#11  
قديم 11-23-2015, 08:52 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي شرط بارديه-بيدل البروتينات متلازمة ليبتين مستقبلات الإشارات

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/18/7/1323.full

السمنة مشكلة صحية عامة رئيسية في معظم البلدان المتقدمة وعامل خطر رئيسي لمرض السكري وأمراض القلب والشرايين. شواهد يدل على ضعف الهدبية يمكن أن تساهم في البدانة الإنسان ولكن الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة غير معروفة. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي متلازمة السمنة الإنسان غير المتجانسة وراثيا المرتبطة اختلال وظيفي الهدبي. ويعتقد أن البروتينات BBS للعب دور في وظيفة الأهداب والخلايا الاتجار البروتين / الحويصلة. هنا، وتبين لنا أن البروتينات BBS هناك حاجة لمستقبلات هرمون الليبتين (LepR) في اشارة الى ما تحت المهاد. وجدنا أن Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران هي مقاومة لعمل هرمون الليبتين للحد من وزن الجسم وتناول الطعام بغض النظر عن مستويات اللبتين في الدم والسمنة. بالإضافة إلى ذلك، انخفض تفعيل STAT3 المهاد التي كتبها ليبتين بشكل كبير في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران. في المقابل، يشير الى المصب الميلانوكورتين مستقبلات تتأثر، مشيرا إلى أن LepR الإشارات تضعف تحديدا في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران. وارتبط ضعاف LepR يشير في BBS الفئران مع انخفاض POMC التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن البروتين BBS1 يتفاعل جسديا مع LepR وأن فقدان البروتينات BBS يشوش الاتجار LepR. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن البروتينات BBS توسط الاتجار LepR وأن يشير LepR ضعاف راء اختلال توازن الطاقة في BBS. وتمثل هذه النتائج آلية جديدة لمقاومة اللبتين والسمنة.

مقدمة

تزايد انتشار السمنة وارتباطه مع مختلف الاضطرابات الإنسان، مثل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم قد جعل دراسة آليات التي تتحكم في توازن الطاقة أولوية عالية. العوامل البيئية والوراثية التي تسهم في البدانة "وباء" هي حاليا قيد التحقيق المكثف ولكن فهمنا للعمليات الجزيئية الخلوية والفسيولوجية التي تنظم توازن الطاقة والعيوب التي تؤدي إلى اختلال توازن الطاقة والسمنة لا تزال بعيدة عن الاكتمال. في الثدييات، يتم التحكم في وزن الجسم وتوازن الطاقة عن طريق التفاعل بين الإشارات الطرفية والدماغ، وخصوصا منطقة ما تحت المهاد (1). اللبتين هو هرمون المشتقة من خلية شحمية الذي يدور في نسبة إلى كمية الدهون في الجسم من أجل إبلاغ الدماغ عن تخزين الدهون الطرفية (2، 3). داخل النواة المقوسة من منطقة ما تحت المهاد، وهو موقع كبير للعمل هرمون الليبتين، ومن المعروف اللبتين للعمل على اثنين على الأقل من السكان العصبية: proopiomelanocortin (POMC) الخلايا العصبية، والتي يتم تفعيلها من خلال ليبتين ونيوروبيبتيدي Y (NPY) الخلايا العصبية [معربا عن المشترك آغوطي البروتين ذات الصلة ب (AgRP)]، وتحول دون اللبتين (1 - +4). في القوارض والبشر، والطفرات في الجينات التي تكود اللبتين ومستقبلات هرمون الليبتين الرصاص إلى السمنة والعقم والغدد الصماء اختلالات شديدة (2، 5).
وتشير الاكتشافات الحديثة أن الخلل الهدبية ويرتبط مع السمنة الإنسان. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب وراثي البشرية تنميط المرتبطة اختلال وظيفي الهدبي والسمنة (6، 7). حتى الآن، تم التعرف على أكثر من 12 جينات BBS وترتبط طفرات في الجينات BBS مع السمنة، polydactyly وتنكس الشبكية (6 - +8). المظاهر السريرية إضافية من BBS تشمل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم وضعف الإدراك، وتشوهات الكلى ونقص الأعضاء التناسلية (6 - +8). على الرغم من أن تشارك البروتينات BBS في القائم أنيبيب الاتجار البروتين / الحويصلة (6، 10)، لم تتميز وظيفة جزيئية دقيقة من كل من البروتين BBS. وبالمثل، فإن الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تؤدي إلى كل عنصر من عناصر النمط الظاهري BBS غير معروفة.
في السابق، أثبتنا أن السمنة في BBS الفئران يرتبط hyperleptinemia ومقاومة اللبتين (11). ومع ذلك، منذ إنتاج هرمون الليبتين يتناسب مع كمية الدهون في الجسم، وكثيرا ما ترتبط hyperleptinemia ومقاومة اللبتين مع السمنة في النماذج الحيوانية والبشر (3، +12 - 14)، ومقاومة اللبتين في الفئران BBS يمكن أن تكون ثانوية إلى السمنة، مقارنة ليكون سببا في السمنة. هنا، تناولنا هذه المسألة، وكشف العيوب الجزيئية مما يؤدي إلى اختلال توازن الطاقة في BBS. باستخدام نموذج BBS الماوس خروج المغلوب (Bbs2 - / -) (15)، التي تلخص أهم مكونات النمط الظاهري البشري بما في ذلك السمنة، علينا أن نبرهن على البروتينات BBS مطلوبة للLepR الإشارات. أكدنا هذا مع BBS نماذج إضافية الماوس خروج المغلوب (Bbs4 - / - وBbs6 - / -) (16، 17). علينا أن نبرهن أيضا أن البروتينات BBS التفاعل بأنفسهم مع LepR والتوسط الاتجار LepR. النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن الإشارات LepR الموهنة بسبب الاتجار تغير من LepR هي السبب الرئيسي للسمنة في BBS.

النتائج

بارديه-بيدل الفئران متلازمة جود عيوب في المحور اللبتين الميلانوكورتين المهاد

لاختبار ما إذا كانت مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي الثانوية إلى السمنة، ودرسنا شهية-قمعها وآثار الخارجية ليبتين الماوس في BBS الفئران التي لديها مستويات تعميم ليبتين على تطبيع بواسطة تقييد السعرات الحرارية خفض الوزن Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - أعطيت الفئران 70-80٪ من الكريات طعام تستهلك عادة يوميا من قبل الفئران البرية من نوع الجنس والعمر المتطابقة. هذا البروتوكول تقييد السعرات الحرارية بشكل فعال منعت السمنة وانخفاض مستويات اللبتين في الدم في الفئران BBS (الشكل 1 A). في حين Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - أظهرت الفئران التي غذيت الإعلانية libitum 4-10 أضعاف أعلى مستويات اللبتين في الدم [الشكل 1 A و (11)]، ومستويات هرمون الليبتين من سعرات حرارية Bbs2 - / - Bbs4 - / - وBbs6 - / - كانت الفئران مقارنة مع البرية من نوع الحيوانات. تسببت Intracerebroventricular (ICV) إدارة يبتين انخفاضا كبيرا في تناول الطعام ووزن الجسم في البرية من نوع الفئران. في المقابل، فشلت ICV يبتين إلى الحد من الاستهلاك الغذائي ووزن الجسم في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران على الرغم من مستويات اللبتين في الدم العادية (الشكل 1 B و C). تناول الطعام تعديلها لوزن الجسم أسفرت عن نتائج مماثلة (لا تظهر البيانات). هذه النتائج تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران ليست الثانوية إلى السمنة. بدلا من ذلك، هذه النتائج تشير مقاومة اللبتين هو سبب السمنة في الفئران BBS.

الشكل 1.
بارديه-بيدل الفئران متلازمة مقاومة لهرمون الليبتين. (A) مستويات هرمون الليبتين في مصل الدم من النوع البري و(CR) Bbs2 المقيدة السعرات الحرارية - / - (2KO)، Bbs4 - / - (4KO) وBbs6 - / - (6KO) الفئران. وقد أظهرت مستوى اللبتين في الدم لتغذية الفئران عادة Bbs2 اغيا للمقارنة = 4-16). (B، C) Bbs2، Bbs4 وBbs6 الفئران الخالية مع مستويات اللبتين تعميم العادية لا تزال تقاوم عمل عن زيادة الوزن والحد من الشهية اللبتين. تم قياس التغيرات في وزن الجسم وتناول الطعام 24 ساعة بعد تناوله ICV ليبتين = 5-16). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران؛ † P <0.05 مقابل السيارة.

مستقبلات ميلانوكورتين، والتي هي المصب لLepR الإشارات، هي عقدة مهمة لتوازن الطاقة (1، 4). ولذلك، درسنا ما إذا كان ضعف قدرة المستقبلات ميلانوكورتين لتغيير الأيض أيضا في BBS الفئران. لهذا، نحن اختبار أثر إعطاء ICV من Melanotan الثاني (MTII)، ناهض مستقبلات ميلانوكورتين، على وزن الجسم وتناول الطعام (الشكل 2 ألف وباء). وعلى النقيض من اللبتين، وانخفاض ICV MTII تناول الطعام ووزن الجسم في كل من النوع البري وBbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، خفضت إدارة MTII الأنسجة الدهنية البنية والبيضاء في كل من السيطرة والحيوانات BBS (الشكل 2 C و D). وتشير هذه البيانات إلى أن قدرة المستقبلات ميلانوكورتين للتأثير على التمثيل الغذائي سليمة في الفئران BBS. الكمي العكسية الناسخ تفاعل البلمرة المتسلسل أظهرت (QRT-PCR) النتائج أيضا أن التعبير عن الميلانوكورتين-3 و -4 مستقبلات كان طبيعيا في BBS الفئران (المواد التكميلية، الشكل S1). جنبا إلى جنب، وهذه البيانات تشير إلى أن السمنة في الحيوانات BBS ونظرا لعيب (ق) المصب أو على مستوى LepR لكن المنبع من مستقبلات ميلانوكورتين في المحور اللبتين الميلانوكورتين المهاد.

الرقم 2.
بارديه-بيدل الفئران متلازمة هي استجابة لناهض مستقبلات ميلانوكورتين، MTII. (A-D) BBS الفئران لا يستجيب لعن زيادة الوزن، وتأثير الحد من كتلة appetite- والدهون من MTII. من النوع البري، Bbs2 - / - وBbs6 - / - تم حقن الفئران مع MTII أو مركبة، وتم قياس التغيرات في وزن الجسم وتناول الطعام بعد 24 ساعة. تم قياس البني الأنسجة الدهنية والدهون الإنجاب بعد وفاة في الفئران vehicle- أو MTII حقن = 4-7). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران. † P <0.05 مقابل السيارة.

الموهنة ليبتين مستقبلات الإشارات في بارديه-بيدل الحيوانات متلازمة

لتحديد خلل محدد مما يؤدي إلى اللبتين المقاومة في الفئران BBS، درسنا التعبير ويشير قدرة الإسوي طويلة من مستقبلات هرمون الليبتين (LepRb)، وشكل الإسوي الذي يشير القدرات داخل منطقة ما تحت المهاد (18، 19). لم تتغير مستويات مرنا من LepRb في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران مقارنة مع من النوع البري الضوابط (الشكل 3 A). لدراسة ما إذا كانت قدرة الإشارات من LepRb أمر طبيعي في الفئران BBS، قارنا قدرة اللبتين لتفعيل المهاد محول الإشارات ومنشط النسخ-3 (STAT3) بين النوع البري والفئران BBS. على النحو الوارد أعلاه، تم تطبيع مستويات اللبتين في الفئران BBS بواسطة تقييد السعرات الحرارية لتجنب مقاومة اللبتين الثانوية إلى السمنة. في السيطرة على الفئران، تسببت اللبتين زيادة قوية في STAT3 الفسفرة (الشكل 3 B). ومع ذلك، تم تخفيض الناجم عن اللبتين STAT3 الفسفرة إلى حد كبير في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (إلى 17-39٪ من السيطرة) وإن كانت مستويات اللبتين في الدم طبيعية في تلك الفئران (الشكل 3 B و C). تدل هذه البيانات على أن اللبتين المقاومة في BBS الفئران سببه عدم قدرة LepR لتفعيل آلية داخل الخلايا اللاحقة المرتبطة هذا المستقبل. في الفئران السمينة التي يسببها النظام الغذائي، ويعتقد مقاومة اللبتين أن يكون بسبب زيادة في القامع للخلوى يشير 3 (Socs-3)، واحدة من الأهداف التي تحدثها STAT3 ومثبط ردود الفعل السلبية من LepR الإنذار (20، 21 ). وجدنا أن كلا مرنا (الشكل 3 D) والبروتين (الشكل 3 E) مستويات Socs-3 وانخفض في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الحيوانات، مشيرا إلى أن المقاومة اللبتين في BBS الفئران لم يكن بسبب زيادة التعبير عن Socs-3 على عكس ما لوحظ في النظام الغذائي الناجم عن نموذج السمنة. الدور المحتمل للآليات أخرى مثل البروتين التيروزين الفوسفاتيز 1B ودوري AMP استجابة البروتين 1 (Creb1) لا يزال -regulated النسخ coactivator-1 في مقاومة اللبتين المرتبطة BBS يتم تحديدها (ملزم العنصر 22، 23). كما وجدنا أن Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - زيارتها الفئران التعبير الطبيعي للSyntaxin 1 (الشكل 3 E)، الذي سبق ان عرضه إلى أن downregulated في الفئران من نقص في هرمون الليبتين (OB / OB) أو LepRb (ديسيبل / ديسيبل) (24). Synaptophysin هو علامة عموم العصبية ولم يتم تغيير مستوى له في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران، مشيرا إلى أنه لا يوجد أي خسارة جسيمة للخلايا العصبية في الفئران BBS (الشكل 3 E). باختصار، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي بسبب الإشارات LepR الموهنة في منطقة ما تحت المهاد.

الرقم 3.
ضعاف LepRb يشير في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) الفئران. مستويات (A) التعبير عن LepR مطولا (LepRb). تم قياس كميات النسبية LepRb من mRNAs التي كتبها الكمي عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (QRT-PCR) بعد التطبيع مع RPL19. تم تحديد مستويات التعبير في البرية من نوع تعسفا في 1 = 6-9). تم تخفيض (B) STAT3 الفسفرة على ادارة اللبتين في الفئران BBS. وكانت الفئران BBS على النحو الوارد أعلاه لتطبيع مستويات اللبتين في الدم وحقن هرمون الليبتين المقيدة السعرات الحرارية. وقد تم تحليل مقتطفات البروتين طائي من قبل ستاندرد دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام والنشاف الغربي. (C) الكمي لSTAT3 مفسفر من البيانات المستخدمة في (B). وقد انخفض (D) Socs-3 مستوى مرنا في الفئران BBS. تم تحديد Socs-3 مستوى مرنا من قبل QRT-PCR على النحو الوارد أعلاه = 4-8). (E) مستويات البروتين من Socs-3، Syntaxin1 وSynaptophysin. β-catenin كان يستخدم كعنصر تحكم التحميل. البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران.

الخلايا العصبية proopiomelanocortin المعيبة في بارديه-بيدل الحيوانات متلازمة

للحصول على مزيد من التبصر في الآليات الجزيئية والخلوية من السمنة في الحيوانات BBS، درسنا مستويات التعبير عن الجينات طائي الرئيسية المشاركة في العمل اللبتين. وتمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها السابقة (11)، ومستويات التعبير عن الجينات Agrp ونبي مشه كانت طبيعية، في حين كان مستوى التعبير عن الجينات POMC مقهم؛ مفقد الشهية أقل من ذلك بكثير في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (الشكل مقارنة مع من النوع البري الضوابط 4 A). المقبل، ونحن اختبار ما إذا كانت الجينات مشه ومقهم؛ مفقد الشهية طائي ردت بشكل صحيح للتغيرات في توازن الطاقة المحيطية في BBS الفئران عن طريق مقارنة مستويات مرنا من هذه نيوروببتيد في الحيوانات التي تتغذى عادة و 48 ساعة صام. في البرية من نوع الفئران، زادت AgRP وNPY مرنا المستويات، وانخفضت مستويات POMC مرنا بعد الصيام (الشكل 4 B). في Bbs2 - / - وBbs4 - / -، وكانت التغيرات في مستويات AgRP وNPY مرنا في الاستجابة للصيام الفئران مماثلة لتلك التي من النوع البري الضوابط. في المقابل، كان الانخفاض الناجم عن الصيام في مستويات POMC مرنا أقل بكثير في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران بالمقارنة مع من النوع البري الضوابط (الشكل 4 B). وتشير هذه البيانات إلى أن الخلايا العصبية POMC من الفئران BBS لا تستجيب بشكل صحيح إلى تغييرات في توازن الطاقة المحيطية. وهكذا، يبدو أن الخلايا العصبية POMC أن تتأثر بشكل انتقائي في BBS الفئران المصب LepR الإشارات.

الرقم 4.
الخلايا العصبية POMC المعيبة في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) الفئران. مستويات (A) طائية من البروتين ذات الصلة آغوطي (AgRP)، نيوروبيبتيدي Y (NPY) وproopiomelanocortin (POMC) مرنا في تغذية عادة Bbs2، Bbs4 وBbs6 الفئران باطل بالمقارنة مع من النوع البري الضوابط = 6-9). (B) تأثير الصيام 48 ساعة (نسبة إلى الدولة تتغذى عادة) على AgRP المهاد، NPY وPOMC مرنا المستويات في البرية من نوع، Bbs2 وBbs4 الفئران فارغة (ن = 4-5). (C) تلطيخ المناعى للخلايا العصبية POMC إيجابية. أقسام الاكليلية من النوع البري، Bbs2 - / - (2KO) وBbs6 - / - كانت ملطخة (6KO) أدمغة مع أضداد POMC وتظهر المقاطع التمثيلية. (D) متوسط ​​عدد الخلايا العصبية POMC إيجابية في النواة المقوسة. احصي الخلايا POMC إيجابية في خمسة أقسام داخل موقف مماثل من كل حيوان ويظهر متوسط ​​عدد الخلايا العصبية POMC في نصف الكرة الأرضية = 3-4). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران.

لاختبار ما إذا كان الانخفاض في عدد الخلايا العصبية POMC قد يكون الخلل الرئيسي في الفئران BBS، قارنا عدد هذه الخلايا العصبية في النواة المقوسة طائي بين النوع البري والفئران BBS. وكشفت النتائج المناعية أن هناك انخفاض طفيف (حوالي 20٪) في الخلايا POMC إيجابية في Bbs2 - / - وBbs6 - / - الحيوانات (الشكل 4 C و D). ومع ذلك، هذا الانخفاض في الخلايا العصبية POMC لا يمكن أن يفسر تخفيض حوالي 40٪ في POMC التعبير الجيني أو الانخفاض أكثر من 60٪ في STAT3 الفسفرة. بالإضافة إلى ذلك، كان المناعية من POMC في الحيوانات BBS في كثير من الأحيان ضعيف (وهو ما يتسق مع مستويات أقل من POMC مرنا) مما يشير إلى أن عدد الخلايا العصبية POMC يمكن الاستهانة بها في الفئران BBS. جنبا إلى جنب مع الكيمياء الحيوية والتعبير الجيني بياناتنا، فإن هذه النتائج تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي في معظمها بسبب الموهنة يشير LepR.

بارديه-بيدل البروتينات متلازمة تتفاعل مع LepRb وتوسط الاتجار LepRb

مؤخرا، تبين أن سبعة البروتينات BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9) تشكل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome (9). ويقترح هذا المجمع كوحدة وظيفية التي تتوسط الاتجار البروتين / الحويصلة إلى أهداب. نحن افترض أن بعض مفارز BBSome قد تتفاعل مع LepRb و / أو STAT3 للتوسط الاتجار بهم. لافت للنظر، وجدنا أن البروتين BBS1 تفاعل تحديدا مع LepRb في ترنسفكأيشن وشارك في مناعي المقايسات عابرة (الشكل 5 A). لم تظهر أي مفارز BBSome أخرى التفاعل مع LepRb. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التفاعل بين BBS1 وLepR محددة لشكل الإسوي إشارات من المستقبلات، LepRb، لأن الإسوي غير إشارة، LEPRA، لم تتفاعل مع BBS1 (الشكل 5 B). واتساقا مع ذلك، وجدنا أن المجال-C محطة حشوية من LepRb، والتي هي فريدة من نوعها لLepRb، كان كافيا للتفاعل مع BBS1 (الشكل 5 C). نحن لم يكشف عن أي تفاعل بين STAT3 وBBS البروتينات (لا تظهر البيانات). طفرة BBS1 M390R، وهو تحور الأكثر شيوعا وجدت في المرضى الذين يعانون BBS البشري وكافية للحث على الظواهر BBS بما في ذلك السمنة في نموذج الفأر المغلوب في (25)، تقلص إلى حد كبير على قدرة BBS1 للتفاعل مع LepRb (الشكل 5 د). متحولة BBS1 M390R كما أظهرت انخفض التفاعل مع LepRb مجال حشوية (الشكل 5 C). لاختبار ما إذا كان التفاعل بين BBS1 وLepRb يحدث في الخلايا الحية، ونحن transfected ARPE 19 الخلايا مع BBS1 إما وحدها أو مع LepRb. وجدنا أنه على الرغم من الكشف عن البروتينات BBS1 overexpressed في جميع أنحاء السيتوبلازم، وشارك في ترنسفكأيشن من LepRb مع المقيدة BBS1 BBS1 توطين لينقط صغيرة في ARPE 19 الخلايا (المواد التكميلية، الشكل S2)، ودعم التفاعل المادي للLepR مع BBS1. وإجمالا، فإن هذه النتائج تشير إلى أن LepRb يمكن أن تترافق مع الوحيدات BBS1 من BBSome.

الرقم 5.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) البروتينات تتوسط الاتجار LepRb. (A) تفاعل BBS1 مع LepRb. البروتينات BBS HA الموسومة (BBS1-5 و7-9) وعابر. مع LepRb وتم فحص التفاعلات التي كتبها المقايسات المشترك مناعي الموسومة FLAG. وقد أظهرت مستويات التعبير من كل من البروتين BBS وLepRb في لست] في لوحات أسفل والمتوسطة، على التوالي. وقد أظهرت LepRb-immunoprecipitated شارك في اللوحة العلوية. IP، مناعي. IB، immunoblotting. (ب) يشير الإسوي من LepR، LepRb، ولكن ليس الإسوي قصيرة LEPRA، يتفاعل مع BBS1. مجال حشوية (C) C-محطة من LepRb (LepRb خلوي) غير كافية للتفاعل مع BBS1. وقد استخدم MYC-GFP بمثابة سيطرة سلبية. (D) BBS1 M390R طفرة يعطل التفاعل BBS1-LepRb. الآخرين هي نفسها كما في (A).

وأخيرا، نحن اختبار ما إذا تم تغيير الاتجار LepRb في غياب البروتينات BBSome. بما يتفق مع الدراسات السابقة للتوطين LepR (26، 27)، وقد وجد معظم LepRb مناعية في شبكة -Golgi العابرة (TGN) والحويصلات الصغيرة، وتم الكشف فقط على مستوى منخفض جدا من LepRb في غشاء البلازما ( الشكل 6 ألف والتكميلية المواد، الشكل S3). وكانت بعض حويصلات صغيرة تظهر مناعية لLepRb إيجابية لTGN46، علامة لالحويصلات بعد جولجي، وكذلك TGN (28)، مما يشير إلى أن هذه الحويصلات هي في الطريق أو إعادة التدوير الإندوسومات إفرازية. تم العثور على جزء من LepRb أيضا في الإندوسومات في وقت مبكر كما تميزت EEA1 (المواد التكميلية، الشكل S3) (29). عندما المنضب البروتين BBS1 التي تدخل RNA shRNA بوساطة (. المواد التكميلية، الشكل S4)، فقد وجد LepRb في حويصلات كبيرة بشكل غير طبيعي بالقرب من النواة (حوالي 7٪ من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل؛ الشكل 6). وجدنا mistrafficking مماثلة من LepRb عندما المنضب البروتين BBS2 (الشكل 6)، مشيرا إلى أن شرط البروتينات BBS للاتجار LepRb لا يقتصر على BBS1. وتشير هذه البيانات إلى أن البروتينات BBS مطلوبة من أجل الاتجار السليم للLepRb على الأرجح بين جولجي والهدبية و / أو غشاء البلازما.

الرقم 6.
متلازمة بارديه-بيدل مطلوبة (BBS) البروتينات للاتجار LepRb. (A) التعديلات للاتجار LepRb في BBS1- والخلايا المنضب BBS2. و transfected ARPE 19 الخلايا مع FLAG-LepRb جنبا إلى جنب مع تدافعت (السيطرة)، BBS1 أو BBS2 رني يبني. تم بحثها توطين LepRb (الخضراء) وTGN46 (الأحمر) بواسطة المجهر المناعي غير المباشر. وترد، الصور المدمجة مع تلوين دابي (نواة الأزرق). (أشرطة مقياس: 10 ميكرون). (B) النسبة المئوية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل (يحدده FLAG المناعي) مع حويصلات كبيرة. القيم هي متوسط ​​من ثلاث تجارب وأحصت ما لا يقل عن 120 الخلايا في كل تجربة. البيانات يعني ± SEM.

نقاش

قد تورطت البروتينات BBS في الاتجار البروتين / حويصلة على طول أنيبيب (9، 10). ولكن، كيف يرتبط هذا الوظيفة العامة مع المكونات الفردية من النمط الظاهري BBS لم يكن معروفا. وتقدم هذه الدراسة الآلية الفيزيولوجية المرضية للسمنة في BBS على المستوى الجزيئي. دراستنا تقدم دليلا على أن مقاومة اللبتين الناجمة عن الشاذة الاتجار LepR والموهن LepR يشير في منطقة ما تحت المهاد هو سبب السمنة المرتبطة BBS. علينا أن نبرهن على القضاء على السمنة وhyperleptinemia لا يستعيد حساسية هرمون الليبتين في الفئران BBS، مشيرا إلى أن المقاومة اللبتين هو الجوهرية بدلا من الثانوية إلى hyperleptinemia والسمنة. علينا أن نبرهن أيضا أن البروتين BBS1 يتفاعل جسديا مع الإسوي إشارات من LepR، LepRb وأن البروتينات BBS مطلوبة للاتجار السليم للLepRb.
وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن البروتينات BBS توسط الاتجار LepRb بين جولجي ومناطق محددة من غشاء البلازما (مثل الدهون طوف، الغشاء الهدبي). في غياب البروتينات BBS، منزعجة الاتجار LepRb والموهن LepRb الإشارات. وهذا يتفق مع النتائج السابقة أن البروتينات BBS ضرورية لتوطين G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) لأهداب الخلايا العصبية (30). على الرغم من أننا اختبار العديد من الأجسام المضادة ضد LepR، لم نكن قادرين على كشف LepRb في شرائح مخ الفأر. قد يكون هذا بسبب انخفاض مستوى سطح التعبير ودوران سريع للLepRb (26، 27). ومع ذلك، فقد تم العثور على LepRb في هدب من الخلايا الظهارية حاسة الشم (31)، مما يوحي بأن LepRb قد حصر إلى هدب من الخلايا العصبية المهاد.
من مفارز BBSome أظهرت BBS1 فقط التفاعل الجسدي مع LepRb. أثبتنا سابقا أن BBS1 أيضا تفاعلت مع Rabin8، وهو عامل الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP لRab8 (9). هذه الملاحظات تثير احتمال أن BBS1 هو الوحيدات ملزم البضائع من BBSome. وبالتالي، فإنه من مصلحة لاختبار ما إذا كان GPCRs mislocalized في BBS الخلايا العصبية متحولة (على سبيل المثال Sstr3 وMchr1) تتفاعل أيضا مع BBS1 (30). خلايا ومع ذلك، عيوب الاتجار LepRb المماثلة الملحوظة في BBS2 المنضب وعدم وجود ارتباط الوراثي، النمط الظاهري واضح بين مختلف الطفرات BBS تشير إلى أن سلامة BBSome مهمة لوظيفتها في الاتجار وأن فقدان أي مفارز BBSome يمكن أن تؤدي إلى نفس النمط الظاهري (mistrafficking من البضائع).
ومن المثير للاهتمام، في BBS الحيوانات فقدان وظيفة LepRb يبدو أن تكون انتقائية. في الواقع، على الرغم من أن التعبير عن Agrp، نبي وPOMC تنظم وقبل كل شيء ليبتين (1)، تأثر فقط التعبير الجيني POMC في الفئران BBS. وهكذا، تظهر فقدان العمل ليبتين أن يقتصر على الخلايا العصبية POMC. الاجتثاث الجيني للLepRb تحديدا في الخلايا العصبية POMC يؤدي إلى فرط الأكل وزيادة كتلة الدهون في الفئران (32، 33). في الفئران BBS، الموهن LepRb يشير في الخلايا العصبية POMC يرجح السبب الرئيسي للسمنة. هذه النتائج متسقة مع النتائج الأخيرة التي دافنبورت وآخرون. (34) تبين أن تعطل بروتينات النقل intraflagellar، Tg737 أو Kif3a، وهي مطلوبة لتكون الأهداب، وتحديدا في الخلايا العصبية أسفرت POMC في فرط الأكل والبدانة لدى الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن الفئران BBS مقاومة لعمل هرمون الليبتين في خفض وزن الجسم وتناول الطعام، لديهم متعاطفة / استجابة القلب والأوعية الدموية الحفاظ على ليبتين (11)، ودعم الفقدان الانتقائي وظيفة LepRb في الفئران BBS. في الواقع، لم تلغ اللبتين إشارات تماما في BBS الفئران. جزء من الإشارات LepRb موجود كما هو مبين من خلال تفعيل STAT3 المتبقية بعد العلاج ليبتين. وهكذا، يبدو أن البروتينات BBS لازما ل"فعالة" يشير LepRb، وهو أمر ضروري للسيطرة على سلوك التغذية، في حين أن مستوى "منخفض" من LepRb الإشارات ما زالت transduced في غياب البروتينات BBS وهذا المستوى من الإشارات غير كافية لزيادة متعاطفة النشاط العصبي وضغط الدم. توطين LepRb إلى مجال محدد في غشاء البلازما قد تكون هناك حاجة لهذا يشير الى "فعالة"، في حين LepRb في أماكن أخرى من غشاء البلازما قد تكون كافية لتنبيغ مستوى "منخفض" للإشارة. بدلا من ذلك، شرط البروتينات BBS في إشارة LepRb قد تكون محددة لبعض أنواع الخلايا و / أو مؤثرات المصب. هذه هي الأسئلة المهمة التي تستدعي إجراء المزيد من الدراسات.
في البشر، وقد تم الإبلاغ عن المتغيرات من BBS2، BBS4 وBBS6 الجينات لتترافق مع السمنة في الأفراد BBS غير (35). في الواقع، كان مرتبطا البديل في الجين BBS2 إلى السمنة الكبار المشتركة، وارتبطت الأشكال في BBS4 وBBS6 الجينات مع البدانة في مرحلة الطفولة المبكرة الحدوث المشتركة والشائعة السمنة المرضية الكبار. إذا كانت المتغيرات محددة من الجينات المرتبطة بالسمنة BBS مشتركة تؤثر إشارات LepRb و / أو الاتجار يزال يتعين تحديد.
باختصار، حددنا عيب معين أن تمثل البدانة في نماذج الماوس من BBS. النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن mistrafficking ويشير الموهنة للLepRb هو السبب الرئيسي لاختلال توازن الطاقة مما يؤدي إلى السمنة في BBS. ويمثل هذا العيب آلية المرضية جديدة للمقاومة اللبتين مع الآثار المحتملة للسمنة الإنسانية المشتركة.

المواد والأساليب

للحصول على وصف مفصل للمواد وطرق، الرجاء الاطلاع على المواد التكميلية، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الوراثة الجزيئية البشرية.
الحيوانات

جيل من Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - وصفت الفئران والتنميط الجيني سابقا (- / +15 - +17). وافقت جامعة أيوا جنة البحوث الحيوانية كافة البروتوكولات.

اللبتين التطبيع / دراسة مقاومة اللبتين

وتم إيواء الضوابط حسب نوع الجنس والعمر المتطابقة والفئران BBS في أقفاص الفردية في 6-8 أسابيع من العمر Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - أعطيت الحيوانات 70-80٪ من المواد الغذائية التي يستهلكها wild- نوع يتحكم كل يوم حتى اليوم قبل العلاج ليبتين. وتم تجهيز الحيوانات مع ICV حقنة عادية كما هو موضح سابقا (36). مركبة أو ليبتين الماوس المؤتلف (2 ميكروغرام في 1 ميكرولتر، أنظمة R & D، مينيابوليس، مينيسوتا) تم حقن ICV. تم التضحية الفئران 24 ساعة بعد تناوله ICV اللبتين، وتم قياس كمية الغذاء ووزن الجسم. لSTAT3 تحليل الفسفرة، تمت إزالة الطعام 18 ساعة قبل حقن ICV. تم حقن هرمون الليبتين أو مركبة ICV والحيوانات التضحية في وقت لاحق 2 ساعة قبل CO 2 الاختناق. الوطاء تم تشريح بسرعة والمتجانس في المخزن المؤقت تحلل. تم تحميل مقتطفات من البروتين على 4-12٪ NuPAGE مكرر تريس المواد الهلامية وتحليلها بواسطة immunoblotting.

دراسة MTII

حسب نوع الجنس والعمر المتطابقة الضوابط من النوع البري وBbs2 - / - وBbs6 - / - تم إيواء الحيوانات في أقفاص الفردية في 9-13 أسابيع من العمر مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. بعد أسبوعين، تم زرع الفئران مع ICV حقنة عادية كما هو موضح أعلاه. تم قياس وزن الجسم وتناول الطعام يوميا لمدة أربعة أيام متتالية قبل الحقن ICV وتستخدم القيم الأساسية. لكل الوراثي، والفئران التي عولجت مع مركبة أو MTII والمطابقة الوزن. تم التضحية الحيوانات 24 ساعة بعد MTII (1 ميكروغرام في 1 ميكرولتر؛ فينيكس الصيدلة شركة، بورلنجام، CA) أو الحقن المركبة CO 2 الخنق، ووزن الجسم، واستهلاك الغذاء وأوزان البني الأنسجة الدهنية والدهون الإنجاب كما تم قياس موضح سابقا (11، 25، 36).

استخراج الحمض النووي الريبي والكمي عكس الناسخ، البلمرة سلسلة من ردود الفعل

تم استخراج الحمض النووي الريبي من الماوس الوطاء باستخدام TRIzol الكاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). تم تصنيعه DNA مكملة من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع وتستخدم لQPCR مع معدل الذكاء SYBR الخضراء Supermix (بيو راد، هرقل، CA) وMx3000P نظام QPCR (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا). تم احتساب النسبي التعبير الجيني من خلال طريقة ΔΔCt التالية التطبيع مع RPL19 (37). وتأكدت المنتجات PCR من خلال تحليل تذوب منحنى والتسلسل. وتظهر تسلسل التمهيدي في التكميلية مادة النص.

المناعية

تم perfused الفئران مع بارافورمالدهيد 4٪ / 0.5٪ غلوتارالدهيد في الفوسفات مخزنة المالحة (2.5 مل / دقيقة، 50 مل). وقد اقتطعت الدماغ كله والمحتضنة في نفس ليلة وضحاها تثبيتي في 4 ° C ثم نقل إلى 30٪ محلول السكروز. تم العقول مقطوع vibratome مع 45 ميكرون سمك. تم permeabilized أقسام التعويم الحر في المياه المالحة الفوسفات مخزنة مع 0.25٪ تريتون X-100 (0.25٪ تريتون X-100)، سدت 3٪ مصل الماعز العادي ومزينة أرنب الأجسام المضادة لمكافحة POMC (1: 4000)، الماعز البيروكسيديز مفتش المضادة للأرنب (1: 200) وVectastain النخبة ABC مجموعة (المتجهات مختبرات، بورلنجام، CA).

ترنسفكأيشن وشارك في مناعي

و transfected الخلايا HEK293T في لوحات ستة جيدا مع 1 ميكروغرام من CS2FLAG-LepR و1 ميكروغرام من أشار HA الموسومة البروتينات BBS باستخدام FuGENE HD (روش العلوم التطبيقية، انديانابوليس، IN). تم immunoprecipitated لست] الخلية مع مكافحة Myc على (9E10، سانتا كروز، سانتا كروز، كاليفورنيا) أو مكافحة HA (F-7؛ سانتا كروز، سانتا كروز، كاليفورنيا) الأجسام المضادة مترافق إلى الاغاروز. وقد تم تحليل البروتينات التي عجلت القياسية دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام وimmunoblotting.

المناعي

وكانت المصنفة ARPE 19 الخلايا على الزجاج زلات غطاء في 24 لوحات جيدا ومع transfected جميع 1 ميكروغرام من الحمض النووي باستخدام FuGENE HD (روش، انديانابوليس، IN). تم إصلاح الخلايا مع الميثانول لمدة 6 دقائق في -20 درجة مئوية، ومنعت مع 5٪ BSA و 3٪ مصل الماعز العادي وزينت مع الأجسام المضادة الأولية المشار إليها. واستخدمت اليكسا الدقيق 488 الماعز المضادة للماوس مفتش (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا) واليكسا الدقيق 568 الماعز المضادة للأرنب مفتش (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا) للكشف عن الأجسام المضادة الأولية.

التحليل الاحصائي

وأعرب عن النتائج كما يعني ± SEM. تم إجراء مقارنات بين المجموعات عن طريق باتجاه واحد أو تحليل التباين الثنائي (ANOVA) مع طريقة فيشر LSD التحليل البعدي للمقارنات متعددة البشرى، حسب الاقتضاء. P <0.05 اعتبرت أن تكون ذات دلالة إحصائية.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #12  
قديم 11-23-2015, 09:00 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي متلازمة بارديه-بيدل البروتينات 1 و 3 تنظم الاتجار الهدبية من مرض الكلى المتعدد الكيسات 1 البروتين

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/23/20/5441.full

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) وراثي جسمي مرض الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) هما ciliopathies متميزة وراثيا ولكنها تشترك الظواهر الشائعة مثل الكيسات الكلوية. سبعة البروتينات BBS شكل مجمع يسمى BBSome التي يتم ترجمتها في الجسم الهدبي أو القاعدية الخيط المحوري وينظم دخول الهدبية أو الخروج سوطي من عدة جزيئات الإشارة. هنا، علينا أن نظهر أنه، على خلاف سبعة تمتد السوماتوستاتين مستقبلات 3 أو مستقبلات هرمون الليبتين الذي يتفاعل مع جميع مفارز من BBSome، البروتين ADPKD polycystin-1 (PC1) يتفاعل مع BBS1، BBS4، BBS5 وBBS8، وأربعة من السبعة مكونات BBSome. فقط نضوب أو تحور BBS1، ولكن ليس استنزاف BBS5 وBBS8، أو خروج المغلوب من BBS4، يضعف الاتجار الهدبية من PC1 في الخلايا الظهارية في الكلى. نضوب هذه BBS البروتينات يؤثر لا على طول الهدبية ولا غشاء البلازما استهداف PC1. التعبير عن BBS3 الممرضة / Arl6 متحولة (T31R) ان اقفال Arl6 في شكل الناتج المحلي الإجمالي يؤدي إلى أهداب التقزم وتثبيط PC1 على أهداب الابتدائي. نقترح أن 11 تمتد بروتين الغشاء PC1 هو شحنة BBSome وأن مكونات BBSome قد تمتلك وظائف فرعية محددة. وعلاوة على ذلك، والتفاعلات الفيزيائية بين BBS وADPKD البروتينات قد تبرز الظواهر الكلى المتداخلة في هذين المرضين.

مقدمة

أهداب الابتدائية ضئيلة، يشبه الشعر العضيات الحسية إسقاط من السطح القمي معظم الخلايا. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب المتنحية غير المتجانسة وراثيا من أهداب الابتدائي. يتميز BBS أساسا من السمنة، وتنكس الشبكية وضعف الإدراك، polydactyly، قصور الغدد التناسلية والعجز الكلوي بما في ذلك الكيسات الكلوية (1). على الرغم من أن تم تحديد 19 جينات BBS حتى الآن، ليست مفهومة تماما الوظائف الخلوية الدقيقة لهذه البروتينات BBS. وأفيد أن تشارك بعض البروتينات BBS في مجال النقل داخل الخلايا (2، 3) والنقل intraflagellar (4). اكتشفت الدراسات البيوكيميائية وBBSome، وهو بروتين معقد تجميعها من قبل سبعة من البروتينات BBS بما في ذلك BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9 (5). وBBSome يموضع وظائف في الجسم الهدبي أو القاعدية الخيط المحوري وتتفاعل مع عامل Rab8 GTPase-تبادل، Rabin8، وتسهيل دخول Rab8 في أهداب الابتدائي في BBS3 (Arl6) التي تعتمد على -GTP الطريقة. هذه العملية ينظم دخول الهدبية من جزيئات الإنذار (6، 7)، وأظهرت الحرجة لتكون الأهداب (8). بالإضافة إلى دخول البروتين الهدبية، BBSome يتحكم أيضا في خروج سوطي من البروتينات مما يشير إلى مثل فسفوليباز D نوع ج في كلاميدوموناس reinhardtii (9).
وراثي جسمي مرض تكيس الكلى (ADPKD) (10)، مما يؤثر على أكثر من 12 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، وتتميز التطوير التدريجي للالخراجات مبطنة الظهارية ومملوءة بسائل في الكلى مختلف شرائح أنبوبي (11). وينظر أيضا الكبد والبنكرياس الكيسي. الطفرات في اثنين من الجينات PKD1 (12، 13) وPKD2 (14)، ترميز على التوالي polycystin-1 (PC1) وpolycystin 2 (PC2)، تمثل ~85 و~15٪ من الحالات ADPKD. حتى الآن، وPC1 PC2 قد تورطت في تحوير عدد من الأحداث الخلوية مثل الكالسيوم 2+ الإشارات (15، 16)، JAK-STAT (17)، mTOR س (18)، AMP الحلقي (19)، الكنسي WNT (20 )، ID2 (21)، الخلية القطبية مستو (22)، cMET (23)، STAT3 (24)، PI3 / AKT (25)، اليشم-1 (26 مستقبلات)، إلى جانب البروتين G (GPCR) (27)، ابيديرمي epidermal عامل النمو مستقبلات (28، 29)، وكذلك توطين ونشاط الكيسي منظم تليف الغشاء تصرف (CFTR) (30، 31). كيف تعدل polycystins هذه المسارات لا يزال بعيد المنال. على الرغم من PC1 وPC2 تم الإبلاغ عن حصر للمواقع التحت خلوية متعددة (15، +32 - 34)، وقد تورط في هدب الأساسي باعتباره عضية الرئيسية لوظيفة polycystin والتسبب في ADPKD (15، 35). PC1 PC2 وتشكيل مجمع مستقبلات القنوات في هدب الابتدائي ودورها في transducing وخارج الخلية السوائل إجهاد القص تدفق الكالسيوم إلى 2+ إشارة في هذا الموقع قد يكون العيب الأساسي في ADPKD (10). كما تم اقتراح دور حسي كيميائي لPC1 وPC2 (36). توضيح من شبكة التفاعل polycystin هي طريقة واحدة لتحديد الأحداث القريبة في شبكات البيوكيميائية المعقدة للpolycystins وتسهيل التصميم الرشيد وتقييم العلاجات لADPKD.
من خلال الشاشة مشاركات باستخدام PC1 ذيل-C محطة كطعم، حددنا BBS8، وهو مكون من BBSome للتفاعل جسديا مع ADPKD. من خلال إنشاء نظام التعبير عن كامل طول PC1 وضربة قاضية lentiviral الفردية الجينات BBS، ونحن أيضا أنه PC1 يتفاعل مع أربعة من عناصر سبعة من BBSome وأن توطين الهدبية من PC1 يمكن تنظيمها من قبل عناصر محددة من BBSome. وجدنا أن BBS1، جين رئيسي BBS، مهم لإيصال الفعال للPC1 لأهداب ولكن ليس لغشاء البلازما. إعادة التعبير عن النوع البري لكنها ليست الإنقاذ BBS1 متحولة الاتجار الإمراض PC1 الهدبية. تعبير عن شكل متحولة المهيمنة السلبية المسببة للأمراض من BBS3 يؤثر أيضا PC1 الهدبية الترجمة. لأن كلا ADPKD وBBS المرضى من الكيسات الكلوية، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن التفاعلات الفيزيائية بين PC1 والبروتينات BBS قد تبرز الظواهر الكلى متداخلة في BBS وADPKD.

النتائج

BBS8 وثلاث مفارز أخرى من BBSome تتفاعل مع PC1

لتحديد شبكة التفاعل من PC1، نحن فحص مكتبة الكلى الجنين البشري باستخدام الخميرة نظام هجين اثنين مع الذيل 198 الأحماض الأمينية حشوية (4106-4303) من PC1 الإنسان كطعم. BBS8، أول بروتين BBS التي تم تحديدها لربط ضعف الجسم القاعدية لقضية BBS (37) وأصبح لدينا شريك فوري ملزم مرشح العلوي من PC1 البشري. BBS8 يشفر بروتين مع تكرار tetratricopeptide متعددة (TPRs) وهي من بين البروتينات BBS السبع التي تشكل مجمع BBSome في الجسم القاعدية (8، 37). جزء من BBS8 معزولة عن مكتبة بترميز الببتيد من الأحماض الأمينية 281 إلى نهاية البروتين، الأحماض الأمينية 593.
لتأكيد هذا التفاعل في خلايا الثدييات، أجرينا شارك في مناعي في الخلايا HEK293 مع transfected الموسومة MYC على حد سواء BBS8 وHA الموسومة PC1-C محطة ذيل حشوية (PC1-CTT). وقد شارك immunoprecipitated-BBS8 مع PC1-CTT في هذه الخلايا (الشكل 1 A). في المقابل، في HEK293 المحللة الخلية مع transfected BBS8 وحده، وعجلت لا BBS8 من الأجسام المضادة لمكافحة HA، مما يدل على خصوصية التفاعل BBS8-PC1-CTT.

الشكل 1.
يتفاعل مع PC1 BBS8 وعدة مفارز BBSome أخرى. (A) التحقق من BBS8 كشريك التفاعل من PC1 في الخلايا HEK293. و transfected الخلايا مع BBS8-MYC وحدها أو BBS8-MYC بالإضافة إلى PC1-CTT-HA. تم immunoprecipitated لست] الخلية مع الأجسام المضادة ضد HA. تم الكشف عن BBS8-MYC (~63 كيلو دالتون، السهم) مع الأجسام المضادة ضد MYC. وimmunoprecipitated BBS8-MYC فقط في وجود PC1-CTT-HA. واستخدمت واحدة العشرين من الخلية لست] كإدخال. (B) PC1-CTT يتفاعل بشكل خاص مع BBS1، 4، 5 و 8. GST وPC1 C-ذيل تنصهر مع ضريبة السلع والخدمات (GST-PC1-CTT) استخدمت حبات لهدم كل من مفارز سبعة من BBSome بالإضافة إلى BBS3 أعربت في HEK293 الخلايا. استخدمت واحدة العشرين من الخلية لست] كمدخل لكل فحص المنسدلة. وقد نشف البروتينات BBS مع الأجسام المضادة ضد HA. جرى التحقيق (C) البقع أيضا مع الأجسام المضادة ضد GST. وتم قياس كمية كمية البروتينات BBS التي استولت عليها GST-PC1-CTT والمدخلات التي كتبها صورة J البرمجيات ونسبة البروتين القبض على مقابل وإدخال مؤامرة مع BBS1 لتعيين 100٪.

لتحديد ما إذا كانت مفارز أخرى من مجمع BBSome قادرة على ربط PC1، أجريت الجلوتاثيون S -transferase (GST) التجارب المنسدلة باستخدام GST-PC1-CTT البروتين الانصهار وخلية 293T لست] مع transfected كل من السبع التي تتألف منها البروتينات BBS BBSome (BBS1، 2، 4، 5 و 7 و 9)، وكذلك BBS3 / Arl6، وGTPase صغير بالغ الأهمية من أجل وظيفة BBSome. ومن المثير للاهتمام، بالإضافة إلى BBS8، تتفاعل على PC1-CTT أيضا مع BBS1 و 4 و 5 (الشكل 1 B).

