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    زابو، P.، تانغ، SH، Rentsendorj، A.، فايفر، GP ومان، JR (2000) آثار أقدام الأمهات محددة في مواقع CTCF المفترضة في المنطقة السيطرة H19 يطبع تعطي الدليل على وظيفة عازل. داء. بيول، 10، 607 -610.
    CROSSREF ميدلاين
  • الجرس، AC وFelsenfeld، G. (2000) مثيلة من وتعتمد على CTCF الضوابط الحدودية مطبوع التعبير عن الجينات Igf2. الطبيعة، 405، 482 -485.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • أصغ، AT، Schoenherr، CJ، كاتز، DJ، انجرام، RS، Levorse، JM وتيلغمان، SM يتوسط (2000) CTCF حساسة للمثيلة النشاط في H19 / Igf2 مكان. الطبيعة، 405، 486 -489 حجب محسن.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Kanduri، C.، بانت، V.، Loukinov، D.، Pugacheva، E.، تشى، CF، Wolffe، A.، أولسون، R. وLobanenkov، VV (2000) جمعية الوظيفية للCTCF مع عازل من المنبع H19 الجين هو الأصل المنشأ محددة وحساسة للمثيلة. داء. بيول، 10، 853 -856.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    نيكولز، RD ونيبر، JL (2001) منظمة الجينوم، وظيفة، ويطبع في برادر ويلي والمتلازمات Angelman. أنو. القس الجينوم هوم. جينيه.، 2، 153 -175.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Buiting، K.، Saitoh، S.، غروس، S.، ديتريتش، B.، شوارتز، S.، نيكولز، RD وHorsthemke، B. (1995) microdeletions الموروثة في Angelman والمتلازمات برادر ويلي تعريف مركز يطبع على الكروموسوم البشري 15. نات. جينيه، 9، 395 -400.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ساتكليف، JS، ناكاو، M.، مسيحي، S.، Orstavik، KH، Tommerup، N.، ليدبيتر، DH وBeaudet، AL (1994) الحذف من جزيرة الدليل السياسي الشامل مميثل تفاضلي في الجين SNRPN تحدد منطقة السيطرة يطبع المفترضة . نات. جينيه، 8، 52 -58.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • شيمر، R.، هيرشكو، AY، بيرك، J.، Mostoslavsky، R.، Tsuberi، B.، أرز، H.، Buiting، K. ورزين، A. (2000) مربع يطبع من برادر ويلي / مجال متلازمة أنجلمان. نات. جينيه.، 26، 440 -443.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    بن Porath، I. والأرز، H. (2000) يطبع: التركيز على مركز داء. أوبان. جينيه. ديف.، 10، 550 -554.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Cavaille، J.، Buiting، K.، Kiefmann، M.، للند، M.، برانان، CI، Horsthemke، B.، Bachellerie، JP، Brosius، J. وHuttenhofer، A. (2000) تحديد الدماغ محددة ومطبوع الجينات الصغيرة RNA نويي نستعرض منظمة الجينوم غير عادية. بروك. Natl أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية، 97، 14311 -14316.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    دي لوس سانتوس، T.، شفايتزر، J.، ريس، CA وفرانك، U. (2000) الصغيرة RNA الحفظ تطويريا، تشبه C مربع / D RNA نويي صغيرة، وكتب من PWCR1، وهو مطبوع الجينات رواية في Prader- المنطقة الحذف ويلي، وهو ما يعبر عنه بشكل كبير في الدماغ. آم. J. هوم. جينيه.، 67، 1067 -1082.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    ميغورو، M.، Mitsuya، K.، نومورا، N.، Kohda، M.، كاشيواغي، A.، Nishigaki، R.، يوشيوكا، H.، ناكاو، M.، اويشي، M. وOshimura، M. ( 2001) تقييم نطاق واسع من الوضع يطبع في المنطقة متلازمة برادر ويلي: لتكرار مجموعة مباشرة مطبوع تشبه جينات صغيرة RNA نويي هوم. مول. جينيه.، 10، 383 -394.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    Filipowicz، W. (2000) مطبوع التعبير من الرنا نويي صغيرة في الدماغ: الوقت لRNomics بروك. Natl أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية، 97، 14035 -14037.
    مجانا النص الكامل
  • ↵
    قبلة لازلو، Z.، هنري، Y.، Bachellerie، JP، Caizergues-فيرير، M. وقبلة، T. مثيلة الريبوز (1996) موقع معين من الحمض النووي الريبي preribosomal: وظيفة جديدة لالرنا نويي صغيرة الخليوي، 85 ، 1077 -1088.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • Cavaille، J.، Nicoloso، M. وBachellerie، JP (1996) المستهدفة الريبوز مثيلة الحمض النووي الريبي في الجسم الحي إخراج أدلة RNA العقاقير المصممة. الطبيعة، 383، 732 -735.
    CROSSREF ميدلاين
  • ↵
    قبلة، T. (2001) نويي الموجهة RNA تعديل ما بعد النسخي صغيرة من الرنا الخلوية. EMBO J.، 20، 3617 -3622.
    مجانا النص الكامل
  • ↵
    Runte، M.، Huttenhofer، A.، غروس، S.، Kiefmann، M.، Horsthemke، B. وBuiting، K. (2001) ونسخة IC-SNURF-SNRPN بمثابة المضيف للأنواع RNA نويي صغيرة متعددة و باعتبارها RNA العقاقير لUBE3A. همهمة. مول. جينيه.، 1

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #5  
قديم 10-20-2015, 12:11 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي قطاعات مطبوع في الجينوم البشري: أنماط مختلفة الحامض النووي في برادر ويلي / Angelman متلازمة المنطقة على النحو الذي يحدده تسلسل الجينوم الطريقة

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/6/3/387.full


https://translate.googleusercontent....d7PwiMb49eHMLw

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #6  
قديم 10-20-2015, 12:14 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي

 

ضبط وEEG أنماط في متلازمة أنجلمان ل

درسنا الحجز وأنماط الطباعة من 18 مريضا مع متلازمة أنجلمان ل. أظهر جميع المرضى مشاكل الحركة. وأبلغ أحد عشر مريضا أيضا أن يكون فترات طويلة الأمد من الحركات متشنج. وأظهر تسجيل الطباعة على صرعية الوضع رمعية في تسعة منهم. وكان سبعة مرضى النوبات الجزئية مع انحراف العين والقيء، مماثلة لتلك التي الصرع القذالي الطفولة. هذه المضبوطات وأنماط الكهربي تشير إلى أن متلازمة أنجلمان ويحدث في معظم المرضى باعتباره غير تقدمي، التي تعتمد على سن الرمع العضلي الدماغي مع مشاركة القذالي بارزة. هذه النتائج تشير إلى أنه في حين ترنح هو عرض من أعراض المستمر في متلازمة أنجلمان، وحدوث حالة عابرة صرعية رمعية قد تكون مسؤولة عن تكرار تحركات غير طبيعية مختلفة، وهي تلك متشنج. (J Neurol الطفل 1995؛ 10: 467-471).

http://jcn.sagepub.com/content/10/6/467.short

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #7  
قديم 10-20-2015, 12:16 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي

 

إنقاذ العجز العصبية في نموذج الفأر لمتلازمة أنجلمان بتخفيض alphaCaMKII الفسفرة المثبطة

Geeske M فان Woerden1، كارين D Harris2، محمد رضا Hojjati1، ريتشارد M Gustin3، Shenfeng Qiu2، روجيريو دي أفيلا Freire1، ويونغ هوي Jiang4، يب] Elgersma1 وادوين J Weeber2،3

ملخص

متلازمة أنجلمان (AS) هو اضطراب عصبي حاد يتميز التخلف العقلي، وخلل المحرك والصرع. وتبين لنا أن العجز الجزيئية والخلوية لنموذج الفأر AS يمكن إنقاذهم عن طريق إدخال طفرة إضافية في موقع الفسفرة المثبطة للalphaCaMKII. وعلاوة على ذلك، هذه المسوخ مزدوجة لم تعد تظهر العجز السلوكية ينظر في AS الفئران، مما يشير إلى أن هذا العجز هي نتيجة مباشرة لزيادة الفسفرة المثبطة للalphaCaMKII.
http://www.nature.com/neuro/journal/...ll/nn1845.html

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #8  
قديم 10-20-2015, 12:22 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي لطيف من الطفرات في UBE3A تسبب متلازمة Angelman

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/8/1/129.full

https://translate.googleusercontent....FEn572NFmphaSw



وتتميز متلازمة أنجلمان (AS) التي التخلف العقلي، وغياب خطاب، والمضبوطات، وضعف المحرك. AS ينجم عن الحذف الأم لكروموسوم 15q11-Q13، disomy أحد الأبوين الأب (UPD)، يطبع عيوب أو الخسارة من وظيفة الطفرات في موضع UBE3A الذي يشفر E6-AP بتحول البروتين يغاز. هو مطبوع الجين UBE3A مع إسكات الأب في دماغ الإنسان وإسكات مماثل من موضع Ube3a في الخلايا العصبية والخلايا العصبية قرن آمون في الماوس. لقد التسلسل إلى exons الترميز الرئيسية للUBE3A في المرضى الذين يعانون مؤشر 56 مع التشخيص السريري للAS ونمط مثيلة الحمض النووي الطبيعي. التعرف على تحليل الطفرات المسببة للمرض في 17 من 56 مريضا (30٪) منها 13 الطفرات مقطوعة، واثنين من الطفرات مغلطة، الأحماض الأمينية واحد الحذف وقفة واحدة كودون طفرة توقع بروتين ممدود. وقد تم تحديد الطفرات في ست من ثماني أسر (75٪) مع الحالة المصابة أكثر من واحد، وفي 11 من 47 حالات معزولة (23٪)؛ لم يتم العثور على طفرة في عائلة واحدة مع اثنين من الأشقاء، واحدة مع نموذجية واحدة مع النمط الظاهري شاذة. وكانت الطفرات دي نوفو في تسع من الحالات المعزولة 11. تم التعرف على تعدد الأشكال الأحماض الأمينية ثريونين استبداله باللاعب ألانين في كودون 178، وتم العثور على 3 بي بي طول تعدد الأشكال في إنترون المنبع من اكسون 8. وفي جميع الحالات بالمعلومات، كان التعبير المظهري يتفق مع يطبع مع النمط الظاهري العادي عندما كانت طفرة على كروموسوم الأب وAS النمط الظاهري عندما كانت طفرة على الصبغي الأمهات. التشخيص المختبري وتقديم المشورة الوراثية للAS معقدة، وتحليل الطفرة هو قيمة في نموذجي سريريا AS المرضى الذين يعانون من تحليل الحامض العادي.
تقديم

