#21  
قديم 11-23-2015, 09:44 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بارديه-بيدل الجينات متلازمة مهمة في الاتجار داخل الخلايا إلى الوراء وظيفة الحويصلة أهداب كوبفر

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/15/5/667.full



وتتميز متلازمة بارديه-بيدل (BBS) عن السمنة، واعتلال الشبكية، polydactyly وضعف الإدراك، الكلى والتشوهات القلبية وكذلك ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري. لا تظهر تسعة جينات BBS المعروفة تنتمي إلى نفس الفئة الوظيفية؛ بعد طفرة من هذه الجينات يؤدي إلى النمط الظاهري عديد المظاهر متطابقة تقريبا. على الرغم من أن وظائف محددة من البروتينات BBS لم يتحدد بعد، البيانات الحالية تدعم دور في وظيفة الأهداب والنقل intraflagellar. للحصول على نظرة ثاقبة على العمليات البيولوجية التي تسيطر عليها الجينات BBS، شرعنا في الدراسات ستة orthologues BBS من الزرد. ضربة قاضية من bbs2، bbs4، bbs5، bbs6، bbs7 أو bbs8 النتائج الزرد في تعطيل الحويصلة كوبفر (KV)، وهو جهاز مهدبة يعتقد أن تلعب دورا في تنميط بين اليسار واليمين. هي العيوب KV بسبب الفقدان التدريجي للأهداب داخل الحويصلة ويؤدي إلى تغييرات لاحقة لتجانب الجهاز. نلاحظ أيضا وجود خلل معين تغيير وسائل النقل جسيم ميلانيني الوراء. هذه الدراسات هي الاولى لمقارنة شاملة لمجموعة متنوعة من الجينات BBS بالتوازي ويبرهن على وجود دور مشترك في الاتجار داخل الخلايا، مما يدل على أن تشارك البروتينات BBS في الاتجار العام عضية.
مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS، MIM 209 900) هو اضطراب عديد المظاهر وراثيا غير متجانسة تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، والتشوهات الكلى والتشوهات الوظيفية، وصعوبات التعلم ونقص الأعضاء التناسلية (1 - 3). المرضى الذين لديهم BBS أيضا زيادة في حدوث مرض السكري وارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب الخلقية (1، 4، 5). حتى الآن، وقد تم تحديد تسعة جينات BBS (+6 - +17). فهم الفيزيولوجيا المرضية لمتلازمة BBS هي ذات أهمية كبيرة نظرا لحقيقة أن مكونات النمط الظاهري تنتشر في عموم السكان.
على الرغم من أن تم تحديد تسعة جينات BBS، لا يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية لهذا الاضطراب وظيفة محددة من البروتينات BBS. BBS4 وBBS8 احتواء tetratricopeptide تكرار (TPR) المجالات، مشيرا إلى أن تتفاعل مع بروتينات أخرى (6، 13). BBS6 (المعروف أيضا باسم MKKS) وتناظر تسلسل لالوحيدات ألفا من Thermoplasma acidophilum thermosome (18)، وهو مجمع chaperonin بدائيات النواة مع تشابه إلى chaperonin حقيقية النواة يسمى المعقد تعقيدا حلقة ببتيد العديم الذيل (19). البروتين BBS3 ينتمي إلى ARF / الأسرة ARL من GTP ملزم بروتينات صغيرة، بعض منها على الأقل يشاركون في الاتجار البروتينات المرتبطة الحويصلة (14، 16). البروتين BBS9 حددت مؤخرا (المعروف أيضا باسم B1) لا يوجد لديه التشابه مع غيرها من البروتينات المعروفة BBS وظيفة غير معروف (17). البروتينات BBS الأخرى المعروفة (BBS1، BBS2، BBS5 وBBS7) هي أيضا البروتينات رواية (7، 11، 12، 15).
العمل مؤخرا يشير إلى أن سمة مشتركة من الجينات BBS هي أنها تشارك في وظائف الهدبية والنقل intraflagellar (IFT). ويدعم هذه الفرضية من خلال حقيقة أن homologs الحفظ جدا من البروتينات BBS توجد في الكائنات الحية مهدبة (14، 15، 20، 21) وثبت العديد من المنتجات الجينات BBS في توطين إلى الهيئات القاعدية في انواع معينة ايليجانس (13، 15، 16 ، 22). وقد تبين BBS4 في توطين للأقمار الصناعية مريكزي من centrosomes والهيئات القاعدية للأهداب الابتدائي، حيث يتفاعل مع مكونات الآلات النقل داينين ​​(23). وعلاوة على ذلك، C. ايليجانس المسوخ من BBS7 وBBS8 جود عيوب في IFT (13، 22). فشل نماذج الماوس خروج المغلوب من BBS2، BBS4 وBBS6 لتشكيل سياط خلال تكوين الحيوانات المنوية، على الرغم من أن هذه الحيوانات تطوير الأهداب الأخرى. إسكات BBS5 في كلاميدوموناس يؤدي إلى غياب سياط (15). غياب الماوس Bbs2، Bbs4 أو Bbs6 لا يعطل تشكيل أهداب في المستقبلات الضوئية، والخلايا المهدبة الحسية في شبكية العين. ومع ذلك، يبدو أن هذه البروتينات لازما لصيانة مستقبلة للضوء (21، 24، 25)، وغياب الماوس Bbs2 أو Bbs6 النتائج في mislocalization من رودوبسين، مشيرا إلى وجود خلل في الاتجار داخل الخلايا و / أو IFT (24، 25).
وأحد الجوانب المثيرة للفضول BBS هو حقيقة أنه على الرغم من كل شكل الجزيئي للأمراض يسلك النمط الظاهري مشابهة جدا، والمنتجات الجين لا تملك تناظر تسلسل مكثفة مع بعضها البعض، ويبدو أنها لا تتفاعل مباشرة جسديا، ولا تنتمي إلى نفس الفئة الوظيفية البروتينات. لا تزال العديد من الأسئلة المتعلقة بدور منتجات الجين BBS، بما في ذلك ما إذا كانت وظيفة هذه البروتينات محدودة لIFT، أو ما إذا كانت هذه البروتينات تلعب دورا أكثر عمومية في الاتجار داخل الخلايا. سواء تشارك هذه البروتينات في الاتجار ثنائي الاتجاه بين الخلايا وIFT وما إذا كانت هذه البروتينات تلعب دورا في الاتجار عضية. من أجل الإجابة على هذه الأسئلة والحصول على مزيد من التبصر في العمليات البيولوجية التي تتقاسمها هذه الجينات، حددنا ortholog الزرد ستة جينات BBS (bbs2، bbs4، bbs5، bbs6، bbs7 وbbs8)، وتستخدم أليغنوكليوتيد] العقاقير morpholino (موس) لضربة قاضية على حدة التعبير عن كل وتقييم التأثير على العمليات التنموية والفسيولوجية متعددة. ركزنا في البداية هذه الدراسة على bbs7 الزرد ثم مدد الدراسة إلى خمسة جينات BBS إضافية. لاحظنا الظواهر المتداخلة لافت للنظر في الأجنة morphant، بما في ذلك الحويصلة كوبفر (KV) اضطراب يؤدي إلى تغييرات في اليسار واليمين (ل-ص) التباين. هذا الخلل لا يؤثر تشكيل أهداب في وقت مبكر بل ويعرض نفسه على تخفيض تدريجي في عدد من أهداب داخل KV مع مرور الوقت. ومن الجدير بالذكر، فإننا نلاحظ أيضا دورا حاسما للبروتينات BBS في الاتجار داخل الخلايا من عضيات (الصباغية). تظهر خسارة وظيفة من بين كل الجينات BBS أن تؤثر في الغالب النقل الوراء الأجسام الصباغية، مشيرا إلى دور وظيفي في مجال النقل حويصلة. بياناتنا تؤدي إلى فرضية موحدة أن يشارك كل البروتينات BBS في نقل الخلايا إلى الوراء. هذه الدراسة من العمليات التنموية والفسيولوجية متعددة في الحيوان كله يكشف بعض المتطلبات الجديدة لوظيفة BBS في الفقاريات، ويمكن استخدامها لخيوط مشتركة لالفيزيولوجيا المرضية المرض.

المواد والأساليب

الزرد BBS الاستنساخ ortholog

أجرينا تحليل BLAST الجينات BBS ضد EMBL / بنك الجينات ومشروع الجينوم (مركز سانجر) قواعد البيانات والكشف عن تسلسل الزرد المتجانسة للغاية لكل من الجينات BBS البشرية المعروفة. وقد صممت الاشعال محددة لتضخيم متواليات BBS الزرد من مكتبات كدنا] (المواد التكميلية، تسلسل التمهيدي). بلغ مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الأجنة التي تم جمعها في مراحل نمو محددة باستخدام TRIzole® كاشف (GibcoBRL) بولي (A) المختارة وعكس كتب (مرتفع TM II، إينفيتروجن). تم استنساخ المنتجات PCR في pSTBlue ناقلات (ميرك) والتحقق من التسلسل على المنظم ABI3730.

جبل بأكمله في الموقع التهجين

كانت ثابتة الأجنة مع 4٪ لامتصاص العرق / الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بين عشية وضحاها. وعولج الأجنة> 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) مع الصباغ المانع. تم توليفها والشعور العقاقير تحقيقات digoxigenin-UTP RNA (روش) من القوالب خطي [bbs2، bbs4، bbs6 وbbs7 العقاقير يتفاعل مع سال الأول، وتوليفها مع T7 RNA البلمرة. وللتحقيقات المعنى، بام مرحبا هضمها وكتب مع SP6 RNA البلمرة]. تحقيقات الأخرى المستخدمة ما يلي: شارون (بام مرحبا، SP6)، nkx2.5، (ايكو RI، T7)، LFT-1 (MLU I، T7)، LFT-2 (MLU I، T7) وfkd2 (ابا I، T3 ). تم تنفيذ جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) كما وصفها طويل وريباغلياتي (26).

Morpholino أليغنوكليوتيد] العقاقير

تم تصميم العقاقير MO والتي تم شراؤها من أدوات الجينات، LLC (المواد التكميلية، تسلسل MO). تم microinjected المنظمات الأعضاء في 7:59 الأجنة الخلية بتركيزات تتراوح بين 200-500 μ م.

سلسلة من ردود الفعل العكسي الناسخ، البلمرة

مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من morphants حجب لصق (10-15 الأجنة / المرحلة) في العصور التالية: 14-16، 24، 30، 48، 70-72، 96، و 120 HPF، وقد تمت صياغتها في شكل كدنا] وتتضخم مع الجينات المحددة الاشعال المرافقة اكسون تستهدف bbs2، bbs6 وbbs7. تم تحليل التعبير عن β-الأكتين باعتبارها الرقابة الداخلية (المواد التكميلية، الاشعال تسلسل).