إنشاء نموذج خلية لدراسة الاتجار الهدبية من PC1

الجمعية الفيزيائية بين PC1 ومفارز من BBSome دفعتنا لاستكشاف نتيجة الوظيفية لهذا التفاعل. تورط BBSome مجمع في استيراد عدة GPCRs سبعة تمتد (6، 38) ويبتين مستقبلات فترة واحدة في هدب من خلايا الثدييات وتصدير البروتينات مما يشير محددة من سياط من كلاميدوموناس reinhardtii (9). ولذلك، فإننا نهدف إلى دراسة دور مكونات BBSome في توطين الهدبية من PC1 والذي يعرف لدينا 11 المجالات عبر الغشاء. قدمنا ​​مجموعة من N-عضال و / أو بالطول بنيات الماوس PC1 C-عضال الموسومة (المواد التكميلية، الشكل S1 A). أدخلنا تعزيز الأصفر البروتين الفلوري (YFP) بعد مخلفات 34 الأولى المصب من الببتيد إشارة توقع و / أو علامة HA الثلاثي، وهو AviTag أو تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) إلى C-محطة من كامل طول PC1 . التعبير عن YFP-PC1 يبني هو تصور بسهولة باستخدام المجهر مضان في الخلايا HEK293 (المواد التكميلية، الشكل S1 B) وإن لم يكن في النخاع الداخلي جمع القناة 3 (IMCD3) خلايا الظهارية (المواد التكميلية، الشكل S1 C) نظرا ل انخفاض مستوى التعبير (التكميلي المواد، الشكل S1 D)، على غرار PC1-EGFP (لا تظهر البيانات). التعبير عن YFP-PC1-AviTag (YPC1A) يعزز tubulogenesis الخلايا IMCD3 (المواد التكميلية، الشكل S1 E)، بما يتفق مع دور ذكرت سابقا من PC1 في هذه العملية (39). باستخدام GFP أو HA العلامة الأجسام المضادة التي تعترف إما YFP / GFP أو علامة HA، والتعبير عن المؤتلف كامل طول PC1 هو كشفها بسهولة على أهداب الأساسي للخلايا IMCD3 (المواد التكميلية، الشكل S2 A). منذ يتعرض N-محطة من PC1 إلى الفضاء خارج الخلية، والتعبير سطح الخلية من YFP-PC1 يمكن تصور بوصف مباشر من الخلايا الحية مع الأجسام المضادة ضد GFP دون إجراءات تثبيت أو permeabilization. وينظر الهدبية التعبير عن YFP-PC1 في كل الخلايا المهدبة IMCD3 أن التعبير عن ثابت كامل طول PC1 (المواد التكميلية، الشكل S2 B).

يتأثر توطين الهدبية من PC1 بسبب نقص BBS1، ولكن ليس BBS5، BBS8 أو BBS4

نحن بعد ذلك حاول أن تستنفد BBS1، 4 و 5 و 8، ومفارز BBSome التي تم سحبها بنسبة PC1-CTT في الخلايا IMCD3 بواسطة lentiviral shRNA. باستثناء BBS4، كنا قادرين على تحقيق> 70٪ ضربة قاضية كفاءة تقييمها من قبل الكمي عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (RT-PCR) (التكميلية المواد، الشكل S3 A). وأكد ضربة قاضية من BBS8 أيضا في مستوى البروتين عن طريق التحليل الغربي (التكميلي المواد، الشكل S3 B و C)، كما كنا قادرين على الحصول على الضد العمل. استنزاف BBS1 أو 5 أو 8 لا تؤثر على عدد الهدبية ولا طول في IMCD3 الخلايا (المواد التكميلية، الشكل S3 D)، مما أدى إلى متوسط ​​طول هدب عند 4.2 ميكرون (التكميلي المواد، الشكل S3 E) ومعدل ciliation من 60٪ (المواد التكميلية، الشكل S3 F). لأن أيا من المواقع المستهدفة خمسة لBBS4 تحقيق الكفاءة ضربة قاضية كافية، وكنا سبق نشرها BBS4 الأساسي الماوس خروج المغلوب الكلى الخلايا الظهارية أنبوبي (2).
وجدنا أن في الخلايا السيطرة المخفوق، والخلايا المهدبة ~83٪ لديهم YFP-PC1 على أهداب (الشكل 2 ألف وباء). في الخلايا BBS1 ضربة قاضية، ومع ذلك، فإن الاتجار YFP-PC1 لأهداب وتضاءلت بشدة مع٪ فقط 40-50 الخلايا وجود YFP-PC1 على أهداب الخاصة بهم. على العكس من ذلك، كان نضوب BBS5 أو ثمانية في الخلايا IMCD3 أي تأثير على الاتجار الهدبية من YFP-PC1. النسبة المئوية للخلايا مهدبة YFP-PC1 إيجابية (~90٪) هي مماثلة لتلك الخلايا السيطرة المخفوق. والمثير للدهشة، لم تتأثر الهدبية توطين YFP-PC1 في الخلايا الأنبوبية الأساسي BBS4 الماوس خروج المغلوب الكلى.

الرقم 2.
BBS1، لا BBS4، BBS5 أو BBS8 أمر مهم للاتجار الهدبية من PC1. (A) YFP-PC1 غائب على أهداب الخلايا في BBS1 ضربة قاضية، على الرغم من تعبيرها عن جسم الخلية ما زال قائما. الاتجار YFP-PC1 لأهداب في BBS5 أو خلايا BBS8 ضربة قاضية وBBS4 خروج المغلوب الخلايا الظهارية الكلوية طبيعية. SCRB، سارعت السيطرة. كانت ملطخة YFP-PC1 من قبل الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء). وقد استخدم الأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر) للاحتفال أهداب. يمثل مقياس شريط 20 ميكرون. ومحاصر المنطقة المحيطة هدب وتوسيع. (B) النسبة المئوية لل-PC1 إيجابي أهداب هو مبين في (A). لا يقل عن 50 YFP-PC1 transfected واحصي الخلايا المهدبة لكل حالة. أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر. (C) وتوطين الهدبية من PC1 الذاتية غائب في الخلايا الليفية الجلد من مريض الإنسان مع طفرة BBS1 M390R. كانت ملطخة PC1 التي كتبها 96521 الأجسام المضادة (الخضراء). وقد استخدم الأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر) للاحتفال أهداب.

كما درسنا الاتجار الهدبية من PC1 في الخلايا الليفية الجلد من مريض مع طفرة BBS1 متماثل (M390R). وقد تبين BBS1 (M390R) أن يكون لها وظيفة ضعاف في نموذج الفأر (40). في الخلايا الليفية السيطرة، لاحظنا PC1 على أهداب الابتدائي في ~10٪ من الخلايا (الشكل 2 C). في المقابل، في الخلايا الليفية المستمدة من المريض BBS1، واقتصرت PC1 إلى منطقة الجسم القاعدية.

التعبير عن الشكل السائد سلبية من BBS3 / Arl6 يضعف PC1 التعريب على أهداب

لتقييم ما إذا BBS3 / Arl6، وGTPase صغير بالغ الأهمية من أجل وظيفة BBSome، يلعب دورا في توطين الهدبية من PC1، عبرنا عن مجموعة من HA الموسومة BBS3 الماوس / Arl6 يبني (من نوع البرية، وT31R متحولة المهيمنة سلبية المسببة للأمراض أو جوهري نشاطا Q73L متحولة) جنبا إلى جنب مع YFP-PC1. وجدنا أن YFP-PC1 بالاتجار إلى أهداب الابتدائي جنبا إلى جنب مع من النوع البري ونشط بشكل جوهري BBS3 / Arl6 (Q73L) (الشكل 3 والتكميلية المواد، الشكل. S4). أدى overexpression من متحولة المهيمن سلبية من BBS3 / Arl6 (T31R) في الخلايا IMCD3 لأهداب يعانون من التقزم، مشيرا إلى وجود خلل تكون الأهداب. ومع ذلك، كانت إشارة PC1 غائبة في الخلايا مع أهداب أقصر على الرغم من التعبير PC1 في خلايا الجسم واضحة للعيان.

الرقم 3.
BBS3 / Arl6 تسيطر على الاتجار الهدبية من PC1. (A) YFP-PC1 وشارك transfected مع إما HA الموسومة البرية من نوع (WT)، T31R أو Q73L BBS3 / Arl6 إلى خلايا IMCD3. كانت ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة ضد GFP لYFP-PC1 (الأخضر)، HA لBBS3 / Arl6 (الحمراء)، والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض والأزرق ولكن هو مبين في أبيض وأسود) للاحتفال أهداب. يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. (B) الكمي لنسبة الاتجار YFP-PC1 إلى أهداب الأساسي هو مبين في (A). لا يقل عن 30 YFP-PC1 transfected واحصي الخلايا المهدبة لكل حالة. أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر.

تفاعل PC1 وBBS1 مهم لPC1 لحركة المرور إلى أهداب الابتدائي

التجربة المنسدلة GST إلى أن BBS1 يتفاعل مع PC1 من خلال الذيل PC1 ل-C المحطة. لذلك، سعينا إلى تحقيق دور PC1-CTT في الاتجار الهدبية من PC1. لهذا الغرض، قدمنا ​​بناء YFP-PC1 دون آخر حمض أميني 198 من PC1 (YFP-PC1ΔCTT) (الشكل 4 أ) واختبار قدرتها على التفاعل مع BBS1 قبل فحص شارك في مناعي. بينما YFP-PC1 المشارك immunoprecipitated HA الموسومة BBS1، فشل YFP-PC1ΔCTT للقيام بذلك (الشكل 4 B). بالإضافة إلى ذلك، كما فشلت YFP-PC1 للمشاركة في immunoprecipitate متحولة الإمراض المشتركة من BBS1 في المرضى الذين يعانون BBS البشري، BBS1 (R146X) (41).

الرقم 4.
تفاعل PC1 وBBS1 مهم لPC1 لحركة المرور إلى أهداب الابتدائي. (A) رسم تخطيطي لكامل طول YFP-PC1 كما هو موضح في المواد التكميلية، الشكل S1 وYFP-PC1ΔCTT حذف متحولة. تم حذف حمض أميني 198 CTT من YFP-PC1، وتوليد YFP-PC1ΔCTT. يتفاعل (B) BBS1 مع YFP-PC1، ولكن ليس مع YFP-PC1ΔCTT. خلايا HEK293 وقد شارك transfected مع HA الموسومة BBS1 وYFP-PC1 أو YFP-PC1ΔCTT. تم immunoprecipitated لست] الخلية مع الضد GFP ونشف لPC1 (7e12) وBBS1 (HA). كامل طول BBS1 (BBS1-HA) وشارك immunoprecipitated من قبل YFP-PC1 لكن ليس YFP-PC1ΔCTT. YFP-PC1 لا يمكن أن يشارك في immunoprecipitate متحولة الإمراض من BBS1 (R146XHA). استخدمت عشر من الخلية لست] كإدخال. (C) آثار الحذف C-المحطة على الاتجار الهدبية من PC1. تم transfected YFP-PC1 أو YFP-PC1ΔCTT إلى IMCD3 كما هو موضح أعلاه، وجرى تقييم الهدبية التعبير عن هذه التركيبات التي تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء) والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر). وأظهرت صور الممثل من كل ترنسفكأيشن. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (D) الكمي لنسبة الاتجار الهدبية للبنيات هو مبين في (C). أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر. (E) التعبير عن WT ولكنها ليست متحولة الإمراض BBS1 (R146X) recues الاتجار الهدبية من PC1. كانت ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة ضد GFP لYFP-PC1 (الأخضر)، HA لBBS1 (الحمراء)، والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض والأزرق ولكن هو مبين في أبيض وأسود) للاحتفال أهداب. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون.

ومن المثير للاهتمام، فشل YFP-PC1ΔCTT للوصول إلى أهداب الأساسي عند transfected إلى IMCD3 الخلايا (الشكل 4 C و D). وعلاوة على ذلك، والعيب في الاتجار PC1 إلى أهداب الأساسي في الخلايا BBS1 ضربة قاضية يمكن انقاذ من قبل reexpressing وBBS1 الإنسان العادي (الشكل 4 E)، ولكن ليس متحولة اقتطاع BBS1 (R146X). ونظرا لعدم قدرة YFP-PC1ΔCTT للتفاعل مع BBS1 وYFP-PC1 للتفاعل مع BBS1 (R146X)، وهذه النتائج تشير إلى أن التفاعل الوظيفي بين BBS1 وPC1 من خلال PC1-CTT مهم للاتجار الهدبية من PC1.

لا يتأثر الاتجار PC1 إلى غشاء البلازما أو الجسم القاعدية من قبل نضوب BBS1

لا PC1 يتراكم في بعض المقصورات غشاء عندما يفشل في حركة المرور إلى أهداب الابتدائي؟ منذ البروتينات قد حركة المرور إلى أهداب إما عن طريق الاستقطاب استهداف الجسم القاعدية أو انتشار الأفقي من غشاء البلازما (42)، درسنا ما إذا كان نضوب BBS1 يؤدي إلى تراكم PC1 في هذه المواقع. على عكس CD8a-SSTR 3i3 التي تتراكم على الغشاء البلازمي للخلايا المنضب من Arl6 أو BBS4 (8)، لم يكن هناك تراكم واضح من PC1 سواء على الجسم القاعدية أو الغشاء البلازمي في الخلايا المنضب BBS1 (الشكل 5 ألف وباء ).

الرقم 5.
آثار استنفاد BBS1 عن الاتجار PC1 إلى الهيئات القاعدية أو غشاء البلازما ونموذجا للتنظيم BBSome الاتجار PC1 إلى هدب الأساسي. (A) الاتجار YFP-PC1 إلى الهيئات القاعدية في الخلايا IMCD3 المنضب BBS1. تم الكشف عن YFP-PC1 مع الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء في الصور المدمجة)، وγ تويولين (الرمز بواسطة السهام، والحمراء في الصور المدمجة) كان يستخدم كعلامة الجسم القاعدية. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. لا يتأثر (B) الاتجار سطح قمي من YFP-PC1 في الخلايا المنضب BBS1. كان تلطيخ الخلايا الحية باستخدام الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة لمكافحة GFP (الأخضر، مع وضع علامة *) أول إجراء للكشف عن خلية PC1 السطح. بعد تثبيت وpermeabilization، تم استخدام الأجسام المضادة الثاني الماوس وحيدة النسيلة ضد GFP (الحمراء) للكشف عن PC1 المؤتلف بما في ذلك بركة سباحة داخل الخلايا. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (C) السطح biotinylation الفحص. تم إجراء biotinylation السطح كما هو موضح في المواد وطرق. تم الكشف عن سطح YFP-PC1 مع الأجسام المضادة ضد GFP، وكان يستخدم β1-إنتغرين كمجموعة تحكم. (D) الكمي لPC1 السطح هو مبين في (C). PC1 سطح تطبيع في الخلايا سارعت تم تعيين إلى 100٪ لإنتغرين بيتا. (E) ويسر الاتجار الهدبية من PC1 من خلال BBSome الاعتراف PC1-CTT في BBS3 / الطريقة التي تعتمد على ARL6. PC1 (باللون الأحمر) التي تحتوي حويصلات تستهدف إلى غشاء البلازما (المسمى من قبل ①) أو قاعدة periciliary (المسمى من قبل ②) وتدخل أهداب إما من غشاء البلازما عبر انتشار الأفقي أو من قاعدة periciliary عبر استهداف الاستقطاب. (F) تعطيل وظيفة البروتين PC1-BBSome معقدة مثل نضوب BBS1، خلل في BBS3 / ARL6 أو حذف / تحور PC1 C-الذيل (ΔCTT) يضعف الاتجار الهدبية من PC1.

وأكد تأثير استنزاف BBS1 على غشاء البلازما استهداف PC1 أيضا كيميائيا من قبل biotinylation فحص سطح الخلية. biotinylation سطح الخلية إما سارعت كشفت السيطرة أو خلايا IMCD3 المنضب BBS1 مع transfected YFP-PC1 أنه لا يوجد انخفاض كبير في PC1 سطح الخلية في الخلايا المنضب BBS1 (الشكل 5 C و D)، مما يوحي بأن الاتجار التي تحتوي على PC1 الحويصلات الموجهة للغشاء البلازما لا تعتمد على وجود BBS1.

نقاش

آلية دقيقة التي PC1 تصل إلى أهداب الابتدائي لا تزال بعيدة المنال. هنا، وتبين لنا، للمرة الاولى، من خلال شاشة مشاركات باستخدام PC1 ذيل C-محطة كطعم، أن PC1 البروتين ADPKD يتفاعل مع البروتينات المشفرة بواسطة الجينات BBS. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن الاتجار الهدبية من PC1 ينظمه البروتينات BBS متميزة (الشكل 5 E). وبالنظر إلى الأهمية البالغة لتوطين السليم وظيفة polycystins في علم وظائف الأعضاء الجهاز العادي، وتوفر النتائج التي توصلنا إليها الأساس لمزيد من فهم النمط الظاهري عديد المظاهر والمسببات من BBS.
نص كبير نسبيا من PKD1 (~14 كيلوبايت) أعاق دراسات PC1. هنا، قمنا بتأسيس نظام تعبيرا عن n و C-محطة الموسومة كل من كامل طول PC1، وهو أمر مفيد لدراسة الاتجار، الحيوي وظيفة كامل طول PC1 في الخلايا الظهارية الكلوية. وجدنا كل من N- وC-تيرميني من PC1 على أهداب الابتدائي. واقترح PC1 للخضوع حدث انشقاق الشق الشبيهة التي يتم تحريرها ذيل صغير-C محطة (43، 44). جنبا إلى جنب مع الدور الحاسم للPC1-CTT في الاتجار الهدبية لها، وتشير البيانات المتوفرة لدينا إما أن جزء كبير من PC1 لا المشقوق أو الانقسام من PC1 في دورته C-محطة يحدث بعد وصوله الى أهداب الابتدائي.
وتشير البيانات المقدمة هنا دور BBSome في استيراد PC1 إلى أهداب الأولية بدلا من تصدير PC1 من أهداب الابتدائي منذ PC1 يتم تقليل، وليس المتراكمة في أهداب الأساسي للخلايا IMCD3 عند فقدان BBSome وظيفة. ومن المثير للاهتمام، مع ذلك، أن الاتجار PC1 ضعاف إلى أهداب الابتدائي وينظر فقط في ضربة قاضية BBS1، ولكن ليس في BBS5 وBBS8 ضربة قاضية أو BBS4 خروج المغلوب الخلايا الظهارية. هناك ما مجموعه 19 (45) الجينات التي تسبب BBS الطفرات. BBS1 هي واحدة من الجينات BBS الرئيسية الثلاثة تحور في 20-30٪ من الحالات BBS بعد الولادة (46). أحد الاحتمالات هو أن BBS1 قد يكون لها دور متميز من مفارز BBSome الأخرى حتى أن التفاعل بين PC1 وBBS1 هو العامل الأكثر أهمية المساهمة في توطين الهدبية من PC1. وقد اقترحت ظائف فريدة من نوعها من الجينات BBS مختلفة يرجع ذلك إلى حقيقة أن الاختلافات المظهرية أو تقلب كثيرا ما لوحظ بين مختلف BBS فئرانا معدلة وراثيا أو المرضى (47). بياناتنا تتفق أيضا مع نموذج التجمع BBSome التي استنزاف BBS1 و 2 و 7 و 9 كان لها أثر بارز في جمعية المجمع BBSome في حين أن استنزاف BBS4 و 5 و 8 قاصر أو أي تأثير في شبكية العين الصباغ الظهارية الخلايا (48). ويشير تقرير صدر مؤخرا أن BBS2 و 7 و 9 شكل المكونات الأساسية للBBSome بينما BBS1، تضاف 4 و 5 و 8 كما مفارز محيط (49). يتفاعل PC1 فقط مع مفارز الطرفية كما هو مبين في هذه الدراسة. BBS4 وBBS8 وتتكون أساسا من عدة زخارف تفاعل البروتين البروتين، وهي TPRs، والتي تشكل الهيكل اللولبي (8). منذ صيد BBS8 الخروج من الخميرة شاشة يومين الهجين باستخدام PC1-CTT كطعم، وPC1-BBS8 أو التفاعل PC1 BBS4 من المرجح المباشر، وربما بوساطة الزخارف TPR. BBS1 وBBS5 تختلف هيكليا من BBS4 وBBS8. لدينا في المقايسات المنسدلة، يظهر PC1 C-ذيل للتفاعل مع BBS1 بقوة كما مع BBS8 (الشكل 1 B). وأكد تفاعل PC1 مع BBS1 أيضا شارك في immunoprecipitations (الشكل 4 B). ونظرا لطبيعة زائدة عن الحاجة المحتملة للتفاعل PC1 مع مفارز BBSome مختلفة، ونحن نعتقد أنه في غياب بعض مفارز BBSome مثل BBS4 أو 5 أو 8، مجمع BBSome المتبقية حفظه النشاط الكافي لاستهداف PC1 للأهداب. وأظهر تقرير صدر مؤخرا أنه في غياب BBS7، وهو BBSome subcomplex لا يزال أشكال والاتجار الهدبية من polycystins تبدو طبيعية بشكل فاضح ويحتمل أن تكون وظيفية (47) كما يدعم فرضيتنا.
BBS1 يتوسط تفاعل BBSome مع Rabin8 (5)، واقترحت أن تكون الوحيدات الاعتراف البضائع من BBSome لدخول الهدبية للفترة واحدة مستقبل الليبتين (7). تعطى فقط استنزاف BBS1 يؤثر على الاتجار الهدبية من PC1، فمن الممكن أيضا أن BBS1 يلعب دورا حاسما في الاعتراف PC1 كما شحنة BBSome وبالتالي فإن تسليم لاحق من PC1 للأهداب. الاعتراف البضائع عن طريق BBS1 قد تكون بوساطه الذيل-C محطة حشوية من PC1 منذ حذف هذا الجزء النتائج أيضا في فشل الاتجار PC1 إلى أهداب (الشكل 5 F). وبالمثل، فإن حلقة الخلايا الثالثة من سبع تمتد السوماتوستاتين مستقبلات 3 (SSTR3) تمتلك سلسلة استهداف أهداب الذين اعتراف BBSome أمر حاسم لتوطين SSTR3 لأهداب (8).
تجارب مع BBS3 / Arl6 توفر دعما إضافيا لتنظيم توطين الهدبية من PC1 بواسطة بروتين آخر BBSome (الشكل 5 F). دراسة أنيقة جين وآخرون. (8 أظهرت) أن شكل محدد GTP من BBS3 / Arl6 هو أمر حاسم لتجنيد BBSome بلمرة إلى الحويصلات الدهنية بمثابة معطف واستهداف BBSome لأهداب، ولكن ليس للجمعية BBSome. في هذه الدراسة، وأظهرت أن الإفراط في الإنتاج من الكفاءة من النوع البري BBS3 ملزم GTP أو النموذج النشط جوهري من BBS3 (Q73L) كان قادرا على المرافق الاتجار PC1 لأهداب بكفاءة. ومع ذلك، overexpression من BBS3 T31R، وهو غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي، متحولة الإمراض المهيمنة سلبية وجدت في المريض BBS البشري، يؤدي إلى أهداب حيلة في الخلايا IMCD3 وفشل PC1 لحركة المرور إلى أهداب. والجدير بالذكر أن BBS3 / Arl6 يتفاعل أكثر كفاءة مع الوحيدات BBS1 من BBSome من خلال الربط إلى N-محطة من BBS1 (8).
النمط الظاهري السريرية للمرضى BBS متغير بدرجة كبيرة، حتى بين الأشقاء مع نفس الطفرات (50). وعلاوة على ذلك، فإن الطيف من BBS النمط الظاهري قد تتداخل مع غيرها من ciliopathies سريريا ومتميزة وراثيا (50). وقد تبين التفاعلات أليلية متعددة بين BBS المكاني أو BBS المكاني مع الجينات ciliopathy أخرى للمساهمة في التباين في التعبير السريري من الطفرات BBS (41، 51). على الرغم من هنا وجدنا أن نقص فقط من BBS1 وBBS3 ضعاف الاتجار PC1 الهدبية، فإنه لن يكون من المستغرب إذا الجينات BBS متعدد الألائل أو بالاشتراك مع الأليلات ciliopathic أخرى تؤثر على الاتجار الهدبية و / أو وظيفة polycystins وبالتالي تؤدي إلى الظواهر ذات الصلة polycystin مثل الكيسات الكلوية.
قد تتراكم البروتينات في موقع معين عندما فشلوا في حركة المرور إلى وجهتها (7، 8). في تجاربنا، إلا أننا لا يمكن أن نلاحظ زيادة ملحوظ من إشارة YFP-PC1 في الجسم القاعدية، غشاء البلازما أو مواقع أخرى فحصها (لا تظهر البيانات) في خلايا BBS1 ضربة قاضية. لأن الغشاء الهدبي لا يمثل سوى جزء صغير من غشاء البلازما الهائل للخلايا IMCD3، وغياب PC1 من أهداب قد لا يؤدي إلى زيادة بارزة في كثافة إشارة PC1 في البلازما أو الأغشية عضية أخرى. العادي توزيع غشاء البلازما من PC1 في الخلايا المنضب BBS1 يوحي بأن الحويصلات المحتوية على PC1 قادرة على برعم من شبكة عابرة للجولجي (TGN)، قفص الاتهام، والصمامات إلى غشاء البلازما في ظل هذه الظروف. وقد تم مؤخرا تبين أن مملس تتحرك من خلال مسار النقل الجانبي رواية من غشاء البلازما إلى الغشاء الهدبي (52). مع البيانات الحالية لدينا، فإننا لا نستطيع التمييز بين الاحتمالات أن المجمع BBSome نقل الشحنات التي تحتوي على PC1 المقيمين في الغشاء البلازمي للأهداب الابتدائي أو مباشرة إلى من TGN إلى غشاء periciliary في الخلايا الظهارية الكلوية.
وباختصار، علينا أن نظهر أن PC1 البروتين ADPKD، وهذه العملية من غير نمطية 11 تمتد، يستهدف إلى أهداب الابتدائي بطريقة BBSome التي تعتمد على. تفاعل PC1 مع BBS1 هو خطوة حاسمة لنقل الحويصلات المحتوية على PC1 كفاءة لأهداب الابتدائي. وهذا يشكل التفاعل مثيرة للاهتمام بين اللاعبين حاسما وراء اثنين من أمراض وراثية متميزة genotypically لكن جزئيا متداخلة ظاهريا. PC1 موجود أيضا على أهداب الأساسي من الخلايا البطانية حيث انها تتوسط mechanosensation والنيتريك الافراج أكسيد (53). ومن المرجح أن مجموعة فرعية من الظواهر التي لوحظت في مرضى BBS مثل الخراجات الكلى وارتفاع ضغط الدم تنتج عن PC1 mistargeted. كما توفر البيانات فهمنا رواية من مسارات الإشارات التي تسيطر عليها BBSome.

المواد والأساليب

زراعة الخلايا وshRNA ضربة قاضية

تم شراء الماوس النخاع جمع خلايا القناة الداخلية (mIMCD3) من ATCC (CRL-2123) والمثقف في DMEM / F12 50/50 تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS). كانت خلايا HEK293 و293EBNA مثقف في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco ولل(DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS. كانت البشرية تحكم الخلايا الليفية الجلد والخلايا M390R (التي قدمها الدكتور Beales) مثقف في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. تم شراؤها البلازميدات تحتوي على خمسة المواقع المستهدفة ضد كل جين من سيجما. تم تجميع الجزيئات Lentiviral في 293EBNA الخلايا التالية تعليمات في المصنع. والخلايا المصابة بفيروسات IMCD3 تليها ليلة وضحاها عن طريق الانتقاء مع بوروميسين بتركيز 2 ميكروغرام / مل. تم اختبار كفاءة ضربة قاضية في الخلايا مستقرة الكمي RT-PCR أو النشاف الغربي. العثور على تسلسل الهدف ShRNA من سيغما أن تكون فعالة في هذه الدراسة هي: BBS1 (TRCN0000252354 وTRCN0000252355)، BBS5 (TRCN0000248514 وTRCN0000248517) وBBS8 (TRCN0000113210 وTRCN0000113212).
لتحليل تكون الأهداب، وكانت المصنفة الخلايا في 70٪ التقاء وجوعا لمدة 48 ساعة في DMEM وسائل الإعلام / F12 تحتوي على 0.5٪ FBS بعد الوصول إلى نقطة التقاء. لتحليل الاتجار الهدبية من PC1، كانت المصنفة الخلايا في 60٪ التقاء وعابر. مع مختلف بنيات بين عشية وضحاها. كانت خلايا ثم المصل جوعا في DMEM وسائل الإعلام / F12 تحتوي على 0.5٪ FBS لمدة 48 ساعة.

البلازميدات والأجسام المضادة

وPCR تضخيم PC1 ذيل-C محطة البشري (PC1-CTT) ترميز جزء 198 الأحماض الأمينية من cDNAs الكلى الإنسان وإدراجها في pACT2 لخلق pACT2-hCTT الطعم البلازميد. تم إدراج هذا الجزء أيضا إلى pGEX-4T-1 لإنشاء pGEX-hCTT بناء لإنتاج GST-PC1-CTT البروتين الانصهار في البكتيريا. كان BBS8 الموسومة MYC هدية المقدمة من الدكتور نيكولاس Katsanis في جامعة ديوك. وHA الموسومة BBS1، 2، 3، 4، 5 و 8 و 9 كانوا الهدايا السخية من الدكتور فال شيفيلد في جامعة ولاية ايوا. تم إنشاء BBS1 اقتطاع HA الموسومة (R146X) من HA-BBS1 بواسطة PCR الطفرات. تم تضخيم BBS3 الماوس من [كدنا الكلى والفأرة المستنسخة في pcDNA3.1-HA ناقل لخلق HA الموسومة BBS3 (pcDNA3.1-BBS3-HA). وقدم T31R ونقطة Q73L طفرة لpcDNA3.1-BBS3-HA بواسطة PCR الطفرات. لتوليد YFP-PC1، تم إدراج إطار القراءة المفتوح من YFP في الماوس PKD1 كدنا] بناء على الفور بعد أول 34 الأحماض الأمينية التي المؤتلف PCR في البلازميد التتراسيكلين محرض التعبير (pcDNA4.1، إينفيتروجن). تم إنشاء YFP-PC1ΔCTT من YFP-PC1 بحذف مشاركة 198 الأحماض الأمينية من PC1 C-المحطة. وقد أكد متواليات من جميع التركيبات ولدت في هذه الدراسة من خلال تحليل تسلسل الحمض النووي.
كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة: مكافحة GFP الأرنب بولكلونل (Abcam) 01:20 000؛ مكافحة GFP وحيدة النسيلة الماوس (كوفانس) 1: 1000 تخفيف، ومكافحة HA حيدة النسيلة الفئران 3F10 (روش) 1: 1000 تخفيف؛ مكافحة HA الماوس وحيدة النسيلة 12CA5 (روش) 1: 100 التخفيف؛ مكافحة MYC الماوس وحيدة النسيلة 9e10 (إينفيتروجن) 1: 1000 تخفيف؛ مكافحة γ تويولين (سيغما) الماوس وحيدة النسيلة 1: 2000 تخفيف؛ لمكافحة الأسيتيل-α تويولين الماوس وحيدة النسيلة (سيغما) 01:50 000 التخفيف؛ مكافحة PC1 الأرنب بولكلونل 96521 (15) 1: 500 ومكافحة PC1 الماوس وحيدة النسيلة 7e12 (سانتا كروز) 1: 2000، ومكافحة BBS8 بولكلونل الأرنب (سانتا كروز) 1: 500 التخفيف.

المناعية والمناعي المجهري

للتحاليل مجهرية، تم إصلاح الخلايا المستزرعة مع 4٪ لامتصاص العرق، permeabilized مع 0.5٪ تريتون X وسدت مع 5٪ ألبومين المصل البقري. خلايا Permeabilized ثم تم ملطخة الأجسام المضادة الأولية المطلوبة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بعد الغسل الكامل، وأضيفت الأجسام المضادة الثانوية مع وضع العلامات المناسبة لآخر ساعة من الحضانة. وقد شنت الشرائح مع إطالة ® الذهب Antifade الكاشف مع أو بدون 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي). لتلطيخ الخلايا الحية، وتشطف الخلايا أولا مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وحضنت مع GFP الأضداد على الجليد. بعد 1 ساعة، وكانت تغسل الخلايا، ثابتة مع 4٪ لامتصاص العرق، واستمر مع بروتوكول تلطيخ العادية المذكورة أعلاه.
تم الحصول على الصور الفلورسنت مع epifluorescence المجهر نيكون 1000 (نيكون، طوكيو، اليابان). وقد اتخذت جميع الصور في نفس المجموعة من التجربة مع ظروف مماثلة وتعرض لسطوع أو تعديل التباين على قدم المساواة في فوتوشوب.

الخميرة فحص اثنين من الهجين

تم تنفيذ الخميرة اثنين الهجين باستخدام Clontech الخاطبة III نظام الخميرة اثنين الهجين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحولت البلازميد الطعم pACT2-hCTT إلى سلالة الخميرة AH109 أولا، وتحولت مكتبة [كدنا الكلى الجنين البشري من إينفيتروجن إلى AH109 / pACT2-hCTT. وقد تم اختيار المستعمرات شكلت على لوحات عالية التشدد-SD / -Ade / العاهل / -Leu / -Trp / XA-غال. تم انتشال البلازميدات من الحيوانات المستنسخة الإيجابية وإرسالها للتسلسل الحمض النووي.

شارك في مناعي

والمتجانس خلايا HEK293 مع transfected مختلف بنيات مع M-PER (بيرس) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (روش) و 1 م م DTT. للمشاركة في مناعي، وحضنت 2-4 ملغ من الخلية لست] إما 2-4 ميكروغرام الأجسام المضادة أو مبلغ مساو من مفتش عادي مع هزاز لطيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أضيفت البروتين الخرز A سيفاروز (إينفيتروجن) وحضنت لمدة 2 ساعة في آخر 4 ° C. تم solubilized حبات غسلها في حجم مساو من 2 × الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) عينة العازلة، وكان مزال البروتينات التي المغلي لمدة 5 دقائق وتحليلها بواسطة النشاف الغربي. استخدمت عشر واحد إلى 1/20 من لست] كمدخلات، ما لم ينص على خلاف ذلك.

GST المنسدلة الفحص

تم إنشاء GST وGST البروتينات الانصهار كما هو موضح سابقا (54). لGST تحليل المنسدلة، وحضنت 500 ميكروغرام من 293 لست] T-خلية التعبير عن مختلف البروتينات BBS HA الموسومة مع GST تنقية البروتينات الانصهار ثبتوا على الجلوتاثيون سيفاروز الخرز (أمرشام فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية) في 4 درجات مئوية خلال الليل. تم طرد الخرز وتم غسلها ثلاث مرات مع الثلج الباردة PBS غسل العازلة التي تحتوي على 1٪ NP-40. تم solubilized حبات غسلها في حجم مساو من 2 × SDS عينة العازلة، والبروتينات مزال من قبل الغليان لمدة 5 دقائق وتحليلها بواسطة النشاف الغربي. استخدمت واحدة العشرين لللست] كمدخلات، ما لم ينص على خلاف ذلك.

سطح biotinylation فحص

تم إجراء biotinylation سطح الفحص كما هو موضح سابقا مع بعض التعديلات (55). و transfected الخلايا بين عشية وضحاها والمصل جوعا لمدة 24 ساعة بعد الوصول إلى نقطة التقاء. وبعد ذلك وصفت بروتينات سطح الخلية في تعليق خلية في درجة حرارة الغرفة مع 0.5 ملغ / مل من NHS-PEG4-البيوتين (الحرارية العلمية) لمدة 30 دقيقة. وهي lysed الخلايا في المخزن الترسيب المناعي الشعاعي، وكانت انسحبت البروتينات المعقدة البيروكسيديز بنسبة حبات streptavidin. ومزال الخرز مع 2 م م حرة د -biotin (بيرس)، وتم حل عينات مزال على 7.5٪ دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام لاحقا التحليل.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #13  
قديم 11-23-2015, 09:05 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي المتناقضة آثار الأوعية الدموية الناجمة عن فقدان بارديه-بيدل الجينات متلازمة

 

http://ajpheart.physiology.org/content/299/6/H1902.full



متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي، اضطراب وراثي جسمي مقهور غير المتجانسة وراثيا يرتبط مع العديد من المظاهر السريرية بما في ذلك السمنة وارتفاع ضغط الدم، والتشوهات القلبية الوعائية. البروتينات BBS تلعب دورا مهما في وظيفة الأهداب، وعضية ميكانيكية حسية في الخلايا البطانية، ولكن إذا كانت هذه البروتينات يشاركون مباشرة في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية غير واضحة. هنا، وتبين لنا أن الجينات BBS (12/01) ويعبر عنه في خطوط البطانية وسلس الخلايا العضلية والأنسجة المخصب في البطانية (الرئة) والعضلات الملساء (المعدة) خلايا فضلا عن الشريان الأبهر. وبعد ذلك، كنا حلقات الأبهري لدراسة وظيفة الأوعية الدموية من نموذجين الماوس BBS أن ألخص النمط الظاهري البشري، وهي Bbs2 - / - (السمنة وسوي ضغط الدم) وBbs6 - / - (السمنة وارتفاع ضغط الدم) الفئران. ومن المثير للاهتمام، تم تعزيز الاسترخاء التي تعتمد على البطانة (الناجم عن ACH) بشكل كبير في Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران. في المقابل، كان الاسترخاء-البطانة المستقلة (الناجم عن نتروبروسيد الصوديوم) دون تغيير في كلا النموذجين الماوس BBS. وبالإضافة إلى ذلك، تم الموهن الردود مقلص إلى السيروتونين وendothelin-1 في Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران. من المذكرة، وupregulated الانزيمات NO-إنتاج (أنوش وiNOS) في الشريان الأورطي من Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران. من ناحية أخرى، انخفض مستوى التعبير عن مفارز غشاء أوكسيديز NADPH (P22 P47 phox وphox) في الشريان الأورطي في Bbs2 - / - الفئران ولكنه زاد في Bbs6 - / - الفئران. في الختام، وهذه البيانات تورط الجينات BBS في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية وتبين أن تعطيل Bbs2 وBbs6 الجينات تؤثر بشكل مختلف على وظيفة الأوعية الدموية.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب غير المتجانسة وراثيا تتميز السمنة، والإعاقة، polydactyly، تشوهات الكلى، قصور الغدد التناسلية، واعتلال الشبكية (تعلم 34). ارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب والشرايين هي أيضا مشتركة في المرضى الذين يعانون BBS (20). نتائج BBS من الطفرات في جينات عديدة، 12 صفها حتى الآن، أن البروتينات ترميز التي تعتبر بالغة الأهمية لبنية ووظيفة أهداب (33). وتمشيا مع هذا، الحفظ جدا تم العثور على homologs من البروتينات BBS في الكائنات مهدبة ولكن ليس في الأنواع nonciliated (19، 22). بالإضافة إلى ذلك، عرضت منتجات الجين BBS لتوطين للأقمار الصناعية مريكزي من centrosomes والهيئات القاعدية للأهداب الابتدائي حيث تتفاعل مع مكونات الآلات النقل داينين ​​النقل intraflagellar (17، 30).
توفر الدراسات الحديثة خيوط مهمة حول كيفية تشارك البروتينات BBS في وظيفة الهدبية ولماذا الطفرات في الجينات أي تقدم BBS على نفس النمط الظاهري. في الواقع، تم العثور على 7 BBS البروتينات (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9) لتشكيل مجمع الأساسية، والمعروفة باسم BBSome، الذي يعمل كوحدة التي تتوسط الاتجار البروتين / الحويصلة إلى أهداب (23) . من ناحية أخرى، 3 مثل chaperonin البروتينات BBS (BBS6، BBS10، وBBS12) تشكيل مجمع في تركيبة مع البروتينات chaperonin أخرى من CCT / TRIC الأسرة والتوسط جمعية BBSome (28).
وقد سمح تطوير نماذج حيوانية من BBS تقدما ملحوظا في فهم الدور المحدد للبروتينات BBS في الأنسجة المختلفة واكتساب المعرفة الآلية في الفيزيولوجيا المرضية لهذه المتلازمة. من المذكرة، ونماذج الماوس BBS يحمل المكونات الرئيسية من النمط الظاهري البشري بما في ذلك السمنة، تنكس الشبكية، وعجز عصبي (10، 13، 22، 24). نحن (10، 26) أثبتت أيضا أن Bbs4 - وBbs6 الفئران -null وارتفاع ضغط الدم، في حين Bbs1 M390R knockin وBbs2 الفئران خروج المغلوب لا.
تعطيل الجينات BBS في الخلايا العصبية يبدو أن تؤثر على غشاء توطين العديد من مستقبلات بما في ذلك مستقبلات هرمون الليبتين (4، 29). ونتيجة لذلك، وفقدان البروتينات BBS في الخلايا العصبية طائي يشوش الآليات التي تتحكم في توازن الطاقة مما يؤدي إلى السمنة (26، 29). من ناحية أخرى، تثبيط جينات BBS في أنسجة الشبكية يؤدي إلى mislocalization من رودوبسين، والتي تسبق الموت أفكارك من المستقبلات الضوئية في شبكية العين والضمور (24). وعلى الرغم من هذا التقدم، وهناك عدد كبير من أنواع الأنسجة والخلايا التي لا تزال تقوض دور البروتينات BBS.
الدور الرئيسي للجينات BBS في وظيفة الهدبية أدت بنا إلى افتراض أن البروتينات BBS يشاركون بشكل حاسم في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية. تم فحص الجينات BBS في خلايا العضلات الملساء البطانية وكذلك الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، لتوضيح دور الجينات BBS في السيطرة على وظائف الأوعية الدموية، قمنا بتقييم آثار الأوعية الدموية حذف Bbs2 أو Bbs6 الجينات في الفئران.
المواد والأساليب

الأدوية والكواشف.

أدن تشافيز، نتروبروسيد الصوديوم (SNP)، تم الحصول عليها-23187 A بوكل، و5-HT من سيغما الدريخ ويذوب في محلول ملحي الفسيولوجية. تم توفيره من قبل جامعة ولاية ايوا الصيدلة البروستاغلاندين F 2α (فايزر صحة الحيوان PGF 2α ؛؛ Lutalyse). تم شراؤها Endothelin-1 (ET-1) من مختبرات شبه الجزيرة الكورية والذائبة في المياه المالحة الفسيولوجية. تدرج جميع التركيزات حيث أن التركيزات النهائية في غرفة الجهاز. كنا الأجسام المضادة ضد مفسفر البطانية سينسيز أكسيد النيتريك (الفوسفات-أنوش؛ Ser1177) ومحرض أكسيد النيتريك سينسيز (iNOS) كلا من خلية اشارة التكنولوجيا، مجموع أنوش (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية)، وβ-الأكتين (Abcam). تم شراؤها الأجسام المضادة أرنب الثانوي من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية. تم شراؤها تعزيز التوهج (ECL) مجموعة الكشف عن شكل أمرشام جنرال إلكتريك للرعاية الصحية. كان السلس الخلايا العضلية المتوسطة القاعدية والخلايا البطانية المتوسطة القاعدية من ونزا.

الحيوانات.

جيل من Bbs2 - / - وBbs6 - وصفت الفئران والتنميط الجيني سابقا (- / 13، 24). واستخدمت Littermate الفئران من النوع البري والضوابط. تم تغذية كل الفئران تشاو الماوس القياسية (LM-485؛ رئيس الوزراء Teklad مختبر الحمية) والمياه الإعلانية libitum. اجتمع الرعاية من الفئران المستخدمة في التجارب المعايير المنصوص عليها من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في مبادئها التوجيهية لرعاية واستخدام حيوانات التجارب. وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

الاستعدادات حلقة الأبهر.

تم إعداد حلقات الأبهري لقياس التقلص والاسترخاء كما هو موضح سابقا (5، 6). وباختصار، 4- لمن العمر 7-مو-Bbs2 - / - وBbs6 - / - أعطيت الفئران والضوابط littermate جرعة قاتلة من بنتوباربيتال (50-100 ملغ / الماوس الملكية الفكرية)، وتمت إزالة الشريان الأورطي الصدري بسرعة وتوضع في كريبس العازلة التي تحتوي على ما يلي: (في ملمول / لتر): 118.3 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل، 2.5 CaCl 2، 1.2 MgSO 4، 1.2 KH 2 PO 4، 25 NaHCO 3، 11 الجلوكوز. تم إزالة النسيج الضام والدهون المتبقية في البرانية، وقطع السفينة إلى أربعة متساوية، وقطع على التوالي من 4-5 ملم في الطول. علقت حلقات الأوعية الدموية في غرفة مخطاط العضل (موضوع سلك مخطاط العضل النظام النموذجي 610M؛ الدنماركي ميو التكنولوجيا) التي تحتوي على 5 مل من الاوكسيجين حل كريبس الحفاظ على 37 درجة مئوية. تم ربط الحلقات إلى محول القوة عن طريق اثنين من السنانير المدمج في الفولاذ لقياس التوتر متساوي القياس (التقلص والاسترخاء). وزاد التوتر يستريح تدريجي للوصول إلى التوتر النهائي من 0.5 غرام، وسمح للعصابات لكي تتوازن لمدة 45 دقيقة. هذه الكمية من الراحة التوتر هو الأمثل لتقلص في هذه الشرايين ونحن (5، 6) أظهروا سابقا. بعد precontraction الأولية (submaximally، 40-50٪ من الحد الأقصى) مع PGF 2α (10-50 ميكرومول / لتر) والاسترخاء مع أدن تشافيز (10 -4 M) وSNP (10 -4 M) لإنشاء النزاهة وظيفة كانت متشكلة السفينة، منحنيات الاستجابة للجرعة. تم التعاقد مع السفن submaximally مع PGF 2α كما هو موضح أعلاه. بعد أن تم التوصل إلى هضبة انكماش مستقرة، وقد تم الحصول على منحنيات الاستجابة للجرعة لأدن تشافيز وSNP (10 نانومتر إلى 0.3 ميكرومتر). تم فحص استجابة مقلص في الشريان الأورطي إلى ET-1 (0.1 نانومتر إلى 0.3 ميكرومتر)، بوكل (4-160 ملم)، و 5-HT (10 نانومتر إلى 0.3 ميكرومتر) بطريقة جرعة استجابة. أجريت كحد أقصى من خمسة منحنيات الاستجابة للجرعة لكل قطعة.

فحوصات الجينات التعبير.

تم فحص الجينات BBS في الماوس مثقف الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية (BMVEC) والعضلات الملساء (BMSMC) الخلايا وكذلك في الشريان الأورطي والرئة والمعدة والبرية من نوع الفئران باستخدام معيار RT-PCR الفحص. كانت تزرع BMVEC وBMSMC (تم الحصول عليها من الدكتور ستيفن مور، جامعة أيوا) في بطانة الخلايا القاعدية والمتوسطة الخلايا العضلية الملساء المتوسطة القاعدية، على التوالي، كما هو موضح سابقا (9). تم الفئران الذين قتلتهم CO 2 اختناق، وتم تشريح الأنسجة، وتجميد فرضت، وتخزينها في -80 ° C. تم تنقية الحمض النووي الريبي مجموع من طريقة TRIzol من الأطباق 100 ملم من BMVEC وBMSMC أو من أنسجة 50 ملغ. تم تضخيم [كدنا التي كتبها الناسخ العكسي II (إينفيتروجن). واستخدمت الظروف PCR التالية: الخطوة 1، 95 ° C، 5 دقائق، الخطوة 2، 95 ° C، 30 ثانية، 55 ° C، 30 ثانية، 72 ° C، 1 دقيقة، 30 دورات، الخطوة 3، 72 ° C و 10 دقيقة. وقد أجريت في الوقت الحقيقي RT-PCR خارجا مع SYBR الخضراء (بيو راد) باستخدام بادئات هو مبين في الجدول 1. وتم تحليل العينات في 2٪ الاغاروز المواد الهلامية.

الجدول 1.
الاشعال PCR تستخدم للدراسات التعبير الجيني

النشاف الغربي.

Bbs2 - / - وBbs6 - / - والفئران والضوابط littermate (4-7 مو القديمة) قتل مع CO 2 الاختناق، وتمت إزالة الشريان الأورطي الصدري بسرعة. تم استخراج البروتينات التي المجانسة الشريان الأورطي في الأنسجة العازلة المحللة (50 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم CaCl 2، 10 ملم ناف، 5 ملي EDTA، 1٪ تريتون X-100، 2 مم orthovanadate الصوديوم، وروش كوكتيل البروتيني قرص المانع). تعرض عينات البروتين ميكروجرام والعشرين لSDS-PAGE، electrotransferred على غشاء البولي فينيل الفلورايد، ثم بحث مع الأجسام المضادة الأولية في التخصصات التالية: الفوسفات-أنوش (Ser1177، 1: 1000)، أنوش (1: 1000)، iNOS ( 1: 1000)، وβ-الأكتين (1: 10000)، تليها الأضداد المضادة للأرنب الثانوي (1: 10000). وتصور التعبير البروتين مع ECL عدة الكشف.

تحليل البيانات.

وأعرب عن البيانات كما يعني ± SE. وتم قياس كمية البيانات لطخة غربية باستخدام NIH يماغيج. وقد استخدم SigmaStat (SYSTAT البرمجيات) لتحليل البيانات. لمنحنيات التركيز على الاستجابة، وإجراء المقارنات مع اتجاهين المتكررة تدابير ANOVA تليها اختبار توكي أو تي -test عند الاقتضاء. وتمت مقارنة البيانات المتبقية في اتجاه واحد يتبع ANOVA بواسطة توكي اللاحق الاختبار. P <0.05 اعتبر كبيرة.

النتائج

يتم التعبير عن الجينات BBS في الأوعية الدموية.

