وقد استخدم
perforatum عشبة (نبتة سانت جون) لعدة قرون في العلاج بالاعشاب من الالتهابات البكتيرية والفيروسية وأمراض الجهاز التنفسي، وجروح الجلد، قرحات الهضمية، والتهاب الاكتئاب الخفيف
1. Hyperforin، معزولة عن أجزاء ازدهارها، هو العنصر الطبيعي الأكثر دراسة هذا النبات، وقد تم الإبلاغ عن للحث على موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية
2، وتمنع نمو الخلايا السرطانية
3، غزو السرطان والانبثاث
4، وكذلك الأوعية الدموية
5. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام hyperforin باسم "بروزاك العشبية" لعلاج الكآبة المعتدلة
6، ويكشف المضادات الحيوية
7 والمضادة للملاريا
8 النشاط، ويدفع الأيض المخدرات كبدي من خلال تفعيل نظام السيتوكروم P450 عن طريق قابلية عالية ملزما للsteroid- وأجنبي بيولوجيا الاستشعار pregnan النووي X مستقبلات (PXR)
9، مما يجعل منه مرشحا حاسما في التفاعل المخدرات.
ليست مفهومة حتى الآن آليات الإجراءات hyperforin، ولكن يمكن أن تشمل تثبيط 5-أكسيجيناز شحمية
10، قابلية عالية ملزما للبريغنان X مستقبلات
9، وإطلاق سراح من الكالسيوم 2+ و / أو الزنك 2+ من مخازن داخل الخلايا
11، 12، ويؤثر من قبل المشبكي والحويصلي امتصاص وتخزين وإطلاق الناقلات العصبية مثل السيروتونين، الدوبامين، بافراز، أستيل كولين، GABA والغلوتامات
13، 14، 15، 16، 17، 18. غوبي
وآخرون 14 المقترحة جود انخفاض في قيمة تخزين مونوامين بسبب تثبيط مثل ريزيربين للنقل مونوامين الحويصلي (VMAT). ولكن، يستهدف في حين ريزيربين أكثر قدرة VMATs في الأسرة SLC18 الجين
19 لالسيروتونين، ادرينالين، بافراز والدوبامين، hyperforin بالإضافة إلى ذلك يؤثر أستيل
18، الركيزة للنقل أستيل الحويصلي (VAChT، SLC18 أيضا عائلة الجينات)، وGABA والغلوتامات
15، 16 ، ركائز للالمثبطة النقل حويصلي الأحماض الأمينية (VIAATs، SLC32 الأسرة الجينات)
20 ونقل الغلوتامات الحويصلي (VGluTs، SLC17 الأسرة الجينات)
21. تخزين الناقلات العصبية يعتمد بشكل كبير على التدرج الكهربائية والبروتون حويصلي، التي تنتجها H + إطعام الفئران، وذلك باستخدام الطاقة لضخ H + باستمرار إلى الحويصلات المشبكية. ويمكن بعد ذلك الناقلات العصبية تكون مركزة ضد التدرج في تبادل اثنين من البروتونات ترك الحويصلة
19. وقد تبين أن تحمض الحويصلات المشبكية المعزولة التي رصدتها مضان أكريدين البرتقال تبريد ألغيت في وجود hyperforin
16، 22، واقترح أن تبديد للH + التدرج من النشاط مثل protonophore يلغي قوة دافعة للناقل عصبي امتصاص إلى الحويصلات
16، 22.
ليس فقط حويصلي، ولكن أيضا البلازما النقل غشاء من الناقلات العصبية ويبدو أن تتأثر hyperforin. وفي هذا الصدد، اقترح hyperforin لزيادة تركيز الصوديوم داخل الخلايا، وتقليل وقت لاحق التدرج الصوديوم اللازمة لالعصبي (إعادة) المتحصلات من الفضاء خارج الخلية من قبل الناقل العصبي قبل المشبكي الناقلون
23، 24. في وقت لاحق تبين أن hyperforin ينشط قنوات الموجبة غير انتقائية في الصفائح الدموية البشرية وورم القواتم الفئران (PC12) خلايا
25، وفي عام 2007 hyperforin تم تقديمه على أنه منشط محدد لغير انتقائية TRPC6 قناة الموجبة (مستقبلات عابرة المحتملين الكنسي 6)
26. وأعرب عن TRPC6 في الصفائح الدموية البشرية
27 والخلايا PC12
26، 28، والتي يسببها hyperforin نا + تدفق، قد يكون راجعا إلى تفعيل TRPC6. ومع ذلك، يتم وصف الآثار الأخرى للhyperforin التي قد تشارك أيضا في أعمالها الدوائية. على سبيل المثال، hyperforin خفف مختلف المواصلة الأيونية voltage- وبوابات يجند في الخلايا العصبية الحصين معزولة أو الخلايا العصبية العصبية للدماغ
29، 30، 31، 32، فإنه يغير سيولة الأغشية
33 وينهار غشاء الميتوكوندريا الرائدة محتمل لإطلاق سراح الزنك 2 + والكالسيوم 2+ في العصارة الخلوية
12.
في هذه الدراسة استخدمنا التصوير الفلورسنت لرصد درجة الحموضة داخل الخلايا، والتغيرات الصوديوم عصاري خلوي وإطلاق الناقلات العصبية، وخلية كاملة التصحيح تقنية المشبك لتحديد وتوصيف تصرف الناجم عن hyperforin في أربعة أنظمة مستقلة، في كلوة-293 الخلايا، والابتدائي الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا أليفة الكروم الماوس، والأغشية الدهنية طبقة ثنائية. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن hyperforin نفسها بمثابة protonophore ويتوسط لتصرف بروتون كبير بذلك. لا يتطلب هذا تصرف وجود البروتينات مثل قناة TRPC6 واتجاهه يعتمد على القوى الموجودة القيادة مثل غشاء المحتملة ودرجة الحموضة التدرج. وتمشيا مع هذه النتائج، وإلغاء تراكم الناقلات العصبية في الخلايا أليفة الكروم الماوس الرئيسي في وجود hyperforin.
OAG التي يسببها TRPC6 مقابل التيارات التي يسببها hyperforin
مادة ال diacylglycerol (DAG)، التي تم إنشاؤها بواسطة G ف / 11 -coupled مسارات الإشارات، أو مباشرة تطبيق النظير DAG، ومن المعروف أن تحفز TRPC3، TRPC6، TRPC7 والفأر TRPC2 قنوات مستقلة من تفعيل مديرية الشؤون الجغرافية بوساطة من بروتين كيناز C (PKC) . باستخدام خلية كاملة تقنية المشبك التصحيح قمنا بقياس تطور الداخل والخارج التيارات، المستخرجة من سلالم الجهد في -80 و+80 بالسيارات، على التوالي، بناء على طلب خارجي من 100 ميكرومتر 1-oleoyl-2-أسيتيل-SN-الجلسرين ( OAG)، تناظرية داغ، في كلوة-293 الخلايا معربا عن ستابلي TRPC6 كدنا] (خلايا كلوة-TRPC6؛
الشكل 1A، أثر أسود). 100 ميكرومتر حمض الفلوفيناميك (FFA)، أظهرت أيضا لتنشيط TRPC6، كشفت نفس التيار كما OAG في الخلايا كلوة-TRPC6
(الشكل 1A، أثر الأزرق).
1B الشكل يدل على المقابلة العلاقات الجهد الحالي (إيفس) كشف نموذجية مزدوجة -rectifying التيارات TRPC6. تطبيق خارجي من 1 و 3 و 10 ميكرومتر hyperforin الجرعة بشكل تابع تنشيط تيار مختلفة في الخلايا كلوة-TRPC6
(الشكل 1C). مركز الحبس الاحتياطي المقابلة
(الشكل 1D لم) لا يمثل الشكل النموذجي للتيار بوساطة TRPC6 (انظر
الشكل 1B). عند تطبيق hyperforin على خلايا غير transfected كلوة-293، وليس التعبير عن TRPC6 (كلوة،
الشكل 1E)، أو على الماوس الأساسي الخلايا الدبقية القشرية
(الشكل 1G) وجدنا نفس التيار بنفس الرابع
(الشكل 1F، ح. ) كما رأينا في الخلايا كلوة-TRPC6. وهكذا، لم يكن بوساطة التيار الناجم عن hyperforin عبر TRPC6. ظهر نفس التيار باستخدام hyperforin كما زودت dicyclohexylammonium (DCHA) الملح (سيغما؛
الشكل 1A-F)، أو حمض الحرة كما هو الحال في الميثانول (سيغما أو كايمان المواد الكيميائية؛
الشكل 1G، ح).
الشكل 1: OAG التي يسببها TRPC6 مقابل التيارات التي يسببها hyperforin. 