إنقاذ الظواهر ضربة قاضية

وsubcloned Morpholino مقاومة للالبرية من نوع BBS RNA إلى pCS2 + ناقلات التعبير (27). وقدم RNA الاصطناعية مع AMBION mMessage mMachine ذات العائد المرتفع توج RNA عدة نسخ. كان مرنا (50 نانوغرام / ميكرولتر bbs6 وكل من 50 و 100 نانوغرام / bbs7 ميكرولتر) شارك في حقن MO المناسب أو خمسة عدم تطابق-المنظمات الأعضاء.

تحليل KV وأهداب

تم تصوير الأجنة الحية باستخدام كاميرا زايس Axiocam. والحويصلات في الأجنة التي يبلغ قطرها أقل من ثلث أن من النوع البري يعتبر انخفاض وتم سجل الأجنة التي الحويصلات لا يمكن تحديد شكليا كما تغيب. لimmunolocalization، تم إصلاحها الأجنة. تم إجراء المناعي وفقا لبروتوكول قياسي باستخدام الماوس المضادة الأسيتيل الأجسام المضادة تويولين وحيدة النسيلة (سيغما T 6793، 1: 800 تمييع) والضد الثانوية، اليكسا 488 مترافق الضد الماعز المضادة للماوس (الجزيئية تحقيقات A-11001، 1: 200 تمييع)، تليها نوى counterstaining TO-PRO ® -3 (الجزيئية تحقيقات T-3605). تم تصوير الأجنة على المسح الضوئي ليزر نظام المجهر متحد البؤر ايكا SP2 AOBS مع 63 × التكبير و 4 × التكبير.

فحص النقل جسيم ميلانيني

تعرض يوم 5 اليرقات إلى ادرينالين (50 ملغ / مل، سيجما، E4375) تضاف إلى الجنين المتوسطة (28) لتركيز النهائي من 500 ميكروغرام / مل. تم رصد جسيم ميلانيني تراجع باستمرار تحت المجهر وسجل نقطة النهاية عندما كانت جميع الأجسام الصباغية في الرأس والجذع محيط بالنواة. لتقييم حركة تقدمي، تعرضت اليرقات إلى ادرينالين للحث على جسيم ميلانيني التراجع، وغسلها مع فائض المتوسطة الجنين ومن ثم عادوا إلى حاضنة مظلمة مع المراقبة الدورية أو يتعرضون لمادة الكافيين (1 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 7.0). كانت بعض الزرد تعامل مسبقا مع brefeldin A (2.5 ميكروغرام / مل) لمدة 45 دقيقة.

الأنسجة العين والتركيب الدقيق

كانت ثابتة خمسة أيام بعد الإخصاب (5 DPF) يرقات مع 4٪ لامتصاص العرق أعدت في 10 م م PBS ل~2 ساعة. تم تشطف الأجنة في برنامج تلفزيوني وكانت تسللت في 30٪ محلول السكروز في برنامج تلفزيوني لعدة ساعات. وبعد ذلك جزءا لا يتجزأ من الأجنة في مجمع الأمثل درجة حرارة القطع وcryosectioned. تم جمع الأقسام في 7 ميكرون وكانت ملطخة الهيماتوكسيلين / يوزين وصمة عار. للانتقال المجهر الإلكتروني (TEM) أو 5 أو 6 يرقات DPF تم إصلاحها عن طريق الغمر في تثبيتي قوة نصف Karnovsky ل(29). العينات كانت ثابتة بعد في tetraoxide الأوسيميوم، المجففة وجزءا لا يتجزأ من الراتنج سبير. تم جمع أقسام سامسونج من خلال مستوى فنجان العين مبصرة لتقييم التركيب الدقيق. واعتبرت أقسام على JEOL 1230 TEM والصور الرقمية التي تم جمعها.

النتائج

تحديد orthologs BBS الزرد

من أجل تحديد orthologs الزرد، أجرينا تحليل BLAST الجينات BBS على قاعدة بيانات الجينوم Ensembl لدانيو rerio، تصميم الاشعال الجينات المحددة واستنساخ الجينات BBS الزرد. ترجمة المفاهيم والمواءمة مع تسلسل BBS الإنسان تبين أن الجينات BBS الزرد لديهم مستويات عالية من التماثل إلى الجينات البشرية (الجدول 1). أجرينا WMISH مع كل من الجينات BBS وأظهرت التعبير الأمهات كل من هذه الجينات مع استمرار التعبير في كل مكان من هذه الجينات. الشكل 1 يوضح هذه البيانات لbbs7. كل من الأم (الشكل 1 أ) والتعبير اقحي (الشكل 1 لوحظ C) مقارنة مع الأجنة سيطرة الشعور (الشكل 1 B و D). bbs7 التعبير في وأثرى 36 HPF في مجال الأمامي، بما في ذلك الدماغ و الحقول العين والمنطقة التامور (الشكل 1 E). في 48 HPF، لوحظ التعبير في قائما الدماغ والعينين وتعبير قوي أيضا في برعم الطرف النامي (الشكل 1 G). يواصل التعبير عن النصوص bbs7 الزرد طوال اليوم الجنينية 5، على النحو الذي يحدده RT-PCR (الشكل 1 I). يبدو التعبير عن BBS أخرى النصوص الزرد (bbs2، bbs4 وbbs6) في كل مكان في 0-24 HPF (على النحو الذي يحدده جبل بأكمله في الموقع) وغير قابل للكشف بواسطة RT-PCR طوال اليوم الجنينية 5 (لا تظهر البيانات).

الشكل 1. BBS الزرد التعبير في كل مكان، والنتائج لصق كتلة MO في محضر تغير. التعبير الزماني والمكاني للbbs7 تحليلها من قبل WMISH مع العقاقير في (A) 16 خلية، (C) 24 HPF، (E) 36 HPF و(G) 48 HPF مراحل وبمعنى التحكم في (B) 16 خلية، (D ) 24 HPF، (F) 36 إدارة الشرطة الاتحادية و(H) 48 HPF مراحل. الحيوان رأي قطب في (A) و (B)، النظر الجانبي، الأمامي إلى اليمين في (C-H). (I) لمحة التنموي bbs7 بواسطة RT-PCR 14-120 HPF (J) منتجات RT-PCR من bbs7 لصق كتلة الأجنة المحقونة MO. وقدمت مكتبات كدنا] من بين مجموعة من 10 الأجنة في 30 و 70 و 120 HPF والمحلية من النوع البري الفرقة تهاجر في 786 سنة مضت ونص غيرت في 877 سنة مضت. ويظهر ممر أسفل سيطرة التضخيم β الأكتين.


الجدول 1.
استنساخ BBS الزرد

ضربة قاضية من BBS الزرد التعبير الجيني

من أجل تقييم ما إذا كان فقدان الزرد النتائج ظيفة BBS في العيوب الجنينية، استخدمنا مختلف MO العقاقير لتعطيل ترجمة استهداف ميثيونين المبادر وتعطيل معالجة RNA استهداف المواقع الواصلة لكل من الجينات BBS تقييمها في هذه الدراسة (bbs2، bbs4 ، bbs5، bbs6، bbs7 وbbs8). الموسومة فلوريسئين تظهر توزع BBS في الأجنة الزرد المنظمات الأعضاء حقن الصغرى موحد حتى ما بعد 48 HPF على BBS المنظمات الأعضاء لصق الجهات المانحة تحفز تخطي من الإكسونات المستهدفة والمنظمات الأعضاء لصق متقبل لحث إنترون إدراج، سواء الناتجة في محاضر لصق الشاذة. تم استنساخ أشكال لصق الشاذة والتحقق من تسلسل. ويعاير أشكال لصق الشاذة التي كتبها RT-PCR لتأكيد فعالية ضربة قاضية الناجم عن MO التعبير الذاتية. وكمثال على نجاح فعالية ضربة قاضية، ضربة قاضية كاملة من bbs7 في 30 HPF (الشكل 1 تم تحقيق J) في الأجنة التي تظهر الظواهر المورفولوجية. نلاحظ ضربة قاضية كاملة تصل إلى 36 HPF (لا تظهر البيانات). استمرت MO بوساطة ضربة قاضية الجينات طوال 120 HPF، ولكن بنسبة 70 HPF، ويلاحظ من النوع البري bbs7 النص مع نص الشاذة. واستخدمت سكان الأجنة تتأثر مع فقدان تام للbbs7 للتحاليل للكشف عن أدوار أساسية في العمليات التنموية الرئيسية. التحقق من صحة وتمديد bbs7 الخسارة من وظيفة الدراسات، تم تقييم الظواهر ضربة قاضية من BBS جينات إضافية (bbs2، bbs4، bbs5، bbs6 وbbs8). أجرينا فحص الصرفي الإجمالي، ولم الأجنة morphant لا تختلف في حجم الجسم العام ومورفولوجية مقارنة بالمجموعة الضابطة. ولوحظ عدم وجود فروق فيما يتعلق الرأس والعين، على الرغم من أن بعض الأجنة عرض تجويف التامور الموسع.

تعطل BBS الزرد يعمل النتائج في العيوب KV

أول النمط الظاهري المورفولوجية نتيجة لضربة قاضية BBS الجين هو تغيير في وقت مبكر تشكيل حويصلة المهدبة. KV هو بنية تحتوي عابرة monocilia ويقترح أن يكون وظيفة مماثلة إلى عقدة الماوس نسبة إلى L-R محور التماثل (30 - 33). وKV ينشأ من الخلايا الظهرية سباقة أثناء تكون المعيدة، تتمدد حويصلة كروية خلال مراحل الجسيدة ويمكن ملاحظته بسهولة في منطقة الذيل برعم (+34 - 36).
تم تقييم morphants bbs7 لإجراء تعديلات على تشكيل KV. في مرحلة 10-13 الجسيدة، KV في morphants غير المعالجة والسيطرة هو بيضوي الشكل التعرف بسهولة على شكل حويصلة في خط الوسط الخلفي، مع متوسط ​​قطرها 60 ميكرومتر (الشكل 2 A، شريط النطاق الأبيض من 100 ميكرون). في هذه المرحلة، قد وصلت إلى أقصى KV قطر التقريبي الذي يرتد تدريجيا في حجم بعد مرحلة 15 الجسيدة. في morphants bbs7 تحليلها في مرحلة 10-13 الجسيدة، 28٪ من الأجنة قد خفضت بشدة قطر KV إلى أقل من ثلث حجم عناصر التحكم (الشكل 2 B) أو غياب الصرفي كاملة من KV (الشكل 2 C) . كان الأجنة Morphant حقن مع تركيز أقل من bbs7 MO تأثير انخفاض على KV مورفولوجيا (7٪، الشكل 2 D)، ودعم استجابة تعتمد على الجرعة لضربة قاضية. كما عرض الأجنة المحقونة مع bbs2، bbs4، bbs5، bbs6 وbbs8 المنظمات الأعضاء عيب KV، وهذا العيب غير موجود في morphants التحكم (الجدول 2، المواد التكميلية، الشكل S1). تم احتساب أهمية في P <0.001 لكل BBS morphant على أساس اختبار فيشر الدقيق. كما تورطت BBS ظيفة البروتين في أهداب نشوء حيوي، وبحثنا القادم مركز KV أهداب في BBS morphants.