لمعالجة الدور المحتمل للجينات BBS في وظيفة الأوعية الدموية، ونحن أول اختبار ما إذا كان يتم التعبير عن الجينات BBS في الخلايا التي تشكل الأوعية الدموية (العضلات الملساء والخلايا البطانية). كما هو مبين في الشكل. يتم التعبير عن الجينات 12 BBS مع شدة مختلفة في البطانية مثقف (BMVEC)، وكذلك العضلات الملساء (BMSMC) الخلايا. وأعرب عن هذه الجينات BBS أيضا بدرجات مختلفة في الأنسجة المخصب في البطانية (الرئة) والعضلات الملساء (المعدة) الخلايا وكذلك في الأوعية الدموية، والشريان الأبهر (الشكل 1).

تين. 1.
يتم التعبير عن الجينات BBS في الأوعية الدموية. تحليل التعبير عن الجينات 12 BBS أنشئت في البطانية الماوس الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ (BMVEC) والعضلات الملساء (BMSMC) الخلايا والبرية من نوع أنسجة الفئران بما في ذلك الرئة والمعدة، والشريان الأورطي عن طريق RT-PCR. M، العلامة.

التي تعتمد على البطانية الاسترخاء هو تغير تفاضلي في الفئران BBS.

لتوصيف دور الجينات BBS في السيطرة على وظيفة الأوعية الدموية، أجرينا دراسات الأوعية الدموية في الشريان الأورطي من Bbs2 - الفئران، والتحكم من النوع البري - / -، Bbs6 - /. من النوع البري تتزاحم من Bbs2 - / - وBbs6 - / - لم الفئران لا يحمل أي اختلاف، وبالتالي، تم الجمع بين واستخدامها كأداة الضوابط من خلال الدراسات وصفها هنا Bbs2 - / - وBbs6 - / - كانت الفئران السمينة كما هو مبين بسبب زيادة وزن الجسم وكتلة الدهون (التكميلي الشكل S1، وهي متاحة في ملحق البيانات على الانترنت في AJP-القلب والدورة الدموية موقع على شبكة الإنترنت علم وظائف الأعضاء). نحن (26) قد أظهرت في وقت سابق أنه في حين أن Bbs6 يعانون من السمنة المفرطة - / - هي ارتفاع ضغط الدم، والسمنة Bbs2 - / - هي سوي ضغط الدم.
/ - - أظهرت الفئران الاسترخاء تعزز إلى حد كبير إلى أدن تشافيز، ولكن كانت الارخاء القصوى لا يختلف مقارنة مع الضوابط البرية من نوع (حلقات الأبهري من السمنة سوي ضغط الدم Bbs2 الشكل 2 A.). زيارتها الفئران استجابة طبيعية لأدن تشافيز (- يعانون من السمنة ارتفاع ضغط الدم Bbs6 - / الشكل 2 A.). لاختبار إمكانية أن التعديلات في المستقبلات المسكارينية يمكن أن تسهم في استجابة توسيع الاوعيه الدمويه المعززة لأدن تشافيز، كنا الكمي RT-PCR لمقارنة مستوى التعبير، إلى النمط الفرعي مستقبلات المسكارينية (M 3 R) التي تتوسط آثار الأوعية الدموية من أدن تشافيز (2 ، 18) في الشريان الأورطي من BBS والسيطرة على الفئران. وتمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها، وزادت مستويات التعبير عن M 3 R بشكل كبير في Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران (التكميلي الشكل S2).

تين. 2.
مقارنة استرخاء الأوعية الدموية بين Bbs2 - / -، Bbs6 - / -، والفئران البرية من نوع التحكم (WT). توسع الأوعية إلى البطانية محددة الموسع أدن تشافيز (A)، حامل الأيون endothelial- وNO-محدد A-23187 (B)، والبطانية مستقلة NO نتروبروسيد الصوديوم المانحة؛ واختبار (SNP C) في حلقات الأبهري من Bbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران والبرية من نوع الضوابط littermate. * P <0.05 مقابل الفئران البرية من نوع ≥ 8).

وعلى النقيض من ردود أدن تشافيز، والارخاء التي تعتمد على البطانة الناجمة عن حامل الأيون الكالسيوم A-23187 وتنخفض قيمته بشكل كبير في Bbs6 - / -، ولكن ليس Bbs2 - / - الفئران (الشكل 2 B). من ناحية أخرى، كانت الاستجابة الأبهر إلى التحفيز البطانة المستقلة (SNP) دون تغيير في كلا النموذجين الماوس BBS (الشكل 2 C) مما يدل على أن التغييرات في الارخاء التي تعتمد على البطانة ليست بسبب ضعف العضلات على نحو سلس.

وانخفض ردود مقلص بشكل ملحوظ في الفئران BBS.

لاختبار ما إذا كان يتم تبديل قدرة السفينة على العقد أيضا في الفئران BBS، قارنا تأثير العديد من المواد فعال في الأوعية على الشريان الأورطي من Bbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران والضوابط littermate. لافت للنظر، وحلقات الأبهري من Bbs2 - / - أظهرت الفئران استجابة مقلص الموهنة إلى حد كبير ET-1، السيروتونين (5-HT)، وبوكل (الشكل A - C). وvasoconstrictions الناجمة عن بوكل تم أيضا مخففة بشكل كبير في Bbs6 - / - الفئران نسبة إلى البرية من نوع الضوابط ولكن أقل مقارنة مع Bbs2 - / - الفئران (الشكل 3 C). في المقابل، لم يكن هناك اختلاف في ردود الناجمة عن PGF 2α (الشكل 3 D) تشير إلى أن التغييرات في الردود مقلص انتقائية.

تين. 3.
توصيف مقلص الردود الأوعية الدموية في Bbs2 - / -، Bbs6 - الفئران، والتحكم من النوع البري - /. وقد يتسبب تقلصات في حلقات الأبهري من Bbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران والبرية من نوع الضوابط littermate استخدام منبهات التي تعتمد على مستقبلات بما في ذلك السيروتونين (5-HT؛ A)، endothelin-1 (ET-1؛ B)، و البروستاجلاندين F 2α (PGF 2α؛ D) أو كلوريد مستقبلات مستقلة المضيقة البوتاسيوم (بوكل، C). * P <0.05 مقابل البرية من نوع الفئران، † P <0.05 مقابل من النوع البري وBbs2 - / - الفئران ≥ 8).

غياب تغييرات هيكلية في الأوعية الدموية للفئران BBS.

درسنا إمكانية أن التغيرات الهيكلية قد تساهم في إحداث تغييرات في تفاعل الأوعية الدموية في الفئران BBS. لهذا، قمنا بتحليل المقطع العرضي الأوعية الدموية المنطقة، القطر الداخلي والخارجي، وسمك الجدار من BBS السباتية الفئران. ومع ذلك، لم يكن هناك اختلاف كبير في كل من هذه المعايير بين Bbs2 - / -، Bbs6 - / -، والضوابط البرية من نوع (التكميلي الشكل S3).

المتناقضة التغيرات الجزيئية في الأوعية الدموية للفئران BBS.

للحصول على نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية التي تمثل تغيرات الأوعية الدموية في الفئران BBS، درسنا التعديلات المحتملة في مستويات NO-إنتاج الإنزيمات في الأوعية الدموية للفئران BBS. وبالنظر إلى أن أنوش تعتبر مصدرا رئيسيا للNO في جدار الأوعية الدموية، قمنا بقياس مستوى النشاط (الفسفرة Ser1177) من هذا الانزيم في الشريان الأورطي. كما هو مبين في الشكل. 4 مقارنة مع من النوع البري تتزاحم السيطرة، aortas من Bbs2 - / - أظهرت الحيوانات زيادة ملحوظة في مستويات الفوسفات-أنوش (تطبيع إلى إجمالي أنوش)، في حين Bbs6 - / - أظهرت الفئران فقط متواضعة (غير ذات دلالة إحصائية) زيادة. من المذكرة، وتطبيع الفوسفات-أنوش إلى بيتا الأكتين، بدلا من إجمالي أنوش، أسفرت عن نتائج مماثلة (الفئران البرية من نوع السيطرة، 100 ± 9٪، Bbs2 - / - الفئران و 162 ± 9٪، وBbs6 - / - الفئران و 117 ± 13٪). بعد ذلك، قارنا التعبير (مستوى البروتين) من إنزيم آخر لإنتاج NO، iNOS، بين BBS والسيطرة على الفئران. كان مستوى iNOS أكبر بكثير (~4 أضعاف) في aortas من Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران (الشكل 4 B.). هذا upregulation في الأنزيمات المنتجة للNO في Bbs2 - / - يتسق مع ارتخاء وعائي مبالغ فيه أدن تشافيز التي يسببها في هذا النموذج الماوس.

تين. 4.
مستوى التعبير عن NO-إنتاج الإنزيمات في الشريان الأورطي من Bbs2 - الفئران، والنوع البري السيطرة littermate - / -، Bbs6 - /. تم قياس مستويات مفسفر البطانية سينسيز أكسيد النيتريك (ف أنوش) وأنوش (A) ومحرض أكسيد النيتريك سينسيز (iNOS) وβ-الأكتين (B) من خلال لطخة غربية. وأظهرت لطخة غربية تمثيلية على القمة، ونتائج القياس الكمي في القاع. * P <0.05 مقابل الفئران البرية من نوع ≥ 6). الاتحاد الافريقي، وحدات التعسفي.

الاكسدة هو العامل المسبب هاما من الخلايا البطانية ويعتقد أن تلعب دورا رئيسيا في حدوث ومضاعفات متلازمة الأيض (1، 12، 27). لذلك، قمنا بتقييم التعبير (مستوى البروتين) مفارز غشاء أوكسيديز NADPH (P22 P47 phox وphox) في الشريان الأورطي من الفئران BBS. وتجدر الإشارة، في حين أن انخفاض التعبير عن phox P22 P47 وphox في Bbs2 - / - الفئران، وازداد التعبير عن هذه البروتينات بشكل كبير في Bbs6 - / - الفئران (الشكل 5.).

تين. 5.
مستوى التعبير عن مفارز غشاء NADPH أوكسيديز في الشريان الأورطي من Bbs2 - الفئران، والنوع البري السيطرة littermate - / -، Bbs6 - /. تم قياس مستويات البروتين من phox P22 P47 وphox في aortas لطخة غربية، وكان يستخدم بيتا الأكتين كما تحكم التحميل. وتظهر البقع الغربية ممثلة في الجزء العلوي، ونتائج القياس الكمي في القاع. * P <0.05 مقابل الفئران البرية من نوع ≥ 6).

نقاش

وصفنا العديد من النتائج الجديدة في هذه الدراسة. لأول مرة، وتبين لنا أن يتم التعبير عن الجينات BBS في الخلايا العضلية البطانية وسلس، والأنسجة المخصب في هذه الخلايا، والشريان الأورطي. ثانيا، وجدنا أنه على الرغم من السمنة، ونماذج الماوس اثنين من BBS لا تظهر أي خلل في توسع الأوعية. في الواقع، فإن Bbs6 ارتفاع ضغط الدم - / - أظهرت ظيفة بطانة الأوعية الدموية العادية، في حين أن Bbs2 سوي ضغط الدم - / - نموذج أظهرت زيادة تعتمد على البطانية استرخاء الأوعية الدموية. الثالثة، حلقات الأبهري من كلا Bbs2 - / - وBbs6 - / - أظهرت الفئران انخفاضا كبيرا في الردود مقلص الناجمة عن مختلف المحفزات. وبشكل أكثر تحديدا، Bbs2 - / - أظهرت انخفاض استجابة مقلص إلى السيروتونين، ET-1، وبوكل، في حين Bbs6 - / - أظهرت انخفاضا كبيرا في الانكماش الناجم عن بوكل لكن أي تغييرات في الرد على ET-1. وأخيرا، وجدنا تغيرات متباينة في التعبير عن المسارات الجزيئية الرئيسية المشاركة في تنظيم الأوعية الدموية في الشريان الأورطي من Bbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران. وتبين هذه النتائج أن Bbs2 وBbs6 الجينات تغير بشكل مختلف لهجة الأوعية الدموية في الفئران.
على الرغم من وجود السمنة في كلا النموذجين الماوس درس، Bbs2 - / - وBbs6 - / - أظهرت الفئران المتناقضة التغييرات الأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن وظيفة بطانة الأوعية الدموية محسن (كما يتضح من تأثير ACH) وانخفاض ردود مقلص في Bbs2 - / - الفئران تتفق مع عدم وجود ارتفاع ضغط الدم في هذا النموذج الماوس (26). من ناحية أخرى، فإن التغيرات الوعائية وصفنا في Bbs6 - / - الفئران تتماشى مع وجود ارتفاع ضغط الدم في هذا النموذج. هذه التغيرات في تفاعل الأوعية الدموية يمكن أن تسهم في الفرق في الضغط الشرياني في هذه نماذج الماوس اثنين.
على غرار النتائج التي توصلنا إليها في الفئران، في البشر تم العثور على العديد من المورثات BBS بما في ذلك BBS6 أن تكون مصحوبة بارتفاع ضغط الدم إلا للمرضى الذين يعانون BBS2 الذين ما زالوا سوي ضغط الدم (20). بالإضافة إلى ذلك، المتغيرات من Bbs6، ولكن تم الإبلاغ عن لا Bbs2، الجينات لزيادة خطر ارتفاع ضغط الدم عند الأشخاص البدناء المشترك (3). وبالتالي توضيح الآليات التي تحمي بعض المرضى يعانون من السمنة المفرطة من تطوير الخلايا البطانية وارتفاع ضغط الدم كما هو الحال في BBS2 سيساعد فهم الفيزيولوجيا المرضية من تشوهات الأوعية الدموية المرتبطة بالسمنة وارتفاع ضغط الدم.
حددنا العديد من التغييرات الجزيئية التي قد تكون مسؤولة عن التغييرات الأوعية الدموية المتناقضة في الفئران BBS. وتبين لنا أن الشريان الأبهر من Bbs2 - / - الفئران تبدي مستويات التعبير العليا للسلالة مستقبلات المسكارينية (M 3) التي تتوسط استرخاء تعتمد على البطانة التي تسببها أدن تشافيز (2، 18). وتتوافق هذه النتيجة مع تعزيز توسع الأوعية أدن تشافيز التي يسببها في هذا نموذج الفأر. نحن أيضا تظهر زيادة مستويات أنوش الفسفرة في موقف Ser1177 في الشريان الأورطي من Bbs2 - / - الفئران. على الرغم من أن تنظيم النشاط أنوش معقد، ومن المعروف الفسفرة Ser1177 أنوش لتعزيز نشاط الإنزيم مما يؤدي إلى ارتفاع NO إنتاج (11، 15) Bbs2 - / - أظهرت الفئران أيضا كبير (~4 أضعاف) زيادة في التعبير iNOS في الشريان الأورطي. وذكر مرتفعة التعبير iNOS سابقا في الشريان الأورطي من الفئران التي يسببها النظام الغذائي يعانون من السمنة المفرطة (25). ملف تعبير عن NO-إنتاج الإنزيمات في Bbs2 - / - الفئران يمكن أن تسهم في تحسين وظيفة بطانة الأوعية الدموية وانخفاض ردود مقلص بوساطة مستقبلات في هذا النموذج الماوس. NO أمر بالغ الأهمية للاسترخاء الأوعية الدموية واعتبار كبير الاسترخاء عامل المستمدة من البطانة في الأوعية قناة مثل الشريان الأورطي (14، 32). الافراج عن NO من قبل البطانة الوعائية يتسبب في العضلات الملساء الوعائية للاسترخاء من خلال تفعيل ذوبان guanylate محلقة، وزيادة تركيز المركب، وتفعيل بروتين كيناز المركب التي تعتمد G، مما أدى إلى توسع الأوعية (21، 32). ومع ذلك، زيادة في iNOS مثل تلك التي لوحظت في الشريان الأورطي من Bbs2 - / - الفئران قد تعزز الالتهابات (7، 8). هذه حالة التهابات قد تعوض الآثار المفيدة من أعلى أنوش مما يؤدي إلى ضغط الدم الطبيعي في هذا النموذج الماوس.
مستوى التعبير من أوكسيديز NADPH، وهو الانزيم الأكسجين التفاعلية الأنواع المنتجة الرئيسية، هو عامل حاسم في وظيفة الأوعية الدموية (14، 16). من المذكرة، والأوعية الدموية NADPH أوكسيديز يبدو أن مصدرا رئيسيا لزيادة الاكسدة في السمنة (31). وجدنا أن مستوى التعبير عن مفارز غشاء أوكسيديز NADPH (P22 P47 phox وphox) في الشريان الأورطي وانخفض في Bbs2 سوي ضغط الدم - / - الفئران ولكنه زاد في Bbs6 ارتفاع ضغط الدم - / - الحيوانات.
ونحن ندرك العديد من القيود على دراسات الحالية التي تحتاج إلى معالجة. أولا، تم فحص وظائف الأوعية الدموية خارج الجسم الحي. ما إذا كانت التغييرات وجدنا باستخدام حلقات الأبهري المحافظة في الجسم الحي لا يزال يتعين تحديدها. وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات أيضا إلى تقييم أهمية تفاعل الأوعية الدموية للسيطرة على ضغط الدم في الفئران BBS. ثانيا، أجرينا فحوصات الجزيئية باستخدام RNA والبروتينات التي تم الحصول عليها من السفينة بأكملها. تتطلب مساهمات مختلف أنواع الخلايا التي تشكل السفينة إلى تغييرات نفيدكم مزيد من التحقيقات. ومع ذلك، أثبتنا أن يتم التعبير عن الجينات BBS في الخلايا التي تعتبر حاسمة للسيطرة على لهجة الأوعية الدموية (العضلات الملساء والخلايا البطانية). ثالثا، على الرغم من أن بعض التعديلات الجزيئية وجدنا يبدو متسقا مع اختلافات في تفاعل الأوعية الدموية وضغط الدم في اثنين من BBS نماذج الماوس، هناك حاجة لدراسات إضافية لربط وظيفيا التعديلات في التعبير عن أنوش، iNOS، ومفارز من NADPH أوكسيديز للتغيرات في تفاعل الأوعية الدموية وضغط الدم. وأخيرا، هناك حاجة لدراسات إضافية أيضا لتحديد الآليات التي فقدان Bbs2 وBbs6 الجينات تؤدي إلى المتناقضة التغيرات الجزيئية في الأوعية الدموية.
في الختام، البيانات المتوفرة لدينا توريط الجينات BBS في تنظيم نغمة الأوعية الدموية وتبين أن تعطيل Bbs2 وBbs6 الجينات تغير تفاضلي وظيفة الأوعية الدموية في الفئران. التغييرات الأوعية الدموية يمكن أن تسهم في المتناقضة آثار ضغط الدم الناجم عن الطفرات في هذه الجينات BBS.

GRANTS

وأيد هذا العمل من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد منحة HL-084207. وأيد AM باير لجائزة NIH القومي للبحوث الخدمة (NRSA) زمالة أبحاث HL-07121. VC شيفيلد هو محقق من معهد هوارد هيوز الطبي.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #14  
قديم 11-23-2015, 09:09 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي العلاج الجيني يمنع الموت مبصرة ويحافظ على وظيفة الشبكية في متلازمة نموذج الفأر بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/108/15/6276.full


ملخص

المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) تجربة تنكس الشبكية الشديد نتيجة لعمليات النقل مبصرة ضعاف التي لا تزال غير مفهومة تماما. حتى الآن، لا يوجد علاج فعال لBBS المرتبطة تنكس الشبكية والعمى وشيك من قبل العقد الثاني من العمر. نحن هنا تقرير وضع الغدة المرتبطة الفيروسي (AAV) المتجه أن ينقذ رودوبسين mislocalization، ويحافظ على قضيب قطاعات الخارجي العادية، التي تظهر تقريبا، ويمنع موت مستقبلة للضوء في Bbs4 نموذج الفأر -null. تحليل مخطط كهربية على الموجة يشير إلى أن الخلايا قضيب انقاذ لا يمكن تمييزها وظيفيا من النوع البري قضبان. وتبين هذه النتائج أن العلاج الجيني يمكن أن تمنع تنكس الشبكية في النموذج BBS الثدييات.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) يتم تشخيص سريريا من خلال وجود أربعة على الأقل من العلامات التالية: ضمور شبكية العين، polydactyly، والسمنة، وصعوبات التعلم، قصور الغدد التناسلية الذكور، والشذوذ الكلوي (1). من هذه، والنمط الظاهري البصرية مدمر على وجه الخصوص: فإن متوسط ​​BBS المريض التقدم إلى العمى القانوني قبل له أو عيد ميلادها ال16. يوجد حاليا 15 المواضع الجينية (أون لاين الوراثة مندلية في مان # 209900) التي هي معروفة لتترافق مع BBS، وعلى الرغم من وراثة هذا المرض كان يعتقد مرة واحدة لمتابعة جسمية نمط المتنحية الكلاسيكية، وتشير الأدلة مؤخرا أن نمطا أكثر تعقيدا، ووصف "الميراث triallelic"، ويشارك في بعض مواضع BBS (2). وقد ظهرت أدلة فقط خلال العقد الماضي أن البروتينات BBS تلعب دورا في وظيفة الهدبية (3). وبشكل أكثر تحديدا، Bbs4 ومكونات BBSome أخرى يبدو أن تشارك في كل من تجنيد البضائع نحو الجسم الهدبي القاعدية (4، 5) والنقل intraflagellar على طول هدب (5 - +7). وتوضيح عدة تقارير الآليات التي تعطل بروتينات BBS تؤدي إلى الظواهر الفردية ينظر في هذه المتلازمة عديد المظاهر غاية (8 - 11).
تنكس الشبكية هو سمة أساسية من جميع النماذج BBS الماوس ولدت حتى الآن (8، +12 - 16). في قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية، وربط هدب هو بنية الهدبية درجة عالية من التخصص الذي يخدم كقناة الوحيدة من قطاع الداخلي إلى الجزء الخارجي. لأن تخليق البروتين يحدث الأقرب إلى الجزء الخارجي، رودوبسين والبروتينات البصرية الأخرى يجب أن يتم الاتجار بهن من خلال هدب ربط للوصول إلى موقع عملها في الجزء الخارجي. عبد البر وآخرون. (11) أظهر أنه عندما تم حذف Bbs4 في الفئران، رودوبسين ومخروط opsins أصبح mislocalized بشكل صارخ في قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية، على التوالي. وأعقب ذلك أفكارك الموت مبصرة وتدهور مخطط كهربية (أرج) موجات ب أ- و(14). وكشف تحليل التركيبية قضبان من الحيوانات الصغيرة التي تربط أهداب والهياكل القاعدية التي تظهر الجسم الطبيعي. هذا الاستنتاج الأخير له انعكاسات هامة على العلاج الجيني: لأن جهاز النقل الهيكلي يبدو أن تتطور بشكل طبيعي في خلايا مستقبلة للضوء Bbs4 -null، ونحن افترضنا أن مكملات ما بعد الولادة من الجين Bbs4 في قضبان شأنه انقاذ رودوبسين mislocalization ومنع قضيب الموت مبصرة.
لاختبار الفرضية لدينا، اخترنا فيروس الغدة المرتبطة-pseudotyped (AAV) كناقل التسليم. AAV المرغوب فيه ميزات كثيرة باعتباره الشبكية العلاج الجيني ناقلات، بما في ذلك المناعية منخفضة (17)، الكفاءة تنبيغ عالية (18)، والتعبير التحوير على المدى الطويل (19)، وtropisms محددة تعتمد على المصلي الخلوية (20). وعلاوة على ذلك، بيانات من ثلاث مراحل التاريخية الأولى من التجارب السريرية تشير إلى أن AAV ديه صورة ممتازة سلامة في البشر (+21 - 23). هنا، نحن تصف نتائج بوساطة AAV تسليم Bbs4 إلى قضبان من الفئران Bbs4 -null. وتوضح النتائج التي توصلنا إليها أن العلاج الجيني يمكن انقاذ رودوبسين mislocalization في هذا النموذج الماوس BBS والحفاظ العادي تقريبا قضيب التشكل الجزء الخارجي. وعلاوة على ذلك، معالجتنا يمنع الموت مبصرة، ويحسن وظيفة الكهربية من شبكية العين، ويحافظ على الاستجابات السلوكية أثار بصريا. وتشير هذه البيانات من نموذج الثدييات التي BBS المرتبطة تنكس الشبكية يمكن علاجها.
النتائج

تنكس الشبكية في Bbs4 -Null ماوس.

أجرينا دراسات تشريحية وظيفية في Bbs4 الفئران -null والنوع البري تتزاحم للحصول على القيم الأساسية قبل التجارب نجدتنا. في البرية من نوع شبكية العين، المناعى تلطيخ رودوبسين (الأحمر) مترجمة إلى منطقة الجزء الخارجي من المستقبلات الضوئية قضيب وكان غائبا تماما عن الطبقة النووية الخارجي (ONL) (الشكل 1 8 أسبوع من العمر). تم العثور على رودوبسين أيضا في منطقة الجزء الخارجي من العمر المتطابقة Bbs4 -null (- / -) شبكية العين، ولكن هذا كان يرافقه mislocalized جزيئات رودوبسين التي تميل إلى تشكيل أنماط حلقية (الشكل 1 B. حول نواة مبصرة الفردي (، النصال) الأزرق). الشكل. 1 C يوضح الفقدان التدريجي للنوى مستقبلة للضوء في شبكية العين BBS، والبعض الآخر الذي قد أظهرت أن تحدث من خلال موت الخلايا المبرمج (11، 12). في 2 أسبوع من عمر - / - شبكية العين أظهر بالفعل دليل على فقدان مبصرة (سبعة إلى ثمانية نوى في العمود ONL) مقارنة مع + / + ضبط نفس العمر الذي كان 10-11 نوى سميكة فقط. الموت مستقبلة للضوء في - / - شبكية العين تقدما مطردا على مر الزمن، وظلت 1-2 فقط نوى في العمود ...... قل في 16 أسبوع. وكانت الشبكية أقصر وأكثر غير متجانسة من + / + شرائح الخارجي في أقرب نقطة زمنية بحثت وكانت لا يمكن التعرف عليها تماما من قبل 16 أسبوع - شرائح الخارجي في - /.

تين. 1.
رودوبسين mislocalization وتنكس الشبكية في الفئران Bbs4 -null. Immunolocalization من رودوبسين (الأحمر) في القديم 8-أسبوع-من النوع البري (A) وBbs4 - / - (B) شبكية العين. Topro-3 (الأزرق) يمثل نواة، والسلطة الوطنية الفلسطينية (الأخضر) يحدد الأغماد مخروط. النصال في B تشير مبصرات قضيب الذي يحمل رودوبسين mislocalized. وتوضح (C) Photomicrographs الفقدان التدريجي للخلايا مستقبلة للضوء في ONL من Bbs4 - / - شبكية العين، مع أقسام من النوع البري على طرفي للمقارنة. (D-F) التوهين من أرج يصاحب فقدان مبصرة. في 8 أسبوع، Bbs4 - / - (الأحمر) الاستجابات هي أصغر بكثير من النوع البري تتزاحم (الأسود) في شدة فلاش انتزاع إما قضيب فقط (D) أو مختلطة قضيب مخروط (E) ردود F هو تضخم عالية. نظرا لوجود موجة حواف الرائدة في اثنين من كثافات مختلفة، مع نموذج photoresponse تركيبها على البيانات (آثار المنقطة). شدة فلاش في سجل الاسكتلندي مؤتمر نزع السلاح * ق / م 2 هي -3.65، -2.93، -2.08، -0.89 و لD؛ 3.45 لE؛ 2.10 و3.45 لF. (أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر في A و B، و 10 ميكرون في C).

أجرينا ERGs لقياس وظيفة الشبكية في Bbs4 الفئران -null مع مرور الوقت. في جميع الأعمار وشدة فلاش فحصها، وسعة A و B موجة الموهن بشدة في - / - الفئران (آثار حمراء اللون) مقارنة مع + / + الضوابط (آثار سوداء). وأظهرت البيانات القديمة 8-أسبوع-تمثيلية للقضيب فقط (الشكل 1 D) والمختلط قضيب مخروط (الشكل 1 E) الاستجابات. لبالحدود وphotoresponses قضيب، أجرينا نوبة الفرقة من طراز photocurrent Cideciyan-جاكوبسون (24) ضد أرج البيانات على بعد موجة من اثنين من شدة فلاش مختلفة. الشكل. 1 F يظهر على الموجة الحواف الأمامية من ممثل - / - العين (يمين) الذي هو أقل في كل من السعة وحساسية مقارنة مع عنصر تحكم من النوع البري العين يقابل عمر (يسار) استجابة قضيب.

التعبير عن AAV الجينات المحورة.

وقد أظهرت التوصيف السابق من هذا نموذج الفأر أن مخروط أوبسين mislocalization شديد من قبل 2 أسبوع من العمر (11)، والموهن مخروط ERGs بنسبة 88٪ في 4 أسبوع (14). لهذه الأسباب، اخترنا لتوجيه جهودنا العلاج الجيني نحو إنقاذ مبصرات قضيب، والتي لها بالطبع أبطأ من انحطاط. كنا على بعد التكميلي النفس الغدة المرتبطة بفيروس pseudotyped (scAAV5) التي تحتوي على المروج الماوس أوبسين (MOP) لدفع تعبير قوي في قضبان (25). واستخدمت اثنين من بنيات الفيروسية في هذه الدراسة: فيروس تحكم يحتوي GFP (المشار إليه فيما scAAV5-MOP-GFP) وفيروس العلاجية التي تحتوي على الماوس Bbs4 الجينات مع علامة HA N-الطرفية (scAAV5-MOP-BBS4). في أيدينا، أدى حقن تحت الشبكية من 1.1 ميكرولتر من scAAV5-MOP-GFP إلى البرية من نوع الماوس العين في منطقة المترجمة من التعبير GFP (الشكل 2 A) التي تغطي 4.8٪ ± 1.1٪ من شبكية العين (يعني ± SEM ، ن = 6). كان تنبيغ من الخلايا قضيب داخل تلك المناطق فعالة للغاية، مع ما يقرب من 100٪ من الخلايا قضيب معربا عن GFP على مقربة من موقع الحقن (الشكل 2 B ط). في المقابل، مبصرات مخروط (النصال في الشكل 2 B ط، إشارة حمراء في الشكل 2 B كانت ب) معربا عن GFP الحالية ولكنها نادرة. وقد تم تحديد الأقماع عن طريق فحص المقاطع البصرية مسلسل من شبكية العين مسطحة شنت ملطخة-رودامين مترافق الفول السوداني راصة (PNA) (فيلم S1).

تين. 2.
التعبير التحوير بعد الحقن تحت الشبكية من AAV. (A) flatmount الشبكية 4 مو بعد الحقن scAAV5-MOP-GFP كشفت مترجمة التعبير الجيني فقط بالقرب من موقع الحقن. (شريط مقياس، 1 ملم.) (بي) متحد البؤر صورة من الجزء العلوي من ONL تظهر قضبان (الأخضر من GFP) والمخاريط (زنازين مظلمة تميزت السهام). وقد تم تحديد الأقماع التي تلطيخ رودامين-السلطة الوطنية الفلسطينية في المقاطع البصرية التسلسلية. (شريط مقياس، 10 ميكرون.) (BII) شرائح الداخلية ينتمون إلى ثلاثة مخاريط (PNA) هي الوحيدة التي لا تعبر عن GFP. (شريط مقياس، 5 ميكرون.) (C) تحليل لطخة غربية لعينة الشبكية حقن AAV تحمل بناء HA-Bbs4 يظهر الفرقة HA-مناعيا قرب 59 كيلو دالتون الذي هو غائب في العينة الضابطة uninjected. (D) بوساطة AAV Bbs4 التعبير يموضع في المقام الأول إلى قطاعات الداخلية والقطاعات الخارجية القريبة (النجمة)، في حين ينظر لا يوجد مثل هذا في تلطيخ الضوابط uninjected. (مقياس شريط 20 ميكرون) الحق: ويرد إشارة رودوبسين لتحديد نظام التشغيل / IS الحدود. أجريت جميع التجارب في ظاهريا الضوابط العادية (Bbs4 + / + أو Bbs4 +/-). Topro-3، وصمة عار النووية؛ السلطة الوطنية الفلسطينية، مخروط غمد علامة. OS، الجزء الخارجي؛ هو، الجزء الداخلي. اوبل، طبقة ضفيري الخارجي.

حقن لدينا scAAV5-MOP-BBS4 بناء إلى نجم الفضاء تحت الشبكية في واحدة الفرقة HA-مناعيا لطخة غربية (الشكل 2 C). وتقع هذه الفرقة، التي كانت غائبة في العينة الضابطة uninjected، في ≈59 كيلو دالتون، الكتلة الجزيئية المتوقع لBbs4 (UniProt # Q8C1Z7) مع علامة HA. لتحديد توطين التحت خلوية من البروتين الفيروسي Bbs4، أجرينا المناعية على المقاطع vibratome 40 ميكرون. تظاهر شبكية العين حقن scAAV5-MOP-BBS4 الفرقة واضحة لتلطيخ منقط HA-الإيجابي (النجمة) التي لم يكن ينظر في شبكية العين السيطرة uninjected (الشكل 2 D). وكانت هذه الفرقة من تلطيخ الأكثر كثافة في المنطقة الواقعة بين الجزء الداخلية نوى مبصرة (ONL) و-رودوبسين الغنية قطاعات الخارجي (الشكل 2D.، يمين). ولكن لوحظت بعض punctae على هامش القريبة من طبقة الجزء الخارجي. هذه البيانات متوافقة مع التعريب الأنسجة من البروتين الذاتية (4، 11)، وكذلك الملاحظات من تجارب زراعة الخلية التي BBS4 يمكن العثور عليها على حد سواء داخل هدب (5) وعلى الأقمار الصناعية مريكزي (4، 5).

إنقاذ رهودوبسن Mislocalization.

بعد إنشاء توطين التحت خلوية من الفيروسية Bbs4، نحن مصممون المقبل ما إذا كان لدينا الجين العلاج العلاج يمكن أن يمنع رودوبسين mislocalization. عولجت فئران Bbs4 القديمة اسبوعين -null عن طريق الحقن تحت الشبكية من scAAV5-MOP-BBS4 في hemiretina الزماني للعين واحدة. في 12 أسبوع من العمر، وقطعت أقسام ناظم البرد الأفقية التي تحتوي على المنطقة المعالجة الفيروس في النصف الصدغي من هذا الباب، والمنطقة ضابطة في النصف الأنف. وأشار المناعية أن نسبة خلايا مستقبلة للضوء مع الحلقي mislocalized رودوبسين تلطيخ (السهام) كانت أقل في المناطق المعالجة (الشكل 3 A) مقارنة مع المناطق غير المعالجة (الشكل 3 B). النسب المئوية في معاملة مقابل المناطق غير المعالجة لشبكية العين ثلاثة فحص (الشكل 3 C كانت) 0.30٪ مقابل 4.19٪ (P <0.0001)، 0.23٪ مقابل 1.58٪ (P <0.01)، وبنسبة 0.09٪ مقابل 2.30 ٪ (P <0.0001). تم إحصاء ما لا يقل عن 600 خلايا ...... قل في كل منطقة، وكان يحسب أهمية باستخدام اختبار χ 2 لجدول طوارئ 2 × 2.

تين. 3.
scAAV5-MOP-BBS4 ينقذ رودوبسين mislocalization ويعيد التشكل الجزء الخارجي. المعالجة (A) وغير المعالجة (B) مناطق نفس الشبكية تظهر اختلافات واضحة في نسبة خلايا مستقبلة للضوء مع رودوبسين mislocalized (السهام). إشارة حمراء مباشرة أسفل ONL تمثل سمة غير محددة تلطيخ هذه الأجسام المضادة (الشكل 1 A). نلاحظ أيضا أن ONL هو أكثر سمكا كبيرا في الشبكية المعالجة (A). الأحمر، رودوبسين؛ الأزرق، وصمة عار النووية Topro-3. (. أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر) (C) في كل شبكية العين ثلاثة درست في هذا العصر، وكانت النسبة المئوية للخلايا مستقبلة للضوء واظهار رودوبسين mislocalization أقل من ذلك بكثير في معاملة مقابل المناطق غير المعالجة (* P <0.01 **؛ P <0.0001؛ أهمية محسوبة بواسطة χ 2 الاختبار لجدول طوارئ 2 × 2). (D) الأقاليم من Bbs4 - / - شبكية العين تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 الواردة قطاعات الخارجية التي كانت مشابهة لافت للنظر في WT قطاعات الخارجي. في غير المعالجة السيطرة Bbs4 - / - شبكية العين، وقطاعات الخارجي لا يمكن التعرف عليها في 16 أسبوع من العمر. (شريط مقياس، 10 ميكرون). OS، الجزء الخارجي؛ هو، الجزء الداخلي. INL، طبقة النووية الداخلية.

كما أظهرت قطاعات الخارجي في Bbs4 شبكية العين -null التحسن بعد العلاج مع scAAV5-MOP-BBS4. تعامل - / - الفئران قتل في 16 أسبوع أظهرت بقع كثيفة، شرائح الخارجي متجانسة في hemiretina الزمانية قياس 20.7 ± 0.52 ميكرومتر في الطول (يعني ± SEM، ن = 12) (الشكل 3 D.، يمين). وكانت هذه مشابهة لمن النوع البري قطاعات الخارجي (الشكل 3D، يسار) في كل من المظهر وطول (22.6 ± 0.21 ميكرون، ن = 12). قطاعات الخارجي من دون علاج - / - شبكية العين، في المقابل، كانت متفرق، غير متجانسة، وقصيرة (13.1 ± 0.44 ميكرون، ن = 12) في 4 أسبوع والتعرف عليها في 16 أسبوع (الشكل 3 D.، مركز لليسار ويمين مركز).

مبصرة الإنقاذ.

لتحديد ما إذا كان العلاج الجيني يمكن أن يمنع موت الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية العين -null Bbs4، أحصينا عدد الأنوية المتبقية في الأعمدة الخلوية من ONL. الشكل. 4 يظهر كلتا العينين من - / - الماوس العلاج في 2 أسبوع وقتل في 16 أسبوع. تلقت العين اليسرى لحقن scAAV5-MOP-BBS4 الزمني، في حين أن العين اليمنى تلقت حقن scAAV5-MOP-GFP الزمني، وترك أجزاء الأنف كل من شبكية العين غير مصورة على أي فيروس. خرائط الحرارة من سمك فقط. t (الشكل 4 أ) تدل بوضوح على المنطقة المحلية في النصف الصدغي للعين اليسرى، حيث كان ONL أربع إلى ست نوى مستقبلة للضوء في السمك. هذه المنطقة تقابل بالضبط إلى جزء من شبكية العين تتعرض لفيروس Bbs4 العلاجي. مناطق لا يتلقى الفيروس العلاجي (أي النصف الأنف للعين اليسرى وكل شطر من العين اليمنى) قد شهد انحطاط لا هوادة فيه أن ترك طبقة مبصرة 1-2 فقط نوى سميكة. Photomicrographs (الشكل 4 B) من المواقع الخمسة المشار إليها في خرائط الحرارة توضح تناقض صارخ بين - / - شبكية العين مع وبدون العلاج العلاج الجيني. المناطق المعالجة (الأول والثاني) لديها ONL سمكا بكثير جنبا إلى جنب مع ما يقرب من المعتاد الظهور-شرائح الخارجي، في حين أن المناطق غير المعالجة (الثالث إلى الخامس) لديها ONL رقيقة متجانس وليس قطاعات الخارجي.

تين. 4.
العلاج مع scAAV5-MOP-BBS4 يمنع الموت مبصرة. (A) في 16 أسبوع، مبصرة البقاء على قيد الحياة وتقييمها من قبل طبقة النووية الخارجي (ONL) سمك في أقسام أفقية تحتوي على العصب البصري. خرائط الحرارة تشير إلى طبقة سميكة الخارجي النووية (الأحمر) في موقع الحقن scAAV5-MOP-BBS4، والطبقة النووية الخارجي رقيقة (الأزرق) في جميع المناطق الأخرى. (B) Photomicrographs من المعالجة (الأول والثاني) وغير المعالجة (من الثالث الى الخامس) مواقع مبين في A. (شريط مقياس، 10 ميكرون). وأصبحت قطاعات الخارجي في BII عازمة أثناء التثبيت وتظهر في المقطع العرضي. هو، الجزء الداخلي. OS، الجزء الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية.

كان نمط المترجمة سمك فقط. t في المنطقة تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 متناسقة عبر جميع شبكية العين فحصها. تضمين هذا حيوانين قتل في 12 أسبوع (التين. S1 و S2)، واثنين من الحيوانات قتل في 16 أسبوع (الشكل 4 والشكل S3)، واحد حيوان قتل في 45 أسبوع (الشكل. S4). كان هذا أقدم الحيوانات ذات أهمية خاصة لأن العين غير المعالجة الواردة على الإطلاق أي خلايا مستقبلة للضوء، في حين أن المنطقة الزمنية للعين المعالجة كان ستة إلى سبعة صفوف من خلايا مستقبلة للضوء في أنحف نقطة فيه.

تحسين وظيفي من الرؤية.

لتقييم وظيفة قضيب في شبكية العين -null Bbs4 بعد العلاج الجيني، أجرينا ERGs ومعلمات الردود على الموجة باستخدام المربعات الصغرى يصلح للphotocurrent نموذج Cideciyan-جاكوبسون (المعادلة 1). أنتج هذا التحليل اتساع (R كحد أقصى) والحساسية (σ) قيمة لوصف استجابة قضيب من كل عين. الشكل. 5 A يدل على البيانات الفعلية على الموجة (آثار الصلبة) في اثنين من كثافات مختلفة ومنحنيات المجهزة (آثار متقطع) لمدة 12 فالتر كالين من العمر - / - الفأر مع عين واحدة تعامل (يسار) ودون علاج البعض (يمين).

تين. 5.
تحليل ERG موجة بعد العلاج scAAV5-MOP-BBS4. (A) التمثيلية 12 أسبوع من موجة الحواف الأمامية وآثار نموذج المجهزة (الخطوط المنقطة) للتعامل (يسار) والتحكم (يمين) عيون Bbs4 - / - الماوس. (B) وعاد إجراءات تركيب نموذج السعة (R كحد أقصى) والحساسية (σ) معلمات للعيون اختبارها في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوع. وتظهر عيون الفردية رموز المفتوحة (الأزرق وscAAV5-MOP-BBS4، الأحمر وscAAV5-MOP-GFP أو أي حقن)، وتمثل الرموز شغل المتوسطات (أشرطة الخطأ = SEM). المتوسطات مجموعة مختلفة إحصائيا في 8 و 12 و 16 أسبوع (الجدول 1). وتظهر (C) متوسط ​​R ماكس واستخدمت القيم سيجما من B كمدخلات لنموذج photocurrent، وآثار الإخراج لكل نقطة من النقاط الزمنية الأربعة التي تم فحصها.

بعد العلاج في 2 أسبوع من العمر، وقد تم تحليل ERG على موجات في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوع. يتم عرض البيانات في الشكل. 5 مع كل من الفردية عيون (رموز فتح) ومتوسط ​​القيم (رموز شغل) هو مبين. في جميع نقاط الوقت الأربعة، وكان يعامل عيون (scAAV5-MOP-BBS4) في المتوسط ​​على حد سواء أعلى سعة وحساسية أعلى من عيون التحكم (scAAV5-MOP-GFP أو uninjected). كان الفرق بين عيون المعالجة والسيطرة صغير في 4 أسبوع لكن نما أوسع وصلت دلالة إحصائية عند كل نقطة زمنية لاحقة الثلاث (الجدول 1). أهمية خاصة هو حقيقة أن متوسط ​​حساسية العينين تعامل زاد فعلا من 12 إلى 16 أسبوع، لتصل إلى قيمة 3.80 ± 0.077 سجل الاسكتلندي مؤتمر نزع السلاح -1 م 2 ق -3 (يعني ± SEM، ن = 15). وكانت هذه القيمة يمكن تمييزها تقريبا من قيمة من النوع البري العمر المتطابقة من 3.83 ± 0.064 = 6). قيم متوسط ​​R ماكس وσ من الشكل. 5 B تم استبداله في المعادلة 1 لإنتاج متوسط ​​حواف الموجة الرائدة لكلا الفريقين (الشكل 5 C) في جميع نقاط الوقت الأربعة (4 أسبوع يسار، 16 أسبوع اليمين). لاحظ أسرع الارتفاع الوقت وزيادة سعة المعالجة (الأزرق) يتتبع في جميع الأوقات. ومن المثير للاهتمام، وظل الفرق السعة بين المعالجة ومراقبة ثابتة نسبيا على مر الزمن، على الرغم من العمليتين انخفضت في السعة المطلقة (مناقشة).

الجدول 1.
مخطط كهربية على الموجة تحليل

أجرينا أيضا حركة العين استجابة (OKR) اختبار لتحديد ما إذا كانت المنطقة محدودة من شبكية العين الحفاظ كافية للحصول على رد السلوكية أثار بصريا. تم اختبار ما مجموعه تسعة الفئران (تتراوح أعمارهم بين 9-11 شهر)، بعد أن تلقى كل حيوان لحقن scAAV5-MOP-BBS4 أحادي في 2 أسبوع من العمر. كشفت التجارب الأولية في ظل ظروف ظلامية أن أربعة من تسعة عيون المعالجة يمكن أن انتزاع OKR إيجابي، في حين كان ينظر توجد مثل هذه الاستجابة لأي من أعين غير المعالجة المقابل. مزيد من الاختبارات السلوكية ويجري حاليا.