الداخل والخارج التيارات في -80 و+80 بالسيارات، على التوالي، من HEK-293 الخلايا، معربا عن ثابت TRPC6 كدنا] (HEK-TRPC6، أ، ج)، غير transfected-كلوة (HEK) خلايا (ه) والماوس الأساسي دبيقي القشرية الخلايا (ز). كما يتضح من الحانات 100 ميكرومتر OAG أو 100 ميكرومتر حمض الفلوفيناميك (FFA؛ أ)، 1، 3 أو 10 ميكرومتر hyperforin كما زودت dicyclohexylammonium (DCHA) الملح (ج، ه)، و 10 ميكرومتر hyperforin تزويد الحمض الحر كما في الميثانول ( طبقت ز)؛ MtOH. تم تطبيع التيارات لحجم الخلية وتم طرح التيارات الأساسية قبل تطبيق المجمع. يتم عرض المقابلة العلاقات الجهد الحالي (إيفس) في (ب، د، و) و (ح). تمثل البيانات سائل ± SEM من العدد المشار إليه من التجارب (الخلايا).
يعتمد التيار الناجم عن hyperforin على جرعة من hyperforin، كما هو مبين في خلايا فأر دبيقي
(الشكل 2A، ب)، مع تركيزات نصف القصوى (EC 50) 9.3 و 8.7 ميكرومتر hyperforin لنحو الداخل
(الشكل 2D) و التيار الخارج
(الشكل 2E)، على التوالي. في موازاة ذلك ارتفعت السعة الخلوية مع تركيزات أعلى hyperforin طالما كان hyperforin الحالي، وانخفضت بعد ذلك مرة أخرى
(الشكل 2C). لم الحالية والسعة لا تصل إلى الهضبة خلال تطبيق hyperforin، ولكن معدل الزيادة تباطأ. على ما يبدو، ومن المقرر إلى إدماج hyperforin محبة للدهون في طبقة ثنائية المادة الدهنية في غشاء البلازما التغييرات السعة. الخلايا الدبقية المعزولة من الفئران TRPC3 / TRPC6 التي تعاني من نقص كشفت نفس الحالي (بوساطة hyperforin
الشكل 2F) بنفس الرابع
(الشكل 2G) كخلايا دبقية صغيرة معزولة من النوع البري الفئران، وليس خلايا تطوير تيار معين على OAG تطبيق
(الشكل 2H، ط). RT-PCR 50 فرز الخلايا الدبقية من النوع البري الفئران لم يكشف عن أي نسخة لTRPC6
(الشكل 2J)، التدقيق أن التيار، والتي تظهر في كل خلايا اختبار حتى الآن الناجم عن hyperforin، لا تعتمد على وجود TRPC6 .
الشكل 2: الحث Hyperforin الجرعة بشكل تابع التيارات في الخلايا الدبقية. 
الداخل والخارج التيارات في -80 و+80 بالسيارات، على التوالي، من الخلايا الدبقية الأولية معزولة من النوع البري (أ، ح، ك) وTRPC3 /-TRPC6 ناقص الفئران (و، ح). وكانت التيارات طبيعية لحجم الخلية، وإلا في (ح)، تم طرح التيارات الأساسية قبل تطبيق المجمع. كما يتضح من الحانات تركيزات مختلفة من hyperforin (أ، و)، و 100 OAG ميكرومتر أو حل حمام، طبقت (لا OAG ح). (ب، ز) و (ط) عرض الحبس المقابلة. (ج) التغيرات الجرعة التي تعتمد على السعة طبيعية من الخلايا في (أ). نوبات السيني من التيارات القصوى التي يسببها hyperforin في الفقرة (أ) تكشف عن وجود تركيز نصف القصوى (EC 50) 9.3 و 8.7 ميكرومتر لنحو الداخل (د) والتيارات الخارج (ه)، على التوالي. الخلايا الدبقية معزولة عن C3 / C6-ناقص (كو، و، ز) والبرية من نوع الفئران (أ، ب) تكشف عن التيارات التي يسببها hyperforin مماثلة، ولا وضعت التيار محددة بناء على طلب OAG (ح، ط). (ي) RT-PCR لTRPC6 (197 بي بي) والنصوص HPRT (160 بي بي) من 50 FACS فرز الخلايا الدبقية. الحمض النووي الريبي مجموع من الدماغ بمثابة السيطرة. (ك) التيارات Hyperforin التي يسببها في وجود (أسود) وغياب الكاتيونات خارج الخلية أحادي التكافؤ، وحلت محلها NMDG + (الأزرق)، الكلور -، وحل محله اسبارتاتي (الحمراء)، والكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ (0Ca0Mg؛ لا البديل؛ الأخضر). (ل) مراكز التحقيق المقابلة تطبيع إلى السعة الحالية عند 100 فولت. تمثل البيانات سائل ± SEM من العدد المشار إليه من التجارب (الخلايا).
لاختبار الأيونات هي المسؤولة عن التيار الناجم عن hyperforin، ونحن تعديل تكوين أيون من الحل الخارجي. ولكن، لا تبديل الخارجي نا + وK + (حل محله الموجبة غير قابلة للاختراق NMDG +)، أو إزالة الكاتيونات ثنائي التكافؤ (0Ca0Mg الاسمية)، ولا استبدال الكلور - (حل محله أنيون اسبارتاتي غير قابلة للاختراق) تغيرت بشكل ملحوظ تطوير التيار الناجم عن hyperforin في الخلايا الدبقية
(الشكل 2K). مركز الحبس الاحتياطي تطبيع التيارات بوساطة hyperforin في حضور وغياب الصوديوم، الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ و الكلور - كل تكشف عمليا على شكل وانعكاس نفس الإمكانيات، مشيرا إلى أن التيار لا يحركه التي يسببها hyperforin التكافؤ وثنائي التكافؤ الكاتيونات نموذجية، ولا الأنيونات نموذجي
(الشكل. 2L). غيرنا بجوار الرقم الهيدروجيني للمحلول الخارجي، حيث أن ما تبقى من أيونات ربما نفاذية الوحيدة البروتونات. تطبيق hyperforin في درجة الحموضة الخارجية أكثر حمضية أو أكثر الأساسية من 7.2 (داخل الخلايا دائما درجة الحموضة 7.2) أسفرت إما الطريقة انخفاضا كبيرا من السعة الحالية
(الشكل 3A). إمكانات انعكاس تم الحصول عليها من مراكز التحقيق
(الشكل 3B) تحول كبير نحو القيم أكثر إيجابية وأكثر سلبية على تحمض خارج الخلية وقلونة، على التوالي
(الشكل 3C). منذ وضع الحالي الناجم عن hyperforin في الظروف الخارجية الحمضية أو الأساسية انخفاضا كبيرا، ونحن تنشيط التيار في درجة الحموضة الخارجية 7.2 وغيرت الرقم الهيدروجيني بعد التيار قد وضعت بالفعل
(الشكل 3D). تغيير لدرجة الحموضة 8.9 أدى إلى انخفاض فوري من السعة الحالية نحو القيم مماثلة كما رأينا لتطوير التيار الناجم عن hyperforin في درجة الحموضة 8.9. في المقابل، بعد زيادة أولية للتيار الداخل، والتحول إلى الرقم الهيدروجيني 5.4 تؤد إلا إلى انخفاض صغير من السعة الحالية. لكن، وكما رأينا بالفعل في
أرقام 3B و ج، إمكانات عكس التيارات التي يسببها hyperforin تحول نحو القيم أكثر إيجابية على تحمض الخارجي والقيم أكثر سلبية على قلونة الخارجية
(الشكل 3E، و).
الرقم 3: Hyperforin يدفع تيار تعتمد على بروتون في الخلايا الدبقية. 
الداخل والخارج التيارات في -80 و+80 بالسيارات، على التوالي، من الخلايا الدبقية الماوس الأساسي (أ، د، ح، ي). كما يدل على ذلك الحانات وطبق إما 10 ميكرومتر hyperforin في درجة الحموضة خارجية مختلفة (PHX؛ أ) أو تم تغيير الرقم الهيدروجيني الخارجية في غياب (ح) أو خلال 10 ميكرومتر hyperforin (د) أو 10 ميكرومتر CCCP (ي) التطبيق. تم تطبيع التيارات لحجم الخلية وتم طرح التيارات الأساسية قبل تطبيق المجمع. يتم عرض الحبس المقابلة في (ب، ه، ط) و (ك). (ج، و) و (ل) إظهار التغيير من إمكانات انعكاس خلال التجارب في (أ، د) و (ي) على التوالي. لاحظ أن إمكانات عكس hyperforin- وCCCP الناجم عن التيارات تتغير مع درجة الحموضة خارجية مختلفة (انظر ج، و ول)، وأن مراكز التحقيق ودرجة الحموضة 5.4 التغييرات التي تعتمد على إمكانية انعكاس متشابهة لhyperforin- وCCCP التيارات يسببها (انظر الإلكترونية وك فضلا و ولتر، على التوالي). في (ز) عن التي تم الحصول عليها تجريبيا قيم إمكانات عكس التيارات التي يسببها hyperforin (يخرف السوداء) يتم رسم مقابل الرقم الهيدروجيني الخارجية (داخل الخلايا درجة الحموضة 7.2). الخط الأحمر المنقط في (ز) يصور H + عكس إمكانات تحسب عن طريق المعادلة نرنست لبروتون الحالي في درجة الحموضة داخل الخلايا 7.2 درجة الحموضة والخارجية كما هو مبين (انظر الإجراءات التجريبية). تمثل البيانات سائل ± SEM من العدد المشار إليه من التجارب (الخلايا).