يدفع الشكل 2. BBS ضربة قاضية العيوب أهداب KV. ظهور KV في morphants bbs7 الحية محمولة مع (A) من النوع البري مثل (B) خفضت و(C) حويصلة غائبة شكليا (شريط حجم 100 ميكرون). رأس السهم يشير موقع حويصلة في مؤخرة الذيل برعم إلى الحبل الظهري، الأمامي إلى اليمين. (D) التمثيل البياني لنسبة KV تغير عن كل معاملة. ويلاحظ حجم العينة على المحور السينية ويلاحظ أن نسبة تغيير في الجزء العلوي من كل شريط. (E - M) صور مجهرية متحد البؤر المضادة للالأسيتيل تويولين تلطيخ KV أهداب (الأخضر) counterstained للنواة (أحمر) وشريط حجم 8.0 ميكرون. morphant السيطرة على (E) 5-7 الجسيدة، (F) 10/08 الجسيدة و(G) 11-13 مراحل الجسيدة. morphants bbs7 مع انخفاض KV في (H) 06:55 الجسيدة، (I) 8-10 الجسيدة و (J) 11-13 مراحل الجسيدة. bbs7 morphant مع عدم وجود KV في (K) 06:55 الجسيدة، (L) 10/08 الجسيدة و(M) 11-13 الجسيدة مراحل.


الجدول 2.
KV النمط الظاهري

morphants BBS يكون عيوب KV أهداب

يحتوي KV عدد سكانها جاحظ أهداب التي يمكن أن تكون مزينة تويولين لمكافحة الأسيتيل. تم إجراء تقييم للتنظيم أهداب في morphants bbs7 التي كتبها المناعية في ثلاث مراحل تنموية متميزة: 5-7 مرحلة الجسيدة، عندما يصبح KV مرئية شكليا، مرحلة 8-10 الجسيدة، عندما KV عادة ما تتزايد في القطر و11-13 مرحلة الجسيدة، المرحلة التي نستخدمها ليسجل الخلل KV الصرفي. في البرية من نوع والسيطرة morphants (الشكل 2 E-G)، أهداب يمكن ملاحظة في نمط كروية في منطقة KV. أهداب عدد وطول والشاملة زيادة مساحة KV مع التقدم في السن التنموي. وسجل morphants bbs7 إلى انخفاض KV تظهر مشابهة لمن النوع البري في مرحلة 5-7 الجسيدة (الشكل 2 H) ولكن لديها مجال خفض جزئيا الجسيدة 10/08 المرحلة (الشكل 2 I) وانخفاض ملحوظ عدد أهداب والمجال من قبل مرحلة 11-13 الجسيدة (الشكل 2 J). ومن المثير للاهتمام، في morphants bbs7 دون KV مرئية شكليا، أهداب موجودة ولكن يبدو أن تجميع في مجال صغير في مرحلة 5-7 الجسيدة (الشكل 2 K). قبل مرحلة 8-10 الجسيدة، تظهر أهداب أقصر وتفرقوا (الشكل 2 L)، وعدد قليل من أهداب، إن وجدت، هي الحاضرة في مرحلة 11-13 الجسيدة (الشكل 2 M). وبالمثل، كشف تحليل المناعى من bbs2، bbs4 وbbs6 morphants عدد قليل أو أي أهداب في مرحلة الجسيدة 10-13 (المواد التكميلية، الشكل S2). في المراحل الأولى لتكوين KV، ونمط أهداب يشبه في البرية من نوع وmorphants bbs7. ومع ذلك، فإن عددا من أهداب يرتد أو يختفي مع تقدم العمر التنموي. هذه البيانات متوافقة مع البيانات الماوس مبصرة انحطاط (21، 24، 25) وتشير إلى أن وظيفة BBS مطلوب من أجل الصيانة المستمرة للأهداب و / أو بقاء الخلايا المهدبة. على الرغم ضربة قاضية كاملة خلال هذه المراحل، لا يمكننا أن نستبعد إمكانية البروتين الأمهات المساهمة في تشكيل أهداب.

ضربة قاضية من BBS يغير الجوانب الجزيئية من التباين ل-ص

تم أهداب غير منظمة المذكورة سابقا في سياق فقدت وظيفة العقدي، مما أدى إلى انخفاض KV أو غائبة (37). وحددت مؤخرا العقدي خصم، كارون، وقد تبين أن تكون حاسمة لمناسبة الزخرفة L-R في الأجنة الزرد، ويتم ترجمة نص شارون إلى الخلايا المحيطة KV (38). في مرحلة 10-13 الجسيدة، هناك عادة حدوة حصان على شكل شارون مجال -expression المرافقة KV الخلفي (الشكل 3 A). التعبير شارون ما زال موجودا في bbs2، bbs4، bbs6 وbbs7 morphant الأجنة، وإن لم يكن في تنميط الشكل، كما هو موضح مع morphant BBS 7 مع عدم وجود KV مرئية شكليا (الشكل 3 B، التكميلية المواد، الشكل S1). وهكذا، والاحتفاظ التعبير شارون في morphants يشير إلى أن الخلايا التي تخيم على المنطقة الخلفية من KV لا تزال موجودة. عدم وجود شكل نموذج أولي يبدو أن نتيجة لKV المنهار، وهو ما يتسق مع التعديلات أهداب لوحظ في morphants.

الشكل 3. BBS ضربة قاضية يؤهب الأجنة إلى عيوب تجانب. WMISH من شارون في 10-13 الأجنة الجسيدة: سيطرة (A) وmorphant bbs7 (B) مع عدم وجود KV مرئية شكليا. عرض الخلفي، الأمامي إلى اليسار. الظهرية نظرا لLFT-1 و LFT-2 التعبير في 21-23 مراحل الجسيدة في bbs7. لا morphants KV تظهر (C) في الجانب الايسر التعبير في اللوحة الجانبية (نجمة) والدماغ (السهم)، (D) التعبير الثنائي و(E) التعبير في الجانب الأيمن في لوحة جانبية (نجمة) والدماغ (السهم). التعبير nkx2.5 في morphants bbs7 عرض (F) الهجرة اليسار أنبوب القلب، (G) أي الهجرة و(H) عكس الهجرة إلى اليمين. ويشير السهم الأسود موقع أنبوب القلب بالنسبة للعيون (L، يسار، R، يمين) في طريقة عرض البطنية. (I) نسبة غيرت الهجرة أنبوب القلب (الركض) باللون الأزرق وحلقات باللون الأحمر بالنسبة لمجموع السكان من morphants bbs7. (J) وجود عيوب الركض في فئة لا KV. وأشارت العلاج وحجم العينة على X -axis وأشارت نسبة المتغيرة في الجزء العلوي من كل شريط.

نحن ثم نحدد ما إذا كان يتم تغيير المكونات الجزيئية للتنميط L-R في BBS morphants. راقبنا تعبير عن (LFT-1) واليساري 2 (LFT-2) الجينات 1 اليساري، فئة فرعية من تحويل النمو عامل بيتا البروتينات الهامة لعدم التماثل ل-ص (مراجعة في أكثر خجلا، 2003). في الزرد 21-23 الجسيدة مرحلة الجنين، LFT-1 و LFT-2 يتم التعبير عنها في اليسار لوحة جانبية الأديم المتوسط، مجال القلب والدماغ، وله LFT-1 أيضا التعبير في خط الوسط من الجنين (الشكل 3 C) . في bbs7 سجل morphants كما KV غائبا، LFT-1 وسقط LFT-2 التعبير إلى ثلاث فئات: أظهرت 55٪ العادي التعبير في الجانب الايسر، أظهرت 36٪ التعبير الثنائي في لوحة الجانبية والدماغ (الشكل 3 D)، و 9٪ قد عكس الجانب الأيمن التعبير (الشكل 3 E). وقد لوحظ الثنائي وعكس LFT-1 و LFT-2 التعبير أيضا في morphants bbs6، في حين morphants السيطرة أظهرت 100٪ جانب اليسار LFT-1 و LFT-2 التعبير.

وميالا morphants BBS عيوب تجانب الجهاز

وBBS ضربة قاضية الناجم عن KV والعيوب أهداب وكذلك تغيير شارون وLFT التعبير دعم دور للوظيفة BBS في تجانب الجهاز. في 22-24 HPF، وأنبوب القلب يستطيل من خط الوسط ويهاجر (وهو ما يسمى "الركض") إلى اليسار. هذه هي واحدة من أولى المؤشرات المورفولوجية للالتباين ل-R والأجنة يمكن سجل لليسار وارد (الشكل 3 F) انقر بزر الماوس الأيمن جناح (الشكل 3 H) أو أي تحيز تجانب (الشكل 3 G). تم تقييم الركض قلب كل من التشكل وWMISH باستخدام مسبار القلب محدد، nkx2.5 (39). عند تقييم جميع سكان morphants bbs7، لاحظنا الركض غير طبيعي (أي هرول هرول أو عكس) في 14٪ من الأجنة المحقونة بالمقارنة مع 1-3٪ الركض غير طبيعي في morphants uninjected أو التحكم (الشكل 3 I). استمر أنبوب القلب للخضوع التشكل وبين 36 و 48 HPF حلقات إلى تنميط S-الشكل، ووضع الأمامي البطين وإلى اليمين من الأذين (كما يشار إلى D-حلقات). وقد لوحظت اثنين تعديلات على حلقات القلب،-حلقات L (اتجاه المعاكس من البطين بالنسبة إلى الأذين) وبلا حلقات (أنبوب القلب على التوالي). أظهر morphants bbs7 تردد 14٪ من حلقات غير طبيعية.
لتحديد ما إذا كانت مرتبطة عيب KV لتغير تجانب الجهاز، وقد تم اختيار مجموعة فرعية من morphants bbs7 الذي عرض KV تغير وتحليلها لقلب حلقات والركض. بين الأجنة المحقونة MO bbs7 مع عدم وجود KV الصرفي أو عرضه 59٪ غيرت الركض القلب، في حين خفضت الأجنة KV أظهرت 34٪ الركض غير طبيعي (الشكل 3 J). الأجنة التي تظهر الركض اليسرى شكلت عادة D حلقة، في حين شكلت اليمين جناح الركض وL-حلقة ولا هرول عرض حلقات التوزيع العشوائي (الشكل 3 I). لوحظ الركض تغيير وحلقات في bbs4، bbs5، bbs6 وbbs8 morphants مع مجموعة من انتفاذ (8-20٪ للركض و5-29٪ للحلقات، الجدول 3). وتشير هذه البيانات إلى أن تجانب القلب وخطر في BBS morphants وترتبط أن الركض وحلقات (الجدول 3).