نقاش

نحن هنا تقديم دليل على أن العلاج الجيني يمكن أن تمنع بصمات مرضية الرئيسية التي توجد في شبكية العين -null Bbs4 (11، 13، 14). على وجه التحديد، والتعبير Bbs4 الفيروسي في المستقبلات الضوئية قضيب ينقذ رودوبسين mislocalization ويحافظ على قضيب قطاعات الخارجية التي تظهر صحية. يتم منع الموت مستقبلة للضوء في المناطق تلقي العلاج الجيني العلاج، في حين أن المناطق غير المعالجة تتحول بسرعة. نحن تأكدت هذه النتائج التشريحية التي كتبها تخطيط كهربية الشبكية والسلوك. أظهرت ردود قضيب أرج أكبر سعة وارتفاع حساسية في العينين تعامل مقابل الضوابط غير المعالجة، وكانت أثارت OKRs إيجابية من بعض العيون المعالجة ولكن لا علاج الضوابط. بشكل جماعي، وتشير هذه النتائج إلى أن العلاج الجيني هو نهج ممكنا لعلاج العمى في المرضى الذين يعانون BBS البشري. على أساس نجاحنا في استكمال هذا الجين Bbs4، يبدو من المرجح جدا أن أشكالا أخرى من BBS، وخصوصا تلك التي ترتبط جزيئيا إلى BBSome (5)، وسوف تكون أيضا أهدافا مناسبة للعلاج بالجينات. والشيء نفسه يمكن أن ينطبق على ciliopathies الشبكية الأخرى، بما في ذلك متلازمة حاجب، متلازمة جوبير، متلازمة العليا-لوكن، وبعض أشكال يبر كمنة خلقية (26). وعلاوة على ذلك، لأنه يعتقد السمنة في BBS أيضا أن يحدث بواسطة آلية البروتين mislocalization مماثلة تنطوي على مستقبلات هرمون الليبتين في الخلايا العصبية المهاد (9)، فمن الممكن أن بعض أشكال السمنة المتلازمات قد تكون أيضا المرشحين للعلاج بالجينات.
في أيدينا، أدى حقن تحت الشبكية من scAAV5-MOP-GFP في GFP التعبير بمتوسط ​​تغطية شبكية العين من 4.8٪ فقط. على الرغم من أن هذا هو أقل مساحة من وقدر الآخرين، حققنا مرتفعة للغاية قضيب تنبيغ داخل منطقة التغطية (تقترب من 100٪ قرب موقع الحقن) والأحداث السلبية التقليل الناتجة عن الإصابات الميكانيكية للأنسجة. كان نمط تغطية الفيروسي من المفيد لدراستنا: أنها قدمت الرقابة الداخلية مريحة عند دراسة المعالجة (الزمانية) وغير المعالجة (الأنف) مناطق أقسام الشبكية عرضية. وعلاوة على ذلك، لأن تنبيغ من الخلايا قضيب كان ما يقرب من 100٪ محليا وغائبة في المناطق البعيدة، وكانت آثار نسيجية للفيروس جلية واضحة. لأسباب سبق ذكرها، اخترنا الماوس أوبسين المروج أن نركز جهودنا على إنقاذ مبصرات قضيب. ونتيجة لذلك، أدى لدينا بناء الفيروسي العلاجية إلى تحسن واضح في نظام قضيب ولكن تحسين مخروط قليلا. ومع ذلك، ونظرا لأوسع نافذة الوقت العلاجية والمروج المناسب (+27 - +29)، وليس هناك سبب واضح لماذا لا يمكن أيضا أن أنقذ المخاريط. على عكس الفأر المستخدمة في هذه الدراسة، وBbs1 M390R ديه knockin عادية نسبيا مخروط أرج وظيفة في 11 أسبوع من العمر (16)، وبالتالي قد يكون نموذجا مناسبا للتقييم المستقبلي لإنقاذ مخروط.
على الرغم من أن دور الجزيئي الدقيق للBbs4 والبروتينات BBS أخرى في المستقبلات الضوئية ليست مفهومة تماما [انظر زغلول وKatsanis (30) لمراجعة]، والكثير من النقاط الأدب دورا في الاتجار داخل الخلايا البروتين والتعريب في المنطقة المجاورة لل الجسم الهدبي القاعدية. ملاحظتنا التعبير Bbs4 الفيروسي في الجزء الداخلي والجزء الخارجي القريب يتسق تماما مع هذه الفكرة. كان قادرا على عكس النمط الظاهري تنميط رودوبسين mislocalization ينظر في عدة نماذج BBS الماوس (ScAAV5-MOP-BBS4 11، 12، 15)، وكذلك نماذج الأخرى التي تم حذفها البروتينات الهدبية (31، 32). وليس من الواضح تماما ما إذا mislocalization رودوبسين في هذا النموذج هو نتيجة مباشرة لBbs4 حذف أو بالأحرى إهانة الثانوية الناجمة عن انحطاط مبصرة. هذا التمييز، ومع ذلك، لا تحدث أثرا يذكر لهذه الدراسة. تم العثور رودوبسين mislocalization أن تسبق الموت مبصرة أفكارك في Bbs2 - وBbs4 نماذج الماوس -null (11، 12)، وذلك على أساس لدينا وجدت أن عمليات الإنقاذ العلاج الجيني رودوبسين mislocalization، وكنا نتوقع تماما أن العلاج الجيني من شأنه أيضا أن يمنع الموت مبصرة . والواقع أن هذه القضية: أدى الحقن الموضعي للscAAV5-MOP-BBS4 في 2 أسبوع من العمر في المترجمة الإنقاذ مبصرة التي لا تزال قائمة حتى حتى بحثت نقطة زمنية مشاركة (45 أسبوع). على العكس، المناطق غير المعالجة تدهورت بشكل مطرد حتى بلغت خسائر مبصرة كاملة. ولذلك أنشأنا التي نافذة علاجية موجود في الماوس -null Bbs4 خلالها عملية مرض شبكية العين هو عكسها.
تحليل كامل الحقل أرج على الموجة باستخدام نموذج Cideciyan-جاكوبسون (24) أثبتت أن لديها حساسية بشكل ملحوظ في هذه الدراسة. دون الحاجة إلى استخدام تقنية أرج متعددة البؤر كنا قادرين على ملاحظة هامة للغاية (P <0.0001) تحسن في وظيفة قضيب الرغم من الحقن تحت الشبكية لدينا تغطي سوى 5٪ من شبكية العين. إمكانية أرج القرنية هي محصلة جميع التيارات خارج الخلية الشعاعية في العين، لذلك لدينا في فوج من العيون تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 افترضنا أن أرج يمثل تركيبة خطية من 5٪ الصحية (المعالجة) شبكية العين و 95٪ المنحطة (غير المعالجة) شبكية العين. السعة القصوى لالموجة، R كحد أقصى، ويرتبط إلى مجموع الظلام الحالي المتداول في قطاعات الخارجي في وقت ظهور ضوء (33)، وبالتالي من المتوقع أن ينخفض ​​في هذا النموذج الماوس كما تفقد قطاعات الخارجي بسبب وفاة مبصرة . لدينا بيانات على الموجة (الشكل 5 C) تبين أن R كحد أقصى في التعامل مع عيون انخفاض 4-16 أسبوع ولكن أكبر من R الحد الأقصى من أعين الرقابة غير المعالجة في كل نقطة زمنية. الأهم من ذلك، والفرق السعة بين المجموعتين التجريبية هو ثابت تقريبا. الفرق ثابت يشير إلى أن عيون المعالجة لديها عدد قليل من السكان انقاذ قطاعات الخارجية التي تبقى في صحة جيدة على مر الزمن (الشكل 4 B i و B II) والإسهام بشكل مطرد إلى والموجة. هذا، ومع ذلك، يتم فرضه على إشارة الخلفية الكبيرة القادمة من شرائح الخارجي غير الصحية التي تتدهور مع مرور الوقت.
معتمد لدينا الخطية الجمع الفرضية أيضا بالتغيرات في حساسية على الموجة (σ) على مر الزمن. شادي وآخرون. (34) خلصت من مرضى التهاب الشبكية الصباغي البشري الذي قضيب انحطاط أدى إلى تخفيض تدريجي من التضخيم تنبيغ، وهي كمية ترتبط ارتباطا وثيقا المعلمة حساسية عنها في هذه الدراسة. وتبين لنا أن حساسية قضيب في غير المعالجة Bbs4 عيون -null تنخفض مفردة النغمة 4-16 أسبوع. في عيون المعالجة، إلا أن انخفاض حساسية 4-12 أسبوع، تليها زيادة ملحوظة من 12 إلى 16 أسبوع. ومن المثير للاهتمام خاصة أن حساسية العين العلاج في 16 أسبوع هي مشابهة جدا لحساسية النوع البري عيون العمر المتطابقة. في سياق نموذجنا الجمع الخطي، وتشير هذه البيانات إلى أن القفزة في حساسية بين 12 و 16 أسبوع يمثل الاختفاء التدريجي لل95٪ قضيب صحي إشارة وهيمنة الناشئة من 5٪ الصحية (المعالجة) قضبان مع قضيب عادية نسبيا المعلمات phototransduction. ويؤكد الحفاظ على الاستجابات السلوكية أثار بصريا من أربعة من تسعة عيون يعامل كذلك إلى أن عدد سكان قضبان الوظيفية نجا نتيجة العلاج لدينا. والحقيقة أن أي الفئران التي عولجت عرضت هذه الاستجابات السلوكية مفاجئا، بالنظر إلى مساحة محدودة من المستقبلات الضوئية انقاذهم. مزيد من الدراسات جارية حاليا لربط تشريحية، الكهربية، والإنقاذ السلوكي على مستوى الفرد العينين.
من منظور تجريبي لدينا عامل التغطية المتوسط ​​من 5٪ في حقن الفيروس كان أكثر من كافية لمراقبة مصلحة التشريحية والوظيفية، وبالتالي التحقق من فعالية لدينا بناء الفيروسي. في النماذج الحيوانية الكبيرة، والتغطية الشبكية من 20-30٪ يمكن تحقيقه بسهولة عن طريق الحقن تحت الشبكية (35، 36). إذا ترجم إلى موضوع الإنسان، أن 30٪ تحتوي على تغطية منطقة البقعة الصفراء لديها القدرة على الحفاظ على حدة البصر العادي تقريبا. شرط هام للعلاج بالجينات، ومع ذلك، هو التشخيص الوراثي في ​​الوقت المناسب قبل حدوث الموت مبصرة واسعة النطاق. وتشير الدراسات السريرية أن من بين المرضى BBS1، نصف فقط سيكون حدة البصر من 20/60 أو أفضل في وقت التشخيص. يبدو أن الوضع يكون أسوأ بالنسبة لأولئك مع BBS10 (37، 38). وهذا يؤكد على أهمية الوعي BBS في طب العيون والمجتمعات طبية واسعة النطاق. نتائجنا هي خطوة مشجعة أولى نحو الحفاظ على الرؤية في المرضى الذين يعانون BBS، ولكن النجاح النهائي لمثل هذا العلاج يتطلب جهد تعاوني بين الباحثين والأطباء متعدية يقظة.

المواد والأساليب

التركيبات الفيروسية.

كامل طول كدنا] للماوس Bbs4 الجين (الانضمام لا. BC145771 تم الحصول عليها) من النظم البيولوجية فتح. تمت إضافة حاتمة العلامة HA (YPYDVPDYA) إلى N محطة من Bbs4، تليها ربط من HA- Bbs4 إلى البلازميد SC-MOPS500-hGFP في مكان hGFP. طريقة البلازميد ترنسفكأيشن باستخدام خلايا HEK293 كما هو موضح سابقا (39) تم استخدامه لإنتاج وتنقية scAAV2 / 5 ناقلات تحمل إما Bbs4 أو GFP. تم تحديد التتر الفيروسية التي كتبها في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح سابقا (40) وكانت 6.82 × 10 12 VG / مل لscAAV5-MOP-BBS4 و 3.64 × 10 12 VG / مل لscAAV5-MOP-GFP.

الحيوانات وتحت الشبكية الحقن.

تم إنشاؤها الفئران Bbs4 -null كما (هو موضح سابقا 8). وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في كلية بايلور للطب. وترد تفاصيل تقنية الحقن تحت الشبكية بطريق الصلبة في مواد SI وطرق.

الأنسجة وImmunoblotting.

تم تنفيذ طرق كما هو موضح سابقا (11) مع تعديلات طفيفة. كانت ملطخة أقسام المجمدة عشرة ميكرومتر مع 1: 1000 لمكافحة رودوبسين (استنساخ RET-P1؛ Neomarkers) ماب ودابي. لتحديد HA-BBS4، 1: تم استخدام 1000 التخفيف من مكافحة HA ماب (16B12 استنساخ؛ كوفانس). لالمجهر الضوئي، كانت ملطخة أقسام الإي بي 1 ميكرومتر مع الميثيلين الأزرق الفوكسين والأساسي. لخلق تمثيل خريطة الحرارة، تم تقسيم الصور الرقمية بشكل متساو إلى 32 مناطق في hemiretina. تم تحديد قيمة سمك لكل منطقة عن طريق حساب متوسط ​​ثلاث تهم من النوى الموجودة في عمود فقط.

اختبار الرؤية وظيفية.

تم تخدير الفئران عن طريق الحقن الملكية الفكرية من 51 ملغم / كغم من الكيتامين، 10 ملغ / كغ زيلازين، و 0.86 ملغم / كغم آسيبرومازين، وسجلت ERGs كما هو موضح سابقا (11). وعلى غرار A-موجة الرائدة الحواف باستخدام طريقة وصفها Cideciyan وجاكوبسون (24). لفترة وجيزة، تم تسجيل ERGs الظلام تكييفها استجابة لاثنين من ومضات مشرقة (2.10 و 3.45 سجل الاسكتلندي * CD * ق / م 2)، والمعادلة التالية كان يصلح لكلا منحنيات وقت واحد باستخدام المربعات الصغرى التقليل: حيث I هي شدة فلاش، R كحد أقصى، وأقصى اتساع الاستجابة؛ σ، والحساسية؛ ور، مرة بعد بداية التحفيز. مزيد من المعلومات حول المعادلة. منحنى البرنامج المناسب، واختبار OKR يمكن العثور عليها في مواد SI وطرق.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #15  
قديم 11-23-2015, 09:14 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بوساطة التفاعل جوهري البروتين البروتين وChaperonin بمساعدة الجمعية متسلسل من مستقر بارديه-بيدل متلازمة مجمع البروتين، وBBSome *

 

http://www.jbc.org/content/287/24/20625.full



الميزات عديد المظاهر من السمنة، وتنكس الشبكية، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الإدراك، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري وجدت في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) تجعل هذا الاضطراب اضطراب نموذجا هاما لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في الأمراض الإنسانية المشتركة. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 16 جينات BBS، سبعة منها (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) رمز للبروتينات التي تشكل مجمع المعروفة باسم BBSome. وظيفة BBSome ينطوي على نشوء حيوي الغشاء الهدبي. ثلاثة جينات BBS إضافية (BBS6، BBS10، وBBS12) لديها تناظر لكتابة II chaperonins والتفاعل مع CCT / البروتينات TRIC وBBS7 لتشكيل مجمع يطلق عليه مجمع BBS-chaperonin. مطلوب هذا المجمع لBBSome التجمع. ولا يعرف الكثير عن هذه العملية وتنظيم تشكيل BBSome. استخدمنا الطفرات نقطة والأليلات فارغة من البروتينات BBS لتعطيل تجميع BBSome مما يؤدي إلى تراكم BBSome سيطة التجمع. التي تميز BBSome سيطة التجمع، وتبين لنا أن المجمع BBS-chaperonin يلعب دورا في الاستقرار BBS7. يتفاعل مع BBS7 BBS2 ويصبح جزءا من التجمع BBS7-BBS2-BBS9 المتوسطة ويشار إلى أن مجمع الأساسية BBSome لأنها تشكل جوهر BBSome. وأضاف BBS1، BBS5، BBS8، وأخيرا BBS4 حتى النخاع BBSome لتشكيل BBSome كاملة.
مقدمة

المجمعات الجزيئات، بما في ذلك الريبوسوم، و26 S proteasome و، مجمع المسام النووي، ومجمعات النقل intraflagellar، هي المسؤولة عن وظائف أساسية، مما أدى إلى اهتمام واسع في توصيف والعملية التي يتم تجميعها (1، 6 ). تنص على تجميع البروتين المعقد والمهم، إذا تقدير كما ينبغي وفي الوسائل التي يمكن أن خلايا تنظيم وظيفة. وعلاوة على ذلك، يمكن فهم أفضل التجمع بروتين معقد توفير نظرة ثاقبة الأمراض غير المتجانسة وراثيا وmultigenic ويحتمل أن توفر وسيلة جديدة للتعديل الدوائي من وظيفة، مما يؤدي إلى تصاميم دواء جديد.
الميزات عديد المظاهر من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) 4 بما في ذلك السمنة، تنكس الشبكية، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الإدراك، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري جعل BBS باعتبارها نموذجا جذابا لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في الأمراض المشتركة (7، 8). حتى الآن، وقد تم تحديد 16 جينات BBS المسببة لل(9). سبعة من البروتينات BBS (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) وقد ثبت أن تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome (10). وظيفة BBSome ينطوي على نشوء حيوي الغشاء الهدبي من خلال Rab8 GTPase الصغيرة والبروتين التفاعل لها، Rabin8. وBBSome أيضا يتفاعل وراثيا مع مسار النقل intraflagellar لتنظيم نقل الإشارة الصوتية القنفذ (11). BBSome مفارز تحتوي على مجالات معروفة للتوسط تفاعلات البروتين البروتين. على وجه التحديد، BBS1، BBS2، BBS7، وBBS9 احتواء المجالات المروحة بيتا. BBS4 وBBS8 يحتوي على عدة tetratricopeptide تكرار المجالات. وBBS5 يحتوي على اثنين من المجالات تناظر pleckstrin. BBS3 / ARL6 (ADP-ribosylation مثل عامل 6) هو عضو في الفصيلة رأس من البروتينات ملزم GTP صغيرة ومطلوب من أجل توطين الهدبية من BBSome (12، 15). BBS6، BBS10، وBBS12 دينا نوع II تناظر chaperonin (16، 19). وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS6، BBS12، وBBS7 التفاعل مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل المجمع الذي سنشير فيما بعد باسم مجمع BBS-chaperonin. مجمع BBS-chaperonin يسهل BBSome التجمع (20). ولا يعرف سوى القليل عن عملية متسلسلة من تشكيل BBSome، وتنظيم هذه العملية، أو الانتقال من BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى BBSome. في الجسم الحي، وتوجد البروتينات BBSome بوفرة في مجمع BBSome بدلا من كونها في شكل فردي أو ضمن المجمعات الحرة أصغر (10)، مما يوحي بأن BBSome سيطة التجمع عابرة وقصيرة الأجل.
فهم عملية BBSome التجمع قد تساعد في تحديد المكونات الجزيئية الجديدة، والطفرات التي تسبب إما أو تعديل الظواهر BBS. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فهم عملية تشكيل BBSome قد توفر معلومات عن وظيفة فرعية فردية، وبالتالي توفير رؤى جديدة بشأن BBSome وظيفة. وعلاوة على ذلك، فإن توصيف BBSome التجمع توفر المقايسات خلية مقرها فعالة لتقييم الطفرات نقطة المحددة في المرضى. وأخيرا، فإن فهم عملية BBSome التجمع قد يؤدي إلى علاجات جديدة للالظواهر ذات الصلة BBS BBS و.
كنا مناهج متعددة لتحديد BBSome سيطة التجمع بما في ذلك إدخال طفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS إلى الفردية البروتينات BBS، والاستفادة من الفئران خروج المغلوب، واستخدام رني ضد الجينات BBS لعرقلة تشكيل BBSome. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن overexpressed مفارز BBSome المحددة التي أسفرت عن تجميع وتراكم سيطة BBSome متميزة. التي تميز هذه الوسيطة، علينا أن نبرهن على BBSome التجمع هو عملية أمر ينطوي على البروتينات مثل chaperonin BBS (BBS6، BBS10، وBBS12) والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين.

إجراءات تجريبية

للحصول على وصف مفصل لمواد وأساليب، انظر "المواد والأساليب". التكميلية
السكروز التدرج تجزئة

تعطلت الأنسجة التي كتبها TISSUEMISER (فيشر) في المخزن تحلل (1- PBS، 0.5٪ تريتون X-100 مع مثبطات الأنزيم البروتيني). تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 20 دقيقة. تم تحميل supernatants على التدرج السكروز 20-60٪. تم طرد التدرج في 100،000 × ز لمدة 14 ساعة باستخدام الدوار TH-660 الحرارية العلمية (أشفيل، NC). أخذت اثنين من كسور مائة ميكروليتر من أعلى وعجلت عن طريق الأسيتون البارد. وقد نسج عينات المترسبة في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة. حلت الكريات في SDS-PAGE عينة العازلة.

البروتيني حساسية الفحص

وهي lysed الخلايا العازلة في الفحص (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 م م بوكل، 10 م م CaCl 2، 10٪ الجلسرين). كمية متساوية من البروتينات كانت مختلطة مع 200 ميكروغرام / مل thermolysin في 4 درجة مئوية لمدة الأوقات المحددة، وردود الفعل أوقفهم إضافة EDTA لتحقيق تركيز النهائي من 10 م م.

النتائج

BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج ترناري الجمعية المتوسطة

وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS7، التي هي جزء لا يتجزأ من BBSome، يتفاعل مع مجمع BBS-chaperonin (20). حقيقة أن جميع مكونات المجمع BBS-chaperonin هي بروتينات نوع chaperonin باستثناء BBS7 تشير إلى أن BBS7 قد تكون بمثابة ركيزة للمجمع BBS-chaperonin وأن يستقر من قبل المجمع. كيف يجعل BBS7 الانتقال من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع BBSome غير معروف حاليا. لمعالجة هذه المسألة، ونحن استخدام العديد من الطرق التي تؤدي إلى تراكم متميزة BBSome سيطة التجمع. وتتلخص الطفرات نقطة المستخدمة في هذه الدراسة في تكميلية الشكل. S1. عندما كنا بإفراط BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة T211I في الخلايا 293T، متحولة BBS7 T211I لديه قدرة انخفضت إلى التفاعل مع مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع WT BBS7 على النحو الذي يحدده المشترك مناعي باستخدام FLAG الأجسام المضادة. ومع ذلك، مناعي من BBS7 T211I يسحب إلى أسفل أكثر نسبيا BBS2 من البروتينات الأخرى BBSome (على سبيل المثال، BBS1 أو BBS4) (الشكل 1 أ)، مشيرا إلى أن هناك تفاعل ثنائي بين BBS7 T211I وBBS2 التي المحاصرين (لا تشرع في الخطوة التالية في التجمع).

الشكل 1.
BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية BBSome. و transfected BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة (T211I) وWT BBS7 إلى خلايا 293T. وتم سحب كلا WT وBBS7 متحولة بنسبة الخرز FLAG. تم الكشف عن وجود غيرها من مفارز BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. غياب BBS2 يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS1، في حين أن فقدان BBS1 لا يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS2. الموسومة FLAG BBS5، BBS8 ، و transfected BBS9، وBBIP10 إلى خلايا 293T. تم immunoprecipitated البروتينات الموسومة (IP) من خلال حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز أخرى BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. كان يستخدم BBS9 رني لاسقاط الذاتية التعبير BBS9 في خط الخلية مستقرة التعبير عن FLAG-BBS2. وimmunoprecipitated وBBSome التي كتبها حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية.

لقد أوقفنا بجوار أسفل BBS2 لتحديد تأثير ذلك على BBSome التجمع. ضربة قاضية من BBS2 يقلل من جمعية BBS7 مع BBS1، في حين أن ضربة قاضية من BBS1 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2 (الشكل 1 B). هذا يدل على أن BBS2 وBBS7 قادرين على التواصل مع كل أخرى مستقلة من BBS1. ويتم الحصول على نتائج مماثلة تظهر التفاعل مستقر من BBS2 مع BBS7 مع الأنسجة من الفئران الطافرة التي تعبر عن شكل متحولة من BBS1 مع أرجينين لطفرة في الحمض الأميني ميثيونين 390 (Bbs1 M390) (الشكل 2 C). هذه النتيجة مزيد من يدعم فكرة أن BBS7 بربط BBS2 مستقل ملزمة لBBS1 والبروتينات BBSome أخرى. وانسجاما مع هذه النتيجة، BBS7 يتفاعل بقوة مع BBS2 وضعيفة مع BBS1 في المقايسات التفاعل البشرى (التكميلي الشكل S2 A).

الشكل 2.
أدرج BBS1 في BBSome قبل BBS4. البقع الغربية من لست] البروتين من WT وBbs1 M390R / M390R الفئران تبين أن غياب BBS1 لا يؤثر على الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين، في حين أن انخفاض مستويات البروتين BBS1 إلى حد كبير في عينات من Bbs1 الفئران M390R / M390R كما هو مبين بالسهم. ويعترف هذا الضد أيضا عدة فرق إضافية لا تغيير في كثافة بالمقارنة بين WT وBbs1 M390R / M390R الفئران، مشيرا إلى أن هذه العصابات هي غير محددة. تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs1 M390R الخصيتين يوضح أن معظم BBS4 يتم فصلها عن وsubcomplex تتكون من BBS2، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9. مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2 من البروتين لست] الخصيتين يدل على أن BBS4 يتم فصلها من subcomplex في غياب BBS1. هذه النتائج مشابهة لتلك التي تظهر من خلال تحليل الانحدار السكروز. مناعي المتبادل من الخلايا 293T transfected يوضح أن BBS4 التفكك من BBS1 M390R يرجع إلى انخفاض التفاعل بين BBS1 M390R وBBS4 مقارنة مع WT BBS1. رسم بياني للترتيب تسلسلي لل BBS1 وBBS4 إدماجها في BBSome.

المقبل، ونحن overexpressed BBS9 الموسومة FLAG في الخلايا 293T وتستخدم BBS9 لهدم مفارز BBSome الذاتية. مناعي من خارجيا أعرب النتائج BBS9 في مناعي كميات كبيرة من BBS2 وBBS7، في حين يتم سحب كميات صغيرة فقط من BBS1 وBBS4 أسفل في ظل هذه الظروف (الشكل 1 C). هذه النتيجة تشير إلى أن BBS9 يشكل مجمع الثلاثي مع BBS2 وBBS7. لمزيد من الدعم وجود مجمع الثلاثي BBS2-BBS7-BBS9، فإننا نهدم BBS9 التعبير باستخدام رني. ضربة قاضية من BBS9 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2، مشيرا إلى أن التفاعل BBS7 / BBS2 لا يتوقف على BBS9. ومع ذلك، ضربة قاضية لBBS9 يقلل إلى حد كبير من جمعية BBS1، BBS4، وBBS8 مع BBS2 (الشكل 1 D).
وانسجاما مع هذه النتيجة، تشير الدراسات إلى التفاعل البشرى أن BBS2 يتفاعل مباشرة مع BBS7 وBBS9، في حين BBS7 وBBS9 لا تتفاعل مباشرة، بل تتفاعل إلا في وجود من BBS2 (التكميلي الشكل S2 B). نشير إلى مجمع الثلاثي يتكون من BBS2-BBS7-BBS9 كما المجمع الأساسية BBSome لأن هذا المجمع يبدو أن العنصر المركزي اللازمة لتشكيل BBSome كاملة.

BBS1 وBBS4 هل الوحدات الصغرى الطرفية من BBSome

وأظهرت دراساتنا التفاعل البشرى أن BBS9 يتفاعل مباشرة مع عدة وحدات فرعية BBSome بما في ذلك BBS2، BBS1، BBS5، وBBS8، وإنشاء BBS9 كما سقالة المركزية للBBSome (10). لتحديد الترابط الذي يتم إدراج مفارز BBSome أخرى في BBSome، ونحن استخدام الأنسجة من BBS فئرانا معدلة وراثيا ولدت في المختبر لدينا (21، 24). أظهر النشاف الغربي من أنسجة الخصية (الذي يعبر عن كميات كبيرة من البروتينات BBS) أن الفئران Bbs1 M390R / M390R انخفضت مستويات البروتين BBS1، ولكن الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين مماثلة لمستويات WT (الشكل 2 A). ويكشف تحليل الانحدار السكروز أن BBS1 M390R طفرة الزميلة عادة مع جميع البروتينات BBSome، باستثناء BBS4 (الشكل 2 B). ونأت معظم BBS4 من BBSome في Bbs1 M390R / M390R الأنسجة الماوس متحولة. لتأكيد هذه النتيجة، ونحن immunoprecipitated وBBSome الذاتية من Bbs1 M390R / M390R فئرانا معدلة وراثيا باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2. كما هو متوقع، BBS1 مفقود من مجمع جنبا إلى جنب مع BBS4 (الشكل 2 C).
للتأكد من أن BBS1 M390R البروتين الطافر يؤثر BBS4 إدماجها في BBSome، شاركنا transfected. Myc على الموسومة BBS1 مع الموسومة FLAG مفارز BBSome إلى خلايا 293T. BBS1 M390R البروتين الطافر قد تقلص إلى حد كبير التفاعل مع BBS4 (الشكل 2 D)، ولكن التفاعلات الطبيعية مع BBS9 وBBS2. معا، وهذه البيانات تشير إلى أن يتم تضمينها BBS1 في BBSome قبل BBS4 (الشكل 2 E). باستخدام نهج مماثل، علينا أن نظهر أن فقدان BBS4 لا يؤثر على إدماج مفارز BBSome الأخرى (بما في ذلك BBS1) في BBSome (الشكل A و B)، مشيرا إلى أن BBS4 هو الوحيدات الماضية لتضاف إلى BBSome (الشكل 3 C).

الشكل 3.
ومن المرجح BBS4 الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs4 - / - الخصيتين لست] يدل على أن جميع مفارز BBSome أخرى لا تزال تشكل تعقيدا في غياب BBS4 مناعي باستخدام المضادة. BBS2 الضد من البروتين لست] الخصيتين إلى أن BBS4 هو الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome. رسم بياني يبين ترتيب تسلسلي للBBS مكونات إدماجها في BBSome.

لتحديد ما إذا كان غياب البروتينات BBS أخرى يسمح جزئي BBSome التجمع، ونحن ترسيتها التعبير عن BBS5 وBBS8 باستخدام رني في الخلايا RPE1. بينت النتائج أن مفارز BBSome أخرى لا تزال تتضمن في BBSome في غياب BBS5، وكذلك في غياب BBS8 (25)، مشيرا إلى أن مثل BBS1، BBS5 وBBS8 تدرج بشكل مستقل في BBSome. وتتفق هذه النتائج مع البيانات التفاعل البشرى تبين أن BBS1، BBS5، BBS8، وBBS2 التفاعل مباشرة مع BBS9 (10).

BBS4 بربط PCM1 ويموضع لالجسيم المركزي / محيط بالمريكز الأقمار الصناعية المستقلة للBBSome الوحدات الصغرى أخرى

حقيقة أن BBS4 من بين مفارز الأخيرة لإدراجها في BBSome يضعه في موقف طيب للتفاعل مع البروتينات غير BBSome بما في ذلك الشحنات BBSome. وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBSome تنتقل من السيتوبلازم إلى محيط بالمريكز الأقمار الصناعية ثم إلى أهداب. BBS4 يموضع لالجسيم المركزي / الأقمار الصناعية محيط بالمريكز ويتفاعل مع محطة C من PCM1 (10، 26). أهمية وظيفية لهذا التفاعل ليست واضحة. لتحديد ما إذا كان يتعين على التفاعل BBS4-PCM1 لتوطين الجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز من BBS4، تم WT-الموسومة GFP وشكلين متحولة من BBS4 (BBS4 G277E وBBS4 R295P) بشكل مستقل شارك transfected مع جزء C-محطة HA الموسومة من PCM1. كل من الطفرات نقطتين تعطلت تفاعل BBS4 مع PCM1 (الشكل 4 A). عندما transfected في الخلايا RPE1 الإنسان، سواء BBS4 G277E وBBS4 R295P تفقد القدرة على توطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز (الشكل 4 B). وتشير هذه البيانات إلى أن التفاعل BBS4 PCM1 مطلوب للBBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية.

الشكل (4).
مطلوب تدخل BBS4-PCM1 لBBSome لتوطين لالجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز. BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل التفاعل بين BBS4 ومحطة C من PCM1. BBS4 (WT أو المسوخ) وHA الموسومة PCM1 C محطة و transfected المشارك في الخلايا 293T، وأجريت شارك في مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد HA وGFP الموسومة GFP. BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل جسيم مركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية BBS4. أظهرت هو تلطيخ مناعي من GFP-BBS4 (WT والمسوخ) في الخلايا RPE1 transfected. γ-تويولين يستخدم (الأحمر) كعلامة centrosomal. و transfected الخلايا الأولية الكلى مع GFP-BBS4، وكانت الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل شارك في ملطخة γ تويولين. يمثل شريط 10 ميكرون.

لتحديد ما إذا كان يلزم BBSome سليمة لBBS4 لتوطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز، ونحن transfected خلايا الكلى مثقف من BBS خروج المغلوب الفئران مع GFP-BBS4. غياب BBS2، BBS6، أو BBS7 لا يؤثر BBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية (الشكل 4 C)، مشيرا إلى أن هذا التعريب هو سمة أصيلة من BBS4 مجانا (يحدث مستقلة عن BBSome). لمزيد من تميز التفاعلات BBS4، رسمناها المجال BBS4 التي تتفاعل مع PCM1 إلى N-380 محطة الأحماض الأمينية (التكميلي الشكل S3 A). الأحماض الأمينية N-المحطة 380 من BBS4 لا تحتوي على المجال الذي يربط مع BBIP10، وهو بروتين BBSome لا يتجزأ يربط المجمع من خلال BBS4 (27). وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن PCM1 يمكن أن تتفاعل مع BBIP10 فقط عندما BBS4 موجود (التكميلي الشكل S3 B).

BBS10 ينظم تفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / TRIC البروتينات لتشكيل مجمع BBS-Chaperonin

كما ذكر سابقا، وأظهرت الدراسات أن BBS7 تشكيل مجمع مع BBS6، BBS12، وCCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin (20). حقيقة أن BBS7 هو العنصر غير chaperonin الوحيد في مجمع BBS-chaperoinin تشير إلى أن BBS7 قد يكون الركيزة لBBS-chaperonin. وظيفة واحدة ممكنة من مجمع BBS-chaperonin هو استقرار BBS7. ويرتبط BBS10 مع هذا المجمع عند مستويات substoichiometric (أقل من نسبة 1: 1). وتشير هذه النتيجة إلى أن BBS10 ليس العنصر الهيكلي للمجمع BBS-chaperonin بل يلعب دورا في تنظيم تشكيل تعقيدا. للتحقيق في دور BBS10 في تشكيل معقد BBS-chaperonin، ونحن استخدام رني لاسقاط BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والتي هي بمثابة أداة ملائمة لمناعي للمجمع BBS-chaperonin. غياب BBS10 يقلل من تفاعل BBS6 مع TCPα وTCPβ، وهما CCT / البروتينات TRIC (الشكل 5 A). وعلاوة على ذلك، overexpression من BBS10 يعزز التفاعل بين BBS6 مع TCPα وTCPβ (الشكل 5 B). وتبين هذه النتائج أن BBS10 ينظم تشكيل مجمع BBS-chaperonin.

الشكل 5.
مطلوب BBS10 للتفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin. يستخدم BBS10 رني لاسقاط التعبير عن BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والذي تم استخدامه لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7 وCCT / البروتينات TRIC للكشف عن وجود هذه البروتينات في المجمع. overexpression من BBS10 يسهل جمعية BBS6 مع CCT / البروتينات TRIC. وقد شارك في transfected-FLAG-BBS10 مع ناقلات فارغة أو Myc على-BBS6، وكان يستخدم Myc على الأجسام المضادة لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7، TCPα، وTCPβ (وحدتين فرعيتين من البروتينات CCT / TRIC) للكشف عن هذه البروتينات في المجمع. IP، مناعي.

الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-Chaperonin يتم التنسيق مع BBSome كور تشكيل مجمع

لا يحتوي على شكل ناضج من BBSome BBS6، BBS12، أو CCT / البروتينات TRIC، مما يوحي يجب فصل هذه المكونات chaperonin من سيطة التجمع عند نقطة معينة. لتحديد متى يتم الافراج عن هذه المكونات من وسيطة التجمع، ونحن overexpressed FLAG الموسومة BBS6 في الخلايا 293T وimmunoprecipitated مع FLAG الأجسام المضادة. كما هو متوقع، مكونات معقدة BBS-chaperonin أخرى، فضلا عن BBS7 الذاتية وشارك immunoprecipitated جنبا إلى جنب مع BBS6 (الشكل 6 A). بالإضافة إلى ذلك، سحبت BBS6 أسفل بعض BBS2. ومع ذلك، فإن كمية BBS2 انزلوا كانت بالنسبة إلى BBS7 أقل من مبالغ BBS2 وجدت في BBSome (كما هو موضح من قبل إنزال BBSome مع BBS5). هذا يدل على أن التفاعل بين BBS2 مع BBS7 يقترن مع الافراج عن BBS6 وBBS12 من مجمع BBS-chaperonin (التكميلي الشكل. S4).

الشكل 6.
ويتم تنسيق الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-chaperonin مع تشكيل معقد BBSome الأساسية. وقد overexpressed FLAG-BBS6 في الخلايا 239T إلى سيطة فخ BBSome. نحن انزلوا BBS6 باستخدام الخرز FLAG والكشف عن مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية. وقد استخدم FLAG-BBS5 كعنصر تحكم إيجابية، وكان يستخدم FLAG-GFP كما سلبي السيطرة. وoverexpressed مفارز BBSome الفردية في الخلايا 293T، وكانت تستخدم لتحديد جمعيات معينة مع CCT / البروتينات TRIC. BBS7 وBBS2 فقط قادرين على التواصل مع CCT البروتينات / TRIC. وقد استخدم FLAG-VHL كعنصر تحكم إيجابية. استخدمت FLAG-GFP وFLAG-BBS3 والضوابط السلبية. IP، مناعي.

التالي درسنا الافراج عن البروتينات CCT / TRIC من وسيطة التجمع. نحن overexpressed كل الوحيدات BBSome في الخلايا 293T وتحديد ما إذا كان أي الوحيدات BBSome يمكن immunoprecipitate أن التحويلات النقدية المشروطة / البروتينات TRIC. أظهر BBS2 وBBS7 المنسدلة قوية من CCT / البروتينات TRIC. أظهر BBS9 المنسدلة أقل نسبيا من البروتينات TRIC CCT / مقارنة مع BBS2 وBBS7 (الشكل 6 B). هذه النتيجة تشير إلى أن إدماج BBS9 لتشكيل يقترن مجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن BBS2 / BBS7 من CCT البروتينات / TRIC.

استقرار BBS2 يعتمد على تفاعله مع البروتينات الأخرى

لقد أثبتنا أن BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية (الشكل 1). لتحديد أهمية هذا المجمع، درسنا مستوى البروتين من BBS2 في غياب BBS7 وBBS9، وكذلك في حالة عدم وجود مجمع BBS-chaperonin. غياب BBS7 يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين في أنسجة الخصيتين BBS2 من Bbs7 - / - الفئران. وعلاوة على ذلك، فإن غياب BBS6 (أحد مكونات المجمع BBS-chaperonin) في Bbs6 - / - نتائج الفئران أيضا إلى انخفاض كميات BBS2 (الشكل 7. A). لأننا لم يكن لديك Bbs10 الفئران خروج المغلوب، نحن نستخدم الخلايا الليفية الجلد من مريض البشري الذي هو متماثل لطفرة BBS10 المشتركة، c91fs95. ومن المتوقع أن تؤدي هذه الطفرة في الغياب التام للبروتين BBS10. في دراستنا، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الإنسان، وغياب BBS10 لا يؤثر على تشكيل أهداب (التكميلي الشكل S5)، على النقيض من التقرير السابق (28). ومع ذلك، فإن غياب BBS10 يخفض مستويات بروتين BBS2 (الشكل 7 أ) ويمنع تشكيل BBSome (التكميلي الشكل. S6).

الشكل 7.
وubiquitinated BBS2 والمتدهورة التي proteasome و. استقرار BBS2 يعتمد على مجمع الأساسية BBSome، فضلا عن مجمع BBS-chaperonin. البروتينات من BBS خروج المغلوب الأنسجة الماوس (الخصية) أو من تم فصل لست] الخلية SDS-PAGE رني المعالجة. كان يستخدم لمكافحة BBS2 الأجسام المضادة للكشف عن مستويات البروتين BBS2. BBS2 حساس لالبروتيني العلاج. أصيب الكلى مع اتش معربا عن FLAG-BBS2 - الخلايا الأولية من WT وBbs6 - /. كانت مختلطة كميات متساوية من البروتين الكلي مع البروتيني thermolysin في 4 درجات مئوية للمرة المشار إليه. مقارنة مع خلايا WT، BBS2 يحط أسرع في Bbs6 - / - الخلايا، مما يشير إلى أن BBS2 غير مستقر في ظل غياب BBS6 خلايا 293T وعولج FLAG-BBS2 الخلايا معربا عن مستقرة، مع MG132 proteasome والمانع. وimmunoprecipitated BBS2 (IP) من خلال حبات FLAG أو مكافحة BBS2 الأجسام المضادة، وتم الكشف عن BBS2 ubiquitinated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. HA-بتحول وكان transfected في الخلايا 293T، وimmunoprecipitated BBS2 الذاتية من قبل مكافحة BBS2 الأجسام المضادة. تم الكشف عن BBS2 Ubiquitinated من قبل مكافحة HA الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. تم علاج الخلايا 293T مع 50 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد (فروج) مع أو بدون 20 μ م proteasome والمانع MG132 أو MG115 لمدة 8 ساعات. تم الكشف عن BBS2 الذاتية في الخلية لست] بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS2.

وبعد ذلك، كنا رني في الخلايا RPE1 للحد بشكل فردي التعبير عن BBS9 (BBSome عنصر معقد الأساسية)، BBS12 وTCPβ (مكونات معقدة BBS-chaperonin). تخفيض كل من هذه البروتينات يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين BBS2. في المقابل، فإن عدم وجود البروتينات BBSome العادي BBS4 أو BBS1 (باستخدام أنسجة من Bbs4 - / - وBbs1 M390R فئرانا معدلة وراثيا، على التوالي) لا تؤثر على مستويات البروتين BBS2 (الشكل 7. A). وتشير هذه البيانات إلى أن استقرار BBS2، وهو مكون من مجمع الأساسية BBSome، يتطلب مجمع BBS-chaperonin، فضلا عن العنصرين الآخرين من مجمع الأساسية BBSome (BBS7 وBBS9). وبالمثل، فإن استقرار BBS7 يتطلب مجمع BBS-chaperonin، وكذلك المكونات الأخرى اثنين من مجمع الأساسية BBSome (BBS2 وBBS9) (التكميلي الشكل S7).
لتحديد كيفية BBS-chaperonin الاستقرار التأثيرات المعقدة البروتين BBS2، ونحن المصابة Bbs6 - / - خلايا الكلى وخلايا الكلى WT مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. تم استخدام نفس تعدد العدوى لتصيب WT وBbs6 - / - خلايا الكلى، وكميات متساوية من البروتينات استخدمت في التحليل. مستوى البروتين BBS2 أقل في Bbs6 - / - الخلايا من الخلايا في WT (الشكل 7. B، 0 ')، بما يتفق مع الاستنتاج أن المجمع BBS-chaperonin مطلوب للBBS2 الاستقرار البروتين. البروتين BBS2 المتبقية في Bbs6 - / - الخلايا أكثر حساسية لالبروتيني thermolysin العلاج. عمر النصف من BBS2 في Bbs6 - / - الخلايا يتم تقليل ~3 أضعاف (4 دقيقة في خلايا WT مقابل 12 دقيقة في Bbs6 - / - الخلايا) (الشكل 7. B). ويتم الحصول على نتائج مشابهة عندما وإعادة تقديم FLAG-BBS2 إلى Bbs7 - / - خلايا الكلى (التكميلي الشكل S7.). وتشير هذه البيانات إلى أن مجمع BBS-chaperonin وBBS7 تلعب دورا في استقرار BBS2.

واليوبيكويتين-proteasome والمسار تشارك في BBS2 تدهور

للتحقيق في الآلية التي تتحلل BBS2 في الخلايا، درسنا ما إذا كان ينطوي على مسار بتحول-proteasome وفي هذه العملية. وubiquitinated كلا BBS2 أعرب خارجيا وأعرب عن التطور الطبيعي عند تحول دون proteasome والتي MG132 (الشكل 7 C). علينا أن نبرهن أيضا أن BBS2 الذاتية وubiquitinated حتى من دون تثبيط proteasome وعندما كنا overexpressed HA-بتحول في الخلايا 293T (الشكل 7 D). أسفرت علاج الخلايا 293T مع تخليق البروتين المانع سيكلوهيكسيميد في انخفاض مستويات البروتين BBS2. وزاد انخفاض مستويات البروتين BBS2 في الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد عندما يتم التعامل مع الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد أيضا مع مثبطات proteasome وMG132 أو MG115 (الشكل 7 E). وتبين هذه النتائج أن BBS2 الحرة وubiquitinated وتدهورت قبل proteasome و.

BBSome الجمعية نموذج

واستنادا إلى البيانات الواردة أعلاه، نقترح نموذجا فيه أشكال BBSome في عملية متسلسلة أمر يساعده على حد سواء الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات BBSome، فضلا عن عدم BBSome-تشبه chaperonin البروتينات BBS (BBS6، BBS10 وBBS12) (الشكل 8). يتفاعل مجمع BBS-chaperonin مع BBS7 لتحقيق الاستقرار فيه. التحولات BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع الأساسية BBSome، وهو مجمع يتألف من BBS7-BBS2-BBS9. ويرافق تشكيل مجمع الأساسية BBSome عن طريق إزالة مجمع BBS-chaperonin. الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين تعزيز إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يضاف BBS4 لاستكمال BBSome، وهي خطوة تتطلب وجود BBS1. مطلوب مجمع BBS-chaperonin لاستقرار الفرد من BBS2 وBBS7 البروتينات قبل هذه البروتينات المشاركة مع BBS9 لتشكيل مجمع الأساسية BBSome.

الشكل 8.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وchaperonin بوساطة التجمع متتابعة من BBSome. المعروضة هي المخططات من النموذج الحالي من أجل BBSome التجمع. واستقرت BBS7 من قبل BBS-chaperonin معقدة (BBS6-BBS12-BBS7-CCT) ويجعل الانتقال إلى مجمع الأساسية BBSome (BBS7-BBS2-BBS9). يتطلب هذا التحول BBS10. والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين توجه إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يتطلب BBS4 BBS1 على أن تدرج في المجمع وغير الوحيدات مشاركة تضاف إلى المجمع.

نقاش

ارتفاع معدل انتشار السمنة، ومرض السكري، وتنكس الشبكية في عموم السكان يجعل دراسة BBS ذات الصلة سريريا تتجاوز تلك مع هذه المتلازمة نادرة نسبيا. في الواقع، وقد ارتبطت متغيرات جينية BBS مع كل من الطفولة وتعليم الكبار السمنة مشتركة في عدد السكان واحد على الأقل (29). وعلاوة على ذلك فهم الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية من BBS سوف توفر معلومات مفيدة تتعلق هذه الاضطرابات شيوعا. على الأقل مجموعة فرعية من وظائف فردية البروتينات BBS تعتمد على تشكيل BBSome، وهو مجمع متعدد فرعية مستقرة تتكون من BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، BBS9، وBBIP10، وهو بروتين الذي الطفرات لم يتم بعد المتورطين في المرض. وقد تركزت الدراسات السابقة وظيفة BBSome على تحديد البروتينات أو الشحنات التي تتفاعل مع BBSome (14، 15، 26، 30، 32). هنا، نحن نقترب من الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية من BBS من وجهة نظر الجمعية BBSome. دراستنا يربط مباشرة مجمع BBS-chaperonin (تتألف من BBS6، BBS12، BBS7، وCCT / البروتينات TRIC) إلى BBSome، مجمعين تم تحديدها من خلال تحليل الكيمياء الحيوية.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وChaperonin مثل دليل BBS البروتينات أمر الجمعية BBSome

بشكل عام، والتجمع بروتين كبير المعقد هو عملية أمرت، عادة ما تتطلب خطوات وسيطة متعددة (1، 5).غالبا ما يكون من الصعب تحديد طبيعة وسيطة التجمع بسبب طبيعتها العابرة ونصف الحياة قصيرة. يمكن ترتيب تجميع محدد من مجمعات البروتين يحتمل أن تلعب دورا هاما في تحديد طبيعة الظواهر الناتجة عن الطفرات في مكونات المجمع. في بعض الحالات، يمكن أن تحور في بروتين واحد من مجمع يؤدي إلى تراكم من تجميع وسيطة أن يحافظ على وظيفة متبقية أو مكسب من وظيفة، في حين أن النظام المختلفة التكوين يمكن أن يؤدي إلى انعدام تام التجمع وخسارة كاملة وظيفة.
في هذه الدراسة، طبقنا النهج وموارد متعددة لتوصيف BBSome سيطة التجمع. الطفرات نقطة في بروتينات معينة BBS، والطفرات فارغة تفتقر تماما بعض البروتينات BBS، والتدخل RNA للحد من مستويات البروتين BBS، وكذلك overexpression من مفارز BBSome محددة تؤدي إلى تراكم الخلايا من التجمع سيطة متميزة. وأملت الجمعية من BBSome من قبل الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات وBBSome ويسترشد أيضا من البروتينات BBS مثل chaperonin-BBS6، BBS10، وBBS12. التحليل البنيوي يكشف أن BBS1، BBS2، BBS7، وBBS9 احتواء المجالات المروحة بيتا، BBS4 وBBS8 يحتوي على عدة tetratricopeptide تكرار المجالات، وBBS5 اثنين من المجالات تناظر pleckstrin. هذه المجالات التوسط عادة تفاعلات البروتين البروتين. وأظهرت البشرى المقايسات المشترك مناعي أن BBS7 يتفاعل مع BBS2 وأن BBS9 يتفاعل مع BBS1، BBS2، BBS5، وBBS8. وقد تبين BBS1 للتفاعل مع BBS2 وBBS4. عملية التجميع BBSome تعكس هذه التفاعلات البروتين البروتين. البروتينات BBS مثل chaperonin (BBS6، BBS10، وBBS12) ضرورية في بدء الخطوة الأولى لتشكيل BBSome من خلال تشكيل مجمع BBS-chaperonin لتحقيق الاستقرار BBS7.

BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج BBSome الأساسية مجمع

لدينا حددت الدراسة BBS2-BBS7-BBS9 بمثابة مجمع المتوسطة هاما في تجميع BBSome ناضجة. ويتم تنسيق تشكيل هذا المجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن مجمع BBS-chaperonin من BBS7. تظهر وظيفة واحدة من هذا المجمع BBS-chaperonin أن يكون لتحقيق الاستقرار BBS7 قبل ارتباطه BBS2 وBBS9. غياب BBS2، BBS7، BBS9، أو أي من مكونات معقدة BBS-chaperonin يقلل من مستويات BBS2 وBBS7، في حين أن غياب أو تحور BBS1 أو BBS4 له تأثير ضئيل على BBS2 وBBS7 الاستقرار البروتين. تتحلل BBS2 المجاني من مسار بتحول-proteasome و. يغاز بتحول لBBS2 غير معروف حاليا.
BBS11 / TRIM32 هو يغاز E3 لعدة بروتينات بما في ذلك الأكتين وdysbindin (33، 34). طفرة معينة من P130S في عائلة واحدة تسبب الظواهر BBS (35). ومن المثير للاهتمام أن يتكهن بأن يغاز E3 المفترض لBBS2 قد يكون BBS11 / TRIM32.

تنظيم BBSome وظيفة

هناك العديد من الآليات المحتملة التي يمكن أن تحدث في تنظيم وظيفة BBSome. أحد الاحتمالات هو أن يحدث التنظيم بعد تجميعها BBSome تماما، وحركة BBSome في المقصورة، وظيفية الخلوية (أي ينظم، أهداب). سواء كانت إيجابية (RAB8) والسلبية interactors (LZTFL1) BBSome وقد تم تحديد (10، 25). ومع ذلك، وتنظيم التجمع هو أيضا احتمال وارد. وبناء على دراستنا، فإن تنظيم التجمع الأرجح أن يحدث على مستوى تشكيل مجمع BBS-chaperonin، على مستوى تشكيل مجمع الأساسية BBSome، و / أو على مستوى الإفراج BBS6، BBS12، والبروتينات CCT / TRIC من BBS7. ومن المرجح BBS10 عنصر تنظيمي رئيسي للمجمع BBS-chaperonin.