الرقم الجيل الثالث 3G يظهر المؤامرة جميع الامكانيات انعكاس قياسها في اعتماد الرقم الهيدروجيني الخارجية (النقط السوداء، ودرجة الحموضة داخل الخلايا 7،2). الخط الأحمر المنقط يصور H + عكس النظرية إمكانات، وتحسب على أساس معادلة نرنست تحت داخل الإقليم معين ودرجة الحموضة خارج الخلية، أي تركيزات البروتون. إمكانات عكس الكشف تجريبيا وتحسب متشابهة، والفرق طفيف هو على الارجح بسبب تدفق بروتون كبيرا، وهو ما قد يغير H + تركيز على مقربة من الغشاء، وبالتالي إمكانية عكس المتوقع. تغيير درجة الحموضة الخارجية 5،4-8،9 دون تطبيق hyperforin لم استحضار التيارات مماثلة في الخلايا الدبقية
(الشكل 3H.؛ انظر
الشكل 3I. لمراكز التحقيق). وباختصار، فإن النتائج تشير حتى الآن إلى أن hyperforin يتوسط لتصرف بروتون في كلوة وكذلك الخلايا الدبقية.
الكربونيل السيانيد م-chlorophenylhydrazone (CCCP)، وهو protonophore تستخدم أساسا في الميتوكوندريا الامم المتحدة ومقرنة، التيارات تنشيط الخلايا الدبقية في
(الشكل 3J. مع IV مشابه)
(الشكل 3K.، أثر أسود)، ولكن سعة أصغر بكثير من hyperforin. على تحمض الخارجي لدرجة الحموضة 5.4 في CCCP بوساطة الداخل الحالي زيادة
(الشكل 3J، ك.)، واحتمال انعكاس تغير بنفس الطريقة تماما كما هو الحال في hyperforin نحو القيم أكثر إيجابية، كما هو متوقع من توزيع بروتون
(الشكل 3L. وانظر أثر الأحمر في
الشكل 3F للمقارنة). التتبع الحمراء في
الشكل 3K يظهر IV الأولي للتيار مباشرة بعد التحول إلى الرقم الهيدروجيني 5.4 بوساطة hyperforin. تتبع البرتقالي يصور الرابع في السعة الحالية القصوى في درجة الحموضة 5.4، حيث على الأرجح بمبلغ إضافي أساسا التيار الخارج، والذي لم مزيد من التحري.
على افتراض أن hyperforin يتوسط تصرف بروتون ومن المتوقع أن يصبح أكثر حمضية بناء على طلب hyperforin، لأن تقدم إمكانات غشاء السلبية قوة دافعة للبروتونات في الخلية العصارة الخلوية من خلايا سليمة. لإثبات ذلك، فإننا تحميل خلايا كلوة سليمة مع تراعي درجة الحموضة صبغة الفلورسنت BCECF-AM، تطبيق تركيزات مختلفة من hyperforin، وقياس نسبة مضان F 490 / F 450 كمؤشر للتغيرات درجة الحموضة داخل الخلايا. مع زيادة تركيزات hyperforin نسبة مضان BCECF انخفضت الجرعة بشكل تابع
(الشكل 4A). كشفت نسبة BCECF المتهدمة ثابت (انظر أيضا
الشكل 4C). ولذلك، فإننا احتساب التغيرات التي يسببها hyperforin النسبية نسبة BCECF فيما يتعلق بتطبيق السيطرة على 1٪ DMSO، الذي لم يغير كثيرا من الإشارات. تناسب السيني من التغيرات النسبية نسبة BCECF في تركيزات مختلفة hyperforin الخارجية، المستخرجة في 200 ق في
الشكل 4A، كشف عن وجود EC 50 من 8.5 ميكرومتر hyperforin
(الشكل 4B)، وهو تقريبا نفس لالناجم عن hyperforin- التيارات في الخلايا الدبقية (انظر
الشكل 2D، ه). للتحقق من صحة القياسات ودرجة الحموضة، NH 4 الكلورين (20 ملم) وطبقت خارج الخلية. NH 3 يدخل الخلايا ويربط H + رفع درجة الحموضة داخل الخلايا (قلونة) مما أدى إلى زيادة نسبة BCECF
(الشكل 4C)، التدقيق أن نقصان، كما رأينا لhyperforin، يمثل تحمض داخل الخلايا. غشاء المحتملة السلبية صغيرة نسبيا من الخلايا كلوة (-50 بالسيارات
34) تمثل قوة دافعة محدودة للالبروتونات داخل الخلية. لذا، أجرينا BCECF تجارب التصوير مضان في تركيبة مع خلية كاملة تقنية المشبك التصحيح، للسيطرة على إمكانات غشاء الخلايا كلوة، وبالتالي القوة الدافعة لH + داخل وخارج الخلية. وأضاف BCECF (حمض الحرة) في حل ماصة التصحيح. بعد أن وصلت نسبة مستقرة مضان
(الشكل 4F)، وغشاء المحتملة (عقد المحتملة، V ح) وفرضت على قيم مختلفة
(الشكل 4D). الأرقام 4E، و، ز، ح تمثل السعة تطبيع، تغييرات درجة الحموضة داخل الخلايا (BCECF F 490 / F 450)، الداخل والخارج التيارات في -80 بالسيارات و+80 بالسيارات، على التوالي، واحتمال انعكاس قبل وأثناء تطبيق 10 ميكرومتر hyperforin. فقط في وجود hyperforin (المشار إليها مربع)، عندما يظهر بروتون التيار المفترض
(الشكل 4G)، وعقد إمكانات -80 بالسيارات و+80 بالسيارات التوسط بين الخلايا تحمض وقلونة
(الشكل 4D، و) على التوالي، كما هو متوقع من القوة الدافعة للالبروتونات داخل الخلية في -80 بالسيارات وخارج الخلية في +80 بالسيارات. كما نتيجة انعكاس التحولات المحتملة للقيم أكثر إيجابية وفقا لحسابات المعادلة نرنست لانخفاض الخلايا (قلونة)، والقيم أكثر سلبية كما يحسب لزيادة الخلايا (التحميض) من تركيز بروتون
(الشكل 4H). أرقام 4I وي المعرض مركز الحبس الاحتياطي المستخرج في النقاط الزمنية المشار إليها (النصال في
الشكل 4G)، وبالتالي إمكانات انعكاس قبل
(الشكل 4I) وخلال
(الشكل 4J) 10 ميكرومتر تطبيق hyperforin، على التوالي، في إمكانية عقد -80، 0 و+80 بالسيارات.
الرقم 4: Hyperforin يؤدي الى تغييرات في درجة الحموضة داخل الخلايا في الخلايا كلوة. 
(أ، ج) التغيرات النسبية نسبة مضان (F 490 / F 450) حساسة للدرجة الحموضة صبغ BCECF-AM في الخلايا كلوة. كما يتضح من الحانات تركيزات مختلفة من hyperforin أو 1٪ DMSO (أ)، أو 20 ملي NH 4 الكلورين (ج) طبقت. الخارجية NH 4 الكلورين يدفع قلونة داخل الخلايا، وبالتالي زيادة من 490 F / F 450 (ج). تناسب السيني من الانخفاض النسبي في نسبة BCECF بتركيزات hyperforin مختلفة، وتحسب في 200 ق فيما يتعلق بتطبيق سيطرة DMSO، تكشف عن وجود تركيز نصف القصوى (EC 50) من 8.5 ميكرومتر (ب). السعة تطبيع (ه)، والتغيرات ودرجة الحموضة داخل الخلايا (F 490 / F 450؛ و)، الداخل والخارج التيارات في -80 بالسيارات و+80 بالسيارات، على التوالي، تطبيع حجم الخلية (ز)، وإمكانية انعكاس (ح) قبل وخلال 10 ميكرومتر hyperforin، وتقاس في الخلايا كلوة مع الحامض الحر للBCECF في ماصة التصحيح. (د) يصور التغييرات في عقد المحتملة (V ح)، وتوفير القوة الدافعة للالتيارات. مراكز التحقيق، المستخرج في النقاط الزمنية المشار إليها (انظر النصال في ز) قبل وخلال 10 ميكرومتر hyperforin، يتم عرضها في (ط) و (ي) على التوالي. تمثل البيانات سائل ± SEM من العدد المشار إليه من التجارب (الخلايا).