الجدول 3.
الركض القلب وحلقات

تغير تجانب القلب لاحظ لbbs7 أقل الحقن MO الجرعة في تردد يعادل ذلك الذي لوحظ في جرعة أعلى. هذه النتيجة تشير إلى أن أهداب في خفض الدرجة KV يستمر في التدهور ويؤدي في مرحلة لاحقة-عيوب تجانب الجهاز. القناة الهضمية حلقات سجل في للخطر أيضا في morphants bbs7 48 HPF (المواد التكميلية، الشكل S3). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الزرد وظيفة BBS مطلوب للمظهر صرفي من KV والخسارة من وظيفة يدفع تعطل أهداب ويهيئ الأجنة عيوب تجانب الجهاز.

BBS الجيني النتائج في تأخر نقل الخلايا إلى الوراء ضربة قاضية

من أجل تحديد ما إذا كان مطلوب وظيفة BBS لعمليات النقل الخلوية العامة، راقبنا النقل في السكان الخلية غير مهدبة. الزرد يغير تصبغ الجلد عن طريق الاتجار الأجسام الصباغية داخل melanophores ردا على الإشارات البصرية والمحفزات الهرمونية. وجسيم ميلانيني هو عضية المتعلقة يحلول، ويتم تنفيذ ثنائي الاتجاه في رحلات مكوكية بين محيط الخلية ومنطقة محيط بالنواة بها المحركات الجزيئية القائمة على أنيبيب، كينيسين الثاني وداينين. كينيسين الثاني هو المحرك موجهة زائد نهاية مسؤولة عن تشتت الأجسام الصباغية إلى محيط الخلية (تقدمي)، في حين داينين ​​هو محرك الموجهة ناقص نهاية مسؤولة عن جسيم ميلانيني التراجع إلى منطقة محيط بالنواة (رجعية) (+40 - 43). الاستفادة من الصباغ الزرد، وبالطبع وقت نقل المواقع عضية في الحيوان كله يمكن ملاحظة. تجميع الصباغ (الوراء) أو التشتت (تقدمي) يمكن حفز في غضون دقائق على العلاج مع الادرينالين والكافيين، على التوالي (44).
في مقايسة لدينا، 5 يرقات DPF هي لإبداء أكبر قدر ممكن تشتت خلايا الميلانية (الشكل تكييفها داكنة 4 A). تعرض مرة واحدة إلى ادرينالين، والأجسام الصباغية ينكمش بسرعة ويمكن تقييم بصريا عن انخفاض في حجم الصباغ (الشكل 4 B). نقطة النهاية هو واضح عندما تظهر جميع الخلايا الصبغية تراكم محيط بالنواة الأجسام الصباغية (الشكل 4 B و E). الأجنة حقن السيطرة وغير المعالجة يتراجع بسرعة الأجسام الصباغية بها (الشكل 4 C-E) (ر = 1.6 و 1.7 دقيقة، على التوالي)، في حين morphants bbs7 قد تأخر كثيرا جسيم ميلانيني تراجع (ر = 6.6 دقيقة، P <0.001). morphants bbs7 تقع في فئتين؛ فئة واحدة يبادر تراجع لكن تبقى الأجسام الصباغية تفرقوا بعد 4.9 و 5.5 دقيقة من التعرض (الشكل 4 G و H، على التوالي)، ولكن تصل في النهاية إلى نقطة النهاية في 7.2 دقيقة. فئة أخرى من bbs7 الأجنة المحقونة MO تظهر تراجع جزئي (الشكل 4 J) ولكن لا تخطي هذه النقطة حتى بعد 20 دقيقة من التعرض (الشكل 4 K). أسفرت عن الجينات BBS ترسيتها في هذه الدراسة (bbs2، bbs4، bbs5، bbs6، bbs7 وbbs8) في تأخيرات كبيرة في جسيم ميلانيني النقل (الجدول 4، الشكل 4 L). وكان ضعف رؤية أي أثر على وسائل النقل التي يسببها هرمونيا لأن القضاء على التعبير عن مخروط قضيب homeobox الجينات، CRX، يولد وظيفيا يرقة العمياء (45، 46) التي وردت للعلاج الادرينالين في نفس معدل morphants التحكم (لا تظهر البيانات).

الرقم 4. BBS ضربة قاضية النتائج في يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني تراجع تأخير. من النوع البري 5 يرقات DPF قبل العلاج (A) وبعد التعرض للادرينالين (B). مربع يدل المنطقة في أعلى التكبير (40 ×) (C - K). من النوع البري 5 يرقات DPF قبل العلاج (C)، 1.0 دقيقة بعد إضافة ادرينالين (D) وعند نقطة 1.3 دقيقة (E). bbs7 morphant مع انخفاض KV قبل العلاج (F)، في 4.9 دقيقة بعد إضافة ادرينالين (G) وعند 5.5 دقيقة (H). كانت نقطة النهاية 7،15 دقيقة لهذه اليرقة محددة، لا يظهر. الظهرية نظرا لbbs7 morphant مع عدم وجود KV قبل العلاج (I) في 11.25 دقيقة بعد ادرينالين إضافة (J) وفي 27 دقيقة (K). (L) التمثيل البياني مع أشرطة الخطأ يدل على تأخير كبير من جسيم ميلانيني الاتجار الناجم عن ادرينالين الوراء بالمقارنة مع من النوع البري والضوابط. يلاحظ العلاج (مراقبة أو BBS -morphant) على س -axis ومتوسط ​​زمن الاستجابة في غضون دقائق ويلاحظ على -axis ذ.


جدول (4).
جسيم ميلانيني حركة رجعية وتقدمي

يمكن تقييمها النقل تقدمي من وقت الشفاء الى كامل تشتت الصباغ بعد اليرقات يتم وضعها في وسائل الإعلام خالية من الادرينالين أو عندما تعامل مع الكافيين. عند اختبارها للاستجابة التقدمي، BBS morphants تستجيب في نفس المعدل كما ان من النوع البري والسيطرة morphants تقييمها مع الانتعاش الطبيعي والناجم عن الكافيين الصباغ التشتت (جدول 4).
العيوب المتداخلة التي لاحظها ضربة قاضية من عدة أعضاء من الأسرة الجينات BBS تشير إلى أن البروتينات BBS تلعب دورا في النقل داخل الخلايا. اذا كان العيب غير محددة إلى الوراء النقل، ينبغي لنا أن نسخة مظهرية وBBS ضربة قاضية الناجم عن خلل جسيم ميلانيني التي كتبها المساس النقل عبر كاشف آخر. Brefeldin A هو المستقلب الفطرية الذي يمنع النقل الخلوي (47، 48). من النوع البري أو السيطرة morphant الأجنة، وتعامل مسبقا مع brefeldin A ثم تتعرض لعرض ادرينالين تراجع تأخير، انقباض جزئي ولكن لم تصل إلى نقطة النهاية محيط بالنواة أو أي رد على الإطلاق (التكميلي المواد، الجدول S1). Brefeldin والعلاج هو عكسها، وبعد الغسيل خارج المخدرات والأجنة تستجيب للعلاج الادرينالين. في هذا الاختبار، brefeldin والعلاج، والتي أيضا يمنع الغالب النقل الوراء داخل الخلايا، يحاكي BBS الخسارة من وظيفة النمط الظاهري.

BBS morphants ومورفولوجيا العين والتركيب الدقيق

التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو سمة أساسية من BBS ويؤدي إلى العمى في المرضى من البشر. لتقييم الأنسجة العين من BBS MO الأجنة ضربة قاضية، كانت ثابتة bbs7 حقن MO الأجنة مرتبة حسب عيب KV في 5-6 DPF، وهو السن الذي مبصرة التشكل جار (49).أقسام الأنسجة من خلال عيون bbs7 الأجنة MO حقن عرض خلية محددة بوضوح العقدة، ضفيري الداخلية والطاقة النووية الداخلية، ضفيري الخارجي وطبقات النووية الخارجي. على الرغم من أن طبقة ضفيري الداخلية لم تظهر الموهن في بعض الحالات، والهندسة المعمارية الشاملة للشبكية العين ظهرت طبيعية في bbs7 morphants (الشكل 5 B) بالمقارنة مع النوع البري (الشكل 5 A). اكتشفنا كذلك وضع شرائح الخارجي مع TEM ووجد أن التركيب الدقيق للا KV bbs7 morphant (الشكل 5 D) يبدو طبيعيا شكليا، مع مبصرة محددة جيدا قطاعات الخارجية والأقراص غشائي (مقارنة الشكل 5 C) .

الرقم 5. الأنسجة العين والتركيب الدقيق في bbs7 الأجنة المحقونة MO. صور Brightfield من H & E الملون المقاطع العرضية التي تم جمعها من خلال عيون من 5 DPF (A) من النوع البري و(B) bbs7 morphant وتصويرها على 20 ×. لاحظ ظهور العدسة والشبكية، مع بارزة طبقة ضفيري الداخلية (الظاهرة كما شكل نصف دائرة وردي في كل من الأجنة). وقد لوحظ التمايز في شبكية العين الطبيعي في هذه اليرقات. تحليل TEM 5-6 DPF (C) من النوع البري و(D) bbs7 morphant سامسونج أقسام جمعها وصفت لشبكية العين الظهارة الصبغية (RPE)، شرائح الخارجي (OS) وطبقة النووية الخارجي (ONL). وقد لوحظ طبيعي التشكل الجزء الخارجي. شريط النطاق في (C و D) هو 2 ميكرون.

إنقاذ BBS morphant الظواهر

للتأكد من أن الظواهر الموصوفة سابقا كانت BBS -specific، bbs2، bbs6 وbbs7 كانت الأجنة المحقونة MO شارك في حقن مقاومة للMO BBS RNA. من النوع البري bbs2، bbs6 وbbs7 RNA خفضت بشكل ملحوظ من حدوث تشوهات KV إلى المستويات التي سجلت في الأجنة المحقونة التحكم (الشكل 6 A). نحن أيضا لوحظ تحسن كبير إحصائيا في معدل جسيم ميلانيني التراجع الناجم عن ادرينالين (الشكل 6 B، المواد التكميلية، الشكل. S4).