أهمية الفسيولوجية والسريرية BBSome الوسطيات: دور للBBSome الوسطيات الجمعية في BBS النمط الظاهري التغير

في ظل ظروف طبيعية، يبدو أن هناك بركة مجانية محدودة من مفارز BBSome الفردية مع الغالبية العظمى من مفارز يجري في BBSome الأشكال المعقدة. ومع ذلك، BBSome سيطة التجمع مثل مجمع الأساسية BBSome قد تشكل في ظروف مثل تلك التي تحدث عند وجود خالية أو نقطة طفرات معينة في المرضى الذين يعانون BBS. الظواهر من BBS تتفاوت تفاوتا كبيرا بين العائلات المختلفة وحتى داخل أفراد من نفس العائلة (الأفراد بنفس طفرة معينة) (36، -، 38). وتشير هذه الملاحظات إمكانية المعدلات الوراثية. يمكن أن يحدث تعديل النمط الظاهري عندما متغير متخالف في جين واحد يؤثر على مظهر المظهري من الجين المسبب للمرض آخر. لأن بعض الطفرات قد يؤدي إلى تراكم التجمع مستقر وسيطة، وجود وسيطة قد يفسر بعض الاختلافات المظهرية لوحظ بين مختلف طفرات الجينات BBS. مثال واحد للاهتمام هو النمط الظاهري ارتفاع ضغط الدم الذي يتجلى في Bbs4 - / - الفئران، في حين Bbs2 - / - الفئران ليس لديها ارتفاع ضغط الدم (39، 40). وعلاوة على ذلك، كما تم الإبلاغ عن الاختلافات الفسيولوجية بين المرضى BBS البشرية التي تسببها طفرات في الجينات BBS متميزة (37). والآلية التي قد تحدث هذا يتطلب مزيدا من التحقيق.
توضيح من الطريقة التدريجية التي يتم تشكيل BBSome يوحي بإمكانية نوع معين أشكال خلية من BBSome. وبعبارة أخرى، فإن حقيقة أن بعض البروتينات BBSome (على سبيل المثال، BBS1، BBS5، وBBS8) تضاف بشكل مستقل لمجمع المتوسطة مستقر يسمح لاحتمال أن BBSome التجانس موجود وأن أشكال غير متجانسة من BBSome قد يكون الأدوار الوظيفية في أنسجة معينة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #16  
قديم 11-23-2015, 09:18 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome وغيابها في الفئران النتائج في بارديه-بيدل الظواهر متلازمة وتشوهات انتقائية في غشاء الاتجار البروتين

 

http://jcs.biologists.org/content/126/11/2372.full



بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو اضطراب عديد المظاهر ومتخالف وراثيا تسبب بشكل مستقل من قبل العديد من الجينات (BBS1-BBS17). سبعة البروتينات BBS الحفظ جدا (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome، التي تعمل في نشوء حيوي الغشاء الهدبي. BBS7 على حد سواء وحدة فرعية فريدة من BBSome ويعرض التفاعل المادي المباشر مع BBS الثاني معقد، مجمع chaperonin BBS. لفحص وظيفة في الجسم الحي من BBS7، ولدت لنا Bbs7 الفئران خروج المغلوب Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لغيرها من الجينات BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، والسمنة، ventriculomegaly والعقم عند الذكور تتميز الشاذ axonemes الحيوانات المنوية سوطي. باستخدام أنسجة من Bbs7 - / - الفئران، وتبين لنا أن BBS7 مطلوب لتشكيل BBSome، وأن BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. على الرغم من أن BBSome بمثابة مجمع معطف للبروتينات الغشاء الهدبي، غير مطلوب BBS7 لتوطين بروتينات الغشاء الهدبي polycystin-1، مستقبلات polycystin-2، أو الطعم المر، ولكن غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات إلى الغشاء الهدبي، مشيرا إلى أن BBS7 تشارك في توطين محددة بروتين الغشاء لأهداب.
مقدمة

أهداب هي الهياكل القائمة على أنيبيب التي تمتد من سطح الخلية لمعظم خلايا حقيقية النواة. أنها تحتوي على مكونات فريدة غشاء الخلية منفصلة عن الغشاء البلازمي، وتصنف على أنها إما أهداب متحركة أو الأساسي (immotile). أهداب تلعب دورا مهما أثناء التطور وعلم وظائف الأعضاء في أنسجة البالغين. عيوب أهداب تؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان ciliopathies يطلق التي تشمل dyskinesis الأساسي الهدبي، مرض الكلى المتعدد الكيسات، سحاف الكلية، جوبير syndome، متلازمة العليا-لوكن، متلازمة ميكل-جروبر، ORO-الوجه الرقمية متلازمة، متلازمة Alstrom، وBardet- متلازمة بيدل (BBS).
BBS هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، والتشوهات الكلى، والإعاقة ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك العيوب الثانوية بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم التعلم. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 17 جينات BBS أن يسبب اضطراب مستقل (عبد الستار وجليسون، 2011). على الرغم من أن الوظائف الخلوية من البروتينات BBS لا تزال غير مفهومة تماما، وقد كشفت الدراسات الوظيفية في الكائنات نموذج التي تشارك البروتينات BBS في وظائف الهدبية والنقل داخل الخلايا. في ايليجانس انواع معينة، يتم التعبير عن BBS الجينات في الخلايا العصبية المهدبة وتوطين للقاعدة الهدبية / المنطقة الانتقالية والمشاركة في IFT على طول الهدبية الخيط المحوري. bbs7 وbbs8 متحولة C. ايليجانس خطوط لها صبغة ملء العيوب، أهداب أقصر، وعيوب في النقل intraflagellar (IFT) (Blacque وآخرون، 2004). ضربة قاضية للتعبير عن BBS الجينات في نتائج الزرد في العيوب الحويصلة كوبفر، وفقدان أهداب سابقة لأوانها، وجسيم ميلانيني الوراء تأخير النقل (الين وآخرون، 2006). BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص انحطاط والسمنة الظواهر الشبكية ينظر في المرضى الذين يعانون BBS. وبالإضافة إلى ذلك، ذكر BBS فئرانا معدلة وراثيا تفتقر سياط الحيوانات المنوية (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛ Mykytyn وآخرون، 2004.؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). وتشير الدراسات البيوكيميائية أن سبعة من البروتينات BBS المعروفة (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) تشكيل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome (Nachury وآخرون، 2007). البروتينات BBS الأخرى بما في ذلك BBS6، BBS10، وBBS12 تشكل المجمع الذي ينظم BBSome التجمع (سيو وآخرون، 2010). واحدة من وظائف BBSome هو تعزيز أهداب نشوء حيوي الغشاء من خلال Rab8 GTPase الصغيرة وبمثابة مجمع معطف للاتجار الهدبية بروتين الغشاء (جين وآخرون، 2010.؛ Nachury وآخرون، 2007.).
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص معظم الظواهر BBS، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. على سبيل المثال، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران هي ارتفاع ضغط الدم، في حين Bbs2 - / - الفئران هي سوي ضغط الدم (رحموني وآخرون، 2008. Bbs3) - / - الفئران لها hydocephalus أكثر حدة وأقل بدينة من غيرها من الفئران BBS (تشانغ وآخرون، 2011). بما يتفق مع الدراسات الماوس، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر على حد سواء. وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011.؛. Kulaga وآخرون، 2004)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، الجينات BBS المختلفة قد تمتلك ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هي فريدة من نوعها من حيث أنه هو وحدة فرعية من BBSome ويتفاعل مباشرة مع جسديا مجمع chaperonin BBS. من أجل دراسة دور BBS7 في الجسم الحي، وتحديد ما إذا كان فقدان Bbs7 لديه أي الظواهر الفريدة المرتبطة بها، ولدت لنا Bbs7 بالضربة القاضية الفئران Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في آخر BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، وعدم من سياط الحيوانات المنوية، والسمنة، وventriculomegaly. علينا أن نبرهن على BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين وما هو مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. والجدير بالذكر، وتبين لنا أن BBSome غير مطلوب للعالمي توطين الهدبية بروتين الغشاء. ومع ذلك، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

النتائج

جيل من الفئران Bbs7 باطل

BBS7 هي فريدة من نوعها بين البروتينات BBS لأنه جزء لا يتجزأ من BBSome ومكون من مجمع chaperonin BBS. للتحقيق في وظيفة في الجسم الحي من الجين Bbs7، ولدت لنا Bbs7 الفئران بالضربة القاضية جين عن طريق استبدال اكسون 5 مع كاسيت بالنيوميسين. هذا يؤدي إلى انزياح الإطار مما أدى إلى Bbs7 أليل فارغة (المواد التكميلية الشكل S1A). تم التحقق من عدم وجود Bbs7 مرنا من خلال تحليل RT-PCR RNA باستخدام معزولة عن Bbs7 - / - الخصيتين الماوس مع الاشعال داخل اكسون 5 (المواد التكميلية الشكل S1B.). وأكد عدم وجود بروتين BBS7 قبل الغرب النشاف (المواد التكميلية الشكل S1C).
أدى التزاوج من الزيجوت Bbs7 +/- 26٪ في Bbs7 + / + الفئران، و 55٪ الفئران Bbs7 +/-، و 19٪ Bbs7 - / - الفئران = 387؛ P <0.05). تردد انخفضت من Bbs7 - / - وقد لوحظ في ذرية أخرى فئرانا معدلة وراثيا BBS وتشير إلى أن بعض Bbs7 - / - الفئران توفي قبل الولادة أو فترة ما حول الولادة.

Bbs7 - / - الفئران تصبح بدينة، تفتقر الخراجات الكلى ولا تتطور polydactyly

Bbs7 - / - الفئران هي الضعفاء عند الولادة، تزن أقل من تتزاحم بهم في 3 أسابيع من العمر، وسمنة على مر الزمن. بعد الفطام، Bbs7 - / - الفئران تبدأ في كسب المزيد من الوزن من النوع البري الفئران بسبب زيادة الاستهلاك الغذائي. قبل 12 أسبوعا من العمر، Bbs7 - / - الفئران (ذكورا وإناثا) تزن أكثر بكثير من تتزاحم سيطرتها، والخلافات أصبحت أكبر في الحيوانات الأكبر سنا. قبل 7 أشهر، من النوع البري الفئران هي 28.7 ± 2.8 جم مقابل Bbs7 - / - 41.1 ± 3.25 غ (P <0.05).
على الرغم من شذوذ الكلوي وpolydactyly هي السمات الأساسية للالظواهر BBS في البشر، ونحن لم نلاحظ الكيسات الكلوية أو polydactyly من الأطراف الأمامية أو hindlimbs في فئرانا معدلة وراثيا Bbs7، مما يشير إلى اختلاف الأنواع أو الاختلافات عتبة بين الماوس والبشرية.

Bbs7 - / - الفئران تبدي تنكس الشبكية وventriculomegaly

التحليل النسيجي للBbs7 العمر 4-8 شهرا - / - تظاهر عيون انحطاط كبير من القطاعات الداخلية والخارجية للخلايا مستقبلة للضوء وطبقة النووية الخارجي (الشكل 1A، B.). وقد لوحظ Ventriculomegaly في البطينات الجانبية والثالث من الدماغ كما رأينا في أقسام الاكليلية من Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - الفئران (الشكل 1C-F.). نحن أيضا لوحظ تخفيف من القشرة المخية وانخفاض في حجم الحصين والجسم المخطط. لم يلاحظ أي تشوهات جسيمة في المخيخ في Bbs7 فئرانا معدلة وراثيا أو غيرها من فئرانا معدلة وراثيا BBS (المواد التكميلية الشكل S2).

تين. 1.
Bbs7 - / -. ملطخة E-عرض الفئران مبصرة فقدان الخلية وventriculomegaly (A، B) H & القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - (B) عيون تظهر فقدان مبصرة الداخلي وشرائح الخارجي فضلا عن انحطاط الطبقة النووية الخارجي. PC، خلايا مستقبلة للضوء. (C-F) محايد الحمراء الملطخة 60-100 ميكرون سميكة أقسام الدماغ الاكليلية من النوع البري (C، E) وBbs7 - / - الفئران (D، F) تظهر البطينات الجانبية الموسع (*)، والظهرية الموسع البطين الثالث (رأس السهم العلوي والسفلي)، وانخفاض المخطط الإحضار (S) وقرن آمون (H)، وترقق القشرة المخية (CC). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 1 مم (C-F).

Bbs7 - / - الفئران لديها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ

منذ BBS هو مرض له علاقة أهداب، درسنا أهداب متحركة وأهداب الابتدائي في Bbs7 - / - الفئران. درسنا أهداب متحركة من طبقة الخلايا البطانة العصبية المبطنة للالبطينين عن طريق تلطيخ أقسام الاكليلية من العمر 3 اشهر من النوع البري وBbs7 - / - أدمغة فئران مع-α تويولين الضد ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة لمكافحة الأسيتيل كعلامات أهداب . مقارنة مع الضوابط، Bbs7 - / - أظهرت الفئران عددا كبيرا من أهداب انخفاض خلية بطانية عصبية وأهداب المتبقية هي أقصر (الشكل 2A، B).

تين. 2.
Bbs7 - / - الفئران لها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ (A، B) كشفت تلطيخ مناعي من البطين الدماغ خلايا البطانة العصبية باستخدام المضادة للالأسيتيل α تويولين (الخضراء) ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة (أحمر) عدم وجود أهداب وأهداب قصيرة (السهم) في طبقة البطانة العصبية من Bbs7 - / - الفئران (A) مقارنة مع من النوع البري الضوابط (B). (C، D) تحليل TEM من المقطع الطولي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر القصير وانتفخ أهداب مع حويصلات في Bbs7 من العمر 3 اسابيع - / - الفئران (D) مقارنة مع عمرها 3 أسابيع تحكم من النوع البري (C). (E-G) تحليل TEM من المقطع العرضي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر هيكل axonemal غير طبيعي في Bbs7 - / - الفئران (F، G) مقارنة مع السيطرة البرية من نوع (E). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 0.2 ميكرون (C-G).

لمزيد من التحليل أهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ، أجرينا تحليل TEM من العمر 3 اسابيع من النوع البري وBbs7 - أدمغة الفئران - /. أهداب متحركة من Bbs7 - / - الدماغ طبقة البطانة العصبية لديها القصير، انتفخ أهداب مع حويصلات (الشكل 2C، D.) وتلك أهداب متحركة أيضا هياكل axonemal المعيبة (الشكل 2F، G.) بالمقارنة مع النوع البري الضوابط (الشكل. 2E). وتشير هذه الدراسات إلى أن غياب البروتين BBS7 يؤثر هياكل أهداب متحركة.
لدراسة أهداب الأساسي في الجسم الحي، ونحن ملطخة أقسام الأنسجة من الكلى والبنكرياس مع الأسيتيل α تويولين. لم نجد اختلافات في أرقام أهداب الأولية أو طول أهداب بين النوع البري وBbs7 - / - الفئران (المواد التكميلية الشكل S3.). كما شكلت أهداب الابتدائي وتظهر طبيعي في الخلايا المستزرعة الظهارية الكلى والخلايا الليفية الجنينية مثقف (MEF) المستمدة من Bbs7 - / - الفئران (. المواد التكميلية الشكل S3 والبيانات لا تظهر)، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية أن يكونوا قد يكون خفية العيوب الهيكلية، مثل التغييرات بعد التعديل في الأنابيب الدقيقة.

Bbs7 - / - الفئران يكون غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية

أثبتنا سابقا لعدم وجود الحيوانات المنوية الأسواط في Bbs1 M390R / M390R knockin، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛. Mykytyn وآخرون، 2004؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - كشفت الخصيتين ندرة الحيوانات المنوية سياط (الشكل 3A، B.). نحن صقلها على هذه الملاحظة عن طريق تلوين المناعي من أنسجة الخصيتين. في حين أن معظم الحيوانات المنوية من Bbs7 - / - الفئران تفتقر إلى ذيل سوطي، وبعض من الحيوانات المنوية لديهم سياط تالف. هذه الأسواط غير طبيعي في كثير من الأحيان تشكيل هيكل حلقة نوع (الشكل 3C-F). لدراسة هذه الآفة تالف في مزيد من التفاصيل، أجزاء من النوع البري وBbs7 - / - تم تحليل الخصيتين بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). الهياكل microtubular والألياف الكثيفة الخارجية المحيطة هيكل microtubular في قطعة الرئيسي غير منظمة إلى حد كبير في المسوخ (الشكل الجيل الثالث 3G، H). في بعض الأحيان لاحظنا العادية 9 + 2 الهياكل axonemal في Bbs7 - / - الفئران (8،8٪ مقابل 100٪ في البرية من نوع، P <0.01). في المقابل، فإن الهياكل axonemal من أهداب متحركة في القصبة الهوائية من Bbs7 - / - الفئران طبيعية إلى حد كبير عن طريق تحليل TEM (المواد التكميلية الشكل S4.).

تين. 3.
Bbs7 - / - الفئران لها غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية (A، B) H & E الملون القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - أظهرت (B) الأنابيب المنوية عدم وجود الحيوانات المنوية سياط. أظهر (C-F) مناعي تلطيخ الخصيتين سياط باستخدام المضادة للالأسيتيل-α تويولين تلطيخ عيوب في Bbs7 - / - الفئران. في كثير من الأحيان ولوحظ وجود نوع من عصابة هيكل أنيبيب في Bbs7 - / - الفئران. C و D الصور وانخفاض القوة، E و F هي صور عالية الطاقة. (G، H) تحليل TEM من المقطع العرضي البرية من نوع (G) وBbs7 - / - (H) الحيوانات المنوية سياط يكشف أن Bbs7 - / - سياط الحيوانات المنوية لا يكون نموذجي 9 + 2 axonemes، ولكن تظهر الهياكل أنيبيب غير منظمة (السهم) والألياف الكثيفة الخارجي (رأس السهم) المحيطة الهياكل microtubular. أشرطة النطاق: 100 ميكرون (A، B)؛ 50 ميكرون (C، D)؛ 20 </ emph> ميكرون (E، F)؛ 0.1 ميكرون (G، H).

مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome

منذ Bbs7 - / - الفئران لها الظواهر مماثلة لغيرها من BBSome الفئران فرعية خروج المغلوب وBBS7 هو وحدة فرعية من BBSome، ونحن التحقيق آثار خسارتها على تشكيل BBSome. والمثير للدهشة، وكانت مستويات البروتين BBS2 بشكل ملحوظ انخفضت في Bbs7 - / - الخصيتين لست] البروتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين. وبالمثل، فقد انخفضت مستويات البروتين BBS7 في Bbs2 - / - الخصيتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين (الشكل 4A.). لتحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى تدهور البروتين أو انخفضت النسخ، كنا نصف الكمية RT-PCR لتقييم Bbs2 وBbs7 مرنا مستويات التعبير. نحن لم تراع الفوارق التعبير عن Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الخصيتين أو الاختلافات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الخصيتين مقارنة مع الضوابط (الشكل 4B.). معا هذه النتائج تشير إلى أن BBS2 وBBS7 الخلافات مستوى البروتين تنتج عن الاختلافات في استقرار البروتين، والتي BBS2 وBBS7 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار.

تين. 4.
مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. (A) BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. أظهرت هي البقع الغربية من إجمالي لست] البروتين من النوع البري (WT)، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs7 - / - الخصيتين. ويظهر تحليل (B) RT-PCR أي تغييرات واضحة في مستويات Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الفئران ولا تغييرات في مستويات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الفئران. (C) وBBSome لا تشكل في BBS الخصيتين الماوس خروج المغلوب. أظهرت هي البقع الغربية من البروتينات الخصيتين immunoprecipitated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS1. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome أخرى مع الأجسام المضادة ضد مفارز BBSome الفردية. واستخدمت كميات متساوية من البروتين الأولي من الخصيتين lystaes للمناعي. (D) تحليل الانحدار السكروز من البروتين لست] الخصيتين تثبت أنه لا يوجد أشكال BBSome في غياب BBS7. (E) فقدان تشكيل BBSome في خلايا الكلى مثقف من BBS الفئران خروج المغلوب وBBS2 انقاذ BBSome تشكيل في Bbs2 - خلايا الكلى - /. أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من مختلف الفئران خروج المغلوب BBS المصابين اتش معربا عن FLAG-BBS2. وهي lysed الخلايا المصابة وتم سحب البروتينات أعرب بنسبة مكافحة FLAG الأجسام المضادة. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة الغربية. (F) FLAG-BBS7 (WT والمسوخ) كانت المشترك مع transfected BBS2 الموسومة MYC إلى خلايا 293T والتفاعل بين BBS7 وBBS2 كان يعاير من قبل المشارك مناعي وكميا بواسطة يماغيج. و transfected (G) FLAG-BBS7 (WT وH323R طفرة) في الخلايا 293T وتم سحب البروتينات transfected أسفل عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. تم تحديد وجود مفارز BBSome الذاتية من قبل، BBS2، BBS4 وBBS7 الأجسام المضادة BBS1 المضادة. وتم قياس كمية مبالغ BBS1، BBS2، BBS4 وBBS7 التي كتبها يماغيج.

ترابط BBS2 وBBS7 للاستقرار البروتين يتسق مع النتائج تبين أن BBS2 يتفاعل جسديا مع BBS7 ويشكل subcomplex (Nachury وآخرون، 2007). ومن المثير للاهتمام، BBS7 وBBS2 مشاركة ملفوف لفائف تناظر تسلسل المجال في المناطق الوسطى من (المواد التكميلية الشكل S5). لم يكن مطلوبا من BBS7 ملفوف لفائف مجال للربط إلى BBS2. بدلا من ذلك، يطلب من الأحماض الأمينية 200-C النهائي للBBS7 للربط إلى BBS2 (المواد التكميلية الشكل S5A). وبالمثل، المجال ملفوف لفائف من BBS2 غير مطلوب على الاطلاق للتفاعل مع BBS7، ولكن فقدان هذا المجال يقلل من التفاعل مع BBS7 (المواد التكميلية الشكل S5B). وعلاوة على ذلك، فإن حذف المنطقة ملفوف لفائف في BBS7 لا يعطل تفاعلها مع غيرها من الوحدات الفرعية BBSome الذاتية. البروتين BBS2 مع حذف المنطقة ملفوف لفائف يعطل التفاعل مع بعض مفارز BBSome الذاتية (BBS7) مع الحفاظ على القدرة على التفاعل مع مفارز BBSome أخرى (BBS1 وBBS9) (المواد التكميلية الشكل S5C).
لدراسة تشكيل BBSome في غياب BBS7، أجرينا مناعي مع الأجسام المضادة ضد BBS1، واحدة من مفارز من BBSome. وقد انخفض وجود مفارز BBSome أخرى في BBS1 سحب هبوطا أو غير قابلة للكشف في غياب BBS7 أو BBS2 كما يتبين من لطخة غربية. هذا يدل على أن BBSome سليمة غير مشكلة في غياب BBS7 (الشكل 4C). أكدنا أيضا هذه النتائج عن طريق تحليل الانحدار السكروز من إجمالي لست] البروتين من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين (الشكل 4D).
للتحقيق في ما إذا كان شرط من BBS7 لتشكيل BBSome هي فريدة من نوعها لأنسجة الخصيتين، ونحن عزل الكلى الخلايا الظهارية الأولية من كلا من النوع البري وBbs7 - / - الفئران وإصابة الخلايا المستزرعة مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. نحن انزلوا العلم BBS2 والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية باستخدام أجسام مضادة لمكافحة BBS (الشكل 4E). وجدنا أن في غياب البروتين BBS7، ويتم تشكيل أي BBSome كامل (ناقص BBS7)، على الرغم من أن بعض المكونات BBSome لا تزال تشكل subcomplex. إذا كانت هذه subcomplexes تزال تحتفظ ببعض المهام المتبقية هي مسألة الفائدة.
لتقييم تأثير على تشكيل BBSome من متماثل الطفرات BBS7 مغلطة (T211I وH323R) وجدت في المرضى الذين يعانون BBS، نحن اختبار ما إذا كان BBS7 تحتوي على هذه الطفرات يمكن إدراجها في BBSome. ويظهر تحليل النشوء والتطور أن هذه الطفرات تقع في مناطق محمية من البروتين. ونحن إنشاء بنيات BBS7 تحور بواسطة الطفرات موقع الموجه والموسومة لهم FLAG في N-محطة من البروتينات. انخفضت البروتينات BBS7 تحور القدرة على التفاعل مع BBS2 كما يتبين من شارك في مناعي عندما transfected المشارك في الخلايا 293T (الشكل 4F). طفرة مغلطة BBS7 H323R قد تراجع في القدرة على هدم مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع من النوع البري BBS7 البروتين (الشكل 4G). تم الحصول على نتيجة مماثلة مع متحولة بروتين T211I (تشانغ وآخرون، 2012b). وتشير هذه النتائج إلى أن الطفرات BBS7 مغلطة تؤثر BBSome تشكيل. وهذا يوفر تفسيرا لماذا هذه الطفرات نقطة متماثل تسبب BBS. في المقابل، لم غياب BBS7 لا تؤثر على مستويات البروتين من مكونات معقدة IFT أو IFT تشكيل معقد (المواد التكميلية الشكل S6A، B). لم فقدان BBS7 لن يؤثر IFT البروتين الهدبية توطين (المواد التكميلية الشكل S6C)، بما يتفق مع الحقائق التي فقدان الجينات BBS ديها الظواهر أكثر اعتدالا من ذلك من فقدان الجينات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف إذا كان معدل حركة IFT هو تغييرها.

غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين مستقبلات الذوق، polycystin-1 أو polycystin-2

ومن المعروف أن BBSome تشارك في نشوء حيوي غشاء أهداب من خلال Rab8. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من BBS الجينات في النتائج الزرد في عيوب في الحويصلة Kuffer وإلى الوراء تأخير النقل جسيم ميلانيني. وعلاوة على ذلك، فقد BBS البروتينات النتائج في تراكم عنصر الصوتية مسار القنفذ مملس (SMO) داخل أهداب دون تفعيل المسار (تشانغ وآخرون، 2012A). هذه الدراسات تدل على أن البروتينات BBS تعمل في الاتجار محدد الحويصلة. وقد تبين أن البروتينات أهداب الأخرى ذات الصلة مثل AHI1 وتشارك FUZZY في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لأهداب الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛ هسياو وآخرون، 2009.). لاختبار ما إذا تشارك BBS7 في الغشاء العام الاتجار البروتين، درسنا مسارات الإلتقام-بالكلاذرين مستقلة وتعتمد على بالكلاذرين في مثقف من النوع البري وBbs7 - / - الخلايا الأولية الكلى باستخدام fluorophore المسمى السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة كعلامات على التوالي. تم الكشف عن عدم وجود اختلافات من السم الكوليرا أو ترانسفيرين مستقبلات الإلتقام بين النوع البري وBbs7 - / - الخلايا (المواد التكميلية التين S7، S8). ويتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام خلايا MEF من النوع البري وBbs7 - / - الفئران. وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs7 ليست متورطة في الاتجار حويصلي العام، ولكن بدلا تشارك في أنواع معينة من الاتجار حويصلي مثل جسيم ميلانيني النقل في الزرد و / أو الاتجار إلى وجهات التحت خلوية محددة مثل الأغشية الهدبية.
بعد ذلك، درسنا الهدبية غشاء الاتجار البروتين في الخلايا فارغة Bbs7. وقد تم مؤخرا أظهرت مستقبلات الطعم المر للتوطين لغشاء الهدبية في أهداب متحركة من ظهارة الهوائية والذوق مستقبلات الأشكال ترتبط عدوى الجهاز التنفسي (لي وآخرون، 2012.؛ شاه وآخرون، 2009.). رغم عدم وجود النمط الظاهري واضح في الكلى، وقد تبين وجود ارتباط طعم مستقبلات مرير مع نوع معين من اعتلال الكلية، البلقان المتوطنة إعتلال الكلى، (التغطية بالخشب وآخرون، 2012). لاختبار إذا يتم ترجمة مستقبلات الطعم المر أيضا إلى غشاء أهداب الابتدائي، ونحن ملطخة خلايا الكلى مثقف مع الأجسام المضادة ضد مستقبلات الطعم المر T2R4 وT2R43 جنبا إلى جنب مع أهداب علامة الأسيتيل α تويولين. وأظهرت النتائج أن مستقبلات الطعم المر توطين لغشاء أهداب الكلى الابتدائي (المواد التكميلية الشكل S9A-C). مستقبلات الذوق وظيفية كما يتضح من العلاج مع ديناتونيوم مجمع المر للحصول على 2+ استجابة الكالسيوم (المواد التكميلية الشكل S9I). من المذكرة، لم فقدان Bbs7 لن يؤثر على توطين أهداب من هذه المستقبلات (المواد التكميلية الشكل S9D-F)، ولا يؤثر على الكالسيوم 2+ تعبئة عندما حفز مع مجمع المر ديناتونيوم (المواد التكميلية الشكل S9J)، مشيرا إلى أن BBS7 و غير مطلوب BBSome لتوطين الغشاء الهدبي أو وظيفة مستقبلات الطعم المر.
طفرة من عدة بروتينات الغشاء الهدبية بما في ذلك polycystin-1، polycystin-2، وMecklin (MKS3)، يسبب الأمراض التي تصيب الإنسان مع الظواهر التي تتداخل تلك BBS. ولذلك، فإننا التحقيق في توطين كلا polycystin-1 وpolycystin-2 في تربيتها Bbs7 - / - خلايا الكلى الأولية باستخدام الأجسام المضادة ضد polycystin-1 وpolycystin-2. غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin 2 (الشكل 5). حقيقة أن Bbs7 - / - الفئران لا تتطور الكيسات الكلوية إلى أن polycystin-1 وpolycystin-2 لا تزال وظيفية، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية عيوب وظيفية خفية في غياب BBS7.

تين. 5.
غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin-2. (A-L) أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من النوع البري (A-C، G-I) وBbs7 - / - (D-F، J -L) الفئران ملطخة مكافحة الأسيتيل α تويولين (الخضراء) كعلامة أهداب ومضادة للpolycystin-1 (A-F؛ أحمر) ومضادة للpolycystin 2 (G-L، أحمر) الأجسام المضادة. أشرطة النطاق: 10 ميكرون.

غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات الغشاء الهدبي

وقد أظهرت الدراسات الجينية في الكائنات النموذج الذي فقدان البروتينات BBS تؤدي إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل في الزرد، IFT عيوب تحول في الطرف الهدبية في C. ايليجانس، وتراكم يشير البروتينات داخل الأسواط في كلاميدوموناس، وتراكم مملس داخل أهداب في الفئران (Lechtreck وآخرون، 2009.؛ وي وآخرون، 2012.؛. الين وآخرون، 2006؛ تشانغ وآخرون، 2012A). ولذلك، فإننا التحقيق مستقبلات الذاتية التي قد تتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - الفئران. وقد تبين أن مستقبلات الدوبامين D1 (D1R) تتراكم في أهداب في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). لتحديد ما إذا D1R يتراكم في أهداب في Bbs7 - / - الفئران، ونحن ملطخة أقسام الدماغ من النوع البري وBbs7 - / - الفئران مع العصبية ACIII أهداب علامة والأجسام المضادة ضد D1R. لا يمكننا العثور على أي تلطيخ الهدبية من D1R في البرية من نوع الدماغ (الشكل 6A-C). في المقابل، وجدنا مناطق متعددة بما في ذلك المخطط واللوزة حيث يموضع D1R لأهداب في Bbs7 - / - (الدماغ الشكل 6D-F). وتشير هذه البيانات إلى أن BBSome يمكن أن تنظم النقل إلى الوراء من D1R داخل أهداب الخلايا العصبية وفقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

تين. 6.
فقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للمستقبلات الدوبامين D1 داخل الأهداب. (A-F) أقسام الدماغ من النوع البري (A-C) وBbs7 - / - كانت ملطخة (D-F) الفئران مع مكافحة ACIII الأجسام المضادة ( الأحمر) كعلامة أهداب الخلايا العصبية ومكافحة D1R الأجسام المضادة (الخضراء). D1R يتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - مخ الفأر مقارنة البرية من نوع السيطرة. شريط النطاق: 20 ميكرون.

نقاش

وهدب هو عضية الهامة التي تلعب أدوارا متعددة خلال التنمية وفي التوازن من أنسجة البالغين. أهداب متحركة مهمة لوظائف مثل إزالة المخاط من الرئتين والدورة الدموية من السائل الشوكي الدماغي من خلال البطينين الدماغي، في حين أهداب الأساسي والمهم لchemo- والميكانيكية والإحساس، وكذلك القنفذ وWNT نقل الإشارة. وسلط الضوء على أهمية أهداب التي كتبها النتائج أن أهداب عطل يساهم في مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان المعروفة باسم ciliopathies التي تشمل متلازمة بارديه-بيدل.
BBS هو اضطراب عديد المظاهر التي تنطوي على العديد من أجهزة الجسم. بعض الظواهر BBS مثل السمنة، وتنكس الشبكية، والسكري، وارتفاع ضغط الدم لديها معدلات انتشار عالية في عموم السكان. ولذلك، فإن دراسة BBS يوفر فرصة فريدة من نوعها للكشف عن بعض مسارات الكامنة أو التأثير على هذه الأمراض الشائعة. BBS خروج المغلوب الفئران تحاكي النمط الظاهري البشري، وبالتالي توفير أداة مفيدة لاكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا المرض فضلا عن اختبار علاجات جديدة.
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا تشترك الظواهر BBS مشتركة، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. الأهم من ذلك، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر (كرمي وآخرون، 1995). وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، قد يكون الجينات BBS مختلفة ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هو جزء لا يتجزأ من BBSome ويتفاعل مع مجمع BBS chaperonin، وهي نتيجة فريدة من نوعها لBBS7 بين BBSome البروتينات جسديا. غياب BBS7 يؤثر على استقرار البروتين من BBS2 ويمنع تشكيل BBSome سليمة. ومع ذلك، لا تزال تشكل أهداب الابتدائية في غياب BBS7. على عكس بالضربة القاضية جين IFT، التي أهداب لا تشكل ويؤدي إلى الفتك الجنينية في الفئران، Bbs7 - / - الفئران يمكن البقاء على قيد الحياة إلى سن الرشد وأهداب الابتدائي لا تزال تشكل في الأنسجة بما فيها الكلى والجزر من البنكرياس، والقناة البنكرياسية، في الظهارية الكلوي مثقف الخلايا والخلايا الليفية. وعلى النقيض من أهداب الابتدائي، أهداب متحركة من خلايا البطانة العصبية بطانة البطينات الدماغية والحيوانات المنوية لديهم سياط عيوب خطيرة في Bbs7 - / - الفئران. أهداب متحركة المعيبة ليست بسبب وventriculomegaly المتقدمة في غياب BBS7 منذ أهداب عيب متحركة تطوير في وقت مبكر من 3 أسابيع في ependyma الدماغ. لا تفعل تظهر أهداب متحركة المعيبة أن يكون السبب الرئيسي للventriculomegaly. تطوير غير طبيعي للخلايا العصبية السلف قد تكمن وراء تطوير ventriculomegaly في هذا النموذج الماوس كما هو موضح لنماذج أخرى الماوس BBS لأن كلا BBS7 وBBS1 تعتبر ضرورية لسلامة BBSome (كارتر وآخرون، 2012). غياب BBS7 لا يؤثر على تشكيل المجمعات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف ما اذا تأثر الحركة من الجسيمات IFT التي كتبها غياب BBSome. ويبدو أن الجينات BBS والجينات IFT أن تؤثر على جوانب مختلفة من وظيفة الهدبية. نتائجنا في الفئران تتسق مع نتائج كلاميدوموناس، وتسليط الضوء على التفاعل بين BBSome ومجمع IFT (Lechtreck وآخرون، 2009).
أثبتنا أن BBS7 البروتين إيواء الطفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS7 (T211I وH323R) لديه قدرة انخفضت إلى تشكيل BBSome مقارنة مع البروتين BBS7 العادي. الأساليب المستخدمة هنا يمكن أن توفر نظام فحص خلية القاعدة فعال لتقييم طبيعة الطفرات مغلطة BBS الإنسان في المختبر.
في الآونة الأخيرة أظهرت الدراسات أن الجينات ذات الصلة أهداب، مثل AHI1 وغامض، وتشارك في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لالهدبية الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛. هسياو وآخرون، 2009). في المقابل، غياب BBS7 لا يؤثر على مسارات إما مستقلة بالكلاذرين وأو بالكلاذرين الإلتقام يتوقف. وبالمثل، وغياب أو طفرة من البروتينات BBS لا تؤثر على مسار إفرازية العام للبروتينات الغشاء بما في ذلك SST3R وترانسفيرين مستقبلات غشاء البلازما (جين وآخرون، 2010) (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن الاتجار حويصلة العامة لا يبدو أن يتطلب BBS7 أو BBSome والاتجار بروتينات معينة أو من غشاء البلازما يمكن أن يثير الشبهة في غياب BBSome. ومن الأمثلة على الاتجار مستقبلات اللبتين، وهو ما ثبت للتفاعل مباشرة مع BBSome (سيو وآخرون، 2009). ومن المثير للاهتمام، في C. ايليجانس، وفقدان BBS الجينات يؤدي إلى زيادة إطلاق سراح الحويصلات كثيفة الأساسية والأنشطة المعززة للأنسولين، نيوروبيبتيدي، وأمين مسارات إشارات الاحيائية (لي وآخرون، 2011). نستنتج أن BBS7 وبالتالي BBSome لا تشارك في الهدبي الاتجار العام بروتين الغشاء بل في محدد الغشاء الهدبي الاتجار البروتين. ويستند هذا الاستنتاج على ملاحظة أن الهدبية بروتينات غشاء مثل polycystin-1، polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر لا تزال المترجمة إلى غشاء الهدبية في الغياب التام للبروتين BBS7، وهو مطلوب لBBSome التجمع. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدلائل إلى أن polycystin-1، لا تزال polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر وظيفية في غياب BBS7. في المقابل، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم SMO داخل أهداب دون تحفيز SMO يجند (تشانغ وآخرون، 2012A). وقد ثبت الأخرى بروتينات الغشاء الهدبي بما في ذلك SST3R وMCHR1 لتوطين لأهداب الخلايا العصبية في ظل ظروف طبيعية، ولكن ليس في غياب BBS2 أو BBS4 (Berbari آخرون، 2008A.؛ Berbari وآخرون، 2008b.). ومع ذلك، فإن غياب BBS7 لا يؤثر توطين الهدبي إما SST3R أو MCHR1 في الخلايا العصبية في الدماغ أو في الخلايا المستنبتة من Bbs7 - / - الفئران (لا تظهر البيانات). في المقابل، تراكمت D1R داخل أهداب في غياب BBS7، على غرار النتائج في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). تراكم D1R داخل أهداب قد يرجع ذلك إلى النقل إلى الوراء تغير من D1R داخل أهداب في غياب BBS7. ودعما لهذا الاحتمال، وأظهرت الدراسات الجينية في الزرد إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل عند التعبير عن BBS يتم منع الجينات (الين وآخرون، 2006). وعلاوة على ذلك، SMO يتراكم داخل أهداب دون التحفيز يجند في غياب BBSome (تشانغ وآخرون، 2012A). تأخر نقل إلى الوراء يمكن أن تنجم عن النشاط تغير المحرك، خلل في مجمع IFT أو تتغير بنية أهداب axonemal، أو تغيير معين في قدرة بعض الشحنات للخروج من هدب. دراسات في C. ايليجانس تشير إلى أن البروتينات BBS بمثابة linkers بين مجمع IFT B ومجمع IFT A (Blacque وآخرون، 2004). وفقدان البروتينات BBS يؤدي إلى وظيفة غير لائقة المجمعات IFT. ودعما لهذا الاحتمال، المسوخ مضاعفة من Bbs7 وTg737orpk تفتقر تماما أهداب، تشبه مجمع IFT B بالضربة القاضية الحقيقية (تشانغ وآخرون، 2012A). بدلا من ذلك، أهداب الأساسي من المسوخ Bbs7 قد يكون لها أيضا خفية خلل في بنية axonemal التي قد تسهم في تراكم D1R داخل الأهداب. أهمية وظيفية من تراكم D1R داخل أهداب غير معروفة حاليا. وقد تبين أن المرضى BBS وBBS الفئران خروج المغلوب زادت القلق والاكتئاب (بارنيت وآخرون، 2002.؛ Eichers وآخرون، 2006.). ومن المثير للاهتمام، انسداد D1R السرقة مع الأدوية الموهن مكيفة التجمد (اختبار الخوف مشروط) أثناء الاختبار الاستبقاء (Guarraci وآخرون، 1999a... Guarraci وآخرون، 1999b). توطين D1R في مناطق الجسم المخطط واللوزة تشير إلى أن الدوبامين إشارات قد تلعب دورا لعيوب السلوك التي لوحظت في نماذج الماوس BBS والمرضى BBS.

المواد والأساليب

الكواشف والأجسام المضادة

وقد تم الحصول على الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS2 الببتيد DKTARYWRIK والأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS7 الببتيد VLQERENYQQ من توسيع النظم البيولوجية (هانتسفيل، AL). وكانت هذه الأجسام المضادة النقاء تقارب والتحقق منها في الفئران خروج المغلوب. وحيدة النسيلة المضادة للبيتا تويولين، بولكلونل مكافحة β-الأكتين، وحيدة النسيلة المضادة للالأسيتيل تويولين، وحيدة النسيلة المضادة للγ تويولين، بولكلونل الأرنب تم شراؤها مكافحة BBS8 وBBS9 من سيغما (سانت لويس، MO). تم شراء الماعز المضادة للBBS1 (N-20)، الماعز المضادة للBBS2 (C-16) الأجسام المضادة، والفأر مكافحة D1R الضد من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، CA). تم شراؤها لمكافحة T2R4 الضد الأرنب بولكلونل والأرنب المضادة للT2R43 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة من العلم الحرارية (بيتسبرغ، PA). تم شراؤها اليكسا 488 مترافق السم الكوليرا واليكسا 568 البشرية مترافق نقل مستقبلات من إينفيتروجن (كارلسباد، كاليفورنيا). وكان الأرنب بولكلونل المضادة للpolycystin-1 هدية من الدكتور أوكسانا Ibraghimov-Beskrovnaya (شركة جنزايم). كان الأرنب بولكلونل مكافحة polycystin-2 الأجسام المضادة هدية من الدكتور ستيفان Somlo (جامعة ييل)، والدكتور غريغوري Pazour (مدرسة الطب بجامعة ماساتشوستس).

جيل من Bbs7 الفئران خروج المغلوب

تم استخدام PCR لتضخيم 5 'و 3' مناطق Bbs7 الجينات من 129 / SVJ الحمض النووي الجيني والمستنسخة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC). تم خطي ناقلات و electroporated إلى R1 الجذعية الجنينية (ES) خلايا (129 × 1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). كما تم عرض G418 واستنساخ مقاومة للganciclovir التي كتبها بعيد المدى PCR لتحديد خطوط الخلايا ES المستهدفة بشكل صحيح. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES مستقلة لإنتاج الوهم. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Bbs7 الفئران متخالف على خلفية وراثية مختلطة من قبل التزاوج مع C57BL / 6J الفئران. تم intercrossed الفئران متخالف، وكان التنميط الجيني لسلالة بواسطة PCR. جميع الدراسات انضمت إلى المبادئ التوجيهية الموضوعة لرعاية واستخدام حيوانات التجارب وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR

تم عزل الحمض النووي الريبي من العمر 2.5 شهرا من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين الماوس باستخدام TRIzol كاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). وقد أعد كدنا] من 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مرتفع الثالث الناسخ العكسي (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا).

تحليل لطخة غربية

من النوع البري وBbs7 تعطلت الخصيتين متحولة من قبل TISSUEMISER (فيشر العلمية، بيتسبرغ، PA) في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100 و مثبط البروتياز من روش، انديانابوليس، IN). تم تجميد الأنسجة تعطلت في النيتروجين السائل وإذابة في حمام الماء درجة حرارة الغرفة. وتكررت هذه الدورة تجميد أذاب ثلاث مرات. ثم تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة وتم قياس تركيز supernatants باستخدام بيو راد العاصمة فحص البروتين (هرقل، CA).
تم فصل البروتينات عن طريق الكهربائي باستخدام 4-12٪ المواد الهلامية NuPAGE مكرر تريس (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا)، يليه نقل إلى الأغشية النيتروسليلوز وتم الكشف عنها من قبل SuperSignal دورا مددت الركيزة (بيرس، روكفورد، IL).

التحليل النسيجي للBbs7 - / - الفئران

الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ العينين والخصيتين من العمر 4-8 شهرا Bbs7 أجريت متحولة والعمر كعينة ضابطة من حد وصفه. أقسام الدماغ الاكليلية من 60-100 ميكرون من العمر 4-8 شهرا Bbs7 - - / كانت ملطخة الحيوانات والعمر كعينة ضابطة مع محايد الأحمر وصورت مع stereomicroscope أوليمبوس SZX12 كما هو موضح (ديفيس وآخرون، 2007.).

دراسات الوزن

تناول الطعام في قفص فردي Bbs7 - - / تم مقارنتها مع الحيوانات Bbs7 +/- والحيوانات البرية من نوع السيطرة تتراوح أعمارهم 4-28 أسابيع باستخدام متوسط ​​ستة حيوانات في كل مجموعة. تم تسجيل الوزن بداية الأسبوعية عند الفطام.

نقل الإلكترون المجهري

تم perfused الفئران مع نصف القوة تثبيتي Karnovsky وتم تشريح الأنسجة وإصلاحها في نصف القوة تثبيتي Karnovsky لعدة ساعات قبل الأوسيميوم بعد التثبيت، والجفاف، وتضمينها في الإي بي 812. نقل الميكروسكوب الإلكتروني اتخذت كما هو موضح سابقا (سويديرسكي وآخرون آل.، 2007).

جيل من BBS2 البشري وBBS7 متحولة بنيات الحذف والطفرات نقطة

تم إنشاء BBS7 المسوخ الحذف عن طريق PCR والمستنسخة في التعبير الثدييات ناقلات pCS2 +. وتم التحقق من كل المسوخ الحذف عن طريق التسلسل المباشر. تم إنشاؤها الطفرات نقطة BBS7 بواسطة الطفرات موقع الموجه (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا) باستخدام N-محطة الموسومة FLAG من النوع البري BBS7 كقالب والتحقق من التسلسل.

مناعي

تفاضلي الموسومة الجينات BBS الإنسان و transfected المشارك في الخلايا 293T. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت هي lysed الخلايا في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100، ومثبط البروتياز، روش، انديانابوليس، IN) ونسج في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تم مسح supernatants من قبل الحضانة مع حبات بروتين G (بيرس، روكفورد، IL). وحضنت لست] مسح مع الأجسام المضادة ضد علامات المقابلة لمدة 4 ساعات. وبعد ذلك يضاف بروتين G الخرز والمحتضنة لمدة 4 ساعات أخرى. تم غسلها حبات أربع مرات مع العازلة تحلل وتم الكشف عن التفاعلات التي النشاف الغربي.

المناعي المجهري

تم إصلاح الخلايا في 4٪ paraformaldhyde في برنامج تلفزيوني أو ثابتة مع الميثانول البارد لمدة 5 دقائق (ل-γ تويولين صمة عار) وpermeabilized مع 0.2٪ تريتون X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. تم غسلها الخلايا 3 × PBS وسدوا مع عازلة تمنع (1٪ BSA في PBS). وكانت مخففة الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تم غسلها الخلايا 3 × PBS، سدت مع عازلة تمنع، ثم حضنت مع فلور اليكسا 488 أو فلور اليكسا 568 المسمى الأجسام المضادة الثانوية (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). كانت ملطخة النوى مع دابي (سيغما، سانت لويس، MO).

كلية زراعة الخلايا الأولية

الكلى من النوع البري وBbs7 - / - تم تشريح الفئران وتعقيمها قبل التنسيب إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 ثوان، ثم مفروم مع مقص. تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 دون المصل. 20 مل من pronase (1 ملغ / مل، روش، انديانابوليس، IN) وأضيف إلى الأنسجة والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 وحضنت مع 20 مل 1-× التربسين EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. تم مكعبات الأنسجة في 500 غ لمدة 5 دقائق وإعادة علقت في 30 مل DMEM / F-12 مع 10٪ مصل. كانت مطلية الأنسجة إعادة علقت في ثلاثة أطباق 10 سم مغلفة بولي-L-ليسين (سيغما، سانت لويس، MO).

السم الكوليرا وترانسفيرين مستقبلات الإلتقام

أجريت السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة المقايسات الإلتقام كما وصفها هسياو وآخرون. (هسياو وآخرون 2009).