جميع المشبك التصحيح خلية كاملة والتجارب التصوير الحموضة حتى الآن تشير بوضوح إلى أن hyperforin يتوسط لتصرف بروتون في الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا كلوة. لإثبات ما إذا كانت هذه تصرف المقرر أن قنوات بروتون في الأغشية الخلوية من هذه الخلايا، تفعيلها من خلال hyperforin، أو إذا hyperforin نفسه يكشف عن النشاط protonophore، أجرينا تجارب التصحيح المشبك على طبقات ثنائية الدهون
35، تخلو من أي البروتينات القناة الايونية. وقد انخفض غيض من ماصة التصحيح في فيلم الدهون على رأس من الحل الحمام، وبعد إنشاء طبقة ثنائية الدهون مغلقة بإحكام ركضنا نفس البروتوكول الجهد بالنسبة للخلية كاملة التجارب المشبك التصحيح، وتطبيق 10 ميكرومتر hyperforin، 100 ميكرومتر CCCP أو 1٪ DMSO إلى طبقة ثنائية المادة الدهنية في غيض من ماصة التصحيح
(الشكل 5A). A gigaohm المقاومة وصغيرة الأساسي الحالي (IV انظر
الشكل 5B) النقاب عن تشكيل الناجح لدهن طبقة ثنائية ضيقة. بناء على طلب من 10 ميكرومتر hyperforin ظهر تيار كبير، والتي تبين أن hyperforin نفسها قادرة على التوسط لتصرف أيون. كان الرابع من التيار بوساطة hyperforin مماثلة كما في الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا كلوة
(الشكل 5C). التحول صغير من احتمال انعكاس نحو القيم أكثر سلبية (تتبع الأسود
الشكل 5C) على الأرجح تنتج عن تراكم البروتونات، وبالتالي انخفاض الرقم الهيدروجيني، في حجم صغير جدا داخل غيض من ماصة التصحيح، مدفوعا السلبية المحتملة داخل ماصة في بداية الطريق المنحدر. هذا هو الوضع مماثل لتحمض الخلايا في تجارب خلية كاملة خلال تطبيق hyperforin، مدفوعا المحتمل عقد السلبية، وهو ما يفضي إلى التحول من إمكانية عكس التيار بوساطة hyperforin نحو القيم أكثر سلبية (انظر
الشكل 4H ، ي).أدى CCCP protonophore (100 ميكرومتر) في تيار أصغر بكثير من hyperforin، ولم 1٪ DMSO لا تغيير في التيار الأساسي على الإطلاق
(الشكل 5A، ج). باختصار، hyperforin نفسه يكشف عن النشاط protonophore قوي في طبقات ثنائية الدهون مستقلة عن أي بروتين القناة.
الرقم 5: Hyperforin يدفع التيارات في طبقات ثنائية الدهون. 
(أ) إلى الداخل والخارج في التيارات -80 و+80 بالسيارات، على التوالي، من طبقات ثنائية الدهون مشددة على طرف ماصة التصحيح. كما يتضح من الحانات إما 10 ميكرومتر hyperforin، و 100 ميكرومتر CCCP أو 1٪ DMSO تم تطبيقها. (ب) يصور العلاقة بين الجهد الحالي (IV) للتيار الأساسي تقاس من الدهون طبقة ثنائية ضيقة. في (ج) مراكز التحقيق المقابلة من التجارب في (أ) يتم عرضها بعد الطرح للتيار الأساسي (انظر ب). لاحظ أن 10 ميكرومتر hyperforin يسببها تصرف كبير في طبقة ثنائية المادة الدهنية. وCCCP protonophore (100 ميكرومتر) غلة لم لDMSO كبير ولكن أصغر بكثير من الحالية، و 1٪ لا يؤدي إلى أي تيار على الإطلاق (الأزرق IV أثر على رأس محور س في ج). تمثل البيانات سائل ± SEM من العدد المشار إليه من التجارب طبقة ثنائية الدهون.
لتقييم عمل hyperforin على تخزين العصبي والافراج نحن على استعداد الخلايا الأولية الماوس أليفة الكروم، والتي يتم تخزينها الكاتيكولامينات في الحويصلات الأساسية كثيفة كبيرة (LDCVs) حيازة الناقل حويصلي مونوامين 1 (VMAT1) 19. وهي خلايا الغدد الصم العصبية منفعل، لديهم نفس الخلايا قمة العصبية السلائف باسم الخلايا العصبية متعاطفة تالية للعقد، والجوانب المختلفة العصبي التمثيل الغذائي وتخزين والإفراج تم دراستها على نطاق واسع مع هذه الخلايا.
كما هو متوقع، وتطبيق 10 ميكرومتر hyperforin يسببها نفس خلية كاملة الحالي مع نفس IV في الخلايا أليفة الكروم
(الشكل 6A، ب) كما رأينا في الخلايا كلوة، والخلايا الدبقية وطبقات ثنائية الدهون. لتصور الآثار المترتبة على تخزين مونوامين الحويصلي والإفراج عنهم، نحن المحتضنة الخلايا أليفة الكروم من النوع البري والفئران TRPC6 ناقصة مع الفلورسنت "كاذبة" ناقل عصبي FFN511 36. مثل الأمينات الأحادية الذاتية، ويتم FFN511 من نقل مونوامين غشاء البلازما (MAT) في العصارة الخلوية ويتراكم في نمط ثابت مع LDCVs
(الشكل 6C). كما هو مبين في
6D الرقم، ه، و، ز انخفض الخلوية التي تعتمد على FFN511 مضان تدريجيا في ظل ظروف التحكم (0.1٪ DMSO) مما يدل على المعدل الأساسي من FFN511 destaining، التي كانت تشبه في الخلايا من النوع البري والفئران TRPC6 ناقصة، والتي تعتمد على ما يبدو على تبييض ضوء تنشيط وإطلاق عفوية من FFN511. ومع ذلك، بناء على طلب من hyperforin 10 ميكرومتر أو الاستقطاب غشاء (70 ملي بوكل) وdestaining من مضان FFN511 التي تعتمد على وتسارع بشكل ملحوظ. وتم الحصول على نتائج مماثلة في وجود CCCP protonophore (10 ميكرومتر؛ انظر
الشكل 6E). Hyperforin التي يسببها destaining، أي الإفراج عن FFN511، كان مماثل في خلايا معزولة من النوع البري أو الفئران TRPC6 ناقصة
(الشكل 6D، ه، و). الزيادة الأولية في مضان تعتمد على FFN511 خلال hyperforin وتطبيق CCCP قد يكون راجعا إلى تأثير dequenching بعد الحد من تراكم هائل من FFN511 في الحويصلات مثبطات أو بسبب التغييرات الحموضة بوساطة hyperforin. ومع ذلك، وأخيرا hyperforin أدى إلى انخفاض في مضان تعتمد على FFN511. كما تحكم استخدمنا خلايا كلوة، والتي لا تحتوي على النقل لالناقلات العصبية، وبالتالي لا تتراكم FFN511
(الشكل 6H).
الشكل 6: Hyperforin يدفع التيارات غشاء ويستنزف ويقلل التحميل من الحويصلات التي تحتوي على مثبطات الخلايا أليفة الكروم في. 
(أ) إلى الداخل والخارج في التيارات -80 و+80 بالسيارات، على التوالي، من الخلايا أليفة الكروم الماوس الأساسي. يشير شريط تطبيق 10 ميكرومتر hyperforin. وتم تطبيع التيارات لحجم الخلية وتم طرح التيارات الأساسية قبل التطبيق. (ب) يبين IV المقابلة. (ج) صورة متحد البؤر مضان FFN511 التي تعتمد في زنزانة أليفة الكروم. (د، ه) التغيرات النسبية في مضان تعتمد على FFN511 (F400، تطبيع إلى القيمة في بداية التطبيق) في الخلايا أليفة الكروم من النوع البري (د) والفئران TRPC6 ناقصة (ه). في الوقت المشار إليه (السهم) 0.1٪ DMSO و 10 ميكرومتر hyperforin أو طبقت 70 ملي بوكل في (د)، و 0.1٪ DMSO و 10 ميكرومتر hyperforin أو 10 ميكرومتر CCCP في (ه). (و) يصور التحليل الإحصائي للمضان المتبقية (F400 في d و e) في 1400 ق. العلامات النجمية (* P <0.05 **؛ P <0.01) دلالة على الفرق كبير لرقابة المطابقة في 0.1٪ DMSO. (ز) الصور التمثيلية للمضان FFN511 التي تعتمد في بداية 1450 والصورة بعد تطبيق 0.1٪ DMSO (مجموعة العلوي) أو hyperforin 10 ميكرومتر (أقل مجموعة) في الخلايا أليفة الكروم. وتظهر اللوحة اليمنى ونقل صورة من الخلايا أليفة الكروم منها. خلايا كلوة لا تكشف عن وجود مضان كبير بعد FFN511 التحميل (ح). (ط) مضان FFN511 التي تعتمد على (F400) في الخلايا أليفة الكروم بعد 15 دقيقة FFN511 حضانة في غياب (0.1٪ السيطرة DMSO تطبيع إلى 100٪) وجود 10 ميكرومتر hyperforin. تمثل البيانات سائل ± SEM من العدد المشار إليه من التجارب (الخلايا) في (أ) و (ب)، وعدد مبين (ن) من التجارب بما في ذلك الخلايا العاشر (ن / خ) في (د، ه، و) و (أنا).