الرقم 6. إنقاذ الظواهر عنيف bbs7 RNA. (A) التمثيل البياني لنسبة الأجنة مع انخفاض أو أي KV لuninjected WT (البرية من نوع)، ومراقبة MO وbbs7 الأجنة المحقونة MO. السيطرة MO حقن شارك في مختلطة مع bbs7 RNA عرض العيوب KV قريبة WT 1،6-2،6٪. bbs7 نتائج حقن MO في ~30٪ العيوب KV. شارك في حقن bbs7 RNA مع bbs7 النتائج MO في عمليات الإنقاذ الجزئي (14.5٪) مع 50 نانوغرام / ميكرولتر من bbs7 RNA و 94٪ الإنقاذ مع 100 نانوغرام / ميكرولتر من bbs7 RNA. (B) التمثيل البياني مما يدل متوسط ​​زمن الاستجابة من جسيم ميلانيني حركة تراجعية الناجم عن الادرينالين. متوسط ​​زمن الاستجابة مع أشرطة الخطأ وأشار في الجزء العلوي من كل معاملة. لاحظ انخفاض معدل الاستجابة مع زملاء حقن bbs7 RNA. وأشار حجم العينة في (). لجميع الحقن، bbs7 جرعات MO هي 500 μ م.

نقاش

من أجل البحث عن القرائن إلى دور البيولوجي مشترك أو وظيفة مشتركة من البروتينات BBS، كنا الدراسات التنموية في الزرد لنموذج BBS. وأحد الجوانب المثيرة للفضول BBS هو حقيقة أن تحور كل من التسعة المعروفة BBS الجينات يؤدي إلى النمط الظاهري مشابهة جدا في البشر، على الرغم من أن منتجات الجين لا تملك تناظر تسلسل مكثفة مع بعضها البعض ولا تنتمي إلى الفئة الوظيفية المشتركة من البروتينات (6 - +17). هذه هي أول دراسة للمقارنة بين الخسارة من وظيفة الظواهر متعددة الجينات BBS بالتوازي في نموذج الفقاريات. لدينا الخسارة من وظيفة دراسات مع ستة الزرد BBS الجينات (bbs2، bbs4، bbs5، bbs6، bbs7 وbbs8) تظهر لافت للنظر الظواهر المتداخلة وتشير مسار بيولوجي مشترك لجميع الجينات BBS. بالإضافة إلى ذلك، التعبير الذاتية للالزرد BBS محاضر في تطوير الدماغ والعين وبراعم الأطراف والمناطق القلب والأوعية الدموية ويتسق مع الأنسجة التي تثبت وجود عيوب في متلازمة الإنسان، بما في ذلك اعتلال الشبكية، polydactyly، صعوبات التعلم، وارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب الخلقية. ومن المثير للاهتمام، وجود خلل في النقل إلى الوراء، التي كشفت عنها الدراسات ضربة قاضية لدينا في الزرد، هو سمة مشتركة بين جميع الجينات BBS ستة اختبارها.
وظيفة BBS في أهداب

يتم حفظها البروتينات BBS غاية في الكائنات مهدبة (14، 15، 20، 21)، وBBS4 يموضع للأقمار الصناعية مريكزي من centrosomes والهيئات القاعدية للأهداب الابتدائي (23). وكانت دراسات سابقة تدعم دور البروتينات BBS في وظيفة الأهداب. في الفئران خروج المغلوب، يطلب من البروتينات BBS لتشكيل سياط خلال تكوين الحيوانات المنوية ولكن ليس هناك حاجة لتشكيل آخرين أهداب متحركة أو الأساسي (21، 24، 25). أدلة من دراسات في C. ايليجانس يشير إلى أن BBS7 وBBS8 اللازمة لتوطين العادي للبروتينات IFT محددة وأن الطفرات الجينية للBBS7 وBBS8 نتيجة عيوب في الهدبية (13، 22). من أجل تقييم شامل على مثل هذه وظيفة البروتينات BBS في الفقاريات، شرعنا في ضربة قاضية وظيفة ستة orthologs BBS الزرد. في هذه الدراسة، وأوجه القصور BBS تغير تشكيل الصرفي من حويصلة المهدبة في الجنين في وقت مبكر. علينا أن نظهر وجود أهداب في وقت مبكر في عملية التنمية، تليها المبكرة التقدمية انحطاط / فقدان هذه الأهداب داخل KV. نلاحظ أيضا عيوب تجانب القلب واختلال الواسمات الجزيئية من تجانب في مجال الجهاز المفترض وكذلك في الدماغ. ومع ذلك، في البشر، وعيوب تجانب ليست عنصرا يلاحظ عموما من BBS. وبالنظر إلى أن الثدييات المشيمية تتطلب القلب وظيفية البقاء على قيد الحياة في الرحم، وتواتر العيوب تجانب وحظ قد لا تعكس التردد الفعلي للحدوث. ودعما لهذا الاحتمال، التزاوج متخالف من BBS خروج المغلوب الفئران تؤدي إلى نسل متماثل ~15٪ بدلا من المتوقع بنسبة 25٪ (21، 24، 25). ونظرا لصغر حجمها ووضع البيض الخارجي، يمكن أن الأجنة الزرد البقاء على قيد الحياة في مراحل اليرقات في وقت مبكر بلا قلب الوظيفي ونظام القلب والأوعية الدموية ويمكن أن تكشف عن وجود دور للبروتينات BBS لم يلاحظ عادة في الثدييات المشيمية.
فمن غير المرجح أن غياب الفردية BBS البروتينات النتائج في أهداب تماما غير وظيفية. الاختلافات بين النمط الظاهري BBS والظواهر ينسب عادة إلى عيوب في أهداب متحركة تشير إلى أن النمط الظاهري BBS لا يمكن تفسيره فقط من خلال تعطيل أهداب الحركة. على سبيل المثال، المرضى الذين يعانون من اختلال وظيفي الهدبية الابتدائية يكون عادة القصبات والتهاب الجيوب الأنفية، في حين لم يتم التعرف على هذه الأعراض كما السمات المشتركة من BBS. الأجنة الزرد مع العيوب أهداب يبرهن على وجود انحناء الجسم مميزة والخراجات في أنبوب القناة الهضمية (50، 51)، عيوب لم يتم العثور على وجه التحديد في BBS ضربة قاضية الأجنة.

وظيفة BBS والنقل داخل الخلايا

من أجل تحديد ما إذا كانت تشارك البروتينات BBS في النقل داخل الخلايا العام، بدلا من مجرد وظيفة IFT، قمنا بتقييم BBS الخسارة من وظيفة الأجنة الزرد لعيوب النقل داخل الخلايا. تحقيقا لهذه الغاية، فإننا مراقبة النقل جسيم ميلانيني في melanophores، والتي يمكن أن يسببها الادرينالين. الأجسام الصباغية المنتسبين مع الأنابيب الدقيقة وتكون قادرة على نقلها في الاتجاهين إما عن طريق كينيسين II (تقدمي) أو داينين ​​(رجعية) محركات (41). ضربة قاضية للتعبير عن كل الزرد BBS أسفرت الجينات في تأخير كبير في وسائل النقل جسيم ميلانيني إلى الوراء، في حين لم تتغير النقل تقدمي. تثبيط النقل إلى الوراء إلى أن منتجات الجين BBS لها دور في النقل داخل الخلايا، وتحديدا الحويصلة إلى الوراء والنقل عضية. نحن تحاكي الخلل النقل جسيم ميلانيني الوراء عن طريق العلاج الدوائي مع brefeldin A، المستقلب الفطرية التي تمنع نقل الخلايا إلى الوراء. على الرغم من أن الدور الدقيق للبروتينات BBS في عملية النقل غير معروف، يمكن لهذه البروتينات تلعب دورا في الحفاظ على العمارة أنيبيب، تساهم بشكل مباشر في وظيفة أو كفاءة المحركات الجزيئية نفسها، خدمة لتحميل البضائع على المحركات الجزيئية أو تعمل على فصل البضائع من خيوط الأكتين قبل النقل. ومن الممكن أيضا أن بعض الجينات BBS قد تلعب دورا تنظيميا في واحد أو أكثر من هذه العمليات. على سبيل المثال، BBS3 ينتمي إلى فئة من البروتينات التي تنظم مجموعة واسعة من العمليات الخلوية بما في ذلك النقل داخل الخلايا (14).
يتم اعتماد الدور المهيمن للجينات BBS في النقل إلى الوراء بالمقارنة مع وسائل النقل تقدمي عن عيوب معروفة في جسيم ميلانيني التشتت داخل الخلايا لدى البشر والفئران. العيوب المعروفة في نتيجة النقل التقدمي في عدم الإبقاء على التوزيع المحيطي الأجسام الصباغية، مما أدى إلى المهق والشعر تشوهات جزئية اللون (44، 52، 53)، والنتائج غير المرتبطة BBS. كما هو موضح هنا، وليس من المتوقع أن تؤدي إلى لون الشعر أو المهق الظواهر النقل تقدمي سليمة ولكن النقل إلى الوراء معيب. النقل جسيم ميلانيني هو نموذج عام لدراسة النقل داخل الخلايا عضيات والحويصلات. نتائج هذه الدراسة تؤدي إلى استنتاج مفاده أن على الأقل بعض مكونات نتيجة النمط الظاهري BBS من خلل في الحويصلة أحادي الاتجاه والنقل عضية والنقل على وجه التحديد داينين ​​التي تعتمد على قرب نهاية ناقص من الأنابيب الدقيقة. نتائجنا لا يستبعد احتمال وجود تأثير خفية في وسائل النقل تقدمي (22).
إذا BBS تدق هبوطا تستهدف مسار مشترك، فإننا نتوقع أن العيب KV ينبغي ربط بإحكام على عيب جسيم ميلانيني النقل. في الواقع، وفئة لا KV من BBS morphant (سجل قبل 15 HPF) لديه أعظم تأخير في النقل (لوحظ في 120 HPF). وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه العيوب محددة اللذين تم انقاذهم من قبل مقاومة للMO BBS RNA.
RP هو سمة أساسية من BBS ويؤدي إلى العمى في المرضى من البشر. وبالنظر إلى تشكيل أهداب عادية نسبيا ومن ثم الضمور في KV، فإننا نتوقع أن BBS حقن MO الزرد سيكون تطوير شبكية العين العادية ولكن تبين فيما بعد انحطاط مبصرة. ملاحظتنا أن مبصرة الجزء الخارجي التشكل لا ضعف شديد في BBS ضربة قاضية تتفق مع Bbs2، Bbs4 وBbs6 البيانات خروج المغلوب الفئران التي تدلل على تطوير شبكية العين العادية ولكن الموت أفكارك في وقت لاحق من خلايا مستقبلة للضوء (21، 24).
وباختصار، فإن البيانات المقدمة هنا تثبت أن كل الجينات BBS ستة درس ضرورية لتشكيل هيكل مهدبة المعروفة باسم KV. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن وظيفة BBS لا يكون لها دور عام في تفريق أو تطوير الخلايا المهدبة أو لتشكيل أهداب أنفسهم، والأنسجة المهدبة أخرى مثل القناة الهضمية والعين لا تتأثر. ولكن بدلا من ذلك، البيانات المتوفرة لدينا هي داعمة لدور وظيفي من البروتين BBS في الحفاظ على أهداب أو في بقاء بعض الخلايا المهدبة، أو كليهما. ضربة قاضية شاملة لهذه البروتينات في نتائج الزرد في الظواهر بما يتفق مع دور في وظيفة الأهداب، وهذا العمل هو أول من تعرف على وجه التحديد شرطا لوظيفة BBS في وظيفة KV أهداب واللاحقة عيوب تجانب الجهاز. نظهر أيضا أن جميع الجينات BBS درس تلعب دورا في نقل الخلايا، مع تأثير أكثر عمقا في وسائل النقل إلى الوراء. لدينا البيانات يدل على تأخير كبير في نقل الخلايا إلى الوراء الأجسام الصباغية مع ضربة قاضية للتعبير عن كل من البروتينات ستة BBS تشير إلى أن تشارك الجينات BBS في عضية ومحددة غشاء الحويصلة النقل داخل الخلايا. ونقترح أن جميع البروتينات BBS تلعب دورا العام في الاتجار داخل الخلايا إلى الوراء من الحويصلات بغشاء والعضيات وجود خلل في الاتجار داخل الخلايا يؤدي إلى ضعف وفقدان أهداب وفي بعض الحالات، يؤدي في نهاية المطاف إلى الموت من أنواع معينة من الخلايا. فإن الآليات التفصيلية التي عيوب النقل داخل الخلايا تؤدي إلى عناصر محددة من النمط الظاهري BBS تتطلب دراسة إضافية