وتتميز متلازمة أنجلمان (AS) التي معتدلة إلى التخلف العقلي الشديد، وعدم وجود خطاب، ورعاش، وترنح، ومشية غير طبيعية، والضحك غير مناسب، واضطراب النوم والمضبوطات. ويقدر معدل الإصابة AS أن تكون 1 في 20 000، مع معظم الحالات يجري متفرقة، على الرغم من حدوث العائلية ليست نادرة. استعراض مفصل من النمط الظاهري السريرية (1، 2) والدراسات الجزيئية الأخيرة (3، 4)، وكذلك الدراسات الكثيرة (5) متاحة. AS ينجم عن نقص في التعبير الجيني من الأمهات كروموسوم 15q11-Q13، في حين نقص الأب لنفس المنطقة يسبب متلازمة برادر ويلي. تحتوي هذه المنطقة الكروموسومات العديد من الجينات والنصوص التي يتم التعبير عنها من كروموسوم الأب وأسكت على كروموسوم الأمهات، بما في ذلك الترميز المكاني صغير النووي المرتبط بروتين نووي ريبوزي ببتيد N (SNRPN) وnecdin (NDN). هناك مثيلة الفرق واسع في جميع أنحاء هذه المنطقة وأبرزها في جزيرة الدليل السياسي الشامل في نهاية 5 'من موضع SNRPN حيث كروموسوم الأب هو unmethylated مع أعربت SNRPN بينما ميثليته الكروموسوم الأمهات مع SNRPN إسكاته. ترميز الجين E6-AP بتحول البروتين يغاز (الجينات رمز UBE3A) خرائط داخل المنطقة وتورط باسم AS الجينات على أساس اكتشاف الخسارة من وظيفة الطفرات في المرضى (6، 7). بعد اكتشاف الطفرات المسببة AS، كان من المسلم به أن مركز ومطبوع مع التعبير الأمهات في الدماغ البشري (8، 9) وفي الحصين الماوس والمخيخ (10).
تسمح البيانات الوراثية الخلوية والجزيئية لتحديد العديد من الآليات الجزيئية التي تسبب AS على النحو التالي. (ط) ما يقرب من 70٪ من المرضى لديهم من جديد الحذف الخلالي من ~4 ميجا بايت على كروموسوم الأمهات 15q11-Q13، وعدد قليل من المرضى الذين لديهم الحذف مماثلة ولكنها مختلفة قليلا الناشئة من جديد أو غير متوازنة كما نقل المواقع. (ب) ما يقرب من 3-5٪ من المرضى الذين لديهم disomy أحد الأبوين الأب (UPD) مما أدى إلى نقص الأمهات. (ج) ما يقرب من 7-9٪ من المرضى قد حددت 'الطفرات يطبع' كما الميراث متحدر من والدين ولكن مع كل الكروموسومات التي لها مثيلة والتعبير النمط الأبوي (11). بعض وليس كل من هؤلاء المرضى لديهم الحذف من مركز المفترض يطبع (IC) (12). (د) ما يقرب من 4-8٪ من المرضى الذين لديهم الخسارة من وظيفة الطفرات في UBE3A (6، 7). (ت) وأخيرا، وهو جزء مؤكد من المرضى (~10-15٪) لديها نموذجية سريريا AS النمط الظاهري، ولكن أيا من العيوب الجزيئية من المجموعات الأربع الأولى هي التعرف على الرغم من تسلسل معظم الإكسونات أو كل لUBE3A. كل من تشوهات جزيئية تعرف تتسق مع التفسير الذي ينتج عن نقص AS التعبير الأمهات لUBE3A.
التسبب في AS غير معروف في الوقت الحاضر. اكتشف E6-AP على أساس قدرتها على إبطال نشاط oncoprotein البروتين p53 في وجود البروتين E6 من فيروس الورم الحليمي البشري (13، 14). وفي وقت لاحق، تبين E6-AP أن يكون E3 بتحول البروتين يغاز وأن تكون قادرة على ubiquitinating البروتين p53، وبطريقة E6 المستقلة، وhomolog البشري من البروتين الخميرة RAD23 تعيين HHRAD23A (15). Ubiquitination يستهدف البروتينات للتدهور من خلال مسار proteosomal (16 - 18)، ويمكن الافتراض أن AS النمط الظاهري قد يكون سبب الفشل في ubiquitinate مجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة في تلك الأنسجة حيث يتم إسكات أليل الأب لUBE3A، والتعبير تعتمد على أليل الأمهات. عدم وجود ubiquitination يمكن أن يؤدي إلى فشل للحط من هذه البروتينات أو التعديلات الفنية الأخرى من البروتينات الهدف (19). الدراسات الحديثة من نموذج الفأر من AS على أساس الطفرة فارغة الناتجة عن استهداف الجينات أثبتت الميزات المظهرية مع العديد من أوجه التشابه مع AS البشري، عيب التعلم السياقي، ضعف التقوية على المدى الطويل في شرائح قرن آمون وزادت وفرة من البروتين p53 في الخلايا العصبية والحصين الخلايا العصبية (20).

الشكل 1
تحليل الطفرة لأعضاء مختارين من كبير AS الأسرة. تم العثور على حذف 4 سنة مضت (1694del4 في الأسرة H-179) في نسب نشرت كبير مع ثمانية أشخاص المتضررين (22). تم تضخيم الجينوم DNA كما هو موضح في المواد وطرق وتحليلها على 15٪ هلام بولي أكريلاميد. يشار إلى الهجرات من المنتجات PCR العادي ومتحولة وكذلك heteroduplexes. رموز نصف الصلبة تشير تتأثر مع AS وتحمل التحور والرموز نصف تحاك تشير معروفين أو مفترضين حاملات التحور مع النمط الظاهري العادي، وتقسيم حرف مفتوحة تشير إلى وجود النمط الظاهري العادي مع عدم وجود طفرة. النجمة تحديد الأفراد لم تختبر ولكن يتوقع ان تحمل التحور.


الجدول 1
الاشعال لتضخيم والتسلسل المباشر من الحمض النووي الجيني


الجدول 2
الطفرات في متلازمة أنجلمان

درسنا الآن مرضى مؤشر 56 مع التشخيص السريري للAS ومنهم من الحذف كبيرة، كان UPD والطفرات يطبع غير موجود. حددنا 13 الطفرات اقتطاع (ثلاثة عنها سابقا) (6، 21)، واثنين من الطفرات مغلطة، واحد الحذف واحد من الأحماض الأمينية وقفة واحدة كودون طفرة توقع بروتين ممدود. حددنا حذف 4 غليان في نسب نشرت كبير، حدد الطفرات في 75٪ من الأسر متعددة و 23٪ من حالات متفرقة، وحدد تعدد الأشكال طول داخل إنترون وتعدد الأشكال مغلطة.

النتائج

اقتطاع الطفرات

والتسلسل كل من الإكسونات ترميز إطار القراءة المفتوح رئيسيا لE6-AP في 56 موضوعات كانت تعتبر أن يكون التشخيص السريري المرجح جدا من AS وتحليل الحامض العادي. تم تضخيم الجينوم الحمض النووي باستخدام بادئات هو مبين في الجدول رقم 1 يتبعه التسلسل المباشر. وقد تم تحديد ثلاثة عشر الطفرات مقطوعة في هذه المجموعة (الجدول 2). خمس من هذه الحالات شارك فيها أكثر من فرد واحد المتضررين في الأسرة، وفي هذه الأسر خمسة وأمهات الأطفال المصابين قامت الطفرة. في الأسر H-137 و H-179 حيث كان التحليل بالمعلومات، وكانت طفرة على الصبغي الأبوي في أمهات طبيعية ظاهريا وغيرها من شركات النقل طفرة طبيعية في الأسر. وقد تم توثيق هذا أكثر على نطاق واسع في نسب كبيرة المنشورة (22) مع ثمانية أشخاص على الأقل تضررا مع AS. تم العثور على هذه العائلة لتنفيذ عملية حذف أربعة قاعدة يسبب طفرة انزياح الإطار (الشكل 1). توفر هذه العائلة الأدلة الكثيرة للتوريث النمط الظاهري مطبوع، مع العديد من الأفراد وراثة طفرة من الأب ودائما وجود النمط الظاهري العادي بالمقارنة مع العديد من الأفراد الآخرين وراثة طفرة من الأم ودائما تتأثر مع AS. تم العثور على الطفرات اقتطاع كما دي نوفو الأحداث في سبع حالات (الجدول 2).

الطفرات مغلطة، حذف الأحماض الأمينية والبروتين وتوقع ممدود

تم العثور على اثنين من الطفرات مغلطة، واحد حذف الأحماض الأمينية واحد، وطفرة واحدة تؤثر على كودون وقف وتوقع بروتين ممدود في الأفراد مع AS النمط الظاهري (الجدول 2). هو أكثر تعقيدا مما كانت عليه في حالة اقتطاع الطفرات لتحديد ما إذا كانت هذه الطفرات المسببة للمرض أو المتغيرات حميدة. في وقت سابق، أبلغنا (6) إجراء تبديل التيروزين لالسيستين في كودون 21 (C21Y)، ولكن من غير المؤكد ما إذا كان هذا يمثل طفرة مسببة للمرض أو البديل حميدة. لتحديد ما إذا كان هذا كذلك استبدال حمض أميني هو طفرة مسببة للمرض، قمنا بتحليل الأخوة تتأثر وثمانية أقارب الأم (الشكل 2). ويرتبط الطفرة C21Y مع فقدان موقع انزيم التقييد ملعقة شاي 45I، ويمكن أن تقرر أن الطفرة C21Y كانت موجودة فقط في الطفل المصاب والدته. فشل تحليل مماثل لتحديد هذه الطفرة في 50 مواضيع عادية لا علاقة لها. وقد درست هذه العائلة أيضا باستخدام تعدد الأشكال 3 سنة مضت (GATGAT مقابل GAT) التي تم تحديدها في إنترون مباشرة من المنبع اكسون 8 (الشكل 2). وعلى الرغم من المتوفى وجده لأمه، كان من الممكن أن يثبت أنه أحال أليل GAT من تعدد الأشكال 3 بي بي لاثنين من بناته وأليل GATGAT إلى أخرى ابنتان. ولما كانت والدة AS مريض واحد فقط من هذه الأربعة التي تحمل طفرة C21Y، فإنه يمكن استنتاج أن هذا التحور حدث من جديد في حياتها، تورط الطفرة C21Y كما يجري في ابنها المسببة للأمراض. وكانت الطفرة مغلطة الأخرى الوحيدة التي وجدت في مرضانا استبدال يسين ليسوليوكيني في كودون 804 (I804K). حدثت هذه الطفرة من جديد في المريض ولذا فمن المحتمل جدا أن تكون المسببة للأمراض. تم العثور على واحد حذف الأحماض الأمينية للفينيل ألانين في كودون 782 (F782Δ) في شقيقان مع AS وكان حاضرا في الأم وجده لأمه. ونظرا لطبيعة الطفرات والبيانات العائلية، وهذا هو المرجح أن تكون الطفرة المسببة للمرض في هذه العائلة. A الحذف دي نوفو من 15 سنة مضت إزالة رامزة التوقف في حالة واحدة. المنطقة-3'غير مترجم قصيرة، وتسلسل النوكليوتيدات الناتجة يتوقع بروتين ممدود تنتهي في متعدد الليزين المشفرة بواسطة بولي (A) الجهاز من مرنا. ونظرا لطبيعة الطفرات ولها دي نوفو الأصل، فمن المرجح أن تكون الطفرة المسببة للمرض في هذا المريض.