التصوير الكالسيوم

تم إجراء التصوير الكالسيوم كما هو موضح سابقا (شاه وآخرون، 2009). خلايا الكلى مثقف من النوع البري وBbs7 - / - تم تحميل الفئران مع 1 ميكرومتر Fura2 صباحا، تم تقييم التغييرات تركيز الكالسيوم في ظهائر باستخدام مجهر مقلوب (نيكون الكسوف TE200، نيكون انسترومنتس، ميلفيل، NY)، والبيانات تم تحليلها باستخدام برنامج شيكل، عناصر (نيكون). تم تطبيق ديناتونيوم apically في تركيزات المشار إليها. تم استخدام برنامج تلفزيوني عن السيطرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #17  
قديم 11-23-2015, 09:26 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome وغيابها في الفئران النتائج في بارديه-بيدل الظواهر متلازمة وتشوهات انتقائية في غشاء الاتجار البروتين

 

http://jcs.biologists.org/content/126/11/2372.full



بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو اضطراب عديد المظاهر ومتخالف وراثيا تسبب بشكل مستقل من قبل العديد من الجينات (BBS1-BBS17). سبعة البروتينات BBS الحفظ جدا (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome، التي تعمل في نشوء حيوي الغشاء الهدبي. BBS7 على حد سواء وحدة فرعية فريدة من BBSome ويعرض التفاعل المادي المباشر مع BBS الثاني معقد، مجمع chaperonin BBS. لفحص وظيفة في الجسم الحي من BBS7، ولدت لنا Bbs7 الفئران خروج المغلوب Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لغيرها من الجينات BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، والسمنة، ventriculomegaly والعقم عند الذكور تتميز الشاذ axonemes الحيوانات المنوية سوطي. باستخدام أنسجة من Bbs7 - / - الفئران، وتبين لنا أن BBS7 مطلوب لتشكيل BBSome، وأن BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. على الرغم من أن BBSome بمثابة مجمع معطف للبروتينات الغشاء الهدبي، غير مطلوب BBS7 لتوطين بروتينات الغشاء الهدبي polycystin-1، مستقبلات polycystin-2، أو الطعم المر، ولكن غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات إلى الغشاء الهدبي، مشيرا إلى أن BBS7 تشارك في توطين محددة بروتين الغشاء لأهداب.
مقدمة

أهداب هي الهياكل القائمة على أنيبيب التي تمتد من سطح الخلية لمعظم خلايا حقيقية النواة. أنها تحتوي على مكونات فريدة غشاء الخلية منفصلة عن الغشاء البلازمي، وتصنف على أنها إما أهداب متحركة أو الأساسي (immotile). أهداب تلعب دورا مهما أثناء التطور وعلم وظائف الأعضاء في أنسجة البالغين. عيوب أهداب تؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان ciliopathies يطلق التي تشمل dyskinesis الأساسي الهدبي، مرض الكلى المتعدد الكيسات، سحاف الكلية، جوبير syndome، متلازمة العليا-لوكن، متلازمة ميكل-جروبر، ORO-الوجه الرقمية متلازمة، متلازمة Alstrom، وBardet- متلازمة بيدل (BBS).
BBS هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، والتشوهات الكلى، والإعاقة ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك العيوب الثانوية بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم التعلم. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 17 جينات BBS أن يسبب اضطراب مستقل (عبد الستار وجليسون، 2011). على الرغم من أن الوظائف الخلوية من البروتينات BBS لا تزال غير مفهومة تماما، وقد كشفت الدراسات الوظيفية في الكائنات نموذج التي تشارك البروتينات BBS في وظائف الهدبية والنقل داخل الخلايا. في ايليجانس انواع معينة، يتم التعبير عن BBS الجينات في الخلايا العصبية المهدبة وتوطين للقاعدة الهدبية / المنطقة الانتقالية والمشاركة في IFT على طول الهدبية الخيط المحوري. bbs7 وbbs8 متحولة C. ايليجانس خطوط لها صبغة ملء العيوب، أهداب أقصر، وعيوب في النقل intraflagellar (IFT) (Blacque وآخرون، 2004). ضربة قاضية للتعبير عن BBS الجينات في نتائج الزرد في العيوب الحويصلة كوبفر، وفقدان أهداب سابقة لأوانها، وجسيم ميلانيني الوراء تأخير النقل (الين وآخرون، 2006). BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص انحطاط والسمنة الظواهر الشبكية ينظر في المرضى الذين يعانون BBS. وبالإضافة إلى ذلك، ذكر BBS فئرانا معدلة وراثيا تفتقر سياط الحيوانات المنوية (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛ Mykytyn وآخرون، 2004.؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). وتشير الدراسات البيوكيميائية أن سبعة من البروتينات BBS المعروفة (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) تشكيل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome (Nachury وآخرون، 2007). البروتينات BBS الأخرى بما في ذلك BBS6، BBS10، وBBS12 تشكل المجمع الذي ينظم BBSome التجمع (سيو وآخرون، 2010). واحدة من وظائف BBSome هو تعزيز أهداب نشوء حيوي الغشاء من خلال Rab8 GTPase الصغيرة وبمثابة مجمع معطف للاتجار الهدبية بروتين الغشاء (جين وآخرون، 2010.؛ Nachury وآخرون، 2007.).
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص معظم الظواهر BBS، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. على سبيل المثال، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران هي ارتفاع ضغط الدم، في حين Bbs2 - / - الفئران هي سوي ضغط الدم (رحموني وآخرون، 2008. Bbs3) - / - الفئران لها hydocephalus أكثر حدة وأقل بدينة من غيرها من الفئران BBS (تشانغ وآخرون، 2011). بما يتفق مع الدراسات الماوس، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر على حد سواء. وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011.؛. Kulaga وآخرون، 2004)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، الجينات BBS المختلفة قد تمتلك ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هي فريدة من نوعها من حيث أنه هو وحدة فرعية من BBSome ويتفاعل مباشرة مع جسديا مجمع chaperonin BBS. من أجل دراسة دور BBS7 في الجسم الحي، وتحديد ما إذا كان فقدان Bbs7 لديه أي الظواهر الفريدة المرتبطة بها، ولدت لنا Bbs7 بالضربة القاضية الفئران Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في آخر BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، وعدم من سياط الحيوانات المنوية، والسمنة، وventriculomegaly. علينا أن نبرهن على BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين وما هو مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. والجدير بالذكر، وتبين لنا أن BBSome غير مطلوب للعالمي توطين الهدبية بروتين الغشاء. ومع ذلك، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

النتائج

جيل من الفئران Bbs7 باطل

BBS7 هي فريدة من نوعها بين البروتينات BBS لأنه جزء لا يتجزأ من BBSome ومكون من مجمع chaperonin BBS. للتحقيق في وظيفة في الجسم الحي من الجين Bbs7، ولدت لنا Bbs7 الفئران بالضربة القاضية جين عن طريق استبدال اكسون 5 مع كاسيت بالنيوميسين. هذا يؤدي إلى انزياح الإطار مما أدى إلى Bbs7 أليل فارغة (المواد التكميلية الشكل S1A). تم التحقق من عدم وجود Bbs7 مرنا من خلال تحليل RT-PCR RNA باستخدام معزولة عن Bbs7 - / - الخصيتين الماوس مع الاشعال داخل اكسون 5 (المواد التكميلية الشكل S1B.). وأكد عدم وجود بروتين BBS7 قبل الغرب النشاف (المواد التكميلية الشكل S1C).
أدى التزاوج من الزيجوت Bbs7 +/- 26٪ في Bbs7 + / + الفئران، و 55٪ الفئران Bbs7 +/-، و 19٪ Bbs7 - / - الفئران = 387؛ P <0.05). تردد انخفضت من Bbs7 - / - وقد لوحظ في ذرية أخرى فئرانا معدلة وراثيا BBS وتشير إلى أن بعض Bbs7 - / - الفئران توفي قبل الولادة أو فترة ما حول الولادة.

Bbs7 - / - الفئران تصبح بدينة، تفتقر الخراجات الكلى ولا تتطور polydactyly

Bbs7 - / - الفئران هي الضعفاء عند الولادة، تزن أقل من تتزاحم بهم في 3 أسابيع من العمر، وسمنة على مر الزمن. بعد الفطام، Bbs7 - / - الفئران تبدأ في كسب المزيد من الوزن من النوع البري الفئران بسبب زيادة الاستهلاك الغذائي. قبل 12 أسبوعا من العمر، Bbs7 - / - الفئران (ذكورا وإناثا) تزن أكثر بكثير من تتزاحم سيطرتها، والخلافات أصبحت أكبر في الحيوانات الأكبر سنا. قبل 7 أشهر، من النوع البري الفئران هي 28.7 ± 2.8 جم مقابل Bbs7 - / - 41.1 ± 3.25 غ (P <0.05).
على الرغم من شذوذ الكلوي وpolydactyly هي السمات الأساسية للالظواهر BBS في البشر، ونحن لم نلاحظ الكيسات الكلوية أو polydactyly من الأطراف الأمامية أو hindlimbs في فئرانا معدلة وراثيا Bbs7، مما يشير إلى اختلاف الأنواع أو الاختلافات عتبة بين الماوس والبشرية.

Bbs7 - / - الفئران تبدي تنكس الشبكية وventriculomegaly

التحليل النسيجي للBbs7 العمر 4-8 شهرا - / - تظاهر عيون انحطاط كبير من القطاعات الداخلية والخارجية للخلايا مستقبلة للضوء وطبقة النووية الخارجي (الشكل 1A، B.). وقد لوحظ Ventriculomegaly في البطينات الجانبية والثالث من الدماغ كما رأينا في أقسام الاكليلية من Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - الفئران (الشكل 1C-F.). نحن أيضا لوحظ تخفيف من القشرة المخية وانخفاض في حجم الحصين والجسم المخطط. لم يلاحظ أي تشوهات جسيمة في المخيخ في Bbs7 فئرانا معدلة وراثيا أو غيرها من فئرانا معدلة وراثيا BBS (المواد التكميلية الشكل S2).

تين. 1.
Bbs7 - / -. ملطخة E-عرض الفئران مبصرة فقدان الخلية وventriculomegaly (A، B) H & القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - (B) عيون تظهر فقدان مبصرة الداخلي وشرائح الخارجي فضلا عن انحطاط الطبقة النووية الخارجي. PC، خلايا مستقبلة للضوء. (C-F) محايد الحمراء الملطخة 60-100 ميكرون سميكة أقسام الدماغ الاكليلية من النوع البري (C، E) وBbs7 - / - الفئران (D، F) تظهر البطينات الجانبية الموسع (*)، والظهرية الموسع البطين الثالث (رأس السهم العلوي والسفلي)، وانخفاض المخطط الإحضار (S) وقرن آمون (H)، وترقق القشرة المخية (CC). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 1 مم (C-F).

Bbs7 - / - الفئران لديها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ

منذ BBS هو مرض له علاقة أهداب، درسنا أهداب متحركة وأهداب الابتدائي في Bbs7 - / - الفئران. درسنا أهداب متحركة من طبقة الخلايا البطانة العصبية المبطنة للالبطينين عن طريق تلطيخ أقسام الاكليلية من العمر 3 اشهر من النوع البري وBbs7 - / - أدمغة فئران مع-α تويولين الضد ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة لمكافحة الأسيتيل كعلامات أهداب . مقارنة مع الضوابط، Bbs7 - / - أظهرت الفئران عددا كبيرا من أهداب انخفاض خلية بطانية عصبية وأهداب المتبقية هي أقصر (الشكل 2A، B).

تين. 2.
Bbs7 - / - الفئران لها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ (A، B) كشفت تلطيخ مناعي من البطين الدماغ خلايا البطانة العصبية باستخدام المضادة للالأسيتيل α تويولين (الخضراء) ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة (أحمر) عدم وجود أهداب وأهداب قصيرة (السهم) في طبقة البطانة العصبية من Bbs7 - / - الفئران (A) مقارنة مع من النوع البري الضوابط (B). (C، D) تحليل TEM من المقطع الطولي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر القصير وانتفخ أهداب مع حويصلات في Bbs7 من العمر 3 اسابيع - / - الفئران (D) مقارنة مع عمرها 3 أسابيع تحكم من النوع البري (C). (E-G) تحليل TEM من المقطع العرضي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر هيكل axonemal غير طبيعي في Bbs7 - / - الفئران (F، G) مقارنة مع السيطرة البرية من نوع (E). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 0.2 ميكرون (C-G).

لمزيد من التحليل أهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ، أجرينا تحليل TEM من العمر 3 اسابيع من النوع البري وBbs7 - أدمغة الفئران - /. أهداب متحركة من Bbs7 - / - الدماغ طبقة البطانة العصبية لديها القصير، انتفخ أهداب مع حويصلات (الشكل 2C، D.) وتلك أهداب متحركة أيضا هياكل axonemal المعيبة (الشكل 2F، G.) بالمقارنة مع النوع البري الضوابط (الشكل. 2E). وتشير هذه الدراسات إلى أن غياب البروتين BBS7 يؤثر هياكل أهداب متحركة.
لدراسة أهداب الأساسي في الجسم الحي، ونحن ملطخة أقسام الأنسجة من الكلى والبنكرياس مع الأسيتيل α تويولين. لم نجد اختلافات في أرقام أهداب الأولية أو طول أهداب بين النوع البري وBbs7 - / - الفئران (المواد التكميلية الشكل S3.). كما شكلت أهداب الابتدائي وتظهر طبيعي في الخلايا المستزرعة الظهارية الكلى والخلايا الليفية الجنينية مثقف (MEF) المستمدة من Bbs7 - / - الفئران (. المواد التكميلية الشكل S3 والبيانات لا تظهر)، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية أن يكونوا قد يكون خفية العيوب الهيكلية، مثل التغييرات بعد التعديل في الأنابيب الدقيقة.

Bbs7 - / - الفئران يكون غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية

أثبتنا سابقا لعدم وجود الحيوانات المنوية الأسواط في Bbs1 M390R / M390R knockin، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛. Mykytyn وآخرون، 2004؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - كشفت الخصيتين ندرة الحيوانات المنوية سياط (الشكل 3A، B.). نحن صقلها على هذه الملاحظة عن طريق تلوين المناعي من أنسجة الخصيتين. في حين أن معظم الحيوانات المنوية من Bbs7 - / - الفئران تفتقر إلى ذيل سوطي، وبعض من الحيوانات المنوية لديهم سياط تالف. هذه الأسواط غير طبيعي في كثير من الأحيان تشكيل هيكل حلقة نوع (الشكل 3C-F). لدراسة هذه الآفة تالف في مزيد من التفاصيل، أجزاء من النوع البري وBbs7 - / - تم تحليل الخصيتين بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). الهياكل microtubular والألياف الكثيفة الخارجية المحيطة هيكل microtubular في قطعة الرئيسي غير منظمة إلى حد كبير في المسوخ (الشكل الجيل الثالث 3G، H). في بعض الأحيان لاحظنا العادية 9 + 2 الهياكل axonemal في Bbs7 - / - الفئران (8،8٪ مقابل 100٪ في البرية من نوع، P <0.01). في المقابل، فإن الهياكل axonemal من أهداب متحركة في القصبة الهوائية من Bbs7 - / - الفئران طبيعية إلى حد كبير عن طريق تحليل TEM (المواد التكميلية الشكل S4.).

تين. 3.
Bbs7 - / - الفئران لها غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية (A، B) H & E الملون القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - أظهرت (B) الأنابيب المنوية عدم وجود الحيوانات المنوية سياط. أظهر (C-F) مناعي تلطيخ الخصيتين سياط باستخدام المضادة للالأسيتيل-α تويولين تلطيخ عيوب في Bbs7 - / - الفئران. في كثير من الأحيان ولوحظ وجود نوع من عصابة هيكل أنيبيب في Bbs7 - / - الفئران. C و D الصور وانخفاض القوة، E و F هي صور عالية الطاقة. (G، H) تحليل TEM من المقطع العرضي البرية من نوع (G) وBbs7 - / - (H) الحيوانات المنوية سياط يكشف أن Bbs7 - / - سياط الحيوانات المنوية لا يكون نموذجي 9 + 2 axonemes، ولكن تظهر الهياكل أنيبيب غير منظمة (السهم) والألياف الكثيفة الخارجي (رأس السهم) المحيطة الهياكل microtubular. أشرطة النطاق: 100 ميكرون (A، B)؛ 50 ميكرون (C، D)؛ 20 </ emph> ميكرون (E، F)؛ 0.1 ميكرون (G، H).

مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome

منذ Bbs7 - / - الفئران لها الظواهر مماثلة لغيرها من BBSome الفئران فرعية خروج المغلوب وBBS7 هو وحدة فرعية من BBSome، ونحن التحقيق آثار خسارتها على تشكيل BBSome. والمثير للدهشة، وكانت مستويات البروتين BBS2 بشكل ملحوظ انخفضت في Bbs7 - / - الخصيتين لست] البروتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين. وبالمثل، فقد انخفضت مستويات البروتين BBS7 في Bbs2 - / - الخصيتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين (الشكل 4A.). لتحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى تدهور البروتين أو انخفضت النسخ، كنا نصف الكمية RT-PCR لتقييم Bbs2 وBbs7 مرنا مستويات التعبير. نحن لم تراع الفوارق التعبير عن Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الخصيتين أو الاختلافات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الخصيتين مقارنة مع الضوابط (الشكل 4B.). معا هذه النتائج تشير إلى أن BBS2 وBBS7 الخلافات مستوى البروتين تنتج عن الاختلافات في استقرار البروتين، والتي BBS2 وBBS7 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار.

تين. 4.
مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. (A) BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. أظهرت هي البقع الغربية من إجمالي لست] البروتين من النوع البري (WT)، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs7 - / - الخصيتين. ويظهر تحليل (B) RT-PCR أي تغييرات واضحة في مستويات Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الفئران ولا تغييرات في مستويات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الفئران. (C) وBBSome لا تشكل في BBS الخصيتين الماوس خروج المغلوب. أظهرت هي البقع الغربية من البروتينات الخصيتين immunoprecipitated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS1. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome أخرى مع الأجسام المضادة ضد مفارز BBSome الفردية. واستخدمت كميات متساوية من البروتين الأولي من الخصيتين lystaes للمناعي. (D) تحليل الانحدار السكروز من البروتين لست] الخصيتين تثبت أنه لا يوجد أشكال BBSome في غياب BBS7. (E) فقدان تشكيل BBSome في خلايا الكلى مثقف من BBS الفئران خروج المغلوب وBBS2 انقاذ BBSome تشكيل في Bbs2 - خلايا الكلى - /. أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من مختلف الفئران خروج المغلوب BBS المصابين اتش معربا عن FLAG-BBS2. وهي lysed الخلايا المصابة وتم سحب البروتينات أعرب بنسبة مكافحة FLAG الأجسام المضادة. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة الغربية. (F) FLAG-BBS7 (WT والمسوخ) كانت المشترك مع transfected BBS2 الموسومة MYC إلى خلايا 293T والتفاعل بين BBS7 وBBS2 كان يعاير من قبل المشارك مناعي وكميا بواسطة يماغيج. و transfected (G) FLAG-BBS7 (WT وH323R طفرة) في الخلايا 293T وتم سحب البروتينات transfected أسفل عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. تم تحديد وجود مفارز BBSome الذاتية من قبل، BBS2، BBS4 وBBS7 الأجسام المضادة BBS1 المضادة. وتم قياس كمية مبالغ BBS1، BBS2، BBS4 وBBS7 التي كتبها يماغيج.

ترابط BBS2 وBBS7 للاستقرار البروتين يتسق مع النتائج تبين أن BBS2 يتفاعل جسديا مع BBS7 ويشكل subcomplex (Nachury وآخرون، 2007). ومن المثير للاهتمام، BBS7 وBBS2 مشاركة ملفوف لفائف تناظر تسلسل المجال في المناطق الوسطى من (المواد التكميلية الشكل S5). لم يكن مطلوبا من BBS7 ملفوف لفائف مجال للربط إلى BBS2. بدلا من ذلك، يطلب من الأحماض الأمينية 200-C النهائي للBBS7 للربط إلى BBS2 (المواد التكميلية الشكل S5A). وبالمثل، المجال ملفوف لفائف من BBS2 غير مطلوب على الاطلاق للتفاعل مع BBS7، ولكن فقدان هذا المجال يقلل من التفاعل مع BBS7 (المواد التكميلية الشكل S5B). وعلاوة على ذلك، فإن حذف المنطقة ملفوف لفائف في BBS7 لا يعطل تفاعلها مع غيرها من الوحدات الفرعية BBSome الذاتية. البروتين BBS2 مع حذف المنطقة ملفوف لفائف يعطل التفاعل مع بعض مفارز BBSome الذاتية (BBS7) مع الحفاظ على القدرة على التفاعل مع مفارز BBSome أخرى (BBS1 وBBS9) (المواد التكميلية الشكل S5C).
لدراسة تشكيل BBSome في غياب BBS7، أجرينا مناعي مع الأجسام المضادة ضد BBS1، واحدة من مفارز من BBSome. وقد انخفض وجود مفارز BBSome أخرى في BBS1 سحب هبوطا أو غير قابلة للكشف في غياب BBS7 أو BBS2 كما يتبين من لطخة غربية. هذا يدل على أن BBSome سليمة غير مشكلة في غياب BBS7 (الشكل 4C). أكدنا أيضا هذه النتائج عن طريق تحليل الانحدار السكروز من إجمالي لست] البروتين من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين (الشكل 4D).
للتحقيق في ما إذا كان شرط من BBS7 لتشكيل BBSome هي فريدة من نوعها لأنسجة الخصيتين، ونحن عزل الكلى الخلايا الظهارية الأولية من كلا من النوع البري وBbs7 - / - الفئران وإصابة الخلايا المستزرعة مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. نحن انزلوا العلم BBS2 والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية باستخدام أجسام مضادة لمكافحة BBS (الشكل 4E). وجدنا أن في غياب البروتين BBS7، ويتم تشكيل أي BBSome كامل (ناقص BBS7)، على الرغم من أن بعض المكونات BBSome لا تزال تشكل subcomplex. إذا كانت هذه subcomplexes تزال تحتفظ ببعض المهام المتبقية هي مسألة الفائدة.
لتقييم تأثير على تشكيل BBSome من متماثل الطفرات BBS7 مغلطة (T211I وH323R) وجدت في المرضى الذين يعانون BBS، نحن اختبار ما إذا كان BBS7 تحتوي على هذه الطفرات يمكن إدراجها في BBSome. ويظهر تحليل النشوء والتطور أن هذه الطفرات تقع في مناطق محمية من البروتين. ونحن إنشاء بنيات BBS7 تحور بواسطة الطفرات موقع الموجه والموسومة لهم FLAG في N-محطة من البروتينات. انخفضت البروتينات BBS7 تحور القدرة على التفاعل مع BBS2 كما يتبين من شارك في مناعي عندما transfected المشارك في الخلايا 293T (الشكل 4F). طفرة مغلطة BBS7 H323R قد تراجع في القدرة على هدم مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع من النوع البري BBS7 البروتين (الشكل 4G). تم الحصول على نتيجة مماثلة مع متحولة بروتين T211I (تشانغ وآخرون، 2012b). وتشير هذه النتائج إلى أن الطفرات BBS7 مغلطة تؤثر BBSome تشكيل. وهذا يوفر تفسيرا لماذا هذه الطفرات نقطة متماثل تسبب BBS. في المقابل، لم غياب BBS7 لا تؤثر على مستويات البروتين من مكونات معقدة IFT أو IFT تشكيل معقد (المواد التكميلية الشكل S6A، B). لم فقدان BBS7 لن يؤثر IFT البروتين الهدبية توطين (المواد التكميلية الشكل S6C)، بما يتفق مع الحقائق التي فقدان الجينات BBS ديها الظواهر أكثر اعتدالا من ذلك من فقدان الجينات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف إذا كان معدل حركة IFT هو تغييرها.

غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين مستقبلات الذوق، polycystin-1 أو polycystin-2

ومن المعروف أن BBSome تشارك في نشوء حيوي غشاء أهداب من خلال Rab8. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من BBS الجينات في النتائج الزرد في عيوب في الحويصلة Kuffer وإلى الوراء تأخير النقل جسيم ميلانيني. وعلاوة على ذلك، فقد BBS البروتينات النتائج في تراكم عنصر الصوتية مسار القنفذ مملس (SMO) داخل أهداب دون تفعيل المسار (تشانغ وآخرون، 2012A). هذه الدراسات تدل على أن البروتينات BBS تعمل في الاتجار محدد الحويصلة. وقد تبين أن البروتينات أهداب الأخرى ذات الصلة مثل AHI1 وتشارك FUZZY في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لأهداب الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛ هسياو وآخرون، 2009.). لاختبار ما إذا تشارك BBS7 في الغشاء العام الاتجار البروتين، درسنا مسارات الإلتقام-بالكلاذرين مستقلة وتعتمد على بالكلاذرين في مثقف من النوع البري وBbs7 - / - الخلايا الأولية الكلى باستخدام fluorophore المسمى السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة كعلامات على التوالي. تم الكشف عن عدم وجود اختلافات من السم الكوليرا أو ترانسفيرين مستقبلات الإلتقام بين النوع البري وBbs7 - / - الخلايا (المواد التكميلية التين S7، S8). ويتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام خلايا MEF من النوع البري وBbs7 - / - الفئران. وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs7 ليست متورطة في الاتجار حويصلي العام، ولكن بدلا تشارك في أنواع معينة من الاتجار حويصلي مثل جسيم ميلانيني النقل في الزرد و / أو الاتجار إلى وجهات التحت خلوية محددة مثل الأغشية الهدبية.
بعد ذلك، درسنا الهدبية غشاء الاتجار البروتين في الخلايا فارغة Bbs7. وقد تم مؤخرا أظهرت مستقبلات الطعم المر للتوطين لغشاء الهدبية في أهداب متحركة من ظهارة الهوائية والذوق مستقبلات الأشكال ترتبط عدوى الجهاز التنفسي (لي وآخرون، 2012.؛ شاه وآخرون، 2009.). رغم عدم وجود النمط الظاهري واضح في الكلى، وقد تبين وجود ارتباط طعم مستقبلات مرير مع نوع معين من اعتلال الكلية، البلقان المتوطنة إعتلال الكلى، (التغطية بالخشب وآخرون، 2012). لاختبار إذا يتم ترجمة مستقبلات الطعم المر أيضا إلى غشاء أهداب الابتدائي، ونحن ملطخة خلايا الكلى مثقف مع الأجسام المضادة ضد مستقبلات الطعم المر T2R4 وT2R43 جنبا إلى جنب مع أهداب علامة الأسيتيل α تويولين. وأظهرت النتائج أن مستقبلات الطعم المر توطين لغشاء أهداب الكلى الابتدائي (المواد التكميلية الشكل S9A-C). مستقبلات الذوق وظيفية كما يتضح من العلاج مع ديناتونيوم مجمع المر للحصول على 2+ استجابة الكالسيوم (المواد التكميلية الشكل S9I). من المذكرة، لم فقدان Bbs7 لن يؤثر على توطين أهداب من هذه المستقبلات (المواد التكميلية الشكل S9D-F)، ولا يؤثر على الكالسيوم 2+ تعبئة عندما حفز مع مجمع المر ديناتونيوم (المواد التكميلية الشكل S9J)، مشيرا إلى أن BBS7 و غير مطلوب BBSome لتوطين الغشاء الهدبي أو وظيفة مستقبلات الطعم المر.
طفرة من عدة بروتينات الغشاء الهدبية بما في ذلك polycystin-1، polycystin-2، وMecklin (MKS3)، يسبب الأمراض التي تصيب الإنسان مع الظواهر التي تتداخل تلك BBS. ولذلك، فإننا التحقيق في توطين كلا polycystin-1 وpolycystin-2 في تربيتها Bbs7 - / - خلايا الكلى الأولية باستخدام الأجسام المضادة ضد polycystin-1 وpolycystin-2. غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin 2 (الشكل 5). حقيقة أن Bbs7 - / - الفئران لا تتطور الكيسات الكلوية إلى أن polycystin-1 وpolycystin-2 لا تزال وظيفية، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية عيوب وظيفية خفية في غياب BBS7.

تين. 5.
غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin-2. (A-L) أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من النوع البري (A-C، G-I) وBbs7 - / - (D-F، J -L) الفئران ملطخة مكافحة الأسيتيل α تويولين (الخضراء) كعلامة أهداب ومضادة للpolycystin-1 (A-F؛ أحمر) ومضادة للpolycystin 2 (G-L، أحمر) الأجسام المضادة. أشرطة النطاق: 10 ميكرون.

غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات الغشاء الهدبي

وقد أظهرت الدراسات الجينية في الكائنات النموذج الذي فقدان البروتينات BBS تؤدي إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل في الزرد، IFT عيوب تحول في الطرف الهدبية في C. ايليجانس، وتراكم يشير البروتينات داخل الأسواط في كلاميدوموناس، وتراكم مملس داخل أهداب في الفئران (Lechtreck وآخرون، 2009.؛ وي وآخرون، 2012.؛. الين وآخرون، 2006؛ تشانغ وآخرون، 2012A). ولذلك، فإننا التحقيق مستقبلات الذاتية التي قد تتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - الفئران. وقد تبين أن مستقبلات الدوبامين D1 (D1R) تتراكم في أهداب في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). لتحديد ما إذا D1R يتراكم في أهداب في Bbs7 - / - الفئران، ونحن ملطخة أقسام الدماغ من النوع البري وBbs7 - / - الفئران مع العصبية ACIII أهداب علامة والأجسام المضادة ضد D1R. لا يمكننا العثور على أي تلطيخ الهدبية من D1R في البرية من نوع الدماغ (الشكل 6A-C). في المقابل، وجدنا مناطق متعددة بما في ذلك المخطط واللوزة حيث يموضع D1R لأهداب في Bbs7 - / - (الدماغ الشكل 6D-F). وتشير هذه البيانات إلى أن BBSome يمكن أن تنظم النقل إلى الوراء من D1R داخل أهداب الخلايا العصبية وفقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

تين. 6.
فقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للمستقبلات الدوبامين D1 داخل الأهداب. (A-F) أقسام الدماغ من النوع البري (A-C) وBbs7 - / - كانت ملطخة (D-F) الفئران مع مكافحة ACIII الأجسام المضادة ( الأحمر) كعلامة أهداب الخلايا العصبية ومكافحة D1R الأجسام المضادة (الخضراء). D1R يتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - مخ الفأر مقارنة البرية من نوع السيطرة. شريط النطاق: 20 ميكرون.

نقاش

وهدب هو عضية الهامة التي تلعب أدوارا متعددة خلال التنمية وفي التوازن من أنسجة البالغين. أهداب متحركة مهمة لوظائف مثل إزالة المخاط من الرئتين والدورة الدموية من السائل الشوكي الدماغي من خلال البطينين الدماغي، في حين أهداب الأساسي والمهم لchemo- والميكانيكية والإحساس، وكذلك القنفذ وWNT نقل الإشارة. وسلط الضوء على أهمية أهداب التي كتبها النتائج أن أهداب عطل يساهم في مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان المعروفة باسم ciliopathies التي تشمل متلازمة بارديه-بيدل.
BBS هو اضطراب عديد المظاهر التي تنطوي على العديد من أجهزة الجسم. بعض الظواهر BBS مثل السمنة، وتنكس الشبكية، والسكري، وارتفاع ضغط الدم لديها معدلات انتشار عالية في عموم السكان. ولذلك، فإن دراسة BBS يوفر فرصة فريدة من نوعها للكشف عن بعض مسارات الكامنة أو التأثير على هذه الأمراض الشائعة. BBS خروج المغلوب الفئران تحاكي النمط الظاهري البشري، وبالتالي توفير أداة مفيدة لاكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا المرض فضلا عن اختبار علاجات جديدة.
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا تشترك الظواهر BBS مشتركة، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. الأهم من ذلك، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر (كرمي وآخرون، 1995). وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، قد يكون الجينات BBS مختلفة ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هو جزء لا يتجزأ من BBSome ويتفاعل مع مجمع BBS chaperonin، وهي نتيجة فريدة من نوعها لBBS7 بين BBSome البروتينات جسديا. غياب BBS7 يؤثر على استقرار البروتين من BBS2 ويمنع تشكيل BBSome سليمة. ومع ذلك، لا تزال تشكل أهداب الابتدائية في غياب BBS7. على عكس بالضربة القاضية جين IFT، التي أهداب لا تشكل ويؤدي إلى الفتك الجنينية في الفئران، Bbs7 - / - الفئران يمكن البقاء على قيد الحياة إلى سن الرشد وأهداب الابتدائي لا تزال تشكل في الأنسجة بما فيها الكلى والجزر من البنكرياس، والقناة البنكرياسية، في الظهارية الكلوي مثقف الخلايا والخلايا الليفية. وعلى النقيض من أهداب الابتدائي، أهداب متحركة من خلايا البطانة العصبية بطانة البطينات الدماغية والحيوانات المنوية لديهم سياط عيوب خطيرة في Bbs7 - / - الفئران. أهداب متحركة المعيبة ليست بسبب وventriculomegaly المتقدمة في غياب BBS7 منذ أهداب عيب متحركة تطوير في وقت مبكر من 3 أسابيع في ependyma الدماغ. لا تفعل تظهر أهداب متحركة المعيبة أن يكون السبب الرئيسي للventriculomegaly. تطوير غير طبيعي للخلايا العصبية السلف قد تكمن وراء تطوير ventriculomegaly في هذا النموذج الماوس كما هو موضح لنماذج أخرى الماوس BBS لأن كلا BBS7 وBBS1 تعتبر ضرورية لسلامة BBSome (كارتر وآخرون، 2012). غياب BBS7 لا يؤثر على تشكيل المجمعات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف ما اذا تأثر الحركة من الجسيمات IFT التي كتبها غياب BBSome. ويبدو أن الجينات BBS والجينات IFT أن تؤثر على جوانب مختلفة من وظيفة الهدبية. نتائجنا في الفئران تتسق مع نتائج كلاميدوموناس، وتسليط الضوء على التفاعل بين BBSome ومجمع IFT (Lechtreck وآخرون، 2009).
أثبتنا أن BBS7 البروتين إيواء الطفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS7 (T211I وH323R) لديه قدرة انخفضت إلى تشكيل BBSome مقارنة مع البروتين BBS7 العادي. الأساليب المستخدمة هنا يمكن أن توفر نظام فحص خلية القاعدة فعال لتقييم طبيعة الطفرات مغلطة BBS الإنسان في المختبر.
في الآونة الأخيرة أظهرت الدراسات أن الجينات ذات الصلة أهداب، مثل AHI1 وغامض، وتشارك في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لالهدبية الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛. هسياو وآخرون، 2009). في المقابل، غياب BBS7 لا يؤثر على مسارات إما مستقلة بالكلاذرين وأو بالكلاذرين الإلتقام يتوقف. وبالمثل، وغياب أو طفرة من البروتينات BBS لا تؤثر على مسار إفرازية العام للبروتينات الغشاء بما في ذلك SST3R وترانسفيرين مستقبلات غشاء البلازما (جين وآخرون، 2010) (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن الاتجار حويصلة العامة لا يبدو أن يتطلب BBS7 أو BBSome والاتجار بروتينات معينة أو من غشاء البلازما يمكن أن يثير الشبهة في غياب BBSome. ومن الأمثلة على الاتجار مستقبلات اللبتين، وهو ما ثبت للتفاعل مباشرة مع BBSome (سيو وآخرون، 2009). ومن المثير للاهتمام، في C. ايليجانس، وفقدان BBS الجينات يؤدي إلى زيادة إطلاق سراح الحويصلات كثيفة الأساسية والأنشطة المعززة للأنسولين، نيوروبيبتيدي، وأمين مسارات إشارات الاحيائية (لي وآخرون، 2011). نستنتج أن BBS7 وبالتالي BBSome لا تشارك في الهدبي الاتجار العام بروتين الغشاء بل في محدد الغشاء الهدبي الاتجار البروتين. ويستند هذا الاستنتاج على ملاحظة أن الهدبية بروتينات غشاء مثل polycystin-1، polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر لا تزال المترجمة إلى غشاء الهدبية في الغياب التام للبروتين BBS7، وهو مطلوب لBBSome التجمع. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدلائل إلى أن polycystin-1، لا تزال polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر وظيفية في غياب BBS7. في المقابل، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم SMO داخل أهداب دون تحفيز SMO يجند (تشانغ وآخرون، 2012A). وقد ثبت الأخرى بروتينات الغشاء الهدبي بما في ذلك SST3R وMCHR1 لتوطين لأهداب الخلايا العصبية في ظل ظروف طبيعية، ولكن ليس في غياب BBS2 أو BBS4 (Berbari آخرون، 2008A.؛ Berbari وآخرون، 2008b.). ومع ذلك، فإن غياب BBS7 لا يؤثر توطين الهدبي إما SST3R أو MCHR1 في الخلايا العصبية في الدماغ أو في الخلايا المستنبتة من Bbs7 - / - الفئران (لا تظهر البيانات). في المقابل، تراكمت D1R داخل أهداب في غياب BBS7، على غرار النتائج في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). تراكم D1R داخل أهداب قد يرجع ذلك إلى النقل إلى الوراء تغير من D1R داخل أهداب في غياب BBS7. ودعما لهذا الاحتمال، وأظهرت الدراسات الجينية في الزرد إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل عند التعبير عن BBS يتم منع الجينات (الين وآخرون، 2006). وعلاوة على ذلك، SMO يتراكم داخل أهداب دون التحفيز يجند في غياب BBSome (تشانغ وآخرون، 2012A). تأخر نقل إلى الوراء يمكن أن تنجم عن النشاط تغير المحرك، خلل في مجمع IFT أو تتغير بنية أهداب axonemal، أو تغيير معين في قدرة بعض الشحنات للخروج من هدب. دراسات في C. ايليجانس تشير إلى أن البروتينات BBS بمثابة linkers بين مجمع IFT B ومجمع IFT A (Blacque وآخرون، 2004). وفقدان البروتينات BBS يؤدي إلى وظيفة غير لائقة المجمعات IFT. ودعما لهذا الاحتمال، المسوخ مضاعفة من Bbs7 وTg737orpk تفتقر تماما أهداب، تشبه مجمع IFT B بالضربة القاضية الحقيقية (تشانغ وآخرون، 2012A). بدلا من ذلك، أهداب الأساسي من المسوخ Bbs7 قد يكون لها أيضا خفية خلل في بنية axonemal التي قد تسهم في تراكم D1R داخل الأهداب. أهمية وظيفية من تراكم D1R داخل أهداب غير معروفة حاليا. وقد تبين أن المرضى BBS وBBS الفئران خروج المغلوب زادت القلق والاكتئاب (بارنيت وآخرون، 2002.؛ Eichers وآخرون، 2006.). ومن المثير للاهتمام، انسداد D1R السرقة مع الأدوية الموهن مكيفة التجمد (اختبار الخوف مشروط) أثناء الاختبار الاستبقاء (Guarraci وآخرون، 1999a... Guarraci وآخرون، 1999b). توطين D1R في مناطق الجسم المخطط واللوزة تشير إلى أن الدوبامين إشارات قد تلعب دورا لعيوب السلوك التي لوحظت في نماذج الماوس BBS والمرضى BBS.

المواد والأساليب

الكواشف والأجسام المضادة

وقد تم الحصول على الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS2 الببتيد DKTARYWRIK والأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS7 الببتيد VLQERENYQQ من توسيع النظم البيولوجية (هانتسفيل، AL). وكانت هذه الأجسام المضادة النقاء تقارب والتحقق منها في الفئران خروج المغلوب. وحيدة النسيلة المضادة للبيتا تويولين، بولكلونل مكافحة β-الأكتين، وحيدة النسيلة المضادة للالأسيتيل تويولين، وحيدة النسيلة المضادة للγ تويولين، بولكلونل الأرنب تم شراؤها مكافحة BBS8 وBBS9 من سيغما (سانت لويس، MO). تم شراء الماعز المضادة للBBS1 (N-20)، الماعز المضادة للBBS2 (C-16) الأجسام المضادة، والفأر مكافحة D1R الضد من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، CA). تم شراؤها لمكافحة T2R4 الضد الأرنب بولكلونل والأرنب المضادة للT2R43 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة من العلم الحرارية (بيتسبرغ، PA). تم شراؤها اليكسا 488 مترافق السم الكوليرا واليكسا 568 البشرية مترافق نقل مستقبلات من إينفيتروجن (كارلسباد، كاليفورنيا). وكان الأرنب بولكلونل المضادة للpolycystin-1 هدية من الدكتور أوكسانا Ibraghimov-Beskrovnaya (شركة جنزايم). كان الأرنب بولكلونل مكافحة polycystin-2 الأجسام المضادة هدية من الدكتور ستيفان Somlo (جامعة ييل)، والدكتور غريغوري Pazour (مدرسة الطب بجامعة ماساتشوستس).

جيل من Bbs7 الفئران خروج المغلوب

تم استخدام PCR لتضخيم 5 'و 3' مناطق Bbs7 الجينات من 129 / SVJ الحمض النووي الجيني والمستنسخة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC). تم خطي ناقلات و electroporated إلى R1 الجذعية الجنينية (ES) خلايا (129 × 1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). كما تم عرض G418 واستنساخ مقاومة للganciclovir التي كتبها بعيد المدى PCR لتحديد خطوط الخلايا ES المستهدفة بشكل صحيح. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES مستقلة لإنتاج الوهم. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Bbs7 الفئران متخالف على خلفية وراثية مختلطة من قبل التزاوج مع C57BL / 6J الفئران. تم intercrossed الفئران متخالف، وكان التنميط الجيني لسلالة بواسطة PCR. جميع الدراسات انضمت إلى المبادئ التوجيهية الموضوعة لرعاية واستخدام حيوانات التجارب وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR

تم عزل الحمض النووي الريبي من العمر 2.5 شهرا من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين الماوس باستخدام TRIzol كاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). وقد أعد كدنا] من 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مرتفع الثالث الناسخ العكسي (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا).

تحليل لطخة غربية

من النوع البري وBbs7 تعطلت الخصيتين متحولة من قبل TISSUEMISER (فيشر العلمية، بيتسبرغ، PA) في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100 و مثبط البروتياز من روش، انديانابوليس، IN). تم تجميد الأنسجة تعطلت في النيتروجين السائل وإذابة في حمام الماء درجة حرارة الغرفة. وتكررت هذه الدورة تجميد أذاب ثلاث مرات. ثم تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة وتم قياس تركيز supernatants باستخدام بيو راد العاصمة فحص البروتين (هرقل، CA).
تم فصل البروتينات عن طريق الكهربائي باستخدام 4-12٪ المواد الهلامية NuPAGE مكرر تريس (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا)، يليه نقل إلى الأغشية النيتروسليلوز وتم الكشف عنها من قبل SuperSignal دورا مددت الركيزة (بيرس، روكفورد، IL).

التحليل النسيجي للBbs7 - / - الفئران

الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ العينين والخصيتين من العمر 4-8 شهرا Bbs7 أجريت متحولة والعمر كعينة ضابطة من حد وصفه. أقسام الدماغ الاكليلية من 60-100 ميكرون من العمر 4-8 شهرا Bbs7 - - / كانت ملطخة الحيوانات والعمر كعينة ضابطة مع محايد الأحمر وصورت مع stereomicroscope أوليمبوس SZX12 كما هو موضح (ديفيس وآخرون، 2007.).

دراسات الوزن

تناول الطعام في قفص فردي Bbs7 - - / تم مقارنتها مع الحيوانات Bbs7 +/- والحيوانات البرية من نوع السيطرة تتراوح أعمارهم 4-28 أسابيع باستخدام متوسط ​​ستة حيوانات في كل مجموعة. تم تسجيل الوزن بداية الأسبوعية عند الفطام.

نقل الإلكترون المجهري

تم perfused الفئران مع نصف القوة تثبيتي Karnovsky وتم تشريح الأنسجة وإصلاحها في نصف القوة تثبيتي Karnovsky لعدة ساعات قبل الأوسيميوم بعد التثبيت، والجفاف، وتضمينها في الإي بي 812. نقل الميكروسكوب الإلكتروني اتخذت كما هو موضح سابقا (سويديرسكي وآخرون آل.، 2007).

جيل من BBS2 البشري وBBS7 متحولة بنيات الحذف والطفرات نقطة

تم إنشاء BBS7 المسوخ الحذف عن طريق PCR والمستنسخة في التعبير الثدييات ناقلات pCS2 +. وتم التحقق من كل المسوخ الحذف عن طريق التسلسل المباشر. تم إنشاؤها الطفرات نقطة BBS7 بواسطة الطفرات موقع الموجه (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا) باستخدام N-محطة الموسومة FLAG من النوع البري BBS7 كقالب والتحقق من التسلسل.

مناعي

تفاضلي الموسومة الجينات BBS الإنسان و transfected المشارك في الخلايا 293T. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت هي lysed الخلايا في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100، ومثبط البروتياز، روش، انديانابوليس، IN) ونسج في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تم مسح supernatants من قبل الحضانة مع حبات بروتين G (بيرس، روكفورد، IL). وحضنت لست] مسح مع الأجسام المضادة ضد علامات المقابلة لمدة 4 ساعات. وبعد ذلك يضاف بروتين G الخرز والمحتضنة لمدة 4 ساعات أخرى. تم غسلها حبات أربع مرات مع العازلة تحلل وتم الكشف عن التفاعلات التي النشاف الغربي.

المناعي المجهري

تم إصلاح الخلايا في 4٪ paraformaldhyde في برنامج تلفزيوني أو ثابتة مع الميثانول البارد لمدة 5 دقائق (ل-γ تويولين صمة عار) وpermeabilized مع 0.2٪ تريتون X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. تم غسلها الخلايا 3 × PBS وسدوا مع عازلة تمنع (1٪ BSA في PBS). وكانت مخففة الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تم غسلها الخلايا 3 × PBS، سدت مع عازلة تمنع، ثم حضنت مع فلور اليكسا 488 أو فلور اليكسا 568 المسمى الأجسام المضادة الثانوية (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). كانت ملطخة النوى مع دابي (سيغما، سانت لويس، MO).

كلية زراعة الخلايا الأولية

الكلى من النوع البري وBbs7 - / - تم تشريح الفئران وتعقيمها قبل التنسيب إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 ثوان، ثم مفروم مع مقص. تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 دون المصل. 20 مل من pronase (1 ملغ / مل، روش، انديانابوليس، IN) وأضيف إلى الأنسجة والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 وحضنت مع 20 مل 1-× التربسين EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. تم مكعبات الأنسجة في 500 غ لمدة 5 دقائق وإعادة علقت في 30 مل DMEM / F-12 مع 10٪ مصل. كانت مطلية الأنسجة إعادة علقت في ثلاثة أطباق 10 سم مغلفة بولي-L-ليسين (سيغما، سانت لويس، MO).

السم الكوليرا وترانسفيرين مستقبلات الإلتقام

أجريت السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة المقايسات الإلتقام كما وصفها هسياو وآخرون. (هسياو وآخرون 2009).