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #22  
قديم 11-23-2015, 09:49 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بارديه-بيدل الصغيرة GTPase ARL6 (BBS3) وظائف متلازمة المرتبطة في أو بالقرب من بوابة الهدبية وينظم WNT اشارة *

 

http://www.jbc.org/content/285/21/16218.full



ومن المعروف أن عائلة موسعة من metazoan عامل ADP-ribosylation وADP-ribosylation عامل مثل GTPases صغيرة للعب أدوار أساسية في تحوير الوظائف الاتجار الغشاء وهيكل الخلية. هنا، نقدم التركيب البلوري للARL6، والطفرات التي تسبب متلازمة بارديه-بيدل (BBS3)، وتكشف مثل حلقة فريدة من نوعها التعريب في نهاية البعيدة الهيئات القاعدية، على مقربة من ما يسمى بوابة الهدبية حيث الحويصلات تحمل فتيل البضائع الهدبي مع الغشاء. الإفراط في GDP- أو أنواع من ARL6 / BBS3 GTP تخوض في الجسم الحي التأثيرات طول هدب الابتدائي وفرة. كما ينظم ARL6 / BBS3 يشير WNT، طريقا نقل الإشارة التي بالاشتراك مع أهداب في الفقاريات خرجت لتوها. الأهم من ذلك، يتم فقدان هذه الوظيفة في اشارة الى المتغيرات ARL6 تحتوي على الطفرات نقطة BBS المصاحب. من خلال تحديد هيكل متجهة الى GTP ARL6 / BBS3، إلى جانب المقايسات الفنية، ونحن نقدم التفسير الآلي لهذه التعديلات المسببة للأمراض، وهي غيرت النوكليوتيدات ملزمة. وبالتالي النتائج التي توصلنا إليها إنشاء دور لم تكن معروفة سابقا لARL6 / BBS3 في الهدبية الثدييات (ديس) تجميع وإشارات Wnt وتوفير المعلومات الأولى الهيكلية للبروتين BBS.
مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) 4 هو اضطراب البشري غير المتجانسة وراثيا تتميز مجموعة واسعة من الظواهر، بما في ذلك السمنة، وأمراض الكلى المتعدد الكيسات، تنكس الشبكية، polydactyly، والإعاقات الحسية (1، -، 4). وهو يمثل نموذجا للciliopathies، فئة من الاضطرابات الجينية وتقاسم المسببات شيوعا من الجسم القاعدية و / أو اختلال وظيفي أهداب (5، -، 9). أهمية الفسيولوجية للأهداب، والعضيات متحركة و / أو حسية موجودة على معظم أنواع الخلايا الفقاريات، وأكد من قبل عدد متزايد من الأمراض عديد المظاهر التي تنتمي إلى هذه الطبقة، التي بالإضافة إلى BBS تشمل متلازمة Alström ترتبط ارتباطا وثيقا، وكذلك متلازمة ميكل ومتلازمة جوبير، ومتلازمة العليا-لوكن.
فكر مرة واحدة ليكون عضية أثرية، والآن أنشأت امتحرك (الابتدائي) هدب فضلا عن كونها ضرورية لتنبيغ الكيميائية والبصرية، والمحفزات الحسية الميكانيكية، والغشاء مستقبلات رصع به ينسق عدد من أجهزة الطرد المركزي إشارات هامة وضرورية لحيوان فقاري التنمية، بما في ذلك القنفذ، WNT، وPDGFRαα الإشارات (6، 10، -، 12).
يتم تجميعها الهدبية الخيط المحوري القائم على أنيبيب في النهاية البعيدة من الجسم القاعدية، بنية مشتقة من مريكز الأم التي الاحواض في غشاء البلازما قبل تكون الأهداب (13، 14). تقريبا كلها مبنية أهداب وصيانتها من قبل وسائل النقل intraflagellar multiprotein (IFT) الآلية التي تحشد البضائع الهدبية، على سبيل المثال المكونات الهيكلية، والمستقبلات، وجزيئات الإشارة، في عضية عبر كينيسين السيارات تقدمي وينقل المكونات إلى قاعدة عن طريق محرك داينين ​​الوراء (15، -، 18). ويعتقد أن آلية IFT أن ترسو بالقرب من النصائح من الألياف الانتقالية، والتي هي هياكل التكوين معروف أن تشكيل-membered تسعة مجموعة شعاعي تشبه المروحة أن تنضم إلى النهاية البعيدة من الجسم القاعدية لغشاء الهدبية (19، 20) . بالقرب من هذا الموقع، على نحو فعال "بوابة الهدبية،" الاتجار في مرحلة ما بعد جولجي من الشحنات حويصلي متجهة إلى هدب إنهاء الانصهار مع الغشاء. نقل الشحنات التي تطلق في عضية ويمكن بعد ذلك بتسهيل من الآلات IFT (21، -، 23).
ومن المعروف أن عدد قليل من العوامل الخلوية للمشاركة في عملية التحول الوظيفي من الاتجار حويصلي للاتجار الهدبية (24) أو ربما، في عملية عكسية حيث يتم الاتجار مكونات الهدبية من العضية. على الرغم من أن الاتجار الهدبي هو nonvesicular، فإنه يعتمد على IFT مفارز البروتين التي تشترك طبولوجيا بيتا المروحة / الملف اللولبي (والظاهر وظائف) مماثلة لتلك التي معطف البروتينات المرتبطة الحويصلة (23، 25، 26). مجموعتنا اكتشف سابقا عضوا في الأسرة ARF تشبه من GTPases صغيرة، ARL6، التي يمكن أن امتلاك تصور هذه الوظيفة الاتجار. ويرتبط ARL6 مع بارديه-بيدل نوع متلازمة 3 (BBS3) (27، 28)، مما يجعل الوقت الحاضر هو 1 من 14 البروتينات المرتبطة BBS (4). في انواع معينة ايليجانس أهداب الحسية، وقد تبين ARL6 للخضوع IFT (28). وعلاوة على ذلك، والبروتينات ARF الشبيهة، والتي تورط عموما في الاتجار الغشاء وتنظيم العمليات المرتبطة أنيبيب (29، -، 32)، واثنين من أعضاء على الأقل أن المشهودة وظائف الهدبية. orthologues ARL3 من الليشمانيا، C. ترتبط ايليجانس، والفئران مع وظائف أهداب / الهدبية مستقبلة للضوء (33، -، 35)؛ وبالمثل، ARL13B يموضع خصيصا لأهداب في C. ايليجانس، والماوس أنها تشارك في تشكيل هدب والقنفذ الإشارات (34، 36). وجود الحصري لARL6 في الكائنات الحية التي تمتلك الأهداب وارتباطه IFT (28 ول) يشير إلى وجود دور محتمل لهذا GTPase صغير في تنسيق أو تسهيل سد الوظيفي الاتجار intraciliary مع الاتجار حويصلي.
على الرغم من أن جميع البروتينات BBS درس حتى الآن يبدو أن تلعب دورا هاما في أي تهريب البضائع إلى القاعدية الجسم / الجسيم المركزي أو خلال أهداب عبر IFT (2)، ويقترح ARL6 / BBS3 أن يكون لها وظيفة يحتمل أن تكون متميزة عن أن مجموعة أساسية من BBS البروتينات التي تجمع في مجمع، وصفه BBSome (37). وتنشأ هذه الفكرة من هذا الاكتشاف أن BBSome، التي تتكون من بروتين معقد فصل كيميائيا تحتوي على BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، والبروتينات BBS9، لا تشارك في يجزئ مع BBS3 في التدرج السكروز (37). ومن المثير للاهتمام، يتفاعل عنصر واحد من BBSome (BBS1) مع Rabin8، وهو عامل الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP لRAB8 GTPase صغيرة. Rabin8 المشارك يموضع مع BBSome في الجسيم المركزي / الجسم القاعدية ويؤثر على الدراجات النوكليوتيدات من RAB8، الذي يدخل هدب في ولاية محددة GTP لها وضروري لتكون الأهداب (37). كما تبين RAB8 مؤخرا للتفاعل مع Rabaptin5، الذي يموضع في الجسم القاعدية، والزميلة مع البروتين IFT يطلق Elipsa / DYF-11 (38، 39). نظرا للدور راسخة من Rabaptin5 باعتباره المستجيب RAB5 في الإلتقام، واقترح أن هذا Rabaptin5-RAB8-Elipsa / DYF-11 الثلاثي قد توفر التفاعلات الحيوية الوظيفية بين الغشاء الهدبي (أو الحويصلات المرتبطة أهداب) وآلية IFT ( 39). في C. ايليجانس، RAB-5 وعرض نفسه للتركيز في قاعدة الأهداب إلى جانب مجمع المرتبطة الاندوسوم أوائل STAM-ساعة الذي ينظم إزالة polycystin-1 / polycystin-2 البروتين من أهداب (40). كيف BBSome البروتينات، التي هي في حد ذاتها المرتبطة مع كل من الهيئة القاعدية وIFT، المشاركة في هذه العملية الفرز الاتجار الجسم الهدبي القاعدية لا يزال بعيد المنال، ودور BBS3، يحتمل أن تكون متميزة عن مكونات BBSome الأساسية، غير معروف في الوقت الحاضر.
لتسليط الضوء على وظائف الجزيئية والخلوية من ARL6 / BBS3، توصلنا لأول مرة التركيب البلوري للشكل محدد GTP من البروتين البشري. هيكل ARL6 / BBS3 يمثل أول من حلها لBBS أو البروتين IFT ويعرض خصائص فريدة لا توجد في GTPases الصغيرة الأخرى. في تركيبة مع GTP ملزمة المقايسات الفنية، يوضح هيكل كيف احد بقايا الطفرات كشفت في المرضى BBS إلغاء النوكليوتيدات ملزمة وبالتالي وظيفة البروتين. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر الآن أن ARL6 في خلايا الثدييات المهدبة يموضع إلى الهيئات القاعدية النهاية البعيدة، قرب أو على الألياف التي تمر بمرحلة انتقالية، وبالتالي على مقربة من موقع حويصلة لرسو السفن / الانصهار في قاعدة الأهداب. وانسجاما مع دور للARL6 في هذا الموقع التحت خلوية، وتبين لنا أن يعطل وظيفتها الخلوية، عن طريق الإفراط في GDP- أو أشكال غير الساحلية GTP، يؤدي إلى الشذوذ الهدبية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، الزائد الخلوي من النوع البري ARL6 يسبب التنظيم تتكون من إشارات Wnt. الأهم من ذلك، هو لم يلاحظ هذا التأثير مع المتغيرات المسببة للأمراض من ARL6 / BBS3. معا، وتكشف النتائج التي توصلنا إليها أن بروتين BBS ليس مباشرة (أو بإحكام) المرتبطة BBSome يموضع إلى موقع الرواية في المنطقة الجسم القاعدية، حيث يمكن أن تنظم أهداب (ديس) تجميع وربما نتيجة لذلك، الهدبية يشير أحداث لاحقة . ونقترح أن ARL6 / BBS3 قد تؤدي هذا الدور عن طريق تحوير الاتجار الغشاء عند قاعدة العضية الهدبية.