الرقم 2
تحليل الأسرة H-101 للطفرة C21Y مغلطة. تم العثور على طفرة فقط في الصبي المصاب والدته. وأشار تحليل لتعدد الأشكال GATGAT / GAT في إنترون المجاور أن الطفرة C21Y كان من جديد في الأم (انظر النص للمناقشة). رموز النسب هي للالشكل 1.

المتغيرات حميدة

وحددت 3 بي بي طول تعدد الأشكال في إنترون مباشرة من المنبع اكسون 8 كما هو موضح أعلاه في الشكل 2. حذفت ثلاثة أزواج قاعدة بين أزواج قاعدة 405 و 410 من بنك الجينات AF016704 بحيث كان تسلسل GATGAT في أليل أطول وGAT في أليل أقصر. وأشار تحليل الكروموسومات 108 في 54 فردا التحكم التي تردد أليل كان 0.14 لأليل أقصر و 0.86 للأليل أطول.
تم العثور على استبدال الحمض الأميني ثريونين لألانين في كودون 178 (A178T) في وقت سابق في AS الموضوع وكان حاضرا في الأب (H-111) (6). وفي وقت لاحق، حددنا إضافيتين AS الحالات مع الطفرة A178T موجودة في الطفل المصاب والأب (H-163 و H-172). تم العثور على ألانين (A178) مع تردد أليل من 0.97، وثريونين (T178) مع تواتر 0.03 في 106 الكروموسومات من 53 مواضيع عادية.

تحليل لتقديم المشورة الوراثية

وقد أشار العديد من الأسر لتحليل الطفرة المتعلقة التشخيص قبل الولادة والاستشارة الوراثية لأفراد الأسرة. في الأسرة H-144، وكانت خالة الأشقاء المتضررين الحوامل وطلبت التشخيص قبل الولادة. وأشار تحليل سابق للعلامات وراثية في المنطقة UBE3A أن خالة تحمل نفس النمط الفرداني grandpaternal مثل الأطفال المتضررين في الأسرة. حدد تحليل طفرة حذف قاعدة واحدة (856delG) في واحدة من الأطفال المتضررين والأم، ولكن هذه الطفرة غير موجودة في الأجداد الأم أو الخالة.
في حالة الأسرة H-137، أحيلت عينة لتقييم المخاطر والتشخيص قبل الولادة ممكن. تم التعرف على الطفرات W305X في الطفل المصاب والدتها. ورفضت والدة التشخيص قبل الولادة، وأنه لم يتم اختباره رضيعها. في واحدة من الأسر التي لديها دي نوفو الطفرات وإنهاء عائلة الحمل في وقت سابق بسبب القلق بشأن خطر لAS مع عدم وجود إمكانية للتشخيص قبل الولادة نهائي قبل أداء تحليل الطفرة. ومن شأن ذلك أن الأسرة لديها الآن مخاطر منخفضة نسبيا من وجود طفل مصاب، ويمكن إجراء تحليل طفرة في التشخيص قبل الولادة لمعالجة القلق بشأن الاصباغ الأمهات للطفرة.

مناقشة

حددنا الطفرات في UBE3A في 17 من 56 مريضا مؤشر (30٪) مع التشخيص السريري للAS وطبيعية تحليل الحامض النووي. تم العثور على الطفرات في ست من ثماني أسر (75٪) مع أكثر من شخص المتأثر مع نموذجي سريريا AS، وفي 11 من 47 حالات معزولة (23٪). لم يتم العثور على طفرة في أسرة مع السيب واحد مع نموذجي سريريا AS والسيب واحد مع ميزات شاذة. هذه النتائج مشابهة لنتائج تقرير Malzac وآخرون. (23) والتي تم العثور على طفرات في 80٪ من الحالات الأسرية و 14٪ من حالات متفرقة. هناك الآن 29 طفرات مختلفة ذكرت أن يسبب AS، بما في ذلك 17 انزياح الإطار، خمسة هراء، ثلاثة مغلطة واحد في كل من واحد الإدراج الأحماض الأمينية، واحد حذف الأحماض الأمينية، والربط، ووقف كودون (6، 7، 21، 23، 24) ( الشكل 3). كثرة انزياح الإطار وهراء الطفرات لافت للنظر. Malzac وآخرون. (23) استخدام واحد تعدد الأشكال حبلا التشكل (SSCP) للفحص، في حين أننا قد استخدمت التسلسل المباشر لتضخيم الحمض النووي الجيني. Malzac وآخرون. (23) فحص المنبع الإكسونات غير الترميز والعثور على أي الطفرات، ولدينا تسلسل الإكسونات المنبع المختارة على بعض المرضى أيضا لم تحدد الطفرات. على الرغم من أننا لم تصادف الاصباغ في عائلاتنا باستخدام الأساليب المذكورة، وجد الاصباغ الجسدية وسلالة الجرثومية التي كتبها Malzac وآخرون. (23) في ثلاث عائلات، مما يشير إلى احتمال تكرار في نسل الأمهات ومنهم من الطفرة ليست واضحة. الانتشار الواسع النطاق للخسارة من وظيفة الطفرات في UBE3A في AS موضوعات يوفر دليلا قويا على أن هذه الطفرات تسبب AS النمط الظاهري. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات تتفق مع التفسير الذي الحذف، UPD وحالات الطفرة يطبع من AS ينطوي أيضا على فقدان التعبير الأمهات من UBE3A باعتبارها الآلية الأساسية للتعبير المظهري. جميع الآليات الجزيئية تتسق مع غياب التعبير عن UBE3A في تلك الأنسجة حيث يتم إسكات أليل الأب، والنمط الظاهري يشبه بشكل عام لجميع الفئات الجزيئية. ويقدم هذا التقرير أدلة واسعة النطاق (ط) أن التعبير المظهري يتسق مع يطبع مع النمط الظاهري العادي عندما الطفرة على الصبغي الأبوي والنمط الظاهري AS عندما الطفرة على الصبغي الأمهات. (ب) أن الطفرات هي أكثر التعرف غالبا في الأسر التي لديها أكثر من الفرد المصاب. (ج) أن الطفرات في UBE3A تسبب AS موروثة في حوالي نصف الحالات ودي نوفو في الفترة المتبقية. و (د) أن الطفرات اقتطاع تمثل نسبة كبيرة من المجموع.

الشكل (3)
الطفرات ذكرت أن تسبب متلازمة أنجلمان. كل الطفرات ذكرت (6، 7، 21، 24 ومعروضة). وصفت الإكسونات بما يتناسب مع حجمها، ولكن لا تظهر الإكسونات المنبع، وإنترونات ليست في نسبة. ويرد بدء ATG كودون تسمى الأحماض الأمينية 1 سد الإكسونات 7 و 8. اثنين من الطفرات (*) وقد تكررت بشكل مستقل. تم تغيير رقم للطفرة 3093ins5 من المنشور الأصلي على أساس التسميات موصى بها (32).

على الرغم من أن هناك معلومات البيوكيميائية كبيرة بشأن النشاط يغاز بتحول والبروتين من E6-AP، بما في ذلك قدرته على ubiquitinate البروتين p53 وHHRAD23A (15، 25)، والسبب في غلبة اقتطاع الطفرات في UBE3A تسبب AS ليست واضحة. وقد تم تحديد عدة مجالات وظيفية للE6-AP. شريحة حامض 18 الأمينية (الأحماض الأمينية 391-408) ضروري لتوجيه جمعية E6 مع البروتين p53 وتعزيز تدهور E6 التي تعتمد على البروتين p53 (26). وكان الحاخام هيشت (ح omologous إلى E 6-AP ج arboxyl- ر erminus) نطاق يشمل ~350 الأحماض الأمينية في الجزء C-محطة من E6-AP، وحفظها للغاية بين البروتينات من الخميرة، وذبابة الفاكهة، ايليجانس Caenorhabdi-تيس والثدييات (27) ويمكن أن تتفاعل مع بعض الأنزيمات E2 على شكل مجمعات لubiquitination من ركائز (15). يحتوي المجال وكان الحاخام هيشت بقايا السيستين في موقف 820 الذي يعتبر موقع نشط لتشكيل ثيو إستر مع بتحول. أحد الاحتمالات هو أن الطفرات مغلطة تحدث بتواتر معقول في UBE3A، ولكن لديهم أي تأثير المظهرية أو تسبب النمط الظاهري أكثر اعتدالا غير معترف بها بأنها تتعلق AS. ذات أهمية خاصة سيكون احتمال أن المرضى الذين يعانون من الظواهر الأكثر اعتدالا التي تشمل التخلف العقلي، والمضبوطات أو ميزات أخرى قد يكون الطفرات مغلطة في UBE3A. على الرغم من أن أقل احتمالا، فمن الممكن أن تسلسل الرئيسي للمكان يهيئ إلى تردد أعلى من اقتطاع طفرات من الطفرات مغلطة.
على الرغم من أن يتم تحديد الطفرات في 75-80٪ من الأسر التي لديها أفراد متعددين المصابين AS، ولم يتم العثور على طفرات في بعض الأسر، كما في حالة عائلتين أننا دراستها. أسر أخرى مع sibs المتضررة وليس من المعروف طفرة تعريفية (7، 23)، وفي حالة واحدة تقترح إعادة التركيب أن الطفرة نحو 5 "نهاية موضع إذا كان في رابطة الدول المستقلة مع UBE3A على كروموسوم الأمهات (7) . فمن المحتمل أن بعض الحالات المتبقية من AS ديهم طفرات على كروموسوم الأمهات التي يتم حتى الآن الكشف عن هويته. المظاهرة الحذف تسبب الطفرات يطبع ~0.8-1 ميغابايت القسيم المركزي لUBE3A يؤكد أن هذه الطفرات يمكن أن يؤثر العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة بعيدة تماما عن مكان. تحديد الطفرات في جزء صغير من حالات معزولة يوحي إما أن هناك الأساس الجزيئي مجهولين آخر لAS التي لا ترتبط مع خطر تكرار عالية، كما هو الحال بالنسبة الحذف الخلالي أو محدث، أو أن جزءا كبيرا من المرضى سريريا تشخيصها على أنها AS ديك شرط غير ذات صلة. الآليات الجزيئية إضافية محتملة وبالتالي تنطوي UBE3A تشمل الطفرات من 15q11-Q13 لم يتم تحديدها بعد، والطفرات في الجينات على الكروموسومات الأخرى التي تنظم التعبير الأمهات من UBE3A والأحداث جينية تؤدي إلى إسكات أليل الأمهات لUBE3A دون تغيير النوكليوتيدات الأساسي. التفسيرات المحتملة لعدم تحديد الطفرات لا تورط UBE3A سيشمل التقييم السريري غير دقيقة أو genocopies مشروعة أو المظاهر النسخية تلبية معايير التشخيص القياسية دون تغيير في التعبير عن UBE3A.
التشخيص المختبري وتقديم المشورة الوراثية للAS هي معقدة بشكل غير عادي. على الرغم من أن الدراسات طفرة لا تحدد الخلل في جميع الحالات، فهي قيمة وأشارت في المرضى الذين يعانون من الطبيعي تحليل الحامض النووي.