بالإضافة إلى تسارع FFN511 destaining، تم تخفيض تحميل FFN511 إلى الحويصلات مثبطات الخلايا أليفة الكروم بشكل كبير في وجود 10 ميكرومتر hyperforin
(الشكل 6I). يتم ترتيب الخلوية (متشابك) مثبطات امتصاص غشاء البلازما symporter مونوامين الصوديوم؛ (MAT
الشكل 7C (1).، مدفوعا نا) + التدرج وإمكانية غشاء السلبية (E M). التيار لا تعتمد على الصوديوم خارج الخلية التي يسببها hyperforin (انظر
الشكل 2K، ل)، ومع ذلك، تجارب التصوير على الخلايا كلوة، محملة نا + -sensitive صبغة الفلورسنت SBFI، كشفت عن وجود زيادة كبيرة في نسبة SBFI، أي زيادة في الصوديوم داخل الخلايا، بناء على طلب hyperforin
(الشكل 7A). باستخدام NMDG + بدلا من نا + في حل خارجي ثبت أن الزيادة في نسبة SBFI لم يكن بسبب hyperforin بوساطة الآثار التي تعتمد على درجة الحموضة في SBFI. ومع ذلك، فإن الانخفاض الناجم عن hyperforin نسبة BCECF مضان (انظر
الشكل 4A)، أي تحمض داخل الخلايا، وتسارع في الخلايا كلوة في غياب خارج الخلية نا + (الشكل 7B.)، مما يشير إلى آلية الحموضة التنظيم تعتمد على الصوديوم عن طريق على سبيل المثال غشاء البلازما الصوديوم بروتون مبادل (NHE)، الذي ينقل البروتونات خارج الخلية، والصرف، نا أيونات طول التدرج تركزها في الخلية. العمل protonophore من hyperforin يتحرك H + في الخلية (المشبك)
(الشكل 7C (3)) والخروج من الحويصلات
(الشكل 7C (4)) نظرا لE سلبي M وحويصلي H + التدرج، على التوالي، مما أدى إلى تحمض داخل الخلايا. وهكذا، جنبا إلى جنب مع تحمض داخل الخلايا، hyperforin يؤدي إلى زيادة في الخلايا نا + تركيز، وربما يرجع ذلك إلى تحفيز NHE
(الشكل 7C (5))، وبالتالي يقلل من قوة دافعة لتعتمد على MAT الخلوي مثبطات امتصاص
(الشكل 7C (1)). يتم ترتيب الحويصلي امتصاص مثبطات قبل حويصلي مثبطات البروتون antiporter (VMAT؛
الشكل 7C (2))، مدفوعا H ضخم + التدرج وإمكانية غشاء حويصلي، سواء التي وضعتها مضخة البروتون الحويصلية (H + إطعام الفئران). تبديد التي يسببها hyperforin من حويصلي H + التدرج (انظر أعلاه) أطلال القوة الدافعة لتعتمد على VMAT حويصلي مثبطات امتصاص.
الرقم 7: نموذج العمل hyperforin على امتصاص مثبطات. 
(أ، ب) التغيرات النسبية نسبة SBFI مضان (F 340 / F 380)، وهو ما يمثل الخلايا نا + تغييرات (أ)، ونسبة BCECF مضان (F 490 / F 450)، وهو ما يمثل تغيرات درجة الحموضة داخل الخلايا (ب)، في الخلايا كلوة خلال تطبيق (انظر السهم) من 30 ميكرومتر (أ) و 10 ميكرومتر (ب) hyperforin في حضور وغياب نا + (حل محله NMDG +). في الفقرة (أ) DMSO 0.3٪ تم تطبيقه على السيطرة. في (ب) يتم عرض تجارب السيطرة دون تطبيق hyperforin بألوان باهتة. تمثل البيانات سائل ± SEM من العدد المشار إليها (ن) من التجارب بما في ذلك الخلايا العاشر (ن / خ). الخلوي (متشابك) امتصاص أحاديات الأمين (MA: (ج) آلية امتصاص مثبطات (الجانب الأيسر من طراز) + يتم ترتيب) من خلال غشاء البلازما symporter مونوامين الصوديوم (MAT؛ (1)). غشاء السلبية المحتملة والمنخفضة داخل الخلايا نا + تركيز توفير القوة الدافعة للخلوي نا + وMA + امتصاص. يتم ترتيب الحويصلي امتصاص مثبطات قبل حويصلي مثبطات البروتون antiporter (VMAT؛ (2))، والانتقال MA + في الحويصلة في مقابل اثنين من البروتونات. وH ضخم + التدرج وإمكانية غشاء حويصلي، سواء التي وضعتها مضخة البروتون الحويصلية (H + إطعام الفئران) يدفع H + من الحويصلة وبالتالي يعزز حويصلي MA + امتصاص. آثار hyperforin على امتصاص مثبطات (الجانب الأيمن من نموذج): العمل protonophore من hyperforin يتحرك H + في الخلية (المشبك) نظرا لإمكانات غشاء السلبية (3). بالإضافة إلى ذلك، hyperforin يتحرك H + من الحويصلات، مدفوعا H ضخم + التدرج والغشاء الحويصلي إيجابي محتمل (4). تبديد للحويصلي H + التدرج أطلال القوة الدافعة لحويصلي تعتمد على VMAT MA + امتصاص (2). وتحمض عصاري خلوي، بوساطة H تعتمد على hyperforin + تدفق وH + بيان من الحويصلات، ويزيد من نشاط المبادلات غشاء البلازما الصوديوم والبروتون (NHE؛ (5))، التي يقودها نا + التدرج والسلبية غشاء المحتملة، ويتحرك احد H + الخروج من الخلية في تبادل واحد نا + في الخلية. وهذا يؤدي إلى زيادة في عصاري خلوي نا + تركيز، والحد من القوة الدافعة للMA الخلوية التي تعتمد على MAT + امتصاص (1).
تؤخذ معا هذه البيانات تظهر تعززت أن الإفراج عن FFN511 وتم تخفيض تراكم FFN511 في وجود hyperforin، والتي، بسبب النشاط protonophore لها وانهيارات درجة الحموضة حويصلي ويزيد من بين الخلايا نا + معزز تفعيل المبادلات الصوديوم والبروتون.
وتظهر هذه الدراسة أن hyperforin، فإن العنصر النشط كبير من نبتة سانت جون استخراج، يؤدي الى تصرف أيون بارزا في الماوس الأساسي الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا أليفة الكروم القشرية، HEK-293 الخلايا وطبقات ثنائية الدهون. هذا تصرف أيون مستقل عن وجود قنوات TRPC6، بوساطة لا من نا +، K +، كا 2+، والمغنيسيوم 2+ ولا من الكلورين -، ولكن يعتمد إلى حد كبير على درجة الحموضة خارج الخلية والخلايا. أداء كامل الخلية المشبك التصحيح وتجارب التصوير الحموضة نحن يمكن أن تظهر أن التيار الناجم عن hyperforin يتم عن طريق البروتونات. وجود نفس بوساطة hyperforin تصرف في طبقات ثنائية الدهون كما هو الحال في أنواع الخلايا الثلاثة يشير إلى أن hyperforin لا يحتاج الى بروتين قناة لبروتون النشاط إجراء، ولكن بدلا نفسها بمثابة protonophore. غير تشبع-الزيادة الحالية والسعة (انظر
الشكل 2C) إلى تراكم hyperforin محبة للدهون في الغشاء البلازمي، والتي قد تفسر آثار الجرعات المنخفضة حتى من hyperforin خلال نبتة سانت جون استخراج العلاج 37.
وعلى سبيل المثال مركبات مع النشاط protonophore في الميتوكوندريا الامم المتحدة صلات-الكربونيل السيانيد ف trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)، الكربونيل السيانيد م-chlorophenylhydrazone (CCCP) أو 2،4-داي نيتروفينول (إدارة التخطيط الوطني). انهم جميعا يشتركون في هيكل العطرية مع مجموعة حمض غير إجتماعي ضعف شخصية الحمضية (الباكاف الحمضية: FCCP 6.2، 5.59 CCCP، DNP 4.1)، قوية الإلكترون سحب شاردة والمجموعات الكارهة للماء ضخمة 38. وعلى النقيض من protonophores العام للbiycyclic polyprenylated acylphloroglucinol hyperforin، ليست نموذجية العطرية، ولكن مركب مثل الفينول 8. وتشترك في نفس مسعور وضعف الطابع الحمضية (الباكاف الحمضية 4.8
7) كما protonophores معروفة، وphloroglucinols البعض مثل moronone (مكرر geranylacylphloroglucinol)
39، 2،4-diacetylphloroglucinol (DAPG)
40، ومضادة للسرطان وكيل nemorosone 41، وقد ثبت أن تكشف protonophore والنشاط فك ربط الميتوكوندريا.
العديد من النماذج تصف H + النبات عن طريق protonophores عبر طبقات ثنائية الدهون. إن أبسط قواعد نموذج على ضعف جزيء الحمضية، الذي يتم امتصاصه في شكله انيوني في واجهة الحل / غشاء على الجانب الإيجابي من الغشاء وهناك بربط H +. يرجع ذلك إلى التفاعل مع H + جزيء يصبح محايدا وينتشر نحو الجانب السلبي للغشاء. هنا H + يترك حمض ضعيف مرة أخرى، والتي بعد ذلك، في شكله انيوني، يتحرك جيئة electrophoretically إلى الجانب الايجابي من الغشاء ودورة إعادة تشغيل 38. يتم توفير القوة الدافعة اللازمة من قبل غشاء المحتملة وتركيز البروتونات على جانبي الغشاء. منذ hyperforin يكشف عن ضعف شخصية الحمضية
7 ويبدو أن تتراكم في الغشاء الخلوي (انظر
الشكل 2C)، قد ينطبق هذا النموذج أيضا لوضع protonophore عمل hyperforin.