التصوير الكالسيوم

تم إجراء التصوير الكالسيوم كما هو موضح سابقا (شاه وآخرون، 2009). خلايا الكلى مثقف من النوع البري وBbs7 - / - تم تحميل الفئران مع 1 ميكرومتر Fura2 صباحا، تم تقييم التغييرات تركيز الكالسيوم في ظهائر باستخدام مجهر مقلوب (نيكون الكسوف TE200، نيكون انسترومنتس، ميلفيل، NY)، والبيانات تم تحليلها باستخدام برنامج شيكل، عناصر (نيكون). تم تطبيق ديناتونيوم apically في تركيزات المشار إليها. تم استخدام برنامج تلفزيوني عن السيطرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #18  
قديم 11-23-2015, 09:28 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي استقلاب الطاقة في متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.nature.com/ijo/journal/v2.../0802420a.html

لخص

مقدمة: السمنة هي ميزة عرض ثابت من متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، وهو اضطراب وراثي ناجم عن خلل جيني واحد. وهذا يتناقض بشكل حاد مع السمنة العامة التي، على الرغم من عنصر وراثي قوي، لديه المسببات المرضية سياقاتها. لBBS، والتوصيف المظهري من مكونات توازن الطاقة وآثار ذلك على إدارتها لا يزال لا يتم التحقيق نسبيا.
الهدف: دراسة الحالات والشواهد لتحديد ما إذا كان استقلاب الطاقة في الموضوعات مع BBS يختلف من الضوابط السمنة يقابل وإبلاغ إدارة السريرية لهؤلاء المرضى.
الطريقة: ما مجموعه 20 شخصا يعانون من السمنة المفرطة وزيادة الوزن مع BBS (11 إناث و 9 ذكور) يقابل بالنسبة للعمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم ل20 شخصا دون BBS. وقد تم قياس معدل الأيض يستريح (RMR) من خلال الكالوري غير المباشرة، والنشاط الجسدي من قبل accelerometry CSA، وتكوين الجسم عن طريق تقنية الديوتيريوم تخفيف والمدخول الغذائي من خلال السجلات الطعام لمدة 7 أيام.
النتائج: كان هناك اختلاف كبير بين BBS والسيطرة المواضيع في الدهون في الجسم (الذكور:٪ من الدهون = 38، SD 2.8 مقابل 34، SD 9.1، الإناث:٪ من الدهون = 45، SD 5.9 مقابل 44، SD 8.1؛ P = 0.46] أو RMR المطلق. (الذكور: 6.95، SD 1.55 MJ / يوم مقابل 7.19، SD 1.28 MJ / يوم؛ P = 0.6) بعد التعديل للمساواة بين الجنسين والعمر والكتلة الخالية من الدهون وكتلة الدهون، لم يكن هناك اختلاف كبير في RMR بين BBS ومراقبة المواد (F (1، 30) = 0.91؛ P = 0.35). وقد لوحظ انخفاض مستوى النشاط البدني في المواد BBS (الأنابيب النانوية الكربونية متوسط ​​/ دقيقة 259، الربعية = 153) مقارنة بالمجموعة الضابطة (الأنابيب النانوية الكربونية متوسط ​​/ دقيقة = 306، الربعية = 119، P = 0.02). استهلاك الطاقة المبلغ عنها، وتكوين المغذيات الكبيرة وضخامة في الإبلاغ كانت مماثلة في المجموعتين.
الخلاصة: هذه الدراسة تكشف أي دليل على الاختلافات المنهجية في استقلاب الطاقة في الموضوعات مع BBS النسبي للأفراد يعانون من السمنة المفرطة الآخرين، مما يدل على أن الأساس الجيني للBBS لا يرتبط مع تشوهات معينة في عملية التمثيل الغذائي للطاقة. هذا اكتشاف مهم لإدارة السريرية ويدعم استخدام الوصفات الطاقة على أساس RMR للسكان يعانون من السمنة المفرطة العام مضافا إليه بدل المناسب للحصول على الطاقة التي أنفقت عبر النشاط البدني. هناك حاجة إلى مزيد من البحوث بشأن النشاط البدني في BBS.
الكلمات الدالة:

متلازمة بارديه-بيدل، توازن الطاقة، وتكوين الجسم، والتدبير العلاجي السريري

أعلى الصفحة مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب المتنحية autosomally تتميز الضمور قضيب مخروط، polydactyl خلف المحور، وصعوبات التعلم، وقصور الغدد التناسلية، تشوهات الكلى والسمنة. ويقدر انتشار BBS في سكان المملكة المتحدة في 1: 125 000 (Beales، بيانات غير منشورة)، على الرغم من معدلات أعلى من ذلك بكثير وقد لوحظ في السكان المعزولين محدد حيث القرابة هي ظواهر أكثر شيوعا، على سبيل المثال، 1:17 500 في نيو فاوند لاند ، 1 01:13 500 في البدو العرب. 2
A انتشار أعلى بكثير من السمنة (BMI ومن المعروف 30KG / م 2) موجودة في الموضوعات مع BBS (52٪) 3 مقارنة لعموم السكان (20٪) ويفترض أن هذا يرتبط أيضا مع أمراض المصاحبة خطيرة. جمعية BBS (www.lmbbs.org.uk) وقد حددت السمنة باعتبارها واحدة من أهم السمات المؤلمة من متلازمة مع طلبات متكررة للمساعدة في إدارتها (باركر، اتصال شخصي، 1996).
على الرغم من هذه الأهمية، ولا يعرف سوى القليل من المسببات المرضية للسمنة في BBS، ولا سيما فيما يتعلق استقلاب الطاقة. فهم أكثر وضوحا من العوامل التي تقوم عليها التقلبات الطاقة قد يسمح بتطوير استراتيجيات إدارة أكثر يتناسب لاستخدامها في هذه الفئة من السكان فريدة من نوعها وكذلك امكانية توفير قدر أكبر من التبصر في المسببات المرضية للسمنة بهم.
السابق البحوث توازن الطاقة في حالة وراثية قابلة للمقارنة، متلازمة برادر ويلي (PWS)، قد توفر أدلة إلى العوامل الكامنة وراء المشاركة في السمنة المرتبطة BBS. وكان الدافع البحث في استقلاب الطاقة في PWS في البداية من قبل التقارير القصصية من الموضوعات التي تتطلب جدا مآخذ الطاقة المنخفضة لتسهيل فقدان الوزن. وتوجد تقارير مماثلة في BBS (Beales، اتصال شخصي، 1996).
في دراسة واحدة، ومجموع نفقات الطاقة (TEE)، وتقاس باستخدام الماء وصفت على نحو مضاعف، وجدت لتكون أقل 47٪ في الموضوعات مع PWS من نظيراتها يعانون من السمنة المفرطة (PWS، 8.27 MJ / يوم، SD 2.42 مقابل الضوابط يعانون من السمنة المفرطة، 15.47 MJ / اليوم، SD 3.42). 5 أكدت باقي مزيد من العمل مؤخرا هذه النتائج في البالغين PWS 6 والأطفال. 7 ومن الواضح أن هذه النتائج لها آثار في إدارة PWS السمنة مع انخفاض كبير الوصفات الطاقة اللازمة لإنقاص الوزن والصيانة. 8 ومع ذلك، هناك أيضا تقارير عن تخفيضات كبيرة في يستريح نفقات الطاقة بالنسبة لضوابط؛ على سبيل المثال، كان استهلاك الطاقة يستريح المطلق 5.36 1.18 MJ في PWS المراهقين مقارنة مع 6.38 1.55 MJ في الضوابط السمنة يقابل. 7 يعكس وخلص المحققون عموما أن أقل TEE لا تعكس الاختلافات في التمثيل الغذائي للطاقة، وخفض بدلا معدل الأيض يستريح المطلق تشوهات في تكوين الجسم مع انخفاض الكتلة الخالية من الدهون (بعثة تقصي الحقائق) لعمر في PWS مقارنة تتأثر الموضوعات. 6 في الواقع عندما تطبيع لأصغر بعثة تقصي الحقائق، وقلص الفارق في RMR إلى 14٪. 5
وقد أكدت الأبحاث اللاحقة نسبة غير عادية من الدهون حر في كتلة الدهون (FM) في PWS. أظهر الكلي تحليل الجسم عن طريق المزدوج للطاقة الأشعة السينية قياس امتصاص (DXA) لبعثة تقصي الحقائق أقل من ذلك بكثير في مواضيع PWS البدينات مقارنة مع الوزن الطبيعي، والموضوعات nonaffected يعانون من السمنة المفرطة، مع ندرة قوسين أو أدنى من الأنسجة العجاف في الأطراف. 9 وبالمثل، وهي نسبة أعلى تم العثور على الدهون في الجسم في الدراسات التي تقارن PWS لضوابط السمنة 10 مع الدهون الزائدة المودعة غير معتادة في الأطراف البعيدة، وكذلك المنطقة جذعي. 11
كثيرا ما توضع التشابه بين PWS وBBS في إدارة السمنة مع وصفات الطاقة والاستراتيجيات الغذائية لاستخدامها في PWS تطبق عادة لإدارة الوزن في BBS، ولكن لا يوجد دليل على دعم لهذه الممارسة.
على حد علمنا، وهذا هو أول دراسة للتحقيق في استقلاب الطاقة في الموضوعات مع BBS. قياس استهلاك الطاقة يستريح المطلق، جنبا إلى جنب مع التدابير من النشاط البدني، ويسمح تقديرات الاحتياجات من الطاقة وهذا له تطبيقات سريرية هامة في إدارة السمنة في BBS. قياس مكونات الجسم يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للعوامل المحتملة التي ينطوي عليها التقلبات الطاقة المفترضة في BBS. وأخيرا، وتقييم استهلاك الطاقة المبلغ عنها وتكوين المغذيات الكبيرة في النظام الغذائي قد توفر بعض الأفكار في وجود أو طبيعة اختلالات تناول الطعام في BBS.

أعلى الصفحة المواد والأساليب

تصميم الدراسة والموضوعات

هذه الدراسة الحالات والشواهد قياس معدل الأيض يستريح، وتكوين هيئة والنشاط البدني وذكرت استهلاك الطاقة في المواد BBS والموضوعات السمنة nonaffected يقابل بالنسبة للعمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم.
تم الحصول على الموافقة الأخلاقية في ديسمبر 1996 من شرق لندن ولجنة أخلاقيات البحوث سلطة مدينة دبي الطبية. كما كانت جميع المواد BBS المكفوفين أو ضعاف البصر بشدة، وكانت كل المعلومات المتاحة على دراسة audiocassette وكذلك شكل ورقة الطباعة القياسية والكبيرة. ونظرا لصعوبات التعلم الخاصة بهم، والحرص الشديد، في وجود عامل قريب أو الرعاية، لشرح الدراسة وضمان أبلغت أن موافقة جيدا بما فيه الكفاية.
المواضيع

تطوع ما مجموعه 24 شخصا مع BBS للمشاركة في الدراسة وجود يجري تحديدها من قبل المحققين (CG، PB) من قاعدة بيانات جمعتها سابقا من 61 محتملة مؤهلة البالغين BBS. تم فحص جميع المواد للتأكد من أنها تستوفي المعايير التشخيصية لBBS، 3 ومعايير اختيار دراسة: BMI 25 كجم / م 2 والعمر 18 ص، ووزن الجسم 2 كغ في 2 أشهر المتابعة، أي حالة طبية أو الأدوية التي قد تؤثر على وزن الجسم، وتوازن السوائل أو عملية التمثيل الغذائي (مثل المنشطات، مدرات البول، والودي، هرمون الغدة الدرقية).
أربع مواد مع BBS لم تستوف معايير الاختيار واستبعدت للأسباب التالية: تشخيص مرض السكري من النوع الثاني = 1)، العلاج ببدائل الغدة الدرقية = 2)، وكبير تغير الوزن = 1).
في كل شيء، 22 شخصا الملائمة للعمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم، ولكن يتأثر BBS أو متلازمات أخرى محددة وراثيا المرتبطة بالسمنة، تطوعت للمشاركة التالية دعوة مباشرة والإعلان الملصق في عيادة السمنة في مستشفى لندن الملكي. تم استبعاد موضوعين بسبب فقدان الوزن كبيرة في الشهرين السابقين والعلاج ببدائل الغدة الدرقية.
القياسات

تم تسجيل وزن الجسم والطول مع المواد ارتداء ملابس خفيفة وليس الأحذية. وقد تم قياس وزن الجسم باستخدام مقياس رقمي الإلكترونية (سيكا ألفا سلسلة 770) بسعة 200 كجم ودقيقة لأقرب 0.1 كجم. وقد تم قياس ارتفاع استخدام Holtain الحائط صتدمتر دقيقة لأقرب 0.5 سم. وقد تم قياس محيط الخصر في منتصف الطريق في خط منتصف الإبط بين أدنى حافة القفص الصدري وعرف الحرقفة. 12
وقدرت كتلة الدهون وبعثة تقصي الحقائق باستخدام تقنية التخفيف الديوتيريوم لقياس ماء الجسم الكلي. 13 وقد تم قياس Predose تخصيب الديوتيريوم في الماء الجسم في عينة اللعاب الأساسية التي تم الحصول عليها من كل موضوع باستخدام salivette. ثم اعطيت الموضوعات للشرب، وذلك باستخدام القش، ما يقرب من 0.35 مول 2 H 2 O في 100 مل من الماء في زجاجة preweighed. على الانتهاء، وكان ممرود القشة في زجاجة فارغة وزجاجة reweighed. وسجلت وقت الجرعات الديوتيريوم وكمية معينة. في 4 ساعات بعد الجرعة، تم أخذ عينة اللعاب الثانية في وحدة البحوث. وقدمت المواضيع مع اثنين salivettes أخرى، وطلبت أن يتبع نفس الإجراء لجمع عينات من اللعاب في 5 و 6 ساعات. وقدم حزمة المدفوعة مسبقا للعودة العينات، التي تم طرد في وقت لاحق والمجمدة.
وقد تم قياس 2 H تخصيب اليورانيوم في عينات اللعاب في MRC الإنسان بحوث التغذية، كامبريدج، المملكة المتحدة باستخدام نسبة النظائر مطياف الكتلة بعد حالة توازن مع H 2 الغاز كما هو موضح في مكان آخر. 14 تم احتساب 2 H مساحة 2 التخفيف باستخدام معادلات نشرت سابقا 13 وانخفضت بنسبة 4٪ لحساب تبادل الديوتيريوم مع الهيدروجين لامائي. 15، 16 وكان من المفترض أيضا أن حسابات المياه عن 71.94٪ من بعثة تقصي الحقائق. تم حساب الدهون في الجسم والتي تمثل الفرق بين وزن الجسم وبعثة تقصي الحقائق.
وقد تم قياس RMR باستخدام منهجية سبق نشرها. 17 ومعايرة Deltatrac II جهاز التمثيل الغذائي باستخدام معايرة الغاز التلقائية ومحدد التدفق وضعت في مجموعة الكبار. تم إجراء القياس في الصباح الباكر، في غرفة هادئة على وحدة البحوث بعد المواد قد صام بين عشية وضحاها (12 ساعة أو أكثر دون المواد الغذائية والسوائل الحرارية أو السجائر).
ونصح المواضيع على ارتداء ملابس خفيفة والاسترخاء على الأريكة قبل بدء القياس بعد أن سبق إطلاع على المعدات. وقد تم قياس تبادل الغازات في الجهاز التنفسي أكثر من 30 دقيقة.
وقد تم قياس النشاط البدني باستخدام نموذج actigraph CSA سئل 7164. الموضوعات لارتداء الشاشة من وقت يتزايد فيه في الصباح حتى الذهاب إلى الفراش في المساء لمدة 7 أيام متتالية. وأعرب عن البيانات التي تم جمعها كما تهم النشاط في الدقيقة (الأنابيب النانوية الكربونية / دقيقة).
كان استهلاك الطاقة باستخدام طعام يومية لمدة 7 أيام، تتزامن مع تدابير النشاط البدني المبلغ عنها ذاتيا. وطلب من الموضوعات لجعل سجلات مفصلة لجميع المواد الغذائية والمشروبات في وقت الاستهلاك. 18 وكان تعديل أسلوب اليوميات الغذاء القياسية اللازمة في موضوعات BBS بسبب الصعوبات التي يواجهونها البصرية. سجلت الموضوعات تناول طعامهم لمدة 7 أيام باستخدام الإملاء 19، 20، وكان كتب من المعلومات من قبل المحقق (CG). ومن المسلم به أن هذا التعديل قد أدخلت خطأ عشوائي إضافية. وقدرت أحجام جزء باستخدام التدابير المنزلية وإذا لم يكن جزء حجم المتاحة، وجرى الاستعاضة عن متوسط ​​أحجام جزء. وقد تم تحليل سجلات النظام الغذائي باستخدام الإصدار Microdiet 8 برنامج للحصول على الطاقة الإجمالية، من اجمالي الكربوهيدرات والدهون والبروتين.
تم تقييم معقولية من الطاقة المأخوذة أفادت باستخدام غولدبرغ قطع. 21 وأفاد متوسط ​​EI (EI ممثل) للمجموعتين ومقارنة مع PAL المتوقع للسكان. كما خطأ متأصل في قياس RMR، EI وPAL، حسبت حدود الثقة باستخدام الصيغة التي سبق وصفها. 21
فقط 16 من أصل 20 موضوعا BBS الانتهاء مرض الديوتيريوم تخفيف تقييم تكوين الجسم. تستند البيانات المتعلقة RMR تعديل لتكوين الجسم على بيانات من 16 شخصا BBS و 20 الضابطة. وأبلغ جميع البيانات الأخرى لجميع المواد الدراسية 20 مع BBS وضوابطها يقابل.
كانت دقة القياسات نسبة النظائر لعينات predose 0.19 جزء في المليون جرعة بمتوسط ​​قيمة 151.6 جزء في المليون. وكانت القيم المقابلة للجرعة عينات آخر 0.55 جزء في المليون التنمية المستدامة في 291.9 جزء في المليون.
تم احتساب دقة بعثة تقصي الحقائق والجسم قياسات الدهون حيث بلغ متوسط ​​السيرة الذاتية٪ من القيم المحسوبة من القياسات 4 و 5 و 6 ساعات من النظائر التخفيف. وكانت القيم 1.1٪ لبعثة تقصي الحقائق و 1.8٪ للFM.
القياس الإحصائي

وقد أجريت جميع التحاليل الإحصائية باستخدام SPSS النسخة 10 (SPSS، UK المحدودة).
تم استخدام النمذجة الخطية لوصف العلاقة الرياضية بين متغير النتيجة RMR وcovariables أخرى مثل العمر والجنس وأيضا لتحديد ما إذا كان تشخيص BBS تمثل أي اختلافات في RMR.
في التحليل وحيد المتغير التباين، تم إدخالها RMR كما تعتمد متغير والتشخيص ونوع الجنس كعوامل، والعمر، وبعثة تقصي الحقائق FM كمتغيرات. تم تقييم التفاعلات أيضا بين الجنسين وتكوين الجسم ومجموعة والمتغيرات تكوين الجسم.
تم استخدام ر -test مستقلة لتحديد ما إذا كان أي وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين BBS والضابطة في استهلاك الطاقة المبلغ عنها أو تكوين المغذيات الكبيرة من النظام الغذائي. تم حساب RMR لكل مجموعة ومقارنتها مع قطع من غولدبرغ لتحديد مدى نقص التقرير: إن متوسط ​​EI ممثل واحد. ونظرا لطبيعة اللامعلمية للبيانات النشاط، تم استخدام مان ويتني U -test لتقييم الفروق بين مستويات النشاط في المجموعتين.

أعلى الصفحة النتائج

الجدول 1 يوضح الخصائص عرض من الموضوعات مع BBS وضوابطها يقابل. كما هو مخطط لها، لم يلاحظ أي اختلاف كبير بين المجموعتين في العمر، الوزن أو الطول. لم يتم العثور على الاختلافات بين الجنسين ضمن المجموعة BBS أو السيطرة على الوزن، والعمر، ومؤشر كتلة الجسم أو الخصر.
الجدول 1 - الخصائص الفيزيائية للBBS والضابطة.

الجدول الكامل

الشكل 1 يوضح أنه لا يوجد اختلاف كبير في RMR المطلق بين BBS والضابطة (يعني RMR = 6.95، SD 1.55 MJ، 7.19، SD 1.28 MJ على التوالي، P = 0.6). كان وزير الخارجية وبعثة تقصي الحقائق أيضا مماثلة في المجموعتين (الذكور:٪ من الدهون = 38، SD 2.8 مقابل 34، SD 9.1، الإناث:٪ من الدهون = 45، SD 5.9 مقابل 44، SD 8.1؛ P = 0.46) (انظر الجدول 2) . عندما تم تصحيح RMR لبعثة تقصي الحقائق، لم يكن هناك اختلاف منهجي في الأيض بين المجموعات كما هو موضح في الشكل 2 (F (1، 33] = 0.13؛ P = 0.72).
الشكل 1.

Boxplot من RMR دون تصحيح categerised من قبل المجموعة.
الرقم الكامل وأسطورة (34 K)

الرقم 2.

العلاقة بين RMR وبعثة تقصي الحقائق من قبل المجموعة.
الرقم الكامل وأسطورة (63 K)

الجدول 2 - بيانات تكوين الجسم لBBS ومراقبة المواد تقاس تقنية الديوتيريوم التخفيف.

الجدول الكامل

وأجري تحليل وحيد المتغير التباين مع المتغيرات بعثة تقصي الحقائق، وزير الخارجية والسن والعوامل الجنس والفئة. وأوضح المتغيرات معا 64٪ من التباين في RMR، مع عدم وجود تباين إضافي يتم شرحه من قبل BBS (F (1، 30) = 0.91؛ P = 0.35). تم العثور على نوع الجنس وبعثة تقصي الحقائق أن يكون لها تأثيرات رئيسية كبيرة على RMR (F (1،30) = 27.1، P <0.001؛ F (1، 30) = 34.59، P <0.001 على التوالي). وكان وزير الخارجية على الشريط الحدودي دلالة (F (1، 30) = 3.84؛ P = 0.06).
بعد إزالة سن المتغيرات nonsignificant والتشخيص من التحليل، ونموذج يفسر 65٪ من التباين في RMR ويتضمن بعثة تقصي الحقائق المتغيرات وFM وعامل الجنسين.
بالإضافة إلى تقييم التأثيرات الرئيسية لكل عامل، أجري مزيد من التحليل لتحديد ما إذا كانت هناك تفاعل بين العوامل. بعد التعديل المناسب، لم يلاحظ أي اختلاف آثار بعثة تقصي الحقائق وFM على RMR بين BBS والضابطة (F (1، 26) = 0.04، P = 0.85؛ F (1، 26) = 0.29، P = 0.60 على التوالي ). وبالمثل، لم يكن هناك تفاعل كبير بين FM أو بعثة تقصي الحقائق والجنس (F (1، 26) = 0.41؛ P = 0.53، F (1، 26) = 0.11؛ P = 0.75).
وقد تم الحصول على بيانات غير كاملة بشأن النشاط البدني من actigraph والوحيدة تدابير من الموضوعات مع 5 أيام على الأقل وأدرجت ما لا يقل عن 9 ساعات تسجيل في التحليل. وقد رفضت بيانات من خمس (13٪) الموضوعات. من تلك الموضوعات المدرجة في التحليل، كان يرتديها الشاشة لمدة متوسطها 14.5 1.43 ساعة / يوم. ولوحظ وجود انخفاض مستوى النشاط البدني في المواد BBS [الأنابيب النانوية الكربونية متوسط ​​/ دقيقة 259، الربعية = 153) مقارنة بالمجموعة الضابطة (الأنابيب النانوية الكربونية متوسط ​​/ دقيقة = 306، الربعية = 119، P = 0.02).
كانت بيانات استهلاك الطاقة تقييم نقدي باستخدام غولدبرغ قطع. ويعني EI مندوب: BMR اللازمة لتتجاوز 1.43 في مواضيع BBS و 1.42 في الضابطة لالمدخول الغذائي للنظر معقولة خلال فترة التسجيل. ان وجود كمية الطاقة في الإبلاغ مقارنة بين المجموعتين مع متوسط ​​EI: RMR = 1.24، SD 0.3 في المجموعة BBS وEI: RMR = 1.11، SD 0.35 في السيطرة على المجموعة. استخدام ر مستقلة -test، لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط ​​ذكرت استهلاك الطاقة بين BBS والضابطة في أي الذكور (P = 0.06) أو مواضيع الإناث (P = 0.1) (يعني ذكرت EI: الإناث BBS 7.78 MJ، الإناث السيطرة 7.09 MJ، BBS الذكور 9.03 MJ، ومراقبة ذكور 8.75 MJ). لم يكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في تكوين المغذيات الكبيرة في النظام الغذائي، والطاقة نسبة من البروتين، (BBS 15٪ مقابل السيطرة 15.6٪، P = 0.44)، والطاقة نسبة من الدهون (BBS 40.3٪ مقابل الضوابط 38٪، P = 0.98 ) والطاقة نسبة من الكربوهيدرات (BBS 41.8٪ مقابل 42.2٪ في الضوابط، (P = 0.49).

أعلى الصفحة نقاش

BBS هو متلازمة حيث تعتبر التشوهات الجينية العوامل الأساسية في تطوير البدانة. على الرغم من هذا، هناك معلومات ضئيلة عن كيف يمكن لهذا الاستعداد الوراثي هو واضح من حيث التشوهات الفسيولوجية والبيوكيميائية.
وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة للتحقيق في استقلاب الطاقة في الموضوعات مع BBS. منذ RMR هو المحدد الرئيسي لاستهلاك الطاقة، توفر قياس RMR نظرة مفيدة في متطلبات الطاقة المقدرة في BBS. بسبب الظواهر معترف بها من دون الإبلاغ عن استهلاك الطاقة وخاصة في السمنة، فمن المستحسن عموما أن الغذائية المشورة إدارة الوزن يقوم على تقديرات نفقات الطاقة بدلا من ذكرت استهلاك الطاقة. 22 ولذلك فمن المهم للمهنيين الصحيين المعنيين في إدارة تشوه السمنة أن تكون مجهزة المعرفة القائمة على الأدلة من نفقات الطاقة في هذه المجموعة.
لا توجد اختلافات كبيرة عند مقارنة RMR المطلق في BBS والضوابط يعانون من السمنة المفرطة (6.96، SD 1.56 MJ مقابل 7.19، SD 1.28 MJ، على التوالي) أو بعد التعديل لتكوين الجسم. هذا هو على النقيض من استهلاك الطاقة في PWS، حيث لوحظ على RMR إلى حد كبير أقل المطلق ما يقرب من 20-50٪. 23 تصميم الدراسة ويوفر أكثر من 90٪ من الطاقة للكشف عن مثل هذا الفارق الكبير إذا كانت موجودة في BBS. في الواقع، وكان يعمل لكشف الفروق في نفقات الطاقة أكبر من 17٪، ​​ما يقرب من ضعف السيرة الذاتية ليستريح معدل الأيض في الاشخاص الاصحاء. ومع ذلك، فمن المسلم به أن الاختلافات أكثر دهاء في يستريح نفقات الطاقة بين BBS والضابطة، أقل من 17٪، قد لا يتم الكشف.
معدل الأيض المنخفض نسبيا في PWS هو في جزء تفسير تخفيضات متناسبة في بعثة تقصي الحقائق، 6 لكن لا يوجد مثل هذه الاختلافات في تكوين الجسم بين الموضوعات مع BBS ووحظت في هذه الدراسة الضوابط، على الرغم من استخدام أسلوب المرجعية لقياس مكونات الجسم . وتشير الاختلافات البارزة في استهلاك الطاقة بين الموضوعات مع BBS وPWS أن الوصفات الطاقة مقارنة غير ملائمة. نظرا للتشابه في تكوين الجسم والعناصر الأرضية النادرة بين BBS والضوابط يعانون من السمنة المفرطة، وهذا يعني أن عملية احتساب الوصفات الطاقة يجب أن تكون مطابقة لتلك المستخدمة في عموم السكان.
هناك، ومع ذلك، بعض الأدلة الأولية من انخفاض مستوى النشاط البدني في BBS بالنسبة لمواضيع السمنة nonaffected. تخفيضات في النشاط البدني هي معقولة بالنظر إلى المعوقات المادية المرتبطة BBS، وهذا قد تخفف من إجمالي احتياجاتها من الطاقة.
لم تعالج هذه الدراسة الحالات والشواهد على وجه التحديد أساس السببي للسمنة في BBS، ولكنها توفر بعض وجهات النظر الهامة للبحث في المستقبل. وقد تم قياس RMR في المواضيع حيث تأسست السمنة بالفعل وأنه لا يمكن استبعاد أن انخفاض RMR يمكن أن تشارك في التنمية في وقت مبكر من السمنة في BBS. لا يمكن تحويل بيانات عن النشاط البدني في الاختلافات الكمية في استهلاك الطاقة، لكنها تشير إلى أن محدودية استهلاك الطاقة ذات الصلة النشاط قد يكون من العوامل الهامة في تطوير البدانة في BBS.
بدلا من ذلك، أي أساس التمثيل الغذائي للبدانة في BBS قد تكون ذات صلة أكثر إلى خلل في تنظيم الشهية مما يؤدي إلى فرط الأكل وتناول المفرط للطاقة بدلا من تشوهات في استهلاك الطاقة بوساطة، على سبيل المثال، من خلال متعاطفة ظيفة الجهاز العصبي أو التمثيل الغذائي في العضلات والهيكل العظمي. 24
ومن اللافت للنظر النظريات السلوكية التي تؤثر على التحكم في تناول الطعام أو ممارسة النشاط البدني. وقد اقترحت النظريات البيئية والاجتماعية المختلفة التي قد تساهم جزئيا في تفسير الجمعيات المستقلة بين صعوبات التعلم وتطوير السمنة في المجموعات السكانية الأخرى. ومع ذلك، لا توجد بيانات وبائية شاملة عن مدى انتشار المسببات المرضية أو السمنة في الذين يعانون من صعوبات التعلم. ومن المؤكد أن هناك مجموعات معينة (BBS، 3 PWS 25 ومتلازمة داون 26) حيث ارتفاع معدل انتشار السمنة صعوبات التعلم والتعايش، ولكن يبقى من غير الواضح ما إذا كانت هذه العلاقة السببية. وتشمل التفسيرات المحتملة محدودة المعرفة الغذائية، ونوع من الذين يعيشون الترتيب والمرافق النظام الغذائي والنشاط أنماط، روح حول ممارسات التغذية، وتقييد الغذاء والنشاط أو الاعتماد على الآخرين للإشراف على النظام الغذائي وممارسة الرياضة بشكل مناسب. 27، 28، 29
النتائج المستخلصة من هذه الدراسة مهمة في التدبير العلاجي السريري من السمنة في BBS. وتقترح أن هناك حاجة إلى مزيد من البحث في إجمالي احتياجات الطاقة من الموضوعات مع BBS، ولكن في الوقت الحاضر يرسم المهنيين الصحيين بعيدا عن تقديم المشورة للغاية حمية منخفضة الطاقة، كما تستخدم في PWS. في PWS، وتستخدم الوجبات الغذائية 4.18 MJ أو أقل شيوعا، وسيكون تطبيق المبادئ التوجيهية مماثلة لBBS وضع مواضيع في العجز في الطاقة كبير وربما بخرق الالتزام على المدى الطويل والذي يعرف إلى تحسين مع تقييد متواضع الطاقة. 30 وحتى بيانات عن TEE هي متوفرة، فمن أكثر ملاءمة للاستخدام تقديرات نفقات الطاقة يستريح على السكان يعانون من السمنة المفرطة العام مع بدل المناسب لممارسة النشاط البدني استنادا إلى الظروف الفردية والقدرات البدنية.

أعلى الصفحة المراجع

  • JS الخضراء، Parfrey PS، هارنيت دينار، فريد NR، كريمر BC، جونسون G، هيث O، McManamon PJ، أوليري E، Pryse فيليبس W. المظاهر الأساسية للمتلازمة بارديه-بيدل، وهو شكل من ورانس-Moon- . بيدل متلازمة ن ي ميد 1989؛ 321: 1002-1009. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • فرج TI، الطيبي AS. ارتفاع عدد حالات متلازمة بارديه-بيدل بين البدو كلين جينيه 1989؛ 36: 463-465. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • Beales PL، Elciolglu N، ولف AS، باركر D، Flinter FA. معايير جديدة لتحسين تشخيص متلازمة بارديه-بيدل: نتائج مسح السكان J ميد جينيه 1999؛ 36: 437-446. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • المسح الصحي لانكلترا: الجداول المرجعية الكبار المتاحة من www.doh.gov/stats/trends1.htm.
  • SCHOELLER DA، فيتسكي LL، بانديني LG، ديتز WW، الإنفاق Walczak A. الطاقة وتكوين الجسم في متلازمة برادر ويلي الأيض 1988؛ 37: 115-120. | مجلات |
  • Brynes AE، غولدستون AP، توماس EL، بل دينار، هولندا A، بلوم ريال، يتم تقليل فروست G. معدل الأيض يستريح في متلازمة برادر ويلي نتيجة لتغير تكوين الجسم (ملخص) بروك البندق شركة نفط الجنوب 1998؛ 57: 100A .
  • فان ميل EA، Westerterp KR، Gerver WJ، Curfs LM، Schrander-Stumpel CT، كيستر AD، ساريس WH. وأوضح نفقات الطاقة في الراحة وأثناء النوم عند الأطفال المصابين بمتلازمة برادر ويلي من خلال تكوين الجسم آم J كلين نوتر 2000؛ 71: 752-756. | مجلات |
  • مارشال BD، شيخ J، O'Bosky D، C والاس، والعلاج السلوكي ليبرمان R. متلازمة برادر ويلي Behav ذر 1979؛ 2: 22.
  • برامبيا P، بوثيو L، مانزوني P، Pietrobelli P، بيكاريا L، وتكوين هيئة Chiumello G. غريب في المرضى الذين يعانون من متلازمة برادر ويلي-Labhart-ي صباحا كلين نوتر 1997؛ 65: 1369-1374. | مجلات | ChemPort |
  • Bakke BL، Draheim CC، مندوزا W، Serfass RC. معدل الأيض أثناء الراحة وممارسة الرياضة في البالغين الذين يعانون من متلازمة برادر ويلي. المؤتمر السنوي العاشر العلمي للجمعية متلازمة برادر ويلي [الولايات المتحدة الأمريكية] سياتل، واشنطن آم J ميد جينيه 1995؛ 64: 577.
  • Meaney FJ، بتلر MG. Charactersiation السمنة في متلازمة برادر-Labhart-ويلي: الزخرفة السمنة ميد Anthropol الكوارت 1989؛ 3: 294-305.
  • Bjorntorp P. تصنيف مرضى السمنة والمضاعفات المتعلقة بتوزيع فائض الدهون آم J كلين نوتر 1987؛ 45: 1120-1125. | مجلات |
  • Pullicino E، الجبان WA، ستابس RJ، ايليا M. السرير والتقنيات الميدانية لتقييم تكوين الجسم: مقارنة مع تقنية الديوتيريوم تخفيف يورو J كلين نوتر 1990؛ 44: 753-762. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • هوفمان DJ، صوايا AL، الجبان WA وآخرون. نفقات الطاقة من الفتيان والفتيات يعانون من التقزم وnonstunted الذين يعيشون في مدن الصفيح في ساو باولو، البرازيل آم J كلين نوتر 2000؛ 72: 1025-1031. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • SCHOELLER DA، فان سانتين E، بيترسون DW، ديتز D، Jaspen J، كلاين PD. مجموع قياسات الماء في جسم الإنسان مع 18 O و 2 H صفت الماء صباحا J كلين نوتر 1980؛ 33: 2686-2693. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • جبان WA، باركنسون SA، Murgatroyd PR. قياسات تكوين الجسم لتغذية البحوث البن

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #19  
قديم 11-23-2015, 09:34 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تباين داخل الأسرة من النمط الظاهري في متلازمة بارديه-بيدل

 

http://bjo.bmj.com/content/81/5/378.full



يهدف إلى وصف اختلاف النمط الظاهري ضمن الأسر التي لديها العديد من الأفراد الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل.
طرق والظواهر من الأشقاء المتضررين في 11 عائلة الاسكندنافية تمت مقارنة مع اثنين أو أكثر من أعضاء الذين لديهم لا يقل عن ثلاثة من الميزات: ضمور شبكية العين، polydactyly، والسمنة، ونقص الأعضاء التناسلية، والتخلف العقلي. تم استبعاد الأفراد دون ضمور شبكية العين.
النتائج: الاختلاف داخل الأسرة من التعبيرية من الميزات السمنة، polydactyly، تم العثور radiograms غير طبيعية في الأطراف، نقص الأعضاء التناسلية، قصر القامة، والشلل النصفي، وتشوهات الأسنان. وضمور الشبكية اختلفت فيما يتعلق بكل من ظهور الأعراض ومسار المرض. مورفولوجية قاع، ومع ذلك، كان ثابت داخل الأسر. أظهر اضطراب الربط الجينية ذات دلالة إحصائية في موضع BBS4 على الصبغي 15 في الأشقاء المتضررة في اثنين من الأسر، إلا أن المظاهر السريرية في هؤلاء المرضى لا تختلف عن غيرها من حالات متلازمة بارديه-بيدل.
أظهرت مقارنة الخلاصة من الأشقاء مع متلازمة بارديه-بيدل الاختلاف من المظاهر التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، وبالطبع من ضمور الشبكية تختلف. لم يتم العثور على المظاهر السريرية المميزة للفصل بين النمط الظاهري BBS4 من المرضى المتبقية.
لا يزال يستند تشخيص المتلازمات أساسا على الفحص السريري الدقيق. وقوع حالات مماثلة داخل الأسرة يوضح كذلك وجود كيان تصنيف الأمراض.
تاريخ ترسيم متلازمة بارديه-بيدل (BBS) معقد.
سوليس كوهين وايس 1 مقارنة ملاحظاتهم مع تلك لورانس والقمر 2 وبيدل، 3 وتعريف متلازمة لورنس-بيدل مع الميزات الرئيسية التهاب الشبكية الصباغي، والسمنة، ونقص الأعضاء التناسلية، وبولي / قصر الأصابع، والتخلف العقلي (الجدول 1). اسم بارديه، 4 الذي وصف ثلاث حالات مماثلة في عام 1920، وأضيف لاحقا إلى متلازمة. هاتشينسون، 5 ومع ذلك، إعادة النظر في المرضى وصفها لورنس والقمر وجدت أعراض عصبية في ثلاثة من أصل أربعة أشقاء. هذه الحالات، وبالتالي، يعتبر متميزا عن حالات بارديه وبيدل 6 وفقا لفصل متلازمة في متلازمة لورنس مون وبارديه-بيدل. في وقت لاحق Alström وزملاء العمل صفت مرض السكري والصمم العصبي مع ضمور شبكية العين، والسمنة، وقصور الغدد التناسلية في ثلاثة من أفراد عائلتين ذات الصلة. 7 وقد دعا هذا الكيان السريري الجديد في وقت لاحق متلازمة Alström.

الجدول 1
ملامح من المرضى في الأسر التي وصفها مختلف المجموعات

وهكذا جرت العادة لتحديد المرضى الذين يعانون من ضمور في شبكية العين، والسمنة، ونقص الأعضاء التناسلية في لورنس مون، بارديه-بيدل، ومتلازمات Alström. وترد الظواهر تؤخذ عادة لتعريف كل في الجدول 2.

الجدول 2
المظاهر التقليدية في لورنس مون، بارديه-بيدل، ومتلازمات Alström

وفي الوقت نفسه، فإن العديد من هؤلاء المرضى أظهرت تباين كبير في التعبير السريري. 8-15
وقد أظهرت الدراسات الجينية الجزيئية الحديثة أن مرضى تحديدها مع BBS زيارتها الاضطرابات الوراثية المعينة إلى أربع صبغيات مختلفة. 16-19 وقد يطلق على مواضع الجينات BBS1، BBS2، BBS3، وBBS4.
والغرض من هذا التقرير هو تقييم دقة التعريف السريري للBBS بمقارنة الظواهر في الأشقاء الذين لديهم ضمور شبكية العين زائد اثنين على الأقل أكثر من ما تبقى من علامات الكاردينال التقليدية من BBS: السمنة، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية، والتخلف العقلي.
منذ تعيين اضطراب في أربعة مرضى من اثنين من الأسر إلى مكان BBS4 على الصبغي 15، وصفنا على حدة النمط الظاهري في كل من هذه الأفراد.
المواد والأساليب

وقد تم تحديد ما مجموعه 44 أفراد الاسكندنافية وجود BBS إذا كان لديهم ضمور شبكية العين زائد اثنين على الأقل أكثر من ما تبقى من علامات الكاردينال التقليدية من متلازمة (السمنة، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية، والتخلف العقلي) (الجدول 2). وكان من بينهم 11 عائلة (أربعة الدانماركية، السويدية اثنين، وخمسة النرويجية) مع اثنين أو أكثر تأثرا الأشقاء. قبلنا علامتين باعتباره كافيا لتشخيص إذا كان الأخوة الثلاثة من علامات الكاردينال. واعتبر ضمور شبكية العين واجبة العثور على 20؛ وبالتالي، تم استبعاد الأفراد دون هذا التوقيع.
وتشمل هذه الدراسة 25 شخصا المتضررين: 16 ذكور وتسع إناث بمتوسط ​​عمر 24.8 عاما (SD 11.4، ومجموعة 3-39). كان زواج الأقارب الحالي في ثلاثة من أسرة (الشكل 1). أسر V، VII، X، والحادي عشر والدنماركية. الأسر الثاني والرابع والسادس والثامن، والتاسع النرويجية. والأول والثالث السويدية (الشكل 1).

الشكل 1
الأنساب من 11 عائلة الاسكندنافية مع 25 حالة مع متلازمة بارديه-بيدل.

وتقع الأفراد والاتصال من خلال سجلات RP السويدية والدنماركية والجمعية النرويجية LMBB ودعوتهم للمشاركة في فحص المرضى الخارجيين 1 يوم من قبل متخصصين في طب العيون (RR وKT)، الكهربية (SA)، وطب الأسنان (MKB) في عيادة العيون الجامعي في لوند، السويد.
تم الحصول على البيانات عن طريق المعلومات من المرضى والسجلات الأقارب والأطباء والمستشفيات والمدارس الخاصة بهم، والتحقيق السريري الحالي.
فحص العيون تتكون تقييم أفضل تصحيح حدة الإبصار وتنظير الشبكية مشلول العضلة الهدبية. وأعرب عن انكسار في حكمه كروية بإضافة نصف لتصحيح أسطواني إلى كروية. وقد درس الجزء الأمامي عن طريق الفحص شق مصباح. واستكملت تنظير العين مباشرة وغير مباشرة عن طريق الصور قاع. Electroretinograms 21 تم الحصول عليها في جميع الأفراد ما عدا اثنين، الذين رفضوا المشاركة. تمت دراسة مسار ضمور شبكية العين بأثر رجعي من كل ستة أطفال المتضررين من ثلاث أسر.
تم نقل الأعمار للمشي ويتحدث كمؤشر للتنمية النفسي خلال الطفولة. واستند تقدير للحالة العقلية في اختبارات الذكاء من السجلات السابقة ومستوى المدرسة والأداء الاجتماعي. أدلى ببيانات إضافية من الحالة العقلية إلا في حالات التخلف العقلي واضح.
الفحص المنهجي العام يتألف قياسات الطول والوزن. وقدرت وجود ترنح والشلل النصفي عن طريق التفتيش من المشي وبواسطة الإصبع لاختبار الأنف. تم تقييم القضيب عن طريق التفتيش على القضيب في ست حالات، بينما تم استجواب الذكور المتبقية أو أقاربهم عن حجم. وقد تم تعريف نقص الأعضاء التناسلية لدى الرجال كما القضيب سم أقل من 04/03 في الأولاد قبل البلوغ، وأقل من 9 سم في البالغين 22 و / أو الإبقاء على الخصيتين. وأكد وجود سابق من polydactyly عن طريق التفتيش من الندوب الجراحية تكملها radiograms. 23 تم فحص الأسنان سريريا وشعاعيا. 24
تم تنقية DNA لرسم خرائط الربط الجينية من الأساليب المذكورة في أماكن أخرى 25 تم تحليل وخلايا الدم البيضاء للشذوذ صبغي. بالإضافة إلى ذلك، تم قياس الكرياتينين في مصل الدم وهرمون تستوستيرون (في ثمانية ذكور).
وتم استجواب الآباء والأمهات والمرضى حول ظهور المشاكل البصرية، وأمراض الكلى، ومرض السكري، والصمم.
وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجان الأخلاقيات في الدنمارك، والنرويج، والسويد، وشارك المرضى في هذه الدراسة بعد استلام المعلومات الكتابية واللفظية.

النتائج

النتائج OCULAR

تم تشخيص ضمور شبكية العين في جميع الحالات وفقا للمعايير التخصيص للدراسة.
كان لسن أول بادرة من العمى الليلي في المتوسط ​​4.6 سنوات (N 25، SD 3.9، ومجموعة 0-16) مع أقصى قدر من الاختلاف داخل الأسرة زائد أو ناقص 6 سنوات. كان العمر لأول علامة على ضعف البصر أثناء النهار 6.6 سنوات (N 24، SD 3.8، ومجموعة 0-16) مع اختلاف داخل الأسرة زائد أو ناقص 14 عاما. في الحادي عشر الأسرة أبلغت جميع الأشقاء المتضررين فقدان الرؤية المركزية قبل أو بالتزامن مع فقدان الرؤية الليلة. في الأسرة السابع، أظهر أخ واحد علامات بصرية ضعف والعمى الليلي في وقت واحد في سن 1، للرؤية الليلية المفقودة آخر يبلغ من العمر 5 و أصبح ضعف البصر في سن 15، والثالث وضعاف البصر في 5 بينما الليل عرض العمى نفسه في سن 7 (الجدول 3).

الجدول 3
نتائج العين في المرضى في 11 عائلة مع اثنين أو أكثر sibs مع متلازمة بارديه-بيدل

معدل الانخفاض في حدة البصر (الشكل 2 هو موضح) من خلال دراسة استطلاعية 9 سنوات لستة أطفال المتضررين من الأسر الثاني والرابع، والثامن مع اختلاف داخل الأسرة من التعبيرية للأسرة الرابعة.

الرقم 2
حدة البصر المتصلة بالعمر قياس مع فاصل 9 سنوات في ثلاث عائلات مع اثنين من الأشقاء المتضررة. مسار المرض يختلف في الأسرة الرابعة.

في الأسر II، لوحظ والرابع والسابع، والتاسع قصر النظر في جميع أعضاء المتضررين (تعريف من قصر النظر: ما يعادل كروية أقل من -0.5 D)، في حين مثلت مد البصر، قصر النظر، وسواء البصر داخل الأسر العاشر والحادي عشر (الجدول 3).
من خلال فحص قاع العين لاحظنا الاختلاف في حجم وشكل صبغات وكمية من ضمور الشبكية والمشيمية بين ولكن ليس داخل الأسر، عندما اتخذ سن بعين الاعتبار (الشكلان 3 و 4) (الجدول 3).

الشكل (3)
قاع العين من ثلاثة أشقاء مع BBS (VII الأسرة) مع شمعي شاحب القرص البصري، ضمور المشيمية والأوعية الضيقة أو طمس، وتصبغ غير نمطية في المحيط.


الرقم 4
قاع العين اثنين من الأشقاء مع BBS (الأسرة I) مع شويكات العظام النموذجية (غير واضحة بسبب إعتام عدسة العين).

وأظهرت الكاملة تسجيلات مخطط كهربية المجال لا ردود قضيب إلى ضوء خافت الأزرق في أي من المرضى، ولكن مع تقنية النطاق الضيق والمتوسط ​​الكمبيوتر، يمكن قياس ردود مخروط المتبقية في عين واحدة على الأقل في 15 من الأفراد. 21 لا الاختلاف داخل الأسرة من ولوحظ في electroretinograms (الشكل 5).

الرقم 5
electroretinograms حقل كامل من ثلاثة أشقاء المتضررة (XI الأسرة). 21 يمكن الحصول على أية استجابات قضيب إلى ضوء خافت الأزرق. كانت السعة مخروط وميض أقل من 0.8 μV، وهو استجابة انخفاض حاد أو غير قابلة للكشف حتى مع وجود ممر الموجة مرشح. الاختلافات الصغيرة في سعة ليست كبيرة.
DEVELOPMENT النفسي والمخابرات

لم ثلاثة أشخاص من ثلاث عائلات مختلفة لا يدخلون في سن 3 سنوات و / أو لم تتحدث في 4 سنوات من العمر. شخص واحد يعاني من الاختناق ما حول الولادة والشلل الرباعي التشنجي وليس لديه اللغة المحكية في وقت الفحص وهذا هو، عندما كان عمره 7 سنوات.
تسعة أفراد أسرهم V، VII، X، والحادي عشر قد تصنف على أنها المتخلفين عقليا عن طريق اختبارات الذكاء في المدرسة، ولكن الكبار الأداء الاجتماعي للمرضى في الأسر VII، X، والحادي عشر لم تؤكد هذا التصنيف. عموما، كان لدينا انطباع بأن الغالبية العظمى من 25 فردا تعمل بها ضمن المعدل الطبيعي للذكاء مع عدم وجود اختلافات واضحة بين الأشقاء المتضررين. في الأسرة IV حضر كل من المرضى المدارس الثانوية الاسكندنافية القياسية. الذكور في الأسرة وعملت في شركة كمبيوتر واحد من المرضى في الأسرة التاسعة عملت في لوحة مفاتيح في مستشفى (جدول 4).

الجدول 4
العلامات السريرية في المرضى في 11 عائلة مع اثنين أو أكثر sibs مع متلازمة بارديه-بيدل
الطول والوزن، ومؤشر كتلة الجسم

وكان ارتفاع أقل من المئين 2.5 في عضو واحد من عائلة V واحد من عائلة X (جدول 4).
السمنة، التي يحددها مؤشر كتلة الجسم (BMI)> 28 كجم / م 2، وقد وجدت في 22 من 25 حالة. وكان الأشخاص الثلاثة مع الوزن الطبيعي أفراد أسرهم السابع والعاشر (جدول 4).
أيدي والأقدام

كان عشرين فردا polydactyly عند الولادة (الشكل 6). من خمسة أفراد المتبقية دون polydactyly ينتمون إلى عائلات الأول والثالث والخامس والثامن، والحادي عشر (الجدول 4).

الشكل (6)
Polydactyly في أصغر مريض في الأسرة الثالثة. وكان شقيقه المتضررين لا polydactyly.

النتائج Radiographical من اليدين والقدمين تضم سنعي قصيرة وعريضة والسلاميات، انحراف الأصابع، تم العثور على أو أعران في جميع الأسر. 23 ومع ذلك، في أسر الثالث والسابع لدينا حالات موثقة مع وبدون تشوهات radiographical (جدول 4). لم يتم العثور على نمط الأسرة معين.
الكلى والمسالك البولية PATHWAYS

في الحادي عشر عائلة كانت جميع الأشقاء الثلاثة النقرس. أحد أفراد الأسر III، V زيارتها، X، والحادي عشر أي شذوذ خلقي أو انخفاض وظائف الكلى (جدول 4) التحقق من فحص radiographical أو زيادة الكرياتينين في مصل الدم، على التوالي.
النتائج العصبية

كان واحدا من الأشقاء في الأسرة التاسعة حلقة من شلل جزئي من أطرافه السفلى الناجمة عن تضيق العمود الفقري، في حين أن شقيقه المصاب لا يوجد تاريخ من شلل جزئي. وكان كل من السمنة ونقص الأعضاء التناسلية، polydactyly، وضمور الشبكية (جدول 4).
الأعضاء التناسلية

ثلاثة عشر من أصل 16 ذكور كان (الشكل قضيب صغير 7). ومن بين هؤلاء، كان سبعة عدم نزول الخصيتين وكان اثنان من اختفاء الخصية مع القضيب الطبيعي. تم تخفيض هرمون تستوستيرون في ثلاثة أشقاء في الحادي عشر الأسرة وكان طبيعيا في الذكور البالغين في الأسر، كان VII، IX، وX. جميع النساء البالغات I عدم انتظام فترات الحيض. قد الأنثى في الأسرة السابع أنجبت طفلا. وكان إخوتها أثرت على القضيب طبيعي ولكن كان واحد اختفاء الخصية. وذكرت المرأة في الأسرة V لديها أعضاء تناسلية صغيرة والشعرانية المعتدل (جدول 4).