المواد والأساليب

السكان المريض

وقد رأيت الكثير من المرضى شخصيا من قبل واحدة من الكتاب، وأحيلت ما تبقى من مدن بعيدة في العديد من البلدان. السجلات الطبية، وفي كثير من الحالات أشرطة فيديو، من المرضى تم استعراضها من قبل المؤلفين وبالدرجة الأولى من جانب واحد محقق (CB)، وتميزت المرضى عن وجود النمط الظاهري يتفق مع AS على أساس معايير التشخيص القياسية (28). وشعر بعض المرضى المشار إليها من غير المحتمل أن يكون AS بناء على مراجعة السجلات الطبية وأشرطة الفيديو، ولم تدرج للدراسات الجزيئية. وكانت المعلومات تاريخ الأسرة المتاحة في جميع الحالات.

تحليل الطفرة

تم عزل الجينوم DNA من الدم المحيطي أو من الابيضاض اللمفاوي مثقف باستخدام SDS / بروتين K الهضم واستخراج الفينول كلوروفورم (29). وتضخمت الإكسونات 7-16 من UBE3A باستخدام بادئات المرافقة حدود إنترون-إكسون (الجدول 1)؛ تسلسل المعلومات أكثر اتساعا متاح (بنك الجينات الانضمام غ AF016703 - AF016708). كانت الظروف PCR 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.3، 1.5 ملي MgCl 2، 50 ملي بوكل، 0.2 ملي dNTPs، 1 ميكرومتر التمهيدي لالإكسونات 9 و 10 و 0.5 ميكرومتر التمهيدي لالإكسونات أخرى. كانت الظروف PCR 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 55 أو 58 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لدورات 30-35. تم تنقية المنتجات PCR باستخدام PCR تنقية أو مجموعات استخراج الهلام (QIAGEN، لوس أنجلوس، CA أو PROMEGA، وميلووكي، ويسكونسن). شملت معظم الاشعال PCR ذيول التسلسل عالمية أو عكس كما هو مبين في الجدول 1. والتسلسل منتجات PCR مباشرة باستخدام الصبغة التمهيدي ABI PRISM أو صبغ فاصل دورة تسلسل مجموعات رد فعل التحضير (بيركن، إلمر، شيكاغو، IL). تم تنفيذ التسلسل الآلي باستخدام المنظم DNA ABI 377 (النظم البيولوجية التطبيقية، فوستر سيتي، كاليفورنيا). وقد أكد كل الطفرات المفترضة عن طريق الاستنساخ وتسلسل أليل متحولة لكل موضوع.
بالنسبة لكثير من الطفرات، وقد تم تأسيسها تحليل PCR لتحليل أفراد الأسرة وكذلك تأكيد طفرة استخدام تحدث بشكل عفوي الاختلافات في مواقع انزيم التقييد، مصطنع الاختلافات في مواقع الانزيم تقييد أو طول اختلاف المنتج. لتحليل الطفرة 1694del4، تم تضخيم الحمض النووي الجيني باستخدام بادئات لاكسون 9B من الجدول 1 وأجريت متداخل PCR مع الاشعال إضافية 5'-CAAATGTAGTGGGAGGGGAAGTGG-3 "و5'-CAGCTCGCTGGACTCAGGGATGGG-3". للدراسات طفرة C21Y، كانت الاشعال لتضخيم 5'-ACTGTGCTTATTGTTTGAATGTTTG-3 "و5'-CTCATTCGTGCAGGCTTCATTTCC-3"، وحللت الطفرة التي الانزيم تقييد الهضم مع ملعقة شاي 45I. لتحليل 3 سنة مضت تعدد الأشكال intronic، كانت الاشعال 5'-CACAGGTTAACTACTTCAGTGC-3 "و5'-TAAGCACAGTGATTAGTACA-3".
يتم ترقيم الإكسونات والنيوكليوتيدات كدنا] وفقا لKishino واغستاف (بنك الجينات انضمام رقم U84404) (30)، والذي يختلف من بعض الاستنساخ وطفرة تقارير سابقة (6، 7، 21، 24، 31)، ولكن هو في اتفاق مع ترقيم من Malzac وآخرون. (23). رامزة ATG سد الإكسونات 7 و 8 هي كدنا] بي بي 587-589 وكودون 1 لترقيم الأحماض الأمينية. يتم تصنيف الطفرات وفقا لتسمية موصى بها (32) مع جميع أرقام النوكليوتيدات على أساس كدنا].

شكر وتقدير

ونود أن نشكر العديد من الأسر والأطباء لتوفير الوصول إلى السجلات الطبية والعينات. نشكر ديان ديكس، سكوت دوديك وشياو يون وانغ للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل عن طريق منح المعاهد الوطنية للصحة لمركز أبحاث التخلف العقلي (HD24064) ومركز البحوث السريرية العام (RR00188).
  • © 1999 مطبعة جامعة أكسفورد
المراجع