يتم تنشيط فك ربط بروتين 1 (UCP1) الذي ينقل البروتونات عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا الدهون البنية التي كتبها الأحماض الدهنية طويلة السلسلة (كفاس) 42. انها تتوسط أيضا تيارات بروتون بعد إعادة في طبقات ثنائية الدهون مستو على التنشيط كفاس 43. في الآونة الأخيرة، Fedorenko
وآخرون 44 اقترح آلية حيث ربط كفاس إلى UCP1، البروتونات الصيد على جانب واحد من الغشاء وإرشادهم الحوض الصغير UCP1 إلى الجانب الآخر من الغشاء. ثم يتم الإفراج عن البروتونات وكفاس البقاء ملزمة في UCP1. آلية بوساطة hyperforin بروتون تصرف قد يكون أكثر ارتباطا لآلية النقل من الأحماض الضعيفة الأخرى (انظر أعلاه) بدلا من UCP1. ومع ذلك، فإن العلاقة بين الجهد الحالي للLCFA تنشيط بوساطة UCP1 بروتون الحالي في mitoplasts، معزولة عن الماوس الدهنية البني الأنسجة
44، ويبدو بالضبط نفس الرابع من التيارات التي يسببها hyperforin في هذه الدراسة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إمكانات عكس التيارات تحول بطريقة مشابهة جدا على التغييرات الرقم الهيدروجيني.
شاترجي
وآخرون 29 تردد عن تعتمد على الجرعة الداخل الحالي في عزلة الخلايا العصبية قرن آمون الفئران تنشيط hyperforin. تناسب السيني كشف عن وجود EC 50 من 9.1 ميكرومتر، قريبة جدا من EC 50 لتيارات الداخل الناجم عن hyperforin والخارج (9.3 ميكرومتر و 8.7 ميكرومتر، على التوالي)، وتحمض داخل الخلايا (8.5 ميكرومتر) تقاس في هذه الدراسة. ومع ذلك، زعموا أن بعض البيانات الأولية على الجهد والاعتماد الأيونية من الداخل التيار تنشيط hyperforin، الذي لا يظهر في ورقتهم، اقترح دورا بارزا من الأنيونات.
تظهر البيانات المتوفرة لدينا بشكل واضح أن hyperforin نفسها بمثابة protonophore قوية التوسط التيارات بروتون كبيرة. يمكن أن تحدث هذه التيارات في غشاء البلازما، مما أدى إلى H + تدفق نظرا لإمكانات غشاء السلبية، وعلى عضيات داخل الخلايا. معظم العضيات الحفاظ على بيئة intraorganellar الحمضية وprotonophore النشاط يؤدي إلى هروب رأس المال من البروتونات في العصارة الخلوية. وهكذا، وفي كلتا الحالتين، يصبح الرقم الهيدروجيني عصاري خلوي أكثر حمضية. هذا تحمض داخل الخلايا و / أو تبديد للبروتون التدرج الميتوكوندريا مع احق الكالسيوم 2+ والزنك 2+ إطلاق سراح
12 قد تساهم بشكل مباشر في مختلف الآثار من hyperforin، بما في ذلك مضادة للالتهاب، proapoptotic، أنتيبروليفرتيف وعمل المضادات الحيوية 1.
وقد تبين أن نبتة سانت جون للتخفيف من أعراض الكآبة المعتدلة 6،
45، ومؤخرا التحليل التلوي يظهر أن مستخلصات نبتة سانت جون هي أيضا مضادات الاكتئاب فعالة لعلاج الاكتئاب الرئيسي 46. العنصر النشط معظم كبار ربما من نبتة سانت جون، hyperforin هو المانع من امكانات 5-HT، الدوبامين، بافراز، أستيل كولين، GABA والغلوتامات امتصاص في الأعمال التحضيرية synaptosomal 13، 14، 15، 17،
18، وجزء من اكتئاب لها وقد عزا الإجراءات للتغيرات في الخلايا H + والصوديوم + تركيزات والتخزين الناقلات العصبيه في الحويصلات المشبكية 17، 22، 23، 24، 25، 26. امتصاص الناقل العصبي الخليوي عن النقل قبل المشبكي يعتمد على نا + من cotransport
47، والظروف التي تقلل من نا + التدرج للغشاء الخلايا العصبية، إما عن طريق خفض أو رفع خارج الخلية داخل الخلايا نا +، الحد بشكل كبير من كفاءة هذه الناقلين. المغني وآخرون.
23 اقترح بالفعل أن hyperforin يمنع امتصاص السيروتونين التي كتبها الارتقاء داخل الخلايا نا + تركيز الصفائح الدموية في الإنسان، ولكن الآلية كيف hyperforin يزيد من عصاري خلوي نا + لم يكن معروفا في ذلك الوقت. في عام 2007، Leuner وآخرون.
26 اقترح hyperforin يتوسط نا + الزيادة، وبالتالي الآثار العصبي إعادة امتصاص، من خلال تفعيل وتحديدا قناة الموجبة غير انتقائية TRPC6. ومع ذلك، من خلال تحمض عصاري خلوي، كما هو مبين في
الشكل 4، الوقود hyperforin مبادل غشاء البلازما الصوديوم والبروتون (NHE)، مما يزيد من داخل الخلايا الحرة نا + تركيز، كما هو مبين في
7A الرقم الذي يحول دون امتصاص الناقل العصبي، وهذا يتوقف على نا + من cotransport . في نفس الوقت hyperforin تبدد H + التدرج في الناقل العصبي الحويصلات 16،
22 حسب النشاط protonophore وبالتالي يضعف الحويصلي امتصاص وتخزين وإطلاق النواقل العصبية (انظر
الشكل 6). وتشير البيانات نشاطنا protonophore أن hyperforin غير الكامنة وراء العمليتين (انظر
الشكل 7C) وشرح لماذا hyperforin على النقيض من ريزيربين أو مثبطات المضادة للاكتئاب مثبطات إعادة امتصاص الكلاسيكية هي فريدة من نوعها من حيث أنها تمارس تأثيرها ليس فقط على الأمينات الأحادية ولكن أيضا على الآخر الناقلات العصبية بما في ذلك أستيل كولين، GABA والغلوتامات.
إعداد الخلايا الدبقية الصغيرة والثقافة
تم الحصول على خلايا دبقية صغيرة من قشرة الدماغ لدى الفئران حديثي الولادة (ثلاثة أيام بعد الولادة 0-3) كما هو موضح سابقا 48. باختصار، تم قطع رأس الجراء وأزيلت أدمغتهم وجمعت تحت ظروف معقمة في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM، إينفيتروجن) تستكمل مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (سيغما) و 1٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين (GlutaMAX، إينفيتروجن ). تم تشريح القشور، السحايا إزالتها، وtriturated بعد الهضم الأنزيمي مع 0.25٪ التربسين / EGTA والغسيل في المتوسط. ثم أجبر جناسة من خلال 40 ميكرون تصفية ومطلي تعليق الناتج في 75 سم 2 قوارير الثقافة المغلفة بولي-L-ليسين التي تحتوي على المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). بقيت الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، وغيرت المتوسطة 3 أيام بعد إعداد ومرة واحدة في الأسبوع بعد ذلك. بعد حوالي 2-3 أسابيع في الثقافة وأظهرت قوارير طبقة متموجة من الخلايا النجمية مع الخلايا الدبقية تنمو على القمة. تم حصاد الخلايا الدبقية ومعزولة عن طريق هز قوارير للافراج عن الخلايا الدبقية الصغيرة فضفاضة يعلق في طاف. تم غسلها الخلايا الدبقية الصغيرة من طاف، مطلي على coverslips الزجاج المطلي بولي-L-ليسين (1 سم في القطر) ويوضع في المتوسط مع 10٪ FBS. للسماح للخلايا على التكيف مع الظروف ثقافة فرعية استخدمت خلايا مطلي لتجارب المشبك التصحيح بعد 3-7 أيام الحصاد.
FACS وRT-PCR الخلايا الدبقية
وكان حصاد الخلايا الدبقية من الثقافات المختلطة (انظر أعلاه)، ملطخة بشكل انتقائي من قبل وحيدة النسيلة الماوس المضادة CD11b الضد مترافق FITC (ميلتيني بيوتيك شركة، صحراء، CA، الولايات المتحدة الأمريكية) وفرزها الى 50 خلايا في أنبوب من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز ( FACS؛ MoFlo تدفق عداد الكريات، Cytomation، بوردو، CO، الولايات المتحدة الأمريكية). لكل RT-PCR استخدمت عددا من الخلايا الدبقية 50 فرزها. تم إجراء RT-PCR باستخدام مرتفع ™ خطوة واحدة RT-PCR مع Platinum® طق (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). واستخدمت أزواج التمهيدي التالية: 5'-TCC AGG AAA TTG AGG ATG ATG CG-3 "و5'-TTG غا دول مجلس التعاون الخليجي TTG CTT TTG ACC C-3" لTrpc6، و5'-GTC AAC GGG GGA CAT AAA AGT TAT TGG-3 "و5'-GCT TGC AAC AAC CAT CTT TTT GGG-3" لHPRT (hypoxanthin-guanin-فسفوريبوزيل). مجموع RNA من مخ الفأر خدم السيطرة الإيجابية.