الرقم 7
في الذكور في الأسرة أولا لوحظ صغر القضيب لا نقص الأعضاء التناسلية في أخته المتضررين.
أسنان

وأظهر فحص الأسنان ترددات أعلى من الأسنان الصغيرة، نقص الأسنان (الأسنان المفقودة خلقيا)، وجذور قصيرة. 24 في الأسرة وعثر السابع نقص الأسنان في كل من الذكور المتضررة (الشكل 8) ولكن ليس في الشقيقة المتضررين. في الأسر V والحادي عشر وجدنا أيضا الأشقاء المتضررة مع وبدون شذوذ الأسنان (جدول 4).

الرقم 8
مشقوق (الأسنان المفقودة خلقيا) في واحدة من الذكور المتضررة في السابع الأسرة. وكان شقيقة تتأثر أي شذوذ الأسنان.
ضعف السمع

وكان كل الأشقاء في الأسرة V فقدان السمع الادراك ومؤشرات داء السكري من النوع 2 مع هامشيا اختبار تحمل الجلوكوز، وزيادة طليعة الأنسولين، وHBA 1C في مصل الدم. كانت الأنثى polydactyly. وكان كل من ضمور شبكية العين مع الضياء من سن 2 سنة، والعمى الليلي في 4-5 سنوات، وضعف البصر من سن 6-8 سنوات. كانوا المتخلفين عقليا، السمنة، وكان نقص الأعضاء التناسلية (جدول 4). وكان أحد أفراد الأسرة التاسع من ضعف في السمع غير الادراك في أذن واحدة.
مرض السكري

وكان الأشقاء اثنين في الأسرة V مع ضعف السمع والأخوة الإناث في الأسرة X ضعف تحمل الجلوكوز. وكان هذا الأخير السمع.
الحالات المرضية الأخرى

وسجلت واحدة من كل واحد من اضطرابات الإضافية التالية في مختلف المرضى: الورم الحميد في الغدة النخامية، حنف القدم، والكيس الشرج، والسكتة الدماغية الدماغ، وسرطان الخصية.
MAPPING الربط الجينية وتحليل كروموسوم

يتم تضمين أسر الحالية في دراسة أكبر من خرائط الربط في 29 عائلة BBS. 25 يتم تحديد أسرنا كما BB12، 14، 18، 22، 23، 24، 25/26، 27، 28، 30، و 31 في هذه الدراسة . وتظهر قيم احتمال إدراج أو استبعاد الربط إلى مواضع BBS على الكروموسومات 11 (BBS1)، 15 (BBS4)، أو 16 (BBS2) في الجدول 5. ولم يعثر على أي ارتباط في أي من الأسر إلى مكان BBS على كروموسوم 3 (BBS3).

الجدول 5
استبعاد وإدراج الربط BBS مواضع على الكروموسومات 11 (BBS1)، 15 (BBS4)، و 16 (BBS2) في 11 عائلة الاسكندنافية مع 2-3 أعضاء المتضررين. 25 ويرد احتمال الربط الكروموسوم أشار بين قوسين

دلالة إحصائية الربط الجيني (اللد بنتيجة 3 أو أكثر) تم العثور على مكان BBS4 على الصبغي 15 في المرضى الذين يعانون من الثامن العائلة والأسرة التاسع. وأظهرت النتائج السريرية في كل من هؤلاء المرضى الأربعة في الجدول 6. تم العثور على أدلة محتملة من الربط إلى مكان BBS4 للأسر الثالث والعاشر وكانت النتائج لأسر الفردية المتبقية التي ليست غنية بالمعلومات.

الجدول 6
جميع العلامات السريرية المسجلة في اثنين من أزواج من الأشقاء في الأسر الثامن والتاسع مع اضطراب مرتبطة وراثيا إلى مكان BBS4 على الصبغي 15

وأظهر تحليل ارتفاع القرار كروموسوم أي شذوذ.

نقاش

مقيدة الدراسات على الأمراض المتنحية في الدول الاسكندنافية التي كتبها انخفاض معدل زواج الأقارب وعدد قليل من الأطفال، والذي يمنع الدلالة الإحصائية للنتائج السريرية والجينية لكل عائلة. من ناحية أخرى تسهل السكان الاسكندنافية الصغيرة وكذلك تعريف متابعة الدراسات. دراستنا من 11 عائلة BBS مع 2-3 أعضاء المتضررين هي، على حد علمنا، أكبر رأيت من قبل نفس المحققين.
تصف الدراسة التباين داخل الأسرة من النمط الظاهري من BBS من خلال المقارنة بين الأشقاء المتضررة في كل من هذه العائلات.
ولدينا انطباع بأن الأفراد المدرجة في دراستنا هي ممثل من هؤلاء المرضى الذين شخصت سريريا. مثل مؤلفين آخرين 17 رأيناها ضرورية ثلاثة من علامات الكاردينال التقليدية (ضمور شبكية العين، والسمنة، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية، والتخلف العقلي) لإدراجها في الدراسة، حيث يتم تشخيص نقص الأعضاء التناسلية بشكل رئيسي في الرجال، وقد شكك التخلف العقلي باعتباره علامة الكاردينال. 11 قبلنا بيان Schachat وMaumenee، 20 أن ضمور شبكية العين هو الحاضر دائما في المرضى الذين يعانون من BBS. كان كل الأشقاء المتضررين في أرج غير طبيعي، في حين تم الإبلاغ عن أي علامات على BBS في الأشقاء العادية. تم تشخيص جميع المرضى كحالات BBS على الرغم من تداخل لورانس مون والمتلازمات Alström (أو متلازمة ادواردز ترتبط ارتباطا وثيقا 26) لوحظ. تداخل لورانس مون وAlström المتلازمات وصفت في الدراسات BBS أخرى. 13-15 27
وأظهرت المقارنة بين الأشقاء BBS في دراستنا الاختلاف داخل الأسرة لالتعبيرية من السمنة، والتشوهات الهيكلية في الأطراف، نقص الأعضاء التناسلية، قصر القامة، والشلل النصفي، تشوهات الأسنان، وللدورة من ضمور شبكية العين. عدم تجانس السريري هو أكثر انتشارا داخل الأسر BBS لدينا مما ذكرت من قبل مؤلفين آخرين 11 الذي، مع ذلك، وصفت الاختلاف داخل الأسرة من التخلف العقلي. في دراستنا كانت درجة منخفضة من اختبار الذكاء في المدرسة لا تتفق مع مستوى الأداء الاجتماعي في وقت لاحق في الحياة في المرضى من الأسر VII، X، والحادي عشر، الذي أصبح كل الذاتي الداعمة. وقد لوحظ أيضا هذا التغيير مع تقدم العمر من الحالة النفسية لدى الأفراد BBS من قبل مؤلفين آخرين. 9 لذلك يجب أن تفسر نتائجنا على التخلف العقلي بحذر ويمكن إجراء أي بيان بشأن تباين داخل الأسرة.
وجدنا الاختلاف من وقت ظهور الأعراض العين ومسار المرض في شبكية العين. وأفاد الوقت لظهور أعراض ضمور الشبكية بدقة وولوحظ عندما غاب عن لعب الأطفال في ضوء خافت أو كان غير قادر على اللعب في الأماكن المظلمة. الاختلاف موجود في أسر الرابع والسادس والسابع، والثامن، والعاشر (الجدول 2 ولذا القائم) على معلومات دقيقة أساسا من الوالدين. في الأسرة السابع، على سبيل المثال، أصبح أخ واحد في وقت واحد أعمى يلة وضعاف البصر أثناء النهار، في حين أن الأخوة أخرى مشكلات بصرية في وضح النهار لأول مرة، وأصبح الليل أعمى في وقت لاحق، ووضعت الثالث الأعراض في ترتيب عكسي (الجدول 2). و، على حد علمنا، لاحظ هذا الاختلاف من ظهور أعراض ضمور شبكية العين للمرة الأولى.
مسار ضمور شبكية العين، ويتضح من معدل الانخفاض في حدة البصر ومتنوعة في اثنين من الأشقاء في الأسرة الرابعة (الشكل 2). لم نعثر على أي تباين الصورة قاع داخل الأسر. ومع ذلك، فقد لوحظ الظواهر المتباينة سريريا ضمن العائلة الواحدة في المرضى الذين يعانون من ضمور الشبكية، الذي كان الحذف في peripherin / RDS الجينات. 28
كما تم وصفها الاختلاف داخل الأسرة من التعبيرية من العلامات السريرية في متلازمة كوهين، 29 والذي يرتبط ارتباطا وثيقا BBS.
وكانت نتيجة رسم الخرائط الربط الجيني في كل لدينا 11 عائلة ذات دلالة إحصائية للربط إلى مكان BBS4 على الصبغي 15 في اثنين من الأسر، وبالتالي تؤكد النتائج السابقة. 17 وقد رسمت كتاب آخرون الأسر BBS إلى مواضع على الكروموسومات 3 (BBS2)، 18 11 (BBS1)، 16 26، و 16 (BBS3)، 19 25 وقد أشارت وأنه حتى مواضع أكثر الوراثية موجودة. 25 والنتائج السريرية في منطقتنا كروموسوم 15 مريضا تراوحت ما يقرب من جميع جوانب هذا الاضطراب. وكان مترجم في polydactyly في القدم أو غائبة تماما في الثامن الأسرة واليد في الأسرة التاسعة. كانت السمنة المرضية في الثامن الأسرة، ولكن كانت أبعد من مجرد الطبيعي (BMI 28) في الأسرة التاسعة. ذلك لا يمكننا تأكيد النتائج من كرمي وزملاء العمل، 30 الذي اقترح أن الطفرات في النتيجة موضع BBS4 في آخر polydactyly المحوري في الغالب من الأطراف العلوية. وكانت بتشوهات في الأسنان وقصر الأصابع استنتاجات مشتركة، ولكن لاحظ هذه الميزات عموما في المرضى الذين يعانون BBS، 11 24، وبالتالي لا تسهم في توصيف السريري من نوع كروموسوم 15.
وقد أثبتت متلازمة بارديه-بيدل أن تكون أكثر سريريا وغير متجانسة وراثيا مما كان متوقعا في وقت سابق. لم يتم العثور على المظاهر السريرية في المرضى الذين لدينا التي يمكن أن تستخدم للتمييز بين عائلات مرتبطة كروموسوم 15 من المواد المتبقية، وقد وصفت أي تمييز السريرية للعائلات مرتبطة مواضع BBS الآخرين. ليبرت وزملاء العمل 16 لم تجد أي سمة معينة أو مجموعة فرعية من الصفات التي يمكن أن تميز فرعية من الأسر التي لديها عشرات اللد إيجابية لكروموسوم 11 من مجموعة مع عشرات اللد السلبية. Bruford وزملاء العمل 25 العثور على أي تمييز السريرية بين BBS1، BBS2، وBBS4 ربط الأسر في موادها من 29 عائلة BBS وأشار إلى أن نتائج كرمي وزملاء العمل 30 يمكن أن تتصل أكثر إلى حدوث طفرات معينة أو الخلفية الوراثية الفطرية مرضاهم من إلى موضع BBS نفسها.
كيف يمكن أن الأشقاء المتضررة، حتى داخل الأسرة نفسها BBS الذي يجب أن تشترك في نفس الطفرة، تظهر مثل هذا التباين في الظواهر؟ العمر أو الجنس وحده لا يظهر لشرح الاختلاف. ومع ذلك، فإن وراثة الأليلات مختلفة من جينات أخرى قد إما تخفيف أو تفاقم التعبير عن هذا المرض إذا كان المنتج هذه، غير معروفة حاليا، الجينات تتفاعل مع جينات المرض من BBS.
آلية تنوع السريرية والجينية في مرضى BBS لم يعرف بعد. مزيد من الدراسات السريرية والجينية متأنية من الأسر BBS مع العديد من الأفراد المتضررين يمكن أن تسهم في فهم أفضل لهذا الاضطراب المعقد.

شكر وتقدير

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #20  
قديم 11-23-2015, 09:40 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.nature.com/ejhg/journal/v...g2012115a.html

ملخص

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو نادر وراثي جسمي مقهور ciliopathy تتميز ضمور شبكية العين، والسمنة، polydactyly بعد المحوري، الفشل الكلوي، صعوبات التعلم وقصور الغدد التناسلية. العديد من الميزات الثانوية المتصلة بها يمكن أن تكون مفيدة في التوصل إلى تشخيص ومهمة في التدبير السريري للBBS. ويستند التشخيص على النتائج السريرية ويمكن التأكد من تسلسل الجينات المسببة للأمراض معروفة في 80٪ من المرضى. الجينات BBS ترميز البروتينات التي توطين للأهداب والجسم القاعدية وتشارك في نشوء حيوي أهداب وظيفة. طفرات تؤدي إلى المحاسبة أهداب المعيبة جزئيا عن الآثار عديد المظاهر التي لوحظت في BBS. ونحن نقدم لمحة عامة عن BBS بما في ذلك النتائج السريرية، الفهم الحالي للأهداب البيولوجيا، واتباع نهج عملي لتشخيص وتقديم المشورة الوراثية وما يصل إلى تاريخ الإدارة.
الكلمات الدالة:

متلازمة بارديه-بيدل. ciliopathies. الميراث مقهورة. الجينات BBS

أعلى الصفحة باختصار

  • ciliopathy مقهورة.
  • وقوع المقدر 1: 160   000 في السكان شمال أوروبا و01:13   500 في بعض الشعوب العربية.
  • ومن خلال تميزها ضمور شبكية العين، الفشل الكلوي، بعد محوري polydactyly، والسمنة، والعجز المعرفي ونقص الأعضاء التناسلية.
  • ويستند التشخيص على المظاهر السريرية.
  • الاختبارات الجينية الجزيئية متاحة ومعروفة 16 الجينات حاليا لتترافق مع متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، وهو ما يمثل حوالي 80٪ من المشخصة سريريا BBS.
  • وتشمل المراقبة التقييم العيون العادية، مونتورينغ الكلوي والكبد والجلوكوز، الدهون و ملفه الشخصي الغدد الصماء والوزن وضغط الدم القياسات العادية.

أعلى الصفحة مقدمة

في عام 1866، وصفه لورنس والقمر أسرة مكونة من أربعة أشقاء مع ضمور شبكية العين، والسمنة، خزل سفلي تشنجي والعجز المعرفي. 1 بارديه 2 وبيدل 3 ذكرت في وقت لاحق الأفراد بشكل منفصل على مزيد من المتضررين بالمثل الذي بالإضافة كان polydactyly بعد المحوري وتكرس حالة متلازمة لورنس-مون بارديه-بيدل. وغالبا ما تنقسم هذه المتلازمة إلى كيانين: متلازمة لورنس مون وبارديه-بيدل متلازمة (BBS)، ولكن هناك تداخل كبير المظهرية، مما يشير إلى أنها قد تكون أليلية. 4 BBS هو الآن على المدى القياسي في الاستعمال الشائع.
BBS هو اضطراب وراثي عديد المظاهر مع interfamilial كبير والاختلاف داخل الأسرة. 6 تعتبر الوراثة تقليديا مقهورة، على الرغم من وجود استثناءات ملحوظة، حيث BBS قد يكون اضطراب قليل الجينات. 7 انتشار BBS يختلف بشكل ملحوظ بين السكان. من 1: 160   000 في الشعوب الأوروبية الشمالية 5 ل01:13   500 و01:17   5000، على التوالي، في مجتمعات معزولة في الكويت ونيو فاوند لاند، حيث يسود مستوى أعلى من زواج الأقارب. 9 كشفت دراسات على أسر المتضررة في نيوفاوندلاند مع BBS لا تقل عن ستة BBS المكاني وثمانية الطفرات BBS مختلفة، وبالتالي لا يمكن أن يعزى ارتفاع معدل انتشار لمؤسس واحد. 10

أعلى الصفحة نظرة عامة السريرية

النمط الظاهري BBS يتطور ببطء طوال العقد الأول من العمر، على الرغم من أن هناك تفاوتا كبيرا. ونتيجة لذلك، يتم تشخيص معظم المرضى في مرحلة الطفولة المتأخرة أو مرحلة البلوغ المبكر. polydactyly بعد المحوري هو شائع، وربما تكون الوحيدة ميزة تشوه واضحة عند الولادة. قد تؤثر على هذه الأطراف الأربعة أو الأطراف العلوية أو السفلية فقط ويمكن أن يحدث بالتزامن مع قصر الأصابع و / أو syndactlyly.
مقبض التشخيص دفع التحقيق الأكثر شيوعا لBBS هو تطوير ضمور قضيب مخروط. ويتبع الخسارة الأولية من المستقبلات الضوئية قضيب قبل زوال في وقت لاحق من مبصرات مخروط. 11 وهذا يمثل باعتبارها التهاب الشبكية الصباغي شاذة بمشاركة البقعي في وقت مبكر. 12 المظاهر السريرية هو ظهور تدريجي من العمى الليلي، تليها الضياء وفقدان الرؤية المركزية واللون. 11 وقد وصفت العديد من المتغيرات من النمط الظاهري لطب العيون في BBS وبعض المرضى تطوير تسلسل العكس من الأحداث المرضية مع فقدان في وقت مبكر من مبصرات مخروط تليها مبصرات قضيب. 4 تخطيط كهربية الشبكية هو التحقيق في الاختيار، وقد تظهر تغيرات مبكرة في غضون العامين الأولين من الحياة، على الرغم من أن تغييرات كبيرة ونادرا ما تكون مرئية قبل سن الخامسة. 12 الأعراض تتطور عادة في العقد الأول من العمر، ومعظم المرضى مصابون بالعمي بحلول العقد الثاني أو الثالث، 13 على الرغم من أشكال معتدلة من المرض لا وجود لها. تشوهات العين الأخرى مثل إعتام عدسة العين والعيوب الانكسارية هي أيضا منتشرة في BBS.
السمنة هي النتائج السريرية رئيسي آخر والتقرير عن حالات أن يكون 72-86٪ من السكان BBS. 14، 15، 16، 17 الوزن عند الولادة عادة ضمن المعدل الطبيعي، على الرغم من وجود أدلة على التوزيع المختل نحو الخطوط المئوية العليا. 18 ثلث الأشخاص الذين يعانون من وزن الولادة الطبيعية تطوير البدانة في سن واحدة. 18 على الرغم من أن البدانة في مرحلة البلوغ تميل إلى أن تكون جذعي، يبدو أنها واسعة الانتشار ونزع فتيل في مرحلة الطفولة.
تطوير مرض السكري من النوع 2 هي السائدة بين المرضى. قد تكون ذات صلة إلى مستوى السمنة وكثيرا ما وجدت ذلك بالتعاون مع غيرها من علامات متلازمة التمثيل الغذائي.
قصور الغدد التناسلية قد تظهر كما تأخر سن البلوغ أو نقص الأعضاء التناسلية عند الذكور وتشوهات في الأعضاء التناسلية للإناث. 17، 19 قد يحدث هذا بشكل مستقل أو بالاشتراك مع قصور الغدد التناسلية والكيمياء الحيوية. وقد لوحظت مجموعة واسعة من تشوهات في الأعضاء التناسلية للإناث، والمساهمة في انخفاض معدلات الخصوبة في BBS. الذكور هم دائما تقريبا يعانون من العقم.
تأخر في النمو والعجز المعرفي شائعة في BBS. تأخير في كثير من الأحيان العالمي ولكن قد تكون محددة في مناطق معينة من التنمية. 12 وفي لفيف من 109 مريضا، أفيد العجز المعرفي لدى 62٪ وحضر نصف هؤلاء المرضى مدرسة خاصة. 4 يتم الإبلاغ عن الأطفال الذين يعانون من BBS في كثير من الأحيان أن يكون السلوك عطوب مع نوبات من الإحباط. 17، 19 يفضل كثير أن يكون روتين ثابت وربما عناصر السلوك القهري وعدم هيمنة الاجتماعية. 4 آخرون النمط الظاهري سلوكية حادة وتطوير اضطراب طيف التوحد أو الذهان. 4
يمكن تشوهات الكلى يكون سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في BBS. 20 والنمط الظاهري الكلوي هو كشوف متغير ولكن بشكل كلاسيكي مع المرض أنبوبي الكيسي والتشوهات التشريحية. 18 عيوب تركيز البولية هي السائدة حتى في المرضى الذين يعانون من شبه طبيعية وظائف الكلى وليس الخراجات الرئيسية. 21
تم الإبلاغ عن العجز خطاب في 60٪ من المرضى. 22 يتكون هذا أساسا من خطاب عالي النبرة الأنف والأطفال في كثير من الأحيان لا تتطور خطاب واضح قبل سن الرابعة. وقد اقترح أن استبدال الحرف الساكن الأول من الكلمة قد تكون مميزة. 4 صعوبات الكلام قد يصعب فقدان السمع، والتي يتم عرضها في 17-21٪ من المرضى. 19 معظم المرضى يعانون من فقدان السمع التوصيلي الثانوية إلى التهاب الأذن الوسطى المزمن. 4 تأخير الكلام في الأطفال الذين يعانون من BBS عموما استجابة للعلاج النطق. 4
ويلاحظ أيضا تورط أجهزة الجسم الأخرى مثل القلب والجهاز الهضمي. نوع من تشوهات قلبية لوحظ في BBS متغير بدرجة كبيرة. كشفت دراسة تخطيط صدى القلب من 22 فردا من ثلاث عائلات البدو الأقارب عالية التردد عيوب القلب بنسبة 50٪. 23 Beales وآخرون 4 العثور على تردد 7٪ فقط في دراسة استندت على 109 مريضا. وتشمل تشوهات قلبية التضيق الصمامات، وبراءات الاختراع القناة arteriosis وبعضلة القلب. 4 يتراوح مشاركة الكبدي من التليف الكيسي للتوسع في القناة الصفراوية، داخل الكبد ومساحات خارج الكبد. 12 وقد تم توثيق مرض Hirschsprungs في BBS لكن وقوع هذه الجمعية غير معروف. 24
الازدحام الأسنان والحنك عالية مقوسة شائعة. وتشمل تشوهات أخرى مشقوق، سوء الإطباق والمينا تنسج. 5 وقد وصفت الشم الملاحظات التالية في نموذج الفأر. في دراسة أجريت على 19 مريضا BBS، كان تسعة الشم / نقص الشم. 25
العديد من الأفراد المصابين يعانون من درجة من الحماقات و 40٪ من فئة واحدة تصف علامات ترنح وضعف التنسيق. 4 خلل تناوبية الحركات ويشير الماضية شائعة (79٪) وكذلك صعوبات في المشي جنبا إلى جنب واختبار فوغ. 4
هناك تداخل كبير في المظاهر السريرية داخل الطيف مرض ciliopathy. على الرغم من الميزات الكلاسيكية المرتبطة BBS موثقة جيدا، وقد اقترح أن النمط الظاهري BBS قد تكون أكثر حتى متموجة مع ciliopathies الأخرى مثل Alström وMcKusick-كوفمان المتلازمات مما ذكر سابقا. 19 عادة ما يميز متلازمة Alström من BBS عن وجود فقدان وغياب polydactyly السمع وصعوبات التعلم. المرضى الذين يعانون من متلازمة McKusick-كوفمان لديهم ارتفاع معدل انتشار الشذوذ البولي التناسلي ولكنها تفتقر عادة ضمور السمنة، قضيب مخروط، وصعوبات التعلم مميزة من BBS. صعوبات التشخيص تثور هذه الميزات في BBS تعتمد على العمر. 26
حاملين BBS لا يبدو أن تكون في خطر متزايد من ارتفاع ضغط الدم أو مرض السكري، 10 على الرغم من وجود أدلة متضاربة بشأن امكانية زيادة مخاطر البدانة في ناقلات. 10، 27، 28 زيادة في سرطانات الكلى والتشوهات، 29 وكذلك ضعف في شبكية العين، 30 وقد ورد في شركات تلزم.
من المذكرة، وتحليل طفرة في غير BBS-الخالية من الدهون والسمنة المرضى قوقازي كشف وجود ارتباط بين الأشكال واحدة النوكليوتيدات في BBS2، BBS4 وBBS6 والسمنة المشتركة. 31

أعلى الصفحة نهج التشخيص

ما لم يشتبه في التشخيص قبل الولادة على أساس التصوير يكشف polydactyly وتشوهات الكلى الهيكلية، وعادة ما يتم تشخيص BBS قبل أن يبدأ المريض لتطوير مشاكل بصرية مميزة من ضمور قضيب مخروط. على الرغم من أن هناك بعض الملامح تشوه المميزة مثل فرط، midface تنسج وretrognathia، وهذه موجودة بشكل غير متسق ويمكن أن تكون خفية. الشكل 1 يوضح الاختلاف من ملامح الوجه ينظر في BBS. معايير التشخيص تعديلها من قبل Beales وآخرون 4 توحي بأن إما أربعة ملامح أساسية أو ثلاثة الابتدائية والثانوية اثنين من الميزات المطلوبة لإجراء التشخيص السريري. الجدول 1 يلخص المظاهر السريرية الرئيسية والثانوية ومعدل الإصابة بها في BBS.
الشكل 1.

صور من المرضى مما يدل على ملامح تشوه المرتبطة BBS. - د) يثبتن ملامح الوجه نموذجية. هذه غالبا ما تكون خفية وليست دائما موجودة. وتشمل الميزات عميقة بين مجموعة عيون، فرط، الهبوطية شقوق مائلة جفني، جسر الأنف مسطح وفم صغير، وجني تنسج وretrognathia. (ه) قصر الأصابع وندوب من الاستئصال من الأرقام التبعية. (و) اكتظاظ الأسنان. (ز) عالية مقوس الحنك. (ح) تنظير القاع مما يدل على ضمور قضيب مخروط.
الرقم الكامل وأسطورة (209 K)

الجدول 1 - ميزات التشخيص وانتشار في BBS.

الجدول الكامل

تأكيدا الجزيئي للتشخيص يمكن الحصول عليها في ما يقرب من 80٪ عن طريق التسلسل المباشر للجينات BBS. بيلينغسلي وآخرون 32 وقد اقترح اتباع نهج عملي لفحص تغيري حيث الأولوية التسلسل وفقا للتردد من الطفرات المسببة للأمراض بين وداخل الجينات BBS من أجل تقديم خدمة تتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة.

أعلى الصفحة الأساس الجيني للمرض

شهد العقد الماضي توسعا سريعا في البحث في هذه المتلازمة، مما أدى إلى اكتشاف 16 الجينات BBS تمثل ما يقرب من 80٪ من المشخصة سريريا BBS ( الجدول 2). تم العثور على معظم الطفرات المسببة للأمراض في BBS1 وBBS10، وهو ما يمثل 23.2٪ و 20٪ على التوالي، 5 على الرغم من بعض التباين الإقليمي في انتشار موجودا. 15 ويبدو أن بعض الجينات لديهم قدر أكبر من تردد معين العرقي من غيرها، على الرغم من أن يتم العثور على الجين المتحول حصرا في عدد سكانها العرقي واحد. في الأفراد شمال أوروبا، BBS1 M390R وBBS10 C91LfsX5 هي الأليلات الأكثر شيوعا، في حين تعتبر أساسا الطفرات في BBS4، BBS5 وTTC8 في المرضى الذين يعانون من الشرق الأوسط وشمال أفريقيا النسب. 32 على الرغم من أن تعتبر تقليديا جسمية حالة المتنحية، وهناك العديد من الحالات المبلغ عنها من وضع triallelic من الميراث حيث هناك حاجة إلى ثلاث طفرات الجينات في BBS قبل أن يصبح النمط الظاهري واضح، أو بدلا من ذلك حيث الثالثة الأفعال موضع المرض كما لتعديل المرض. 33، 34، 35، 36
الجدول 2 - الجينات BBS.

الجدول الكامل

فضلا عن المظهرية التداخلات عرضت بين ciliopathies، هناك شواهد تشير إلى أن الجينات الطافرة في BBS وciliopathies الآخر يحمل بعض التداخل الوراثي. 37 على سبيل المثال، تم تحديد الطفرات في BBS2، BBS4 وBBS6 في المرضى الذين يعانون من متلازمة ميكل. 38 وبالمثل، والطفرات في MKS1، والتي تؤدي عادة إلى متلازمة ميكل، قد تترافق مع النمط الظاهري BBS والطفرات في MKS3 تم تحديدها في المرضى الذين يعانون من متلازمة BBS وجوبير. 39 ويبدو أن النمط الظاهري ciliopathy يعكس كلا من مواضع تحور معين ومجموع الحمل تغيري. 39، 40
راثى-النمط الظاهري علاقة

الارتباط الوراثي، النمط الظاهري سيئة، على الرغم من أن دراسة واحدة تشير إلى النمط الظاهري أكثر اعتدالا المرتبطة طفرة M390R شيوعا وجدت في BBS1. 15 وقد اقترحت دراسات أخرى أن الظواهر العينية محددة 41، 42 وأكثر شدة التشوهات الرقمية 42 قد تكون مرتبطة BBS2، BBS3 وBBS4 الطفرات. والدراسات على نطاق واسع لا يدعم هذه النتائج، وتتفاقم مزيد من التكهنات حول علاقة بها interfamilial كبير وتقلب المظهري داخل الأسرة. وهذا يدعم فرضية أن البروتينات BBS تتفاعل في عملية الخلوية المشتركة، مما يجعل المورثات تمييزه سريريا. 37
تقديم BBS الجينات المتغيرات إلى قواعد البيانات العامة مثل Mutadatabase (www.mutadatabase.org) قد تساعد في مزيد من ترسيم الارتباط الوراثي، النمط الظاهري.

أعلى الصفحة بيولوجيا المرض

يتم حفظها للغاية أهداب الهياكل الخلوية إسقاط من السطح القمي معظم الخلايا في العمود الفقري. انها تندرج في فئتين: متحرك وimmotile (الابتدائي) أهداب. 12، 14 يتم تنظيم أهداب متحركة في '9 + 2 "تكوين أنيبيب فيه تسعة أزواج أنيبيب تحيط صدرة المركزية. هذه الأهداب توليد التدفق أو حركة السوائل. الشكل 2 يوضح هيكل هدب متحرك وimmotile. أهداب متحركة خلل يمكن أن يؤدي إلى خلل الحركة الهدبية الابتدائية يظهر مع توسع القصبات، والعقم وعدم التماثل بين اليسار واليمين. 43 ويعتقد Immotile (الابتدائي) أهداب لتعمل أساسا عضية الحسية التي تنظم مسارات نقل الإشارة ويكون تكوين '9 + 0'، في بنية مماثلة لأهداب متحركة ولكن من دون زوج المركزي. 12، 14، 44 وتتميز العيوب في immotile أهداب سريريا من قبل التهاب الشبكية الصباغي، polydactyly، بتوضع مقلوب، صعوبات التعلم والكلى الكيسي والكبد والبنكرياس. 39 BBS هو مرض من أهداب immotile.
الرقم 2.

بنية هدب. رسم تخطيطي يوضح مقطع طولي من هدب الأساسي بما في ذلك توطين البروتينات المشفرة بواسطة الجينات المسببة للأمراض في بارديه-بيدل متلازمة. مجمع chaperonin يتوسط تجميع BBSome، الذي يتفاعل مع BBS3 (أ GTPase) وأعضاء الأسرة راب لتنظيم تكون الأهداب والحفاظ على هدب. يوضح وجهة النظر المقطع العرضي تكوين أهداب متحركة (9 + 2) وأهداب immotile (9 + 0).
الرقم الكامل وأسطورة (137 K)

يرتكز على هدب في الجسم القاعدية، وهو مريكز المتخصصة التي تعمل بمثابة مركز تنظيم أنيبيب. ومدبرة تكون الأهداب والصيانة عبر الجسم القاعدية التي تعمل بانسجام مع BBSome، والتي بدورها عن طريق التضمين مجمع chaperonin وأفراد الأسرة راب من البروتينات. 43 معا هذه البروتينات تسهيل النقل intraflagellar (IFT). هذه العملية الخلوية الحركة ثنائية الاتجاه من جزيئات يسهل تشكيل وصيانة هدب ( الشكل 2).
BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9 تشكيل مجمع BBSome 45، 46، 47 وBBS6، BBS10 وBBS12 تشكيل مجمع chaperonin. 48 المتبقية المعروف الجينات المسببة للأمراض ومتغير توقع ظائف على النحو المبين في الجدول 2. وقد تم التأكد من وجود فرق المظهري بين المرضى إيواء الطفرات المسببة للمرض في الجينات المرتبطة BBSome مقارنة مع الأشخاص الذين يعانون الطفرات في الجينات المرتبطة مجمع chaperonin.
وقد تم توضيح المرضية الجزيئية من الآثار عديد المظاهر من BBS جزئيا فقط. السمنة لوحظ في BBS هي متعددة العوامل في الأصل. استقلاب الطاقة ويبدو أن تكون مشابهة في المرضى الذين يعانون BBS ويقابل المرضى يعانون من السمنة المفرطة في عموم السكان. 49 نماذج الماوس تظهر وجود علاقة بين نقص BBS، وزيادة الاستهلاك الغذائي وانخفاض النشاط البدني، وليس هناك دليل على مقاومة اللبتين الطرفية. 50 اللبتين هو هرمون الشبع الذي يعمل عن طريق الالتصاق بمستقبلات هرمون الليبتين في منطقة ما تحت المهاد. الفئران BBS-متحولة زادت مستويات هرمون الليبتين. تبين التجارب المشتركة مناعي أن البروتين BBS1 يتفاعل مباشرة مع مستقبلات هرمون الليبتين وأن الطفرة M390R المشتركة يعطل هذا التفاعل. 51، 52
ماريون وآخرون 53 وجدت أن أهداب الابتدائية موجودة عابر في التفريق ما قبل الخلايا الشحمية وتحتوي على مستقبلات للWNT ومسارات القنفذ. هذه المسارات يشير الحفظ جدا جزء لا يتجزأ من التطور الطبيعي ويكون بمثابة جهري من تكون الشحم. تثبيط BBS10 وBBS12 يدفع تكون الشحم وأشار إلى أن هذا أمر ثانوي لتعطيل إشارات Wnt، التي لا يمكن الكشف عن بعد BBS نهدم. 53
ويعتقد ضمور قضيب مخروط أن يكون لذلك الاتجار غير طبيعي عبر أهداب تعديل معيب يربط بين قطاعات الداخلية والخارجية من خلايا مستقبلة للضوء مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. 50، 54، 55
تم العثور على مستقبلات الإشارات الصوتية القنفذ على أهداب في براعم الأطراف النامية. 55 ويعتقد أن البروتينات IFT لتعديل هذا المسار 39 ارتبط والتقلبات مع تشوهات الأطراف التي لوحظت في ciliopathies. 56
وrapamycin mTOR س إشارات المانع ينقذ الكيسات الكلوية وجدت في BBS morphants الزرد، تورط في مسارات الإشارات المنبع من mTOR س في BBS أمراض الكلى. 57
ويمكن أن يعزى نقص الشم / الشم إلى معيبة الظهارة الشمية مهدبة وضعف الخصوبة في جزء منه إلى خلل في أهداب الخلايا المنوية / ناقلة البيضات.
وارتبط BBS أول من اختلال وظيفي الهدبي عقب تحديد BBS8، التي localises للهياكل مهدبة والهيئات القاعدية وcentrosomes في الخلايا. 58 ومنذ ذلك الحين وقد أكدت عدة نماذج حيوانية هذه النتائج، وقد عززت الفهم الحالي للوظيفة البروتينات BBS. وقد حددت الماوس ونماذج الزرد دور البروتينات BBS في WNT ومسارات القنفذ سونيك، وكذلك مسارات إشارات أخرى. 39 وقد ثبت أن بروتينات BBS لتنظيم IFT والدهون homoeostasis في الديدان وتعدل الاتجار داخل الخلايا وظيفة centrosomal في الزرد. 59 نماذج الماوس تشترك العديد من الميزات المظهرية لوحظ في البشر المصابين BBS، وبالتالي تكون بمثابة نموذج الثدييات ممتازة للمرض. سيمونز وآخرون 60 أثبت هذا مع العلاج الجيني الناجح تمنع الموت مستقبلة للضوء في نموذج الفئران-BBS4 فارغة. وعلاوة على ذلك، فإن التقدم في فهم الأساس البيولوجي للسمنة في نماذج الفئران يمكن أن يؤدي إلى العلاج بالعقاقير المستهدفة لإدارة السمنة في المرضى الذين يعانون BBS. 28، 52

أعلى الصفحة إدارة

مطلوب نهج متعدد التخصصات لتحقيق إدارة فعالة هذا الشرط عديد المظاهر. على الرغم من أن الأبحاث جارية، لا يوجد حتى الآن علاج استهدافا لBBS. المضاعفات المرتبطة BBS ينبغي أن يعامل عرضيا كما هو الحال في عامة السكان. الشكل 3A الخطوط العريضة لإدارة المرضى الذين يعانون من BBS. الشكل 3B يحدد مسار التقييم المناسب للمرضى الذين يعانون من BBS المشتبه بهم والذين لا يستوفون معايير التشخيص المعدلة لBBS.
الرقم 3.

إدارة المرضى الذين يعانون من المشتبه بهم وأكد BBS. (أ) الخطوط العريضة لإدارة المرضى الذين يعانون من تشخيصها سريريا BBS. (ب) يحدد مسار التقييم المناسب للمرضى الذين يعانون من BBS المشتبه بهم والذين لا يستوفون المعايير السريرية معدلة لBBS.
الرقم الكامل وأسطورة (139 K)

يجب قياس ضغط الدم كل ستة أشهر أو أكثر في كثير من الأحيان إذا كان هناك دليل على ارتفاع ضغط الدم. يجب أن يوصف خافضات ضغط الدم ودهون، تخفيض الدواء حسب الاقتضاء. فمن المستحسن أن جميع المرضى الذين لديهم الموجات فوق الصوتية واحد على الأقل الكلوي الأساسي لاستبعاد أي تشوهات واضحة. استجواب تركيزا فيما يتعلق بأي من أعراض مرض السكري الكاذب هو مفيد في كثير من الأحيان ينظر إلى هذا الكيان كثيرا ما يغفل في المرضى الذين يعانون من BBS. المرضى الذين يعانون من الفشل الكلوي ينبغي أن تحال إلى أمراض الكلى.
مطلوب تقييم لطب العيون مفصل بما في ذلك مخطط كهربية لتحديد بداية ودرجة ضمور قضيب مخروط وللكشف عن العيوب البصرية الأخرى مثل الأخطاء الانكسارية، اعتلال الشبكية السكري أو إعتام عدسة العين. يمكن المعينات البصرية والتدريب التنقل بشكل ملحوظ تحسين نوعية الحياة لأولئك الذين يعانون من ضعف البصر.
إدارة الوزن فعالة أمر حتمي لتجنب الإصابة بالأمراض المرتبطة مثل متلازمة الأيض التي المرضى الذين يعانون من BBS قد تكون عرضة بشكل خاص. ممارسة الرياضة وعلم التغذية المراجعة يمكن أن تساعد في توفير استراتيجية انقاص الوزن.
مطلوب تقييم التنموي والتربوي منتظم لضمان حصول المرضى الحصول على النحو الأمثل من بيئة التعلم. ومن الجدير بالذكر أنه على الرغم من التقييم المبكر مفيد في وضع الطفل في بيئة تعليمية أفضل، فإنه ليس دائما مؤشرا على إمكانية الكبار الكاملة. 4 يستفيد كثير من المرضى من مراجعة من قبل طبيب نفسي للمساعدة في القلق، والاكتئاب أو سلوكية القضايا، التي هي أكثر شيوعا في BBS.
ويجب أن يشمل تقييم الغدد الصماء التقييم لتحديد أي علامات وأعراض مرض السكري عن طريق الفم مع احق اختبار تحمل الغلوكوز إذا كان ذلك مناسبا. تقييم وظيفة الغدة الدرقية، لمحة الدهون وتطوير الخصائص الجنسية الثانوية هو المهم. إذا يمكن أن يتم المناسب، مزيد من الغدة النخامية اختبار وظيفة والعلاج بالهرمونات البديلة حرض.
اعتمادا على حاجة الفرد، والإحالة إلى أخصائي تقويم الأسنان لتقييم الأسنان الزحام / نقص الأسنان أو طبيب القلب للتحقيق من أي تشوهات قلبية الهيكلية قد يكون مناسبا.
الاستشارة الوراثية

ورثت BBS عموما بطريقة مقهورة. على الرغم من أن هناك حالات متعددة من الميراث triallelic، هذه الحالات يصعب تحديد ويعتقد أن تمثل أقل من 10٪ من جميع الحالات. 5 ولذلك فمن المناسب للمرضى محامي والأسر وفقا لراثي خطر تكرار المتنحية التقليدي. وبالتالي، فإن أي أخ من الطفل المصاب لديه خطر 25٪ من التأثر ومخاطر 50٪ من كونه الناقل من اعراض و 25٪ بأنهم غير متأثر وليس الناقل.
في العائلات التي لا يعرف الطفرات المسببة للأمراض، ما قبل الزرع التشخيص الوراثي أو اختبارات ما قبل الولادة قد يكون ممكنا. بدلا من ذلك، في الأسر المعرضة للخطر حيث طفرة غير معروف، استهدف الهجوم الثاني بالموجات فوق الصوتية الثلث يجوز تطبيق التصور من polydactyly بعد المحوري وتشوهات الكلى الإرشادية للتشخيص BBS. 61، 62
ينبغي نصح المرضى وأولياء الأمور لطبيعة غير المتجانسة للحالة. وinterfamilial كبير والاختلاف داخل الأسرة يعيق التوقعات حول الإنجازات التعليمية الفردية، وتدهور البصرية أو غيرها من الصعوبات المرتبطة BBS. على الرغم من أن العقم هو القاعدة، وهذا لا يمكن الافتراض كما أن هناك العديد من التقارير لكل من الرجال والنساء مع BBS الذين لديهم أطفال. 4

أعلى الصفحة استنتاج

منذ تم التعرف على الجين الأول للBBS منذ أكثر من عقد من الزمان، كانت هناك تطورات واسعة في هذا المجال. وقد تم حتى الآن اكتشاف ما مجموعه 16 الجينات المسببة للأمراض وفهمنا للخصائص الوظيفية سهلت نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الظواهر الهدبية بشكل عام وBBS على وجه الخصوص. في السنوات المقبلة، فمن المرجح أن يتم تحديد الجينات الأخرى المسببة للمرض والتي سيكون هناك مزيد من التحسن في الخدمات التشخيصية السريرية السماح لتشخيص أسرع واختبارات ما قبل الولادة.
القدرة على التنبؤ بدقة أكبر مستوى للعجز الفرد المتضررين من المرجح أن تجربة يمكن تحسينها من خلال تعزيز فهمنا للعمليات الجزيئية التي تؤدي إلى التباين المظهري. وفهم العوامل جينية قد تفسر التباين داخل الأسرة والمعدلات الأخرى في حالة يتحتم في هذه العملية.
توضيح من التسبب الجزيئي للالمظاهر السريرية لBBS والبحوث في علم التداوي قد تسفر عن خيارات العلاج الرواية التي تستهدف جوانب الجهاز محددة من الشرط، مثل الكيسات الكلوية أو انحطاط قضيب مخروط، أو يكون لها تأثير تحوير أعم على عدة جوانب لهذه الحالة.

أعلى الصفحة تضارب المصالح

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

أعلى الصفحة المراجع

  • لورانس JZ، القمر RC: أربع حالات من "التهاب الشبكية الصباغي" التي تحدث في نفس العائلة، ويرافقه عيوب العامة للتنمية الإجسام سمنة الدقة 1995؛ 3: 400-403. | مجلات | ISI |
  • بارديه G: في متلازمة السمنة الخلقية مع polydactyly والتهاب الشبكية الصباغي (مساهمة في دراسة الأشكال السريرية للسمنة نخامية) الإجسام سمنة الدقة 1995؛ 3: 387-399. | مجلات |
  • بيدل A: زوج من الأشقاء مع adiposo-التناسلية ضمور الإجسام سمنة الدقة 1995؛ 3: 404. | مجلات | CAS |
  • Beales PL، Elcioglu N، ولف AS، باركر D، Flinter FA: معايير جديدة لتحسين تشخيص متلازمة بارديه-بيدل: نتائج مسح السكان J ميد جينيه 1999؛ 36: 437-446. | مجلات | ISI | CAS |
  • مياه AM، Beales PL: بارديه-بيدل متلازمة؛ GeneReviews [الإنترنت] 1993-2003 (حدثت في 2011).
  • ريسه R، Andreasson S، Borgastrom MK آخرون. تباين داخل الأسرة من النمط الظاهري في بارديه-بيدل متلازمة برازيلي J Ophthalmol 1997؛ 81: 378-385. | المادة | مجلات |
  • Katsanis N، انسلي SJ، Badano JL آخرون. . الميراث Triallelic في متلازمة بارديه-بيدل، وهو اضطراب المتنحية مندلية العلوم 2001؛ 293: 2256-2259. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • فرج TI، الطيبي AS: ارتفاع عدد حالات متلازمة بارديه بيدل بين البدو كلين جينيه 1989؛ 36: 463-464. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • الأخضر JS، Parfrey PS، هارنيت دينار وآخرون. المظاهر الأساسية للمتلازمة بارديه-بيدل، وهو شكل من متلازمة لورنس-مون بيدل ن ي ميد 1989؛ 321: 1002-1009. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • ويب MP، ديكس EL، أخضر JS آخرون. متلازمة مقهورة بارديه-بيدل: أقارب من الدرجة الأولى ليس لديها استعداد لالأيضية والاضطرابات الكلوية الكلى كثافة العمليات 2009؛ 76: 215-223. | المادة | مجلات | CAS |
  • . هامل CP: المخروط قضيب ضمور J Orphanet نادر ديس 2007؛ 2: 7. | المادة | مجلات |
  • بيكر K، Beales PL: بمعنى جعل من أهداب في المرض: ciliopathies البشري آم J ميد جينيه C سيمين ميد جينيه 2009؛ 151C: 281-295.
  • آدامز NA، Awadein A، توما HS: إن ciliopathies الشبكية جينيه العيون 2007؛ 28: 113-125. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • . توبين JL، Beales PL: متلازمة بارديه-بيدل: ما وراء هدب Pediatr Nephrol 2007؛ 22: 926-936. | المادة | مجلات | ISI |
  • Hjortshoj TD، Gronskov K، فيلب AR آخرون. متلازمة بارديه-بيدل في الدنمارك - تقرير 13 الاختلافات تسلسل الرواية في ستة جينات هوم Mutat 2010؛ 31: 429-436. | المادة | مجلات |
  • Rooryck C، D لاكومب: متلازمة بارديه-بيدل آن Endocrinol (باريس) عام 2008؛ 69: 463-471. | المادة | مجلات |
  • مور SJ، أخضر JS، فان Y آخرون. علم الأوبئة السريرية والجينية لمتلازمة بارديه-بيدل في نيو فاوند لاند: لمدة 22 المحتملين على السكان، دراسة، فوج آم J ميد جينيه A 2005؛ 132: 352-360. | مجلات |
  • Putoux A، Attie-Bitach T، مارتينوفيتش J، غوبلر- MC: التباين المظهري من متلازمة بارديه-بيدل: التركيز على الكلى Pediatr Nephrol 2012؛ 27: 7-15. | المادة | مجلات |
  • Deveault C، G بيلينغسلي، دنكان JL آخرون. BBS التقييم الوراثي، النمط الظاهري للأتراب المرضى متعددة الأعراق يدعو إلى إعادة النظر في تعريف مرض هوم Mutat 2011؛ ​​32: 610-619. | المادة | مجلات |
  • أوديا D، Parfrey PS، هارنيت دينار، Hefferton D، كريمر BC، أخضر J: أهمية القصور الكلوي في التاريخ الطبيعي للمرض بارديه-بيدل آم J الكلى ديس 1996؛ 27: 776-783. | المادة | مجلات | CAS |
  • ماريون V، SCHLICHT D، A Mockel وآخرون. متلازمة بارديه-بيدل يسلط الضوء على الدور الرئيسي للهدب الأساسي في كفاءة استيعاب المياه الكلى كثافة العمليات 2011؛ ​​79: 1013-1025. | المادة | مجلات |
  • Beales PL، وارنر AM، قاتل GA، Thakker R، Flinter FA: متلازمة بارديه-بيدل: دراسة جزيئية والمظهرية من 18 عائلة J ميد جينيه 1997؛ 34: 92-98. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • Elbedour K، زوكر N، Zalzstein E، بركي Y، كرمي R: تشوهات القلب في متلازمة بارديه-بيدل: دراسات تخطيط صدى القلب من 22 مريضا آم J ميد جينيه 1994؛ 52: 164-169. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • دي Pontual L، زغلول NA، توماس S وآخرون. قشوة بين الطفرات المتقاعد وBBS ينظم تعصيب المعوي ويسبب المرض هيرشسبرونغ المتلازمة بروك Natl أكاد العلوم الولايات المتحدة الأمريكية عام 2009؛ 106: 13921-13926. | المادة | مجلات |
  • Kulaga HM، ليتش CC، Eichers ER وآخرون. فقدان البروتينات BBS يسبب

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
إضافة رد

أدوات الموضوع
طريقة عرض الموضوع

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك

BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة

الانتقال السريع


 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية



الساعة الآن 12:42 AM.