  • ↵
    • روب SA،
    • بول KRE،
    • ويلسون BJ،
    • بريت EM
    و"دمية سعيدة" متلازمة Angelman: استعراض الملامح السريرية القوس. ديس. الطفل 1989؛ 64: 83-86.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    • وليامز CA،
    • زوري RT،
    • هندريكسون J.،
    • مطارد H.،
    • ماروم T.،
    • Whidden E.،
    • دريسكول DJ
    متلازمة أنجلمان. داء. Probl. Pediatr 1995؛ 25: 216-231.
    ميدلاين الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • جيانغ Y.،
    • تساي T.-F.،
    • Bressler J.،
    • Beaudet AL
    يطبع في Angelman والمتلازمات-برادر ويلي. داء. Opin.Genet.Dev 1998؛ 8: 334-342.
    منحة جوجل
  • ↵
    • نيكولز RD،
    • Saitoh S.،
    • Horsthemke B.
    يطبع في برادر ويلي والمتلازمات Angelman اتجاهات جينيه عام 1998؛ 14: 194-200..
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • يدبيتر DH،
    • Ballabio A.
    علم الوراثة الخلوية الجزيئية من المتلازمات الجينية متجاورة: الآليات والنتائج المترتبة على اختلال التوازن جرعة الجينات. في: Scriver CR، Beaudet AL، ماكر WS، فالي D.، المحررين والأيضية والجزيئية أسس ورثت مرض نيويورك: ماكجرو هيل، 1995.. ص 811 - 839.
    منحة جوجل
  • ↵
    • ماتسورا T.،
    • ساتكليف JS،
    • فانغ P.،
    • Galjaard R.-J.،
    • جيانغ Y.-H.،
    • بينتون CS،
    • Rommens JM،
    • Beaudet AL
    دي نوفو اقتطاع الطفرات في E6-AP بتحول البروتين يغاز الجين (UBE3A) في متلازمة أنجلمان الطبيعة جينيه 1997؛ 15:.. 74-77.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Kishino T.،
    • لند M.،
    • اغستاف J.
    الطفرات UBE3A / E6-AP تسبب متلازمة أنجلمان الطبيعة جينيه 1997؛ 15: 70-73..
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • فو TH،
    • هوفمان AR
    يقتصر يطبع من هذا الجين متلازمة أنجلمان، UBE3A، إلى الدماغ الطبيعة جينيه 1997؛ 17: 12-13..
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Rougeulle C.،
    • جلات H.،
    • لند M.
    هو مطبوع على Angelman متلازمة الجينات مرشح، UBE3A / E6-AP، في الدماغ الطبيعة جينيه 1997؛ 17:.. 14-15.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • ألبرخت U.،
    • ساتكليف JS،
    • Cattanach BM،
    • بيتشي CV،
    • ارمسترونغ D.،
    • ايشيل G.،
    • Beaudet AL
    التعبير مطبوع من الفئران الجينات متلازمة أنجلمان، Ube3a، في قرن آمون والخلايا العصبية الطبيعة جينيه 1997؛ 17: 75-78..
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Horsthemke B.،
    • ديتريتش B.،
    • Buiting K.
    يطبع الطفرات على الكروموسوم البشري 15. همهمة. Mutat 1997؛ 10: 329-337.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Buiting K.،
    • ديتريتش B.،
    • جروب S.،
    • ليش C.،
    • بوتشولز T.،
    • سميث E.،
    • ريس A.،
    • برغر J.،
    • Abeliovich D.،
    • بارت-ويت U.،
    • يانسن B.،
    • ليرر I.،
    • فان دن Ouweland بلغ متوسط ​​الأجر الشهري،
    • هالي DJJ،
    • Schrander-Stumpel C.،
    • سميتس H.،
    • Meineri P.،
    • مالكولم S.،
    • غاردنر A.،
    • لند M.،
    • نيكولز RD،
    • صديق K.،
    • شولز A.،
    • ماتيس G.،
    • Kokkonen H.،
    • هيلبرت P.،
    • فان Maldergem L.،
    • غلوفر G.،
    • كاربونيل P.،
    • ويليمز P.،
    • Gillessen-Kaesbach G.،
    • مقبلات-themke B.
    عيوب يطبع متفرقة في متلازمة برادر ويلي ومتلازمة أنجلمان: الآثار المترتبة على نماذج بصمة التبديل، وتقديم المشورة الوراثية، والتشخيص قبل الولادة AM. J. هوم. جينيه عام 1998؛ 63: 170-180.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Huibregtse JM،
    • Scheffner M.،
    • هاولي PM
    A البروتين الخلوي يتوسط جمعية البروتين p53 مع oncoprotein E6 من أنواع فيروس الورم الحليمي البشري 16 أو 18 EMBO J 1991؛ 10: 4129-4135.
    ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Huibregtse JM،
    • Scheffner M.،
    • هاولي PM
    الاستنساخ والتعبير عن كدنا] لE6-AP، وهو البروتين الذي يتوسط تفاعل الورم الحليمي البشري E6 oncoprotein مع البروتين p53. مول. الخلية. بيول 1993؛ 13: 775-784.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    • كومار S.،
    • كاو WH،
    • هاولي PM
    التفاعل الجسدي بين E2 وكان الحاخام هيشت E3 إنزيمات معينة يحدد cooperativity وظيفية. J. بيول. علم 1997؛ 272: 13548-13554.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    • Hochstrasser M.
    تعتمد على بتحول وتفتت البروتين. أنو. القس جينيه 1996؛ 30: 405-439.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
    • الباوميستير W.،
    • والز J.،
    • Zühl F.،
    • Seemuller E.
    . وproteasome و: نموذج من البروتياز compartmentalizing النفس خلية 1998؛ 92: 367-380.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • تشيخانوفير A.،
    • شوارتز AL
    المسار بتحول-proteasome و: تعقيد وظائف لا تعد ولا تحصى من البروتينات الموت بروك. Natl أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية عام 1998؛ 95: 2727-2730.
    مجانا النص الكامل
  • ↵
    • Hochstrasser M.
    . تدهور البروتين أو التنظيم: UB القاضي خلية 1996؛ 84: 813-815.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • جيانغ Y.-H.،
    • ارمسترونغ D.،
    • ألبرخت U.،
    • اتكينز CM،
    • Noebels JL،
    • ايشيل G.،
    • Sweatt دينار،
    • Beaudet AL
    تحور يغاز بتحول Angelman في الفئران تسبب زيادة البروتين p53 حشوية وعجز التعلم السياقي وطويلة الأجل التقوية العصبية 1998؛ 21: 1-20.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • تساي T.-F.،
    • رأس روتشيلد A.،
    • بن نيريا Z.،
    • Beaudet AL
    التشخيص قبل الولادة وكشف الناقل للطفرة نقطة في UBE3A تسبب متلازمة أنجلمان. آم. J. هوم. جينيه عام 1998؛ 63: 1561-1563.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Meijers-Heijboer EJ،
    • Sandkuijl LA،
    • برونر HG،
    • سميتس HJM،
    • Hoogeboom AJM،
    • Deelen WH،
    • فان هيميل JO،
    • Nelen MR،
    • سميتس DFCM،
    • Niermeijer MF،
    • هالي DJJ
    تحليل الربط مع كروموسوم 15q11-13 علامات يظهر يطبع الجينومية في متلازمة أنجلمان العائلية. J. ميد. جينيه عام 1992؛ 29: 853-857.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    • Malzac P.،
    • ويبر H.،
    • Moncla A.،
    • غراهام JM،
    • Kukolich M.،
    • وليامز C.،
    • Pagon RARLA،
    • Kishino T.،
    • اغستاف J.
    تحليل تحور UBE3A في مرضى متلازمة أنجلمان. آم. J. هوم. جينيه عام 1998؛ 62: 1353-1360.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • فونغ DC،
    • يو B.،
    • تشيونغ KF،
    • سميث A.،
    • ترينت RJ
    UBE3A "طفرات" في اثنين من المرضى متلازمة أنجلمان لا علاقة لها ومختلفة ظاهريا. همهمة. جينيه عام 1998؛ 102: 487-492.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Scheffner M.،
    • Huibregtse JM،
    • Vierstra RD،
    • هاولي PM
    وHPV-16 ET وE6-AP الوظائف المعقدة باعتبارها يغاز بتحول والبروتين في ubiquitination البروتين p53 خلية لعام 1993؛ 75: 495-505.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Huibregtse JM،
    • Scheffner M.،
    • هاولي PM
    توطين المناطق E6-AP أن فيروس الورم الحليمي البشري المباشر E6 ملزمة، بالتعاون مع البروتين p53، وubiquitination من البروتينات المرتبطة بها. مول. الخلية. بيول 1993؛ 13: 49 1 8-4927.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    • Huibregtse JM،
    • Scheffner M.،
    • Beaudenon S.،
    • هاولي PM
    عائلة من البروتينات الهيكلية والوظيفية ذات الصلة E6-AP بتحول البروتين يغاز. بروك. Natl أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية عام 1995؛ 92: 2563-2567.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    • وليامز CA،
    • Angelman H.،
    • كلايتون سميث J.،
    • دريسكول DJ،
    • هندريك وابنه JE،
    • الربوة JH،
    • Magenis RE،
    • Schinzel A.،
    • اغستاف J.،
    • Whidden EM
    متلازمة أنجلمان: توافق في الآراء بشأن معايير التشخيص صباحا. J. ميد. جينيه 1995؛ 56: 237-238.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • سامبروك J.،
    • فريتش EF،
    • Maniatis T.
    . الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبر كولد سبرينج هاربور، NY: كولد سبرينج هاربور مختبر الصحافة، 1989.
    منحة جوجل
  • ↵
    • Kishino T.،
    • اغستاف J.
    منظمة الجينوم من UBE3A / E6-AP الجينات والجينات الكاذبة ذات الصلة الجينوم 1998؛ 47: 101-107.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • ياماموتو Y.،
    • Huibregtse JM،
    • هاولي PM
    والإنسان E6-AP الجين (UBE3A) بترميز ثلاثة إيسفورمس المحتملة البروتين الناتجة عن الربط التفاضلية الجينوم 1997؛ 41: 263-266.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من Google
  • ↵
    • Antonarakis SE
    توصيات لنظام التسمية لطفرات جينية بشرية. التسميات الفريق العامل. همهمة. Mutat 1998؛ 11: 1-3.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم الباحث العلمي من

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #9  
قديم 10-20-2015, 12:26 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي

 

متلازمة أنجلمان استعرض من منظور العصبي. فرضية UBE3A-GABRB3.


دان B، بويد SG
مستشفى الاطفال الجامعى الملكة فابيولا، الجامعة الحرة في بروكسل، بروكسل، بلجيكا. bernard.dan@ulb.ac.be
Neuropediatrics [2003، 34 (4): 169-176]
النوع: مجلة المادة، مراجعة
دوى: 10.1055 / S-2003-42213
شروط تسليط الضوء مجردة
الجينات علم الوجود (1) أمراض (4) الجينات / البروتينات (2) نوع (2)
وتتميز متلازمة أنجلمان باعتلال النمو العصبي (مع أو بدون نوبات صرع) المرتبطة عجز وظيفي من الجينات UBE3A. آليات مختلفة للUBE3A تعطيل ترتبط مع الظواهر السريرية متفاوتة الخطورة. ومع ذلك، ثلاثة أنماط متميزة، متسقة للغاية الكهربي الإيقاعية يمكن ملاحظتها في جميع المرضى تقريبا بغض النظر عن التركيب الوراثي، شدة السريرية وجود أو شدة اضطراب الحجز. نمط I يتكون من أشواط من السعة العالية 2-3 / ق النشاط الإيقاعي غلبة على المناطق الأمامية. يتكون النمط الثاني من يدير أكثر انتشارا من 4-6 / ق النشاط الإيقاعي. يتكون النمط الثالث من رشقات نارية أو أشواط من السعة العالية 3-5 / ق النشاط الإيقاعي، القصوى على المنطقة القفوية، التي تحتوي في بعض الأحيان المسامير الصغيرة وتيسره إغلاق العين. نستعرض أدلة العصبي متوفر من دراسات الإنسان والحيوان في ضوء التطورات الأخيرة الجزيئية. ميزات الكهربي في كل من المرضى ونماذج الماوس المختلفة تشير إلى فئتين فصل: أنماط إيقاعية مميزة، والتي لا ترتبط الصرع، وقلة النشاط المحدد التفريغ ذات الصلة الصرع. هذه الميزات تتوافق مع نموذج القشرية والمهادي القشري الخلل الناتج عن التقلبات في متشابك العصبي GABAergic من قبل (1) تجنيد نقص من GABA وظيفية (A) مستقبلات ذات الصلة إلى انخفاض التعبير UBE3A الجينات في جميع الحالات و(2) انخفضت كمية beta3 وحدة فرعية في هذه المستقبلات المرتبطة إلى انخفاض التعبير GABRB3 الجيني في حالات الحذف.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #10  
قديم 10-20-2015, 12:31 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي المتلازمات نماذج الخلايا الجذعية المحفزة للاضطرابات يطبع الجينومية Angelman وبرادر ويلي

 