إعداد خلية أليف للكروم والثقافة
تم الحصول على الخلايا أليفة الكروم من الغدد الكظرية من الفئران حديثي الولادة (ثلاثة أيام بعد الولادة 0-1). كانت مقطوعة الرأس الجراء وتم تشريح الغدد الكظرية التي تم جمعها في لوك متوسط (في ملي: 154 كلوريد الصوديوم، 5.6 بوكل، 3.6 NaHCO 3، 5.6 الجلوكوز، 5 HEPES، ودرجة الحموضة 7.3)، وتمت إزالة النسيج الضام. بعد 45 دقيقة من عملية الهضم الأنزيمي مع 10 وحدة / مل غراء في DMEM تحتوي على 0.02٪ L-السيستين، 1 ملم CaCl 2 و 0.5 ملي EDTA أوقف رد فعل الأنزيمي DMEM تستكمل مع 10٪ FBS، 0.25٪ الزلال و 0.25٪ trypsin- المانع (نوع II-O، بيض الدجاج). ثم كانت تغسل الغدد في "المخصب" DMEM (4.5 غرام / لتر الجلوكوز، 0.1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا، 1٪ الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم-X) وtriturated بلطف مع ماصة 200 ميكرولتر حتى الحصول على تعليق خلية. الخلايا ثم تم مطلي على زلات غطاء زجاجي (1 سم في القطر) ويتم الحفاظ عليها "المخصب" DMEM في الحاضنة في 10٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. وقد أجريت تجارب في غضون 1-5 أيام بعد الإعداد.
الفئران
TRPC6 - / - وTRPC6 - / - / TRPC3 - / - وقد وصفت الفئران في أماكن أخرى 49، 50. تم إنشاء TRPC6- واحدة والفئران TRPC3 نقص وقدم تفضلت مختبر لوتز Birnbaumer (علوم الصحة البيئية / NIHR والبحوث المثلث بارك، NC 27709، الولايات المتحدة الأمريكية). نفذت كل رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة. وتمت الموافقة على المبادئ التوجيهية وجميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة سارلاند مدرسة الطب.
زراعة الخلايا كلوة
HEK-293 خلايا (آي تي سي سي، CRL 1573) تم الحصول عليها من نوع الثقافة مجموعة أمريكا (آي تي سي سي، ماناساس، VA، الولايات المتحدة الأمريكية) والخلايا كلوة معربا عن ستابلي TRPC6 كدنا] (تفضلت التي تقدمها الدكتور MX تشو، جامعة تكساس مركز العلوم الصحية، وكانت هيوستن) مثقف في MEM وDMEM، على التوالي، مع 10٪ FBS. بقيت الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، وغيرت المتوسط كل يوم الثالث على التوالي. كانت مطلية الخلايا على coverslips الزجاج من 1 سم وقطرها المغلفة مع بولي-L-يسين.
التسجيلات الكهربية
وسجلت التيارات بكي في ختم ضيق التصحيح خلية كاملة التكوين المشبك باستخدام EPC-9 مكبر للصوت (HEKA الالكترونيات، LAMBRECHT، ألمانيا). تم سحب ماصات التصحيح من الزجاج الشعيرات الدموية GB150T-8P (المنتجات العلوم، هوفهايم، ألمانيا) في بولير العمودي (PC-10، Narishige، طوكيو، اليابان)، وكان المقاومات بين 2 و 4 MΩ عندما تمتلئ حل داخلي القياسي (في ملي : 120 CS-الصوديوم، كلوريد الصوديوم 8، 1 MgCl 2، 10 HEPES، 10 CS-BAPTA، 3.1 CaCl 2 (100 نانومتر مجانا كا 2+، وتحسب مع
WebMaxC (http://www.stanford.edu/~cpatton/webmaxcS . HTM))، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.2 مع CsOH). الحل الخارجي القياسية يرد (مم): 140 كلوريد الصوديوم، و 2.8 بوكل، 2 MgCl 2، 1 CaCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم. بالنسبة لبعض التجارب تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 5.4 أو 6.5 و 7.9 أو 8.9 بإضافة حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم، على التوالي. في الأحادي التكافؤ حل خالية من الأيونات الموجبة نا + وK + حلت محلها NMDG + (N-ميثيل-د-glucamine)، وثنائي التكافؤ اسميا حل خالية من الأيونات الموجبة CaCl 2 و MgCl 2 حذفت. خالية من كلوريد حل خارجي يتكون من (مم): 140 نا اسبارتاتي، 1 كا-غلوكونات، 2 MgSO 4، 10 HEPES و 10 الجلوكوز، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم. أضيفت Hyperforin، الكربونيل السيانيد م-chlorophenylhydrazone (CCCP)، 1-oleoyl-2-أسيتيل-SN-الجلسرين (OAG) أو حامض الفلوفيناميك (FFA) إلى حل خارجي معيار من 100 ملم أو 50 ملم حل الأسهم في DMSO ل تصل تركيزات النهائي كما هو مبين. أجريت OAG وFFA التجارب على الخلايا كلوة، معربا عن TRPC6 في 200 ميكرومتر الخارجي CaCl 2. طبقت جميع الحلول المعدلة مباشرة على خلية التصحيح فرضت عبر تطبيق ماصة ضغط يحركها. في بعض التجارب تم استخدام ماصة تطبيق الثانية. الأسمولية من جميع الحلول تراوحت بين 290 و 310 الميلي أسمول. طبقت سلالم الجهد من 50 مللي مدة تمتد على مدى الجهد من -100 إلى 100 فولت عند 0.5 هرتز من عقد المحتملة (V ح) من 0 بالسيارات على مدى فترة تصل إلى 500 الصورة باستخدام برنامج PatchMaster (HEKA). وقد تم تصحيح جميع الفولتية ل10 بالسيارات إمكانية تقاطع السائلة. تم تصفية التيارات 2.9 كيلو هرتز ورقمنة على 100 ميكرو ثانية فترات. تم تحديد التيارات بالسعة والمقاومة سلسلة وتصحيح قبل كل منحدر الجهد باستخدام التعويض السعة التلقائي للEPC-9. تم طرح التيارات الأساسية قبل تطبيق للحصول على صافي الحالية النامية. تم استخراج الداخل والخارج التيارات من كل منحدر التسجيل الحالي الفردية عن طريق قياس سعة الحالية في -80 و+80 بالسيارات، على التوالي، ورسم مقابل الوقت. تم استخراج الجهد الحالي (IV) العلاقات في نقطة زمنية المشار إليها. تم تطبيع التيارات إلى الحجم الأولي للخلية للحصول على الكثافة الحالية (PA / الجبهة الوطنية). لبعض التغييرات التجارب من حجم الخلية (تطبيع السعة التي تقاس والمستخرجة من التعويض السعة التلقائي للEPC9) وتم التخطيط لإمكانية عكس التيارات مقابل الوقت.
أجريت داخل الخلايا الحية تجارب التصوير الحموضة خلية باستخدام فازة الثاني ومضخم (MEA1530SF-V2DN، SMT، سيفيلد، ألمانيا) نظام التصوير المستندة من TILL الضوئيات (Martinsried، ألمانيا) في زايس Axiovert 135 M المجهر مضان مجهزة زايس 40 × / 0.65 الهدف Achroplan. وقد أنجز السيطرة على اكتساب الملون II والبيانات عبر البرنامج EPC-9 وPatchMaster. قبل الخلايا التجارب وحضنت في وسائل الإعلام تستكمل مع 2 ميكرومتر حساسة للدرجة الحموضة صبغة الفلورسنت BCECF-AM لمدة 30 دقيقة في الظلام في 37 ° C، وغسلها بمحلول الخارجي القياسية لإزالة الزائدة BCECF-AM. الخلايا محملة BCECF، وتزايد في 1 سم coverslips الزجاج، تم نقلهم إلى غرفة الحمام التي تحتوي على الحل الخارجي القياسية، وتمت مراقبة BCECF مضان من خلية واحدة مع مضخم في> 510 نانومتر بعد الإثارة في 490 و 450 نانومتر لمدة 15 مللي ثانية كل بمعدل 0.5 هرتز لمدة تصل إلى 600 ق. وأضاف Hyperforin إلى حل خارجي معيار من 100 ملم الأوراق المالية (DMSO) للوصول إلى تركيزات النهائي كما هو مبين وتطبيقها مباشرة على الخلايا وحيدة عن طريق ماصة تطبيق ضغط يحركها (انظر
الشكل 4A-ج). بالنسبة لبعض التجارب 20 ملي NH 4 تم إضافة الكلور إلى حل خارجي القياسية والضغوط التي مورست على خلية محسوبة. نسبة لتصحيح الخلفية BCECF مضان في 490 و 450 نانومتر (F 490 / F 450 وتآمر) مقابل الوقت. بالنسبة لبعض التجارب تم الكشف عن مضان BCECF التي تعتمد من قبل الكاميرا (SensiCam) نظام التصوير المستندة (Polychrom V، TILL الضوئيات) في زايس Axiovert 100 M المجهر مضان عبر هدف زايس Fluar 20 × / 0.75، وأضيف hyperforin في حمام كما هو مبين (انظر
الشكل 7B). أجريت الحصول على البيانات وتحليلها من قبل TILLvisION البرمجيات (TILL الضوئيات).