إجراءات تجريبية

الاستنساخ، تعبير البروتين، وتنقية

للدراسات البلورات، وبقايا الأحماض الأمينية 16-186 من ARL6 من استنساخ الثدييات الجينوم مجموعة (الإحداثيات Geneservice AT30-A7) تم تضخيمها من قبل PCR وsubcloned في ناقلات pET28a-LIC (GI: 145307000)، وذلك باستخدام و-فيوجن PCR نظام الاستنساخ (Clontech). تم تحويل بناء إلى سلالة القولونية BL21-CodonPlus (DE3) -RIL (Stratagene)، وكانت تزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في رائع مرق إلى A 600 3.0 باستخدام نظام محتدما LEX. تم تخفيض حمام الماء إلى 15 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستقراء باستخدام 1 م م الآيزوبروبيل 1-ثيو-β- د -galactopyranoside وثم غادرت عند 15 درجة مئوية خلال الليل. حصاد، تم طرد الخلايا، في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 ° C-المجمدة فلاش. ومعلق الكريات الخلايا إذابة من 1.8 لتر من ثقافة في 100 مل من تحلل العازلة (10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.5 متر كلوريد الصوديوم، 5 م م إميدازول) مع 1 م م phenylmethylsulfonyl الفلوريد، و 0.5٪ CHAPS و lysed مع صدر microfluidizer في 20000 رطل مسح طاف من خلال عمود تبادل أنيون DE52 (هتما) معايرتها قبل مع تحلل العازلة ومن ثم تحميلها على 5 مل HisTrap HP (GE للرعاية الصحية) عمود أيضا قبل معايرتها مع العازلة تحلل. ومزال البروتين الهدف مع التدرج إميدازول 50-500 م م في 50 مل. تم جمع الكسور بروتين مزال، تجميع، وتنقيته من خلال تبني الترشيح هلام (Superdex 75) العمود معايرتها قبل مع العازلة التي تحتوي على 20 م م HEPES، ودرجة الحموضة 8.0، 500 م م كلوريد الصوديوم، و 1 م م dithiothreitol. تم تعديل الكسور البروتين التي تم جمعها لاحتواء 5 م م MgCl 2 ثم حضنت مع 5 × بروتين تركيز المولية من الناتج المحلي الإجمالي لمدة 1 ساعة. ثم تركزت البروتين باستخدام الترا Amicon 15 فلتر الطرد المركزي لتركيز النهائي من 79.2 ملغ / مل. كان البروتين النقي كتلة من 21،354.8 دا.
بلورة وتحديد الهيكل التنظيمي

وقد نمت بلورات الانعراج باستخدام يجلس انخفاض التبخر في درجة حرارة الغرفة. احتوى المحلول الام 2 م (NH 4) 2 SO 4، 0،2 م كلوريد الصوديوم، 0.1 م كاكوديلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.5. يبدو الكريستال ركوب بعد 2 أيام. تم جمع البيانات حيود في النحاس الدورية مصدر الأنود (RIGAKU FR-E) ومعالجتها باستخدام HKL2000 (41) برمجيات. تم إجراء استبدال الجزيئي باستخدام PHASER البرنامج (42) مع فرقة من الهياكل اثنين (رموز PDB 1ZD9 و2H16) كنموذج البحث. تم بناء نموذج ARL6 الأولي تلقائيا في ARP / السدى (43)، تليها عدة جولات من ضبط النفس تنسيق وعامل درجة الحرارة التحسينات في REFMAC (44)، والمصادقة الهندسة في MOLPROBITY (45 الخادم)، ودليل التكيف في الطير المائي (46). وتلخيص البيانات الحيود والإحصاءات نموذج في الجدول 1. وقد تم إيداع الإحداثيات وعامل سعة هيكل في PDB كرمز 2H57 (47).
GTP ملزم الفحص

البرية من نوع الإنسان العاقل ARL6 كدنا] (بنك الجينات TM عدد الانضمام NM_032146 تم استنساخ) في pRSET-6A (48). وقد أعدت كل المسوخ ARL6 بطريقة الطفرات موقع الموجه المعدلة المعروفة باسم SLIM (49). للحصول على البروتين GST الموسومة، تم استنساخ كامل طول ARL6 إلى pGEX-6P-1 (أمرشام العلوم البيولوجية).
واستخدمت BL21 (DE3) خلايا pLysS للتعبير عن غير محدد (pRSET) أو الموسومة GST (pGEX) من النوع البري وARL6 متحولة. تحولت E. وكانت القولونية الخلايا المستزرعة في 50 مل من مرق LB التي تحتوي على 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين عند 37 درجة مئوية حتى A 600 = 0.6. استميلت الثقافات مع 0.4 م م الآيزوبروبيل 1-ثيو-β- بين عشية وضحاها -galactopyranoside د في درجة حرارة الغرفة. إلى الحصاد، ومكعبات الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 5000 × ز لمدة 10 دقيقة، وعلقت في غسل العازلة (50 م م ناه 2 PO 4، 2 م م dithiothreitol، 0.3٪ توين 20، 4 μ م ATP)، و lysed صوتنة. تم فصل الأجزاء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 20000 × ز لمدة 10 دقيقة. وقد أجريت فحوصات ملزمة GTP كما هو موضح سابقا (50، 51). لفحص الكسر القابلة للذوبان، ورصدت 10 ميكرولتر من المحللة على غشاء النيتروسليلوز، الذي تم غسلها بعد ذلك في غسل العازلة وسمح لاحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة العازلة في ملزمة (50 م م ناه 2 PO 4، 2 م م dithiothreitol، 0.3٪ توين 20، 4 μ م ATP، 2.5 م م MgCl 2) مع 2 μCi من GTP / مل. التالي ملزمة، وتشطف الغشاء في غسل العازلة ويتعرض لتصوير أو شاشة الفوسفور. لفحص جزء بيليه، علقت البروتين في Laemmli عينة العازلة ومفصولة SDS-PAGE. وغارقة هلام في 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، مع 20٪ الجلسرين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونقل السائل على نتروسليلوز. وقد تم TLC كما هو موضح سابقا (50).
زراعة الخلايا الثديية

النسر الأساسية الدنيا والمتوسطة (إينفيتروجن كان يستخدم) للحفاظ على HEK-293 الخلايا، و1: خليط 1 من المعدل المتوسط ​​Dulbecco والنسر وهام في F-12 المتوسطة (إينفيتروجن كانت تستخدم) لزراعة الخلايا IMCD3 وhTERT-RPE. واستكملت كلا النوعين من وسائل الإعلام مع 10٪ مصل بقري جنيني، وكانت تزرع جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. لعلاج المخدرات، علقت نوكودازول في DMSO وتستخدم بتركيز نهائي من 0،1 ميكروغرام / مل لمدة 1 ساعة أو طوال الليل. كان MYC -tagged بناء P50 dynamitin التعبير هدية عينية من ريتشارد فالي (جامعة كولومبيا) وكان transfected في الخلايا IMCD3 باستخدام Lipofectamine2000 (إينفيتروجن) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وكذلك كل البنى الأخرى المستخدمة.
مناعية ومضان المجهر

لجميع التجارب مناعية، كانت تزرع الخلايا على coverslips الزجاج وتشطف مع الفوسفات مخزنة المالحة قبل التثبيت. تم إصلاح الخلايا إما عن طريق الحضانة 10 دقيقة في -20 درجة مئوية الميثانول، تليها الإماهة 10 دقيقة في TBS-T (20 م م تريس قاعدة، ودرجة الحموضة 7.5، 150 م م كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20)، أو عن طريق تثبيت 30 دقيقة مع 2٪ امتصاص العرق في PHEM (0.05 م أنابيب، 0.025 م HEPES، 0.01 م EGTA، 0.01 م MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.2)، تليها استخراج 2-مين مع 0.1٪ تريتون X-100 في PHEM. بعد التثبيت، وخلايا منعت إما لمدة 1 ساعة في TBS-T تستكمل مع 1٪ البقري ألبومين المصل قبل الحضانة الأجسام المضادة الأولية أو المحتضنة مباشرة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة مخففة في TBS-T. ثم تم غسلها الخلايا في TBS-T وحضنت 60 دقيقة أخرى في الضد الثانوية المناسب. تم counterstained نوى التي يحتضنها coverslips الزجاج في 100 ن م 4، 6-diamidino-2-phenylindole لمدة 5 دقائق في TBS-T في درجة حرارة الغرفة. وقد شنت الشرائح في إطالة مكافحة تتلاشى كاشف (المسابر الجزيئية) والتي لاحظها مضان المجهر باستخدام epifluorescence القياسي، لايكا LSM 410 مبائر، أو لايكا TCS أنظمة المجهر SP متحد البؤر. أجريت مناعي المجهري متحد البؤر الرقمي وdeconvolution كما هو موضح سابقا (52).
تم تنفيذ المناعية للأنسجة الخصية الماوس على الماوس جزءا لا يتجزأ من أكتوبر وسريعة المجمدة قبل باجتزاء. تم الحصول على أقسام الكلى الماوس من INOVA تشخيص، سان دييغو (الكتالوج رقم 508385)، والتي تم الحصول عليها قرد أقسام الدماغ من ميديكا، إنسينيتاس، CA (الكتالوج رقم 0608-BR). وقد أجريت تلطيخ والتصوير كما هو موضح أعلاه لخلايا ثقافة أنسجة الثدييات.
وتشمل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في مناعية مضادة للARL6C ومضادة للARL6N (Abgent)، ومكافحة γ تويولين (سيغما)، ومكافحة الأسيتيل تويولين (سيغما)، ومكافحة α تويولين (سيغما)، ومكافحة PCM1 (هدية من الدكتور أندرياس Merdes، جامعة ادنبره). وتشمل الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة الأرنب والفأر مفتش مترافق مع فلور اليكسا 488 و 594 (المسابر الجزيئية).
تحاليل احصائية