http://www.pnas.org/content/107/41/17668.full

https://translate.googleusercontent....OK00uB4QRH03pw

ملخص

متلازمة أنجلمان (AS) ومتلازمة برادر ويلي (PWS) هي الاضطرابات العصبية النمائية من يطبع الجينوم. AS النتائج من فقدان وظيفة يغاز البروتين بتحول E3A (UBE3A) الجينات، في حين أن الخلل الجيني في PWS غير معروف. على الرغم من أن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) توفير نماذج لا تقدر بثمن من الأمراض التي تصيب البشر، يمكن إعادة برمجة النووية يحد من فائدة iPSCs من المرضى الذين AS وPWS يجب بالانزعاج علامات بصمة الجينومية من عملية إعادة برمجة جينية. لدينا iPSCs المستمدة من المرضى الذين يعانون من AS وPWS تظهر أي دليل على الحامض النووي بصمة المحو في رابطة الدول المستقلة -acting مركز PSW يطبع. الأهم من ذلك، نجد أن، كما هو الحال في الدماغ العادي، يتم تأسيس يطبع من UBE3A خلال تمايز الخلايا العصبية من AS iPSCs، مع الأب UBE3A أليل قمع بالتزامن مع ما يصل التنظيم من محضر UBE3A العقاقير. وهذه النماذج التوجيهية من اضطرابات يطبع الجينومية تسهيل التحقيق في عمليات المرض AS وPWS وتسمح دراسة توقيت التنموي وآلية UBE3A القمع في الخلايا العصبية البشرية.
متلازمة أنجلمان (AS) هو اضطراب عصبي يتميز الإعاقة الفكرية العميقة، والكلام غائبا، نوبات متكررة، والعجز الحركي، وسلوكه المميز سعيد (1، 2). وتتميز متلازمة برادر ويلي (PWS) فرط الأكل / السمنة. قامة قصيرة، واليدين، والقدمين. والمشاكل السلوكية التي تشبه الوسواس القهري (3). AS يسببه فقدان وظيفة أليل ورثت أمومي من E3 يغاز بتحول UBE3A. UBE3A يخضع لأنسجة محددة يطبع الجينومية. على الرغم من أن يتم التعبير عن كل من الأليلات في معظم الأنسجة، وقمع أليل الموروثة من الأب في الدماغ (4 - +6). ويعتقد التعبير مطبوع من UBE3A أن تحدث نتيجة التعبير المتبادل من نص طويل غير المكودة العقاقير، UBE3A-ATS، الذي هو جزء من نص> 600 كيلو بايت الشروع في ميثليته تفاضلي مركز يطبع PWS (IC) الواقعة في اكسون 1 من الجين SNURF-SNRPN (7 - 9). ويرتبط PWS مع فقدان العديد من أنواع الرنا نويي صغيرة (snoRNAs) (10)؛ ومع ذلك، أساس الجيني غير معروف حاليا، وليس هناك نموذج الفأر الذي يلخص كافة الميزات من PWS.
وقد أثبتت نماذج الماوس من AS كبير في دراسة جوانب هامة من آلية المرض AS. هناك، ومع ذلك، فإن الاختلافات في نوعية الأنسجة من النص التي تؤوي UBE3A-ATS بين البشر والفئران (11)، مشيرا إلى أن توقيت وآلية UBE3A القمع قد تختلف بين هذه الأنواع. القدرة على دراسة توقيت التنموي وآلية القمع الدماغ محددة من UBE3A أليل الأب في نموذج التنمية البشرية أمر بالغ الأهمية لفهم أفضل لعملية المرض AS واستخدام الخلايا العصبية الحية من المرضى الذين يعانون من AS لاكتشاف التدخلات العلاجية غير موصوف سابقا. هنا، وقد وضعنا هذا النموذج عبر الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (التوجيهية) التكنولوجيا.
النتائج

iPSCs البشرية الناتجة عن AS وPWS الخلايا الليفية.

تم إنشاء خطوط التوجيهية باستخدام الخلايا الليفية من مريضين مختلفة مع AS الذين قاموا رثت أمومي الحذف من كروموسوم 15q11-Q13 ومن مريض واحد مع PWS الذين قاموا حذف الأب من كروموسوم 15q11-Q13. تم إنشاؤها باستخدام ناقلات iPSCs فيروسات ترميز OCT4، SOX2، KLF4، MYC، وLIN28 (12، 13). وقد حددت المستعمرات برمجتها في البداية شكليا وتم التحقق في وقت لاحق باستخدام مناعية للتحقق من التعبير عن NANOG علامات تعدد القدرات، SSEA4، TRA1-60، وTRA1-81 (الشكل 1 والشكل S1). AS عرضت iPSCs أن يكون [كروتب المتوقع من 46، XX أو XY، ديل (15) (pter> Q11 Q13 ::> qter) وللتعبير عن الجينات المرتبطة مع تعدد القدرات على مستويات مماثلة لH9 (WA09) الخلايا ES الإنسان ( HESC) خط (الشكل 1 والشكل S2). واستخدمت الجذعية صفائف تعدد القدرات الخلية البشرية لالكمي RT-PCR (QRT-PCR) للتحليل التعبير الجيني الهيئات مضغي AS التوجيهية المشتقة (EBS) بعد 14 د من التمايز عفوية. تدل هذه البيانات على أن AS iPSCs هي قادرة على التمايز multilineage، ليتم التعبير عن علامات مبكرة النسب تمثل كل طبقة من طبقات جرثومية جنينية ثلاثة وكذلك طبقة الأديم الظاهر الغاذي (الشكل S3).

تين. 1.
AS iPSCs التعبير عن علامات تعدد القدرات وكان يتوقع كروتب]. (A) على النقيض من المرحلة (أ-ج) صور AS تظهر iPSCs مثل HESC التشكل. مناعية للعلامات تعدد القدرات على خطوط التوجيهية تمثيلية يظهر التعبير عن NANOG (د-F)، SSEA4 (ز-ط)، TRA1-60 (ي-ل)، وTRA1-81 (م-ص). تم تنفيذ (B) تحليل النمط النووي على الكروموسومات G النطاقات من قبل خلية خط الوراثة. ممثل الكروموسومات من اثنين G النطاقات AS خطوط التوجيهية تظهر التهم كروموسوم العادية من 46 XX (ASdel1-0) و 46 XY (ASdel2-0).

AS وPWS iPSCs الحفاظ على المناسبة مثلأيشن بصمة بعد إعادة برمجة.

لأن إعادة برمجة النووية من الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة قد تنطوي على محو العالمي للعلامات جينية، فقد قيل أن مثيلة التفاضلية التي يصادف PWS-IC ويمكن أيضا أن تمحى خلال إعادة برمجة، مما يجعل من الصعب إنشاء نموذج التوجيهية للAS ( 14). وفي هذا الصدد، ذكر الحامض النووي الشاذة في مطبوع H19 وKCNQOT1 الجينات في iPSCs في الآونة الأخيرة (15). قمنا بتقييم بصمة الحامض في وضعها الطبيعي، AS، وPWS iPSCs التي كتبها مثيلة محددة PCR (16، 17). وأظهرت iPSCs من الأشخاص الطبيعيين والأشخاص ذوي AS من وPWS أنماط مثيلة نفس خطوط الخلايا الليفية التي كانت مشتقة. كانت أليل الأمهات الميثيلي وأليل الأب unmethylated كلا موجودة في iPSCs العادية، في حين لوحظ فقط أليل الأب unmethylated في AS iPSCs ولوحظ فقط أليل الأمهات ميثليته في PWS iPSCs (الشكل 2 والشكل. S4 A). وقد تأكدت هذه النتائج باستخدام حساسة للمثيلة نوكلياز داخلية تقييد الكمي فحص PCR (الشكل. S4 B).

تين. 2.
يتم الاحتفاظ بصمة الحامض في PWS-IC خلال إعادة برمجة. (A) مثلأيشن محددة تحليل PCR من الحمض النووي الجيني من العادية، الخلايا الليفية AS، وPWS. الاشعال محددة لأليل مميثل تضخيم الفرقة التي هي 174 سنة مضت، في حين الاشعال محددة لأليل unmethylated تضخيم منتج 100-BP. حصيرة، الأمهات؛ بات، الأب. (B) مثلأيشن محددة PCR باستخدام الحمض النووي الجيني من ثلاثة مختلفة AS خطوط التوجيهية واثنين من مختلف خطوط التوجيهية العادية. NEG، سلبية. (C) مثلأيشن محددة PCR باستخدام الحمض النووي الجيني من ثلاثة خطوط PWS التوجيهية المختلفة.

AS iPSCs يمكن التفريق إلى الخلايا العصبية الوظيفية.

لأنه كما هو اضطراب عصبي، سعينا لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية من AS iPSCs. وقد تختلف AS وطبيعية iPSCs إلى الخلايا العصبية باستخدام EB سيطة لتقريب التطور الطبيعي الإنسان (18، 19) (التين. S5 و S6). وتمشيا مع تقرير صدر مؤخرا (20)، تفاوت كبير في كفاءة التمايز لوحظ بين خطوط التوجيهية المختلفة. لذلك، اخترنا خط عادي واحد واحد خط AS التوجيهية التي يتم عرضها كفاءة الخلايا العصبية النسب التمايز لمزيد من الدراسات.
وجاء توقيت التنموي التمايز العصبي لكلا AS وiPSCs العادية بشكل وثيق التي سبق أن أبلغت عن hESCs (19). بعد 4 أسبوع من التمايز، MAP2- والخلايا العصبية TUJ1 إيجابية يمكن تحديد (الشكل 3 ألف وباء. والشكل S6 B - D). تم الكشف عن الخلايا النجمية بعد 6 أسبوع من التمايز عن طريق تلطيخ لS100β (الشكل 3 C و الشكل. S6 B). كانت بالتزامن مع ظهور الخلايا النجمية تطوير نقاط الاشتباك العصبي واضحة من جانب ظهور Synapsin خلايا I-الإيجابية (التين. S5 D وS6 C). بعد 10 أسبوع من التنمية، المناعية مع الأجسام المضادة قناة الصوديوم (PanNav) إلى أن قنوات الصوديوم المترجمة إلى الجزء الأولي محور عصبي في بعض وليس كل الخلايا العصبية (التين. S5 E و F وS6 E).

تين. 3.
يمكن توليد الخلايا العصبية الوظيفية من AS iPSCs. صورة (A) المرحلة النقيض من الخلايا العصبية عمرها 10 فالتر كالين في المختبر متباينة الناتجة عن AS iPSCs. (B) الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من وصمة عار إيجابيا لβIII تويولين (TUJ1 والأخضر). تنشأ (C) النجمية S100β إيجابية تلقائيا في الثقافات الخلايا العصبية AS التوجيهية المستمدة من بعد 6 أسبوع من التمايز. (D) التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية الناضجة AS التوجيهية المستمدة من بعد 10 أسبوع من التمايز. (العليا) تدريب من إمكانات العمل التي حركها depolarizing الحقن الحالية (50 سنويا). (أشرطة المعايرة: 20 فولت، 0.1 ثانية.) (السفلى) الاحتلالات مثال EPSCs عفوية المسجلة من نفس الخلايا العصبية في غياب أو حضور أمبا مستقبلات DNQX (10 ميكرومتر). (أشرطة المعايرة: 10 السلطة الفلسطينية، 1 ق.) (E) التسجيلات الكهربية من غير ناضجة AS الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من بعد 10 أسبوع من التمايز. (العليا) الاستجابة إلى depolarizing الحقن 60-السلطة الفلسطينية الحالي. (السفلى) عدم وجود نشاط متشابك عفوية. الحانات المعايرة هي نفسها كما في D.

وأشارت هذه البيانات إلى أن الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من والنضج في الثقافة وأن بعض وليس كل الخلايا العصبية كانت ناضجة وظيفيا. في اتفاق مع البيانات مناعية، 10 فالتر كالين متباينة AS الثقافات التوجيهية الواردة الخلايا العصبية التي عرضت القطارات من إمكانات العمل والتيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) بوساطة أمبا تنشيط مستقبلات (على سبيل المثال في الشكل 3 D). ويمكن أيضا أن يتم تحديد الخلايا العصبية التي لم يكن لديك القطارات المتكررة من إمكانات العمل و / أو EPSCs قوية (الشكل 3 E). أظهرت العادية الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من تنوع مماثل بعد 10 أسبوع من تطوير (على سبيل المثال في الشكل S7). على الرغم من أن الخلايا العصبية الوظيفية ناضجة مع النشاط متشابك يمكن أن تتولد من AS iPSCs من قبل في المختبر تطوير والثقافات 10 فالتر كالين غير متجانسة في نضجها. وهذا ليس مستغربا لأن 14٪ فقط من الخلايا العصبية لوحة القشرية الإنسان العينات التي أخذت في 16 أسبوع من الحمل النار إمكانات العمل المتكررة (21).