من أجل تحديد التغييرات التي يسببها hyperforin من درجة الحموضة داخل الخلايا تحت إمكانات غشاء محددة، تم استخدام هذه التقنية الضوئية (انظر التصوير الحموضة) في تركيبة مع خلية كاملة التصحيح تقنية المشبك (انظر التسجيلات الكهربية). ماصة التصحيح الواردة حل داخلي قياسي تستكمل مع 100 ميكرومتر من BCECF (حمض الحرة). كان متحمس BCECF في 490 و 450 نانومتر لمدة 25 مللي ثانية لكل بمعدل 0.5 هرتز لمدة تصل إلى 800 ق. تم تطبيق Hyperforin إلى الخلية عن طريق الضغط مدفوعة تطبيق ماصة كما هو موضح في التصوير ودرجة الحموضة والتجارب المشبك التصحيح. تم تغيير إمكانية عقد بين سلالم الجهد من 0 إلى -80 بالسيارات أو +80 بالسيارات كما هو مبين (انظر
الشكل 4D-ح). وقد تم تحليل التيارات الخلوية والتغيرات مضان كما هو موضح أعلاه.
الخلايا الخلية الحية نا + أجريت تجارب التصوير باستخدام نفس القائمة على نظام كاميرا التصوير (Polychrom V، TILL الضوئيات) كما لتصوير الرقم الهيدروجيني (انظر أعلاه). قبل الخلايا التجارب وحضنت في وسائل الإعلام تستكمل مع 2 ميكرومتر من نا + -sensitive صبغة الفلورسنت SBFI-AM عن 30-45 دقيقة في الظلام في 37 ° C، وغسلها بمحلول الخارجي القياسية لإزالة الزائدة SBFI-AM. الخلايا محملة SBFI، وتزايد في 1 سم coverslips الزجاج، تم نقلهم إلى غرفة الحمام التي تحتوي على الحل الخارجي، وتمت مراقبة SBFI مضان من الخلايا وحيدة في> 510 نانومتر بعد الإثارة في 340 و 380 نانومتر لمدة 100 مللي كل بمعدل 0.5 هرتز لمدة تصل إلى 800 ق. أضيفت Hyperforin وDMSO في الحمام كما هو مبين. نسبة لتصحيح الخلفية SBFI مضان في 340 و 380 نانومتر (F 340 / F 380 وتآمر) مقابل الوقت (انظر
الشكل 7A). أجريت الحصول على البيانات وتحليلها من قبل TILLvisION البرمجيات (TILL الضوئيات).
الماوس أليف الكروم وHEK-293 الخلايا، مطلي على coverslips الزجاج، وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على 10 ميكرومتر من الناقلات العصبية كاذبة الفلورسنت FFN511 (trifluoroacetate هيدرات الملح). بالنسبة لبعض التجارب و10 ميكرومتر hyperforin أو 0.1٪ DMSO (كما المراقبة) بالفعل حاضرا أثناء الحضانة مع FFN511. تم غسلها الخلايا مع معيار حل المسابقة خارجي (انظر التسجيلات الكهربية) وأبقى في الظلام لمدة 15 دقيقة أخرى. خلال التجربة كان كل 5 ثوان FFN511 متحمس في 400 نانومتر لمدة 10 مللي ومضان تعتمد على FFN511 (> 510 نانومتر) من الخلايا واحدة تم الكشف باستخدام نفس القائمة على نظام كاميرا التصوير (Polychrom V، TILL الضوئيات) كما لدرجة الحموضة والصوديوم + التصوير (انظر أعلاه). طبقت Hyperforin، CCCP، بوكل عالية أو DMSO في الحمام كما هو مبين. أجريت الحصول على البيانات وتحليلها من قبل TILLvisION البرمجيات (TILL الضوئيات).
المجهر متحد البؤر
تم تحميل الماوس الخلايا أليفة الكروم بنفس الطريقة لFFN511 تجارب التصوير (انظر أعلاه). بالإضافة إلى ذروة الإثارة لها في حوالي 400 نانومتر FFN511 يظهر أيضا إثارة كبيرة في 488 نانومتر. وهكذا، تم استخدام خط 488 نانومتر ليزر الأرجون لتصور مضان تعتمد على FFN511 (إعدادات التصفية GFP) مع المجهر متحد البؤر زايس LSM780 التي تسيطر عليها برنامج النظام ZEN 2012 (كلا من كارل زايس، Oberkochen، ألمانيا).
تجارب الدهون طبقة ثنائية
وقدمت طبقات ثنائية الدهون على طرف ماصات التصحيح من الطبقات الوحيدة فوسفورية على السطح من الحل حمام (انظر المرجع 35). وباختصار، حلت 10 ملغ الدهون (Ionovation، أوسنابروك، ألمانيا) في 100 ميكرولتر ن ديكان، وأضيف 1 ميكرولتر بلطف على سطح 1 مل من محلول حمام في الذي غمر ماصة التصحيح بالفعل. حمام وماصة حل تتكون من 150 ملي بوكل و 10 ملي HEPES، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع KOH. في غضون نحو 10 دقيقة تم تشكيل أحادي الطبقة الدهنية على رأس من الحل الحمام. تم نقل ماصة التصحيح بلطف من الحمام مع أحادي الطبقة الدهنية تشكيل في طرفها. بواسطة immerging ماصة التصحيح مرة أخرى في المغطاة أحادي الطبقة الدهون حمام حل طبقة ثنائية المادة الدهنية الضيقة (في بعض الأحيان) أشكال في غيض من ماصة التصحيح، وأشار مقاومة gigaohm. طبقت سلالم الجهد وتم قياس التيارات وتحليلها كما هو موضح في خلية كاملة التجارب المشبك التصحيح أعلاه. 10 ميكرومتر hyperforin، و 100 ميكرومتر CCCP أو 1٪ DMSO طبقت على طبقة ثنائية المادة الدهنية في غيض من ماصة التصحيح.
تحليل البيانات
تم إجراء تحليل أولي للتجارب التصوير الحموضة الكهربية والقائم على مضخم مع FitMaster (HEKA)، وFFN511 القائم على الكاميرا، SBFI وتم تحليل تجارب التصوير الرقم الهيدروجيني باستخدام TILLvisION (TILL الضوئيات). ايغور برو (الموجة المقاييس، بحيرة أوسويجو، OR، الولايات المتحدة الأمريكية)، يماغيج (NIH، الولايات المتحدة الأمريكية) وأدوبي المصور استخدمت لمزيد من التحليل وإعداد الأرقام. عند الاقتضاء وبلغ متوسط البيانات وإعطاء كما يعني ± SEM لعدد المحدد من الخلايا. استخدمت اثنين من الذيل عينة اثنين تي الاختبارات على قدم المساواة الطلاب التباين في (مايكروسوفت إكسل) لاختبار اختلافات كبيرة. حسبت إمكانات عكس النظرية لتيارات بروتون عبر المعادلة نرنست
مع
R = 8.314 J / (مول * K)،
T = 297 K،
F = 96485 C / مول،
ض = 1،
و[H +]
تحويلة و[H +]
كثافة العمليات تمثل تركيزات البروتون الخارجية والداخلية، على التوالي.
Hyperforin-dicyclohexylammonium تم الحصول على (-DCHA) الملح من سيغما، وhyperforin حل الحمض الحر كما هو الحال في الميثانول من سيجما وBiomol (كايمان الكيميائية). تم الحصول على BCECF-AM وحامض خالية من BCECF من المسابر الجزيئية (يوجين، OR، الولايات المتحدة الأمريكية)، وSBFI-AM من TEFLabs (أوستن، TX، الولايات المتحدة الأمريكية). الدهون لطبقة ثنائية المادة الدهنية قدمت التفضل الدكتور مارتن يونغ، MEDIZINISCHE BIOCHEMIE اوند Molekularbiologie، هومبورغ. وقد تم الحصول على FFN511 وجميع المواد الكيميائية الأخرى من سيجما.
هذا العمل مرخص تحت رخصة المشاع الإبداعي الدولي غير التجارية NoDerivs 4.0. يتم تضمين الصور أو غيرها من المواد طرف ثالث في هذه المقالة في رخصة المقال الإبداعي، ما لم ينص على خلاف ذلك في خط الائتمان. إذا لم يتم تضمين المواد تحت رخصة المشاع الإبداعي، سوف يحتاج المستخدمون إلى الحصول على إذن من صاحب الترخيص من أجل إنتاج المواد. لعرض نسخة من هذا الترخيص، زيارة
« آخــر المشـاركــات »
12-05-2015, 08:55 PM
العرض العادي