تم حساب الاختلافات في طول أهداب باستخدام ر اختبار الطالب، في حين تم حساب الاختلافات في النسبة المئوية للخلايا مع أهداب باستخدام اختبار χ 2.
WNT luciferase المراسل فحوصات

خلايا كلوة-293T معربا عن ثابت مراسل pTOPflash (53 كانت المصنفة) والخلايا hTERT-RPE في مناطق ذات كثافة من 10 4 خلايا لكل بئر في لوحة 24-جيدا. بعد 24 ساعة، و transfected الخلايا مع ما مجموعه 1 ميكروغرام من الحمض النووي (Renilla السيطرة luciferase المراسل، البلازميد من الاهتمام، ومراسل pTOPflash البلازميد عند الضرورة) باستخدام FuGENE 6 (روش العلوم التطبيقية) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم استنساخ BBS3 من النوع البري وأليل متحولة إلى pCMV وpcDNA 6.2 بروتين الفلورية الخضراء العمود الفقري واختبارها مع ناقلات الرقابة المناسبة على التوالي. وقد حفز الخلايا مع Wnt3a المتوسطة مكيفة (54) 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن وتحصد 24 ساعة بعد التحفيز. تم قياس luciferase النشاط باستخدام طقم المزدوج luciferase المراسل مراسل الفحص (PROMEGA) على TECAN Genios برو luminometer وBMG LABTECH FLUOstar أوميغا لوحة القارئ.

النتائج

هيكل الكريستال من ARL6 يعرض خصائص فريدة من نوعها، ويقترح إلغاؤها النكليوتيد ملزم للالممرضة المتغيرات

لإلقاء الضوء على وظيفة الجزيئية للARL6 / BBS3 وتسهيل الدراسات هيكل وظيفة، توصلنا إلى هيكل عالية الدقة من هذا GTPase صغير. باستخدام طريقة الجلوس انخفاض التبخر القياسية، حصلنا على بلورات الانعراج على ما يصل الى 2 قرار Å لشكل اقتطاع N-محطة من ARL6 (بقايا 16-186) في ولاية محددة GTP (ARL6-GTP) (الجدول 1). ثم تم حلها البنية البلورية للبروتين عن طريق استبدال الجزيئي، كما هو موضح في إطار "إجراءات تجريبية".

الجدول 1
بيانات حيود والإحصاءات نموذج البلورات
rmsd، جذر متوسط ​​الانحراف مربع.

هيكل مجمع ARL6-BBS3-GTP يظهر GTPase نموذجي أضعاف مع ورقة β المركزية الذين تقطعت بهم السبل ستة تحيط بها خمس سنوات اللوالب ألفا (الشكل 1 A)، لكنه يختلف عن معظم GTPases الصغيرة التي يتحلل عادة GTP المربوطة وغالبا ما توجد في ولاية محددة الناتج المحلي الإجمالي. وعلى الرغم من التشابه بين ARL6-GTP إلى أخرى رأس GTPases الصغيرة الفصيلة في ولايات محددة التماثلية GTP أو GTP nonhydrolyzable، بما في ذلك التشكل من خمس الحفاظ G-مربع (G1-5) تسلسل (55)، وثلاثة عناصر الهيكلية للARL6-GTP ، لا سيما في التبديل الأول، التبديل الثاني، والمناطق interswitch، وأظهرت الخلافات بتكوين مثيرة من ذلك من ARF1 في ولاية محددة الناتج المحلي الإجمالي (ARF1 الناتج المحلي الإجمالي) (الشكل 1 B). اعتمدت منطقة التبديل لي التشكل الموسعة غير النظامية التي تنسجم مع التقيد GTP ولم تشكل β حبلا إلى الزوج مع β3 كما هو الحال في ARF1 الناتج المحلي الإجمالي (الشكل 1 B). المنطقة I التحول من ARL6 هي اثنين من مخلفات أطول من أعضاء نموذجي آخرين من العائلة ARF، وتشكيل 3 10 -helix في بقايا 40-42 (الشكل 1 B). مجموعة أميد من الغليسين-72 في منطقة التبديل II تشكل السندات الهيدروجين مع مجموعة γ-فوسفات GTP ويتم نقل بزيادة 7.5 Å بالمقارنة مع المقابلة بقايا الغليسين-70 من ARF1 الناتج المحلي الإجمالي (الشكل 1 C)؛ هذا التغيير مهم المحتمل للربط تفضيلية من GTP. في المطابقة لحركة بقايا التبديل الثاني الغليسين-72، وβ-دبوس الشعر من المنطقة interswitch (خيوط β2-β3) ويمتد ومعرضة للمذيب (56). ومن المثير للاهتمام، ARL6 هو العضو الوحيد في GTPases أسرة المنتدى والصغيرة التي لديها سيرين (بقايا سر-71) في المركز الثاني من X عزر D XX G للتبديل المنطقة الثانية؛ كل GTPases ARF الشبيهة الأخرى لديها الجلايسين في نفس الموقف (57). اقترحت مجموعة الهيدروكسيل سلسلة من الجانب سر-71 سندات أشكال الهيدروجين مع مجموعة أميد من GLN-73 وجزيء الماء لمهاجمة جماعة γ الفوسفات من GTP خلال التحلل (الشكل 2 A). وتمشيا مع انخفاض درجة الحرارة عامل توزيع ARL6-GTP (الشكل 1 D)، وهذه الروابط الهيدروجينية إضافية تجعل الشبكة بالكامل التفاعل التي تنطوي على المغنيسيوم 2+ وGTP، وخصوصا التبديل الأول والتبديل II المناطق، أكثر جمودا مقارنة GTP- الآخر GTPases المنتدى الاقليمى للاسيان ملزمة. من ناحية أخرى، وحلقة ربط β2 وβ3 أكثر مرونة مقارنة GTPases ARF الأخرى (الشكل 1 D).

الشكل 1.
التركيب البلوري للARL6 / BBS3 GTPase صغير. A، تمثيل اسطوانة من هيكل ARL6 في شكل محدد GTP لها. يتم تلوين عناصر الهيكل التي تخضع لتغييرات جوهرية على دورة النقد الناتج المحلي الإجمالي / GTP الأرجواني لتبديل I، II الأزرق للتبديل، والأحمر للinterswitch. يتم عرض حلقة P باللون الأصفر، ويظهر GTP ملزمة في التمثيل عصا. B، مقارنة بنية محددة GTP ARL6 GTPase (رمز PDB 2H57) مع الالتزام الناتج المحلي الإجمالي كامل طول ARF1 GTPase (PDB كود 1HUR). عناصر الهيكل التي تمر بمرحلة تغير التشكل الأساسي في دورة الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP، والتبديل الأول، التبديل الثاني، وinterswitch، واللون الأرجواني، والأزرق، والأحمر للARL6 والسماوي والأزرق البنفسجي، والشوكولاته الأحمر في ARF1. يتم عرض جميع عناصر البنية الثانوية الأخرى من ARL6 في الشريط (القمح)، على الرغم من ARF1 يظهر فقط Cα التتبع (الخضراء). C، تغيير متعلق بتكوين الرئيسي في المنطقة التبديل الثاني عند تغيير الدول النوكليوتيدات المربوطة بين ARL6 (محددة GTP) و ARF1 (متجهة إلى الناتج المحلي الإجمالي). نظام الألوان هو نفسه كما هو الحال في A. 70 الغليسين من ARF1 تظهر ذرات Cα من الغليسين-72 من ARL6 والمقابلة كما المجالات. D، والمرونة التشكل الإقليمية محددة GTP ARF1 (يسار، PDB كود 1O3Y) مقارنة مع تلك التي منضم GTP ARL6 (رمز PDB الصحيح 2H57). يتم تلوين شرائط وفقا لB -factor قريب من ذرات Cα، حيث يتم تلوين ذرات Cα مع أعلى B -factor الأحمر، ويتم تلوين ذرات Cα مع أدنى B -factor الأزرق.


الشكل 2.
التركيب البلوري للARL6 / BBS3 يسلط الضوء على الإمراضية من المتغيرات وجدت في المرضى الذين يعانون BBS. A، عرض ستيريو شبكة التفاعل حول موقع نشط من GTPase صغير ARL6. وتظهر جزيئات الماء في 2+ أيون الأزرق والمغنيسيوم في البرتقال. وتظهر التفاعلات القطبية تتعامل مع الهجوم على جزيء الماء وسر-71 تقدم اللاعب خطوط حمراء. بقايا الثريونين-31، تحور الذي يسبب BBS، هو المسمى في أرجواني. B، عرض ستيريو لشبكة الرابطة الهيدروجينية حول صناديق G4 و G5 وكذلك الغليسين-169 من ARL6. وتظهر السلاسل الجانبية ذات الصلة ARL6 في التمثيل العصا، وتظهر العصي لGTP مع دائرة نصف قطرها أرق. وصفت الروابط الهيدروجينية التي تنطوي على جزيء GTP كخطوط متقطع السوداء. وصفت الروابط الهيدروجينية التي تنطوي على الغليسين-169 باللون الأحمر، والسندات الآخرين الهيدروجين التي تنطوي على بقايا لG4 و G5 هي باللون الأصفر. C، الأساسية مسعور حول لوي-170 من ARL6. وتظهر السلاسل الجانبية من لوي-37، إيل 33، الفنيل ألانين-128، ولوي-170 كما المجالات.

حل التركيب البلوري للARL6 / BBS3 وليس فقط سمح لنا لتوصيف بنية البروتين من النوع البري، ولكنها قدمت أفكارا بالحالة المرضية للبدائل حمض أميني واحد (T31M، T31R، G169A، وL170W) لدينا وذكرت المجموعة أن تسبب BBS في المرضى (28). عدة مجموعات الأميد في مربع G1 (GX4GKT)، المعروف أيضا باسم P-حلقة، وتشكل روابط هيدروجينية الحاسمة مع triphosphates من النوكليوتيدات GTP. على وجه الخصوص، تساهم المجموعة سلسلة