UBE3A الأب هو مكبوت خلال تكوين الخلايا العصبية في المختبر من AS iPSCs.

بالإضافة إلى صيانة المؤمنين من مثيلة بصمة PWS-IC، وغيرها من سمات جينية الرئيسية لنموذج مناسب لAS هي قمع أليل UBE3A الأب على التمايز العصبي. على الرغم من أن يتم التعبير عن كل من الأليلات UBE3A في معظم الأنسجة، وقمع أليل الموروثة من الأب في الدماغ (+4 - 6). ويعتقد التعبير مطبوع من UBE3A أن تحدث نتيجة التعبير المتبادل من نص طويل غير المكودة العقاقير، UBE3A-ATS، الذي هو جزء من نص> 600 كيلو بايت الشروع في ميثليته تفاضلي PWS-IC تقع في اكسون 1 من SNURF الجينات -SNRPN (+7 - +9).
القدرة على استخلاص المختلطة السكان من الخلايا العصبية الناضجة من AS وطبيعية iPSCs سمحت لنا لاختبار ما إذا كانت عملية إعادة برمجة جينية قد أثرت على تنظيم الأنسجة محددة من UBE3A يطبع. وكان يعاير UBE3A التعبير QRT-PCR في iPSCs والثقافات الخلايا العصبية التوجيهية المشتقة من المرضى العادي والمرضى الذين يعانون AS. الشكل. 4 A يظهر QRT-PCR للتعبير UBE3A في AS وiPSCs الطبيعية والخلايا العصبية التوجيهية مشتقة. لوحظ انخفاض مستويات UBE3A التعبير في كلا AS iPSCs والثقافات الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة النسبية لنظرائهم العادية. علاوة على ذلك، انخفض التعبير UBE3A في الخلايا العصبية AS التوجيهية المستمدة من النسبي إلى AS iPSCs، مما يدل على قمعها جينية على تمايز الخلايا العصبية. على العكس من ذلك، مستويات UBE3A التعبير لا تتغير بين iPSCs الطبيعية والخلايا العصبية التوجيهية المشتقة، على الرغم من القمع واضح من UBE3A أليل الأب.

تين. 4.
وقمعت UBE3A الأب في AS الخلايا العصبية التوجيهية مشتقة. (A) تحليل QRT-PCR التعبير UBE3A في AS وiPSCs الطبيعية والخلايا العصبية التوجيهية مشتقة. التعبير الجيني هو تطبيع لGAPDH ويرد بأنه التغير النسبي أضعاف إلى مستويات التعبير UBE3A في iPSCs العادية. أشرطة الخطأ تشير SD لثلاث ثقافات مستقلة. (B) تحليل لطخة غربية من المعتاد وAS iPSCs (I) والخلايا العصبية القديمة 10 فالتر كالين-التوجيهية المستمدة من (N).

لتحديد ما إذا كان للقمع الأبوي UBE3A أليل يؤدي إلى انخفاض مستويات البروتين UBE3A في نموذجنا في المختبر من AS، تم إجراء تحليل لطخة غربية على AS وiPSCs الطبيعية والثقافات الخلايا العصبية التوجيهية المشتقة (الشكل 4 B). على غرار نتائج QRT-PCR، يتم تقليل البروتين UBE3A بشكل ملحوظ في AS مقارنة مع iPSCs العادية. وتمشيا مع يطبع الأنسجة محددة، وزيادة تخفيض مستويات البروتين UBE3A في AS الثقافات العصبية التوجيهية المستمدة مقارنة مع AS iPSCs. وكانت مستويات البروتين UBE3A مماثلة بين iPSCs الطبيعية والثقافات الخلايا العصبية التوجيهية مشتقة. في نظامنا التوجيهية النموذج، وقمع وUBE3A أليل الأب بشكل كبير في الخلايا العصبية مشتقة من AS التالية iPSCs 10 أسبوع من التمايز، تلخص خاصية جينية الرئيسية للمرض في المختبر.

الخلايا العصبية النوعية أعلى إلى تنظيم UBE3A-ATS الاقتران مع UBE3A القمع.

على الرغم من أن آلية القمع UBE3A في الدماغ لم يتم توضيحها بشكل كامل، فإنه لا ينتج من الأنسجة محددة الحامض النووي الفرق من المروج UBE3A لأن المروج الدليل السياسي الشامل الغنية UBE3A هو unmethylated في جميع أنسجة الإنسان والفأر التي تم فحصها ، بما في ذلك الإنسان الأنسجة بعد الوفاة الدماغية (1). أكدنا أن UBE3A المروج الأب هو unmethylated في الخلايا العصبية التوجيهية المشتقة وكذلك في الخلايا الليفية وiPSCs (الشكل S8). نستنتج أن إسكات أليل UBE3A الأب في الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من هو ليس نتيجة مثيلة زائفة من المروج UBE3A أثناء عملية إعادة البرمجة، بل أنه يعكس آلية طبيعية من UBE3A يطبع في الدماغ.
هناك أدلة تشير إلى أن الدماغ محددة UBE3A القمع بوساطة طويلة غير المكودة العقاقير RNA (+7 - +9) (الشكل 5 A). لتحديد ما إذا كان UBE3A العقاقير نسخة UBE3A-ATS يعرض خصوصية الأنسجة المتوقعة التعبير، تم تحليل الإكسونات غير المرمزة noncoding الموجودة المصب SNURF-SNRPN. تم استخدام التهجين لطخة الشمالي لتقييم التعبير عن snoRNAs معالجتها، SNORD116 (وتسمى أيضا HBII-85) وSNORD115 (وتسمى أيضا HBII-52)، مما يدل على أن يتم التعبير عن SNORD116 في كل iPSCs والخلايا العصبية، في حين يقتصر SNORD115 التعبير iPSC- الخلايا العصبية مشتقة (الشكل 5 B)، بما يتفق مع تقارير أخرى أن يتم التعبير عن ذلك على وجه التحديد في الدماغ (11). RT-PCR باستخدام بادئات الاعتراف الإكسونات تقسم في الكتلة SNORD116، الكتلة SNORD115، وUBE3A-ATS (9) أكد هذه النتيجة (الشكل 5 C). تشير هذه البيانات إلى أن على الرغم من أن يتم التعبير عن الترميز وغير مكود الداني الإكسونات SNURF-SNRPN ومعالجتها في الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان، الإكسونات أكثر البعيدة تصبح أعرب ومعالجتها كما هو الحال في المختبر تقدم التطور العصبي على نحو متزايد. لأن النص UBE3A-ATS، الذي يتداخل UBE3A، تم الكشف فقط في الثقافات الخلايا العصبية، فإننا نستنتج أن قمع الخلايا العصبية محددة من UBE3A قد تحدث في وقت متأخر نسبيا خلال تكوين الخلايا العصبية، تتزامن مع ما يصل التنظيم من SNORD116، SNORD115، وUBE3A-ATS .

تين. 5.
وأعرب عن UBE3A-ATS فقط في الثقافات الخلايا العصبية ويرتبط مع الأب القمع UBE3A. (A) خريطة للSNURF-SNRPN والنصوص UBE3A. الأبيض ودوائر بيضاوية الشكل سوداء تشير إلى unmethylated وميثليته PWS-IC، على التوالي. خط الصلبة مع السهام تشير النصوص التي أعرب عنها في iPSCs، في حين أن خط منقط يشير النصوص العصبية محددة. AS iPSCs ومشتقاتها العصبية تفتقر إلى كامل أليل ورثت أمومي من هذه المنطقة. (B) لطخة الشمالية باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع من AS وiPSCs العادية (I) والتوجيهية المستمدة من الخلايا العصبية القديمة 10 أسبوع (N) ويظهر التعبير عن snoRNAs SNORD116 وSNORD115 خلال المختبر في التطور العصبي. (C) RT-PCR باستخدام بادئات تمتد الإكسونات متعددة من SNORD116، SNORD115، وUBE3A-ATS في iPSCs (I)، البالغ من العمر 3-أسبوع-التوجيهية المستمدة من الخلايا العصبية السلائف (P)، والكبار 10-أسبوع-التوجيهية المشتقة الثقافات الخلايا العصبية (N).

مناقشة

قد توفر iPSCs نماذج قوية من الاضطرابات الجينية البشرية المعقدة (+22 - 24). واحد عائقا أمام استخدام iPSCs لنموذج اضطرابات الإنسان تنطوي يطبع الجينوم هو احتمال أن بصمة إما أن تمحى خلال إعادة برمجة أو لم يتواصل خلال ثقافة iPSCs. البيانات المتوفرة لدينا (الشكل 2 والشكل. S4)، مشيرا إلى أن بصمة الحامض في PWS-IC لا تمحى أو إعادة تعيين أثناء عملية إعادة البرمجة النووية في كل من خطوط التوجيهية الذكور والإناث، ويدعم النموذج المقبول على نطاق واسع أن PWS-IC يتم مسح مثيلة بصمة في سلالة الجرثومية، التي أنشئت إما في سلالة الجرثومية أو خلال المراحل الأولى من التطوير قبل الغرس، وبعد ذلك حافظت طوال تنمية (25 - 28). وتشير هذه النتائج إلى أن مثيلة بصمة PWS-IC هو صهر لمحو العالمي للعلامات جينية الناجمة عن عملية إعادة البرمجة. ومن المثير للاهتمام، وأيضا الحفاظ على هذا بصمة مستقر خلال ثقافة على المدى الطويل من خلايا الإنسان والفئران ES (سواء +29 - 31).
على الرغم من أن لاحظنا التباين في إمكانية التفريق العصبية لدينا AS iPSCs، كنا قادرين على إثبات أننا يمكن أن تنتج وظيفية مباشرة AS الخلايا العصبية في الثقافة. الأهم من ذلك، أظهرت هذه الخلايا العصبية أمبا EPSCs بوساطة مستقبلات. في الآونة الأخيرة، جرير وآخرون. (32) أثبتت أن نقاط الاشتباك العصبي مثير في الخلايا العصبية الفئران مع انخفاض UBE3A لديها مستقبلات أمبا أقل وانخفاض وظيفة أمبا مستقبلات. جارية لتحديد ما إذا كان أمبا مستقبلات توطين وظيفة تختلف بين AS والخلايا الطبيعية في ثقافاتنا الخلايا العصبية البشرية مزيد من الدراسات الكهربية وimmunocytochemical الناضجة الخلايا العصبية التوجيهية مشتقة.
واحدة من النتائج الأكثر لفتا للدراستنا هو أن التعبير عن المصب غير المرمزة noncoding الموجودة الإكسونات SNURF-SNRPN يصبح أكثر الخلايا العصبية محددة بطريقة الداني، لالقاصي. وهذا يختلف عن نماذج الماوس، حيث كل الإكسونات غير المرمزة noncoding الموجودة المصب Snurf-Snrpn هي الدماغ محددة (11). تشير الدلائل إلى أن تنظيم هذه النسخة، وبشكل أكثر تحديدا، الجزء UBE3A-ATS من محضر يلعب دورا هاما في قمع UBE3A الأب (+7 - +9). تعبير منسق من الأب UBE3A-ATS وقمع UBE3A الأب في AS iPSCs خلال في المختبر تكوين الخلايا العصبية تسمح لنا استخدام هذا النموذج لدراسة تنظيم وتجهيز UBE3A-ATS وآثاره على هيكل لونين من UBE3A المروج الأب أثناء البشرية التطور العصبي.
لدينا نموذج خلية ثقافة الإنسان للAS يلخص نمط الأنسجة محددة من UBE3A يطبع، وبالتالي يوفر أداة هامة لمعالجة توقيت وآلية جينية UBE3A إسكات خلال تطوير العصبية البشرية. في المختبر AS نظام نموذجي هو موضح هنا سوف تكون ذات فائدة في تشخيص التشوهات الفسيولوجية للمرض على المستوى الخلوي، بما في ذلك تحليل الكهربية للخلايا العصبية AS التوجيهية المشتقة أيضا. تطوير في المختبر من أمبا بوساطة مستقبلات النشاط متشابك عفوية إلى أن هذه الخلايا العصبية التوجيهية المشتقة يمكن استخدامها لدراسة هيكل متشابك والتنمية في AS الخلايا العصبية. سيكون لدينا نموذج التوجيهية للPWS تكون مفيدة في مواصلة التحقيق في الأساس الجيني للPWS، بما في ذلك كيفية فقدان العديد من أنواع snoRNAs تساهم في اضطراب. ونحن نخطط أيضا لاستخدام تكنولوجيا التوجيهية لنموذج كروموسوم 15q11-Q13 المرتبطة الازدواجية التوحد. فإن نماذج الثقافة خلية من هذه الاضطرابات العصبية الوراثية والبشرية الأخرى توفير أدوات هامة لتعزيز فهم آليات المرض وتطوير أدوات فريدة من نوعها لاكتشاف الأدوية.

المواد والأساليب

الليفية المريض محددة.

تم تخزين الخلايا الليفية في وقت لاحق من ASdel1 المريض معزولة والمقدم من قبل بروس KORF (مستشفى الأطفال في بوسطن، بوسطن، MA) في عام 1995 الأنسجة مجهولة المصدر في النيتروجين السائل. تم تنفيذ FISH لتأكيد الحذف 15q11-Q13 قبل إعادة برمجة. تم الحصول على ASdel2، PWSdel1، والخلايا الليفية الطبيعية من مستودع لالمسخ سلالات الخلايا البشرية في المركز الصحي لجامعة ماكجيل / مونتريال مستشفى الأطفال (مونتريال، QC، كندا)، وهي الخلايا أرقام الأسطر WG1631، WG1534، وMCH065، على التوالي.

زراعة الخلايا.

وقد حافظت الخلايا الليفية الإنسان، الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS)، و293T / 17 الخلايا في DMEM (إينفيتروجن) تستكمل مع 10٪ (المجلد / المجلد) FCS. وكانت iPSCs مثقف في المتوسط ​​HESC التقليدية تتألف من DMEM-F12 (إينفيتروجن) تستكمل مع 20٪ (المجلد / المجلد) خروج المغلوب بديل المصل، والأحماض الأمينية غير الأساسية، 1 ملي L-الجلوتامين، و 100 ملم β المركابتويثانول و 4 نانوغرام / مل جمعية جيل المستقبل الأساسية. واستمرت الخلايا في حاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ (المجلد / المجلد) CO 2. تم passaged iPSCs حوالي مرة واحدة في الأسبوع عن طريق خفض المستعمرات يدويا باستخدام إبرة.

الإنتاج الارتجاعي.

تم الحصول على pMXs ناقلات فيروسات تحمل إدراجات لOCT4 (البلازميد 17217)، SOX2 (البلازميد 17218)، KLF4 (البلازميد 17219)، وC-MYC (البلازميد 17220) من Addgene. ولدت A pBABE-GFP ناقلات فيروسات تحمل LIN28 التي كتبها subcloning PCR تضخيم LIN28 كدنا] بين المواقع SnaBI وEcoRI. وتم التحقق من الحيوانات المستنسخة عن طريق الهضم التقييد ومتسلسلا.
وبناء التغليف فيروسات، pMDL.Gagpol، كان هدية من الكسندر Lichtler (جامعة كونيتيكت المركز الصحي، فارمينغتون، CT)، والبلازميد المغلف، pMD2.G، تم الحصول عليها من Addgene (البلازميد 12259). تم إنتاج الفيروسات القهقرية في 293T / 17 الخلايا ترنسفكأيشن باستخدام Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن). تم جمع supernatants المحتوية على الفيروس في 24 و 48 ساعة posttransfection واستخدامها مباشرة لإعادة البرمجة أو تجميدها لاستخدامها لاحقا.

الجيل التوجيهية.

تم إنشاء iPSCs التالية البروتوكولات نشرت سابقا (12). على وجه التحديد، تم تنفيذ اثنين transductions التسلسلية باستخدام كميات متساوية من supernatants المحتوية على الفيروس الارتجاعي خمسة أكثر من 48 ساعة. بعد ستة أيام من تنبيغ الأول، كانت مطلية 10 5 الخلايا الليفية transduced إلى طبقة المغذية MEF المشع على 10 سم 2 الطبق. تم تغذية الخلايا الليفية Transduced مع HESC المتوسط ​​كل يوم. تم القبض على المستعمرات مع HESC مورفولوجيا (ضيق جدا ومستديرة جدا) لتعيش المشع طبقات المغذية MEF بعد ≈4 أسبوع.

تمايز الخلايا العصبية.

وقد أجريت تمايز الخلايا العصبية وفقا لبروتوكولات المنشورة (18، 19) مع تغييرات طفيفة. على وجه التحديد، وiPSCs قطع يدويا ورفع من الطبقة المغذية الماوس الليفية بدلا من فصلها مع Dispase (إينفيتروجن).
وقد تم توليد خلايا عصبية عادية تستخدم في دراستنا من مرور 20 iPSCs وكان لا يقل عن 10 أسبوع من العمر. كانت الخلايا العصبية AS مثقف من مرور 15-20 iPSCs وكانت أيضا لا يقل عن 10 أسبوع من العمر لجميع التجارب مبين. أخذت الخلايا العصبية السلائف بعد 3 أسبوع للثقافة، قبل الطلاء الثاني على الأطباق المغلفة laminin.

مثيلة-PCR محددة.

لأداء مثيلة محددة PCR، تعرضت السلطات الوطنية المعينة الجينومية لتحويل بيسلفيت باستخدام أدوات EZ الحامض النووي الذهب (للبحوث Zymo) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم استخدام الحمض النووي بيسلفيت تحويلها إلى البذور وPCR تعدد باستخدام بادئات التالية: 15maternalF، 5'-TAATAAGTACGTTTGCGCGGTC-3؛ 15maternalR، 5'-AACCTTACCCGCTCCATCGCG-3؛ 15paternalF، 5'-GTAGGTTGGTGTGTATGTTTAGGT-3؛ و15paternalR، 5'-ACATCAAACATCTCCAACAACCA-3 ". تم تنفيذ الضوابط الأبوية الأم وباستخدام مجموعات التمهيدي الأب أو الأم وحدها في قوالب تضخيم سابقا. حجم جزء الأمهات 174 سنة مضت، وحجم جزء الأب هو 100 سنة مضت.

مناعية.

تم تنفيذ مناعية على iPSCs والخلايا العصبية وفقا للأساليب التي نشرت سابقا (33)، مع تغييرات طفيفة. على وجه التحديد، coverslips الموجهة لتلطيخ مع علامات غير النووية لم permeablized مع العازلة هيكل الخلية (CSK) قبل التثبيت، وcoverslips أن ملطخة لم permeabilized علامات سطح الخلية. كانت ثابتة Coverslips ملطخة GAD65 / 67 و TUJ1 في الميثانول لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية ثم ممهى لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني بدلا من امتصاص العرق التثبيت. وتصور الشرائح ملطخة بواسطة المجهر مضان وتصوير باستخدام مجهر زايس Axiovision في تكبير من 5 × 20 × و 63 ×.

الكهربية.

تم نقل الخلايا في ثقافة نمت coverslips على الفردية إلى غرفة تسجيل (درجة حرارة الغرفة) ثابتة إلى مرحلة المجهر تستقيم أوليمبوس BX51WI مزودة 40 × الغمر بالمياه عدسة الهدف. خلال التسجيلات، وcoverslips perfused باستمرار في 2 مل / دقيقة مع الحل حمام. تم معايرتها درجة الحموضة محتدما المستمر مع 95٪ (المجلد / المجلد) O 2 -5٪ (المجلد / المجلد) CO 2. تم الحصول على خلية كاملة الجهد المشبك [الانتظار V (عقد الجهد) = -70 بالسيارات] والمشبك الحالي تسجيلات من الخلايا في ثقافة استخدام تقنيات المحددة سابقا (34). تم ترشيح كل الأحداث الكهربائية في 2.9 كيلو هرتز ورقمية في ≥6 كيلو هرتز باستخدام HEKA ITC-16 التحويل الرقمي بنيت إلى EPC9 / 2 مكبر للصوت (حكا ELEKTRONIC). تم تعويض سلسلة المقاومة 70٪ عند تأخر من 10-100 ميكرو ثانية. تم رصد مقاومة الإدخال مع 5-بالسيارات (50 مللي) الخطوات hyperpolarizing الجهد. خارج خط أجري التحليل باستخدام Clampfit (الصكوك أكسون).

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
إضافة رد
صفحة 1 من 2 1 2

« الموضوع السابق | الموضوع التالي »

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك
BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة
الانتقال السريع

 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع |  المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية


الساعة الآن 02:18 PM.

الاتصال بنا - موقع أطفال الخليج ذوي الاحتياجات الخاصة - الأرشيف - الأعلى

Powered by vBulletin® Version 3.8.2
Copyright ©2000 - 2024, Jelsoft Enterprises Ltd

a.d - i.s.s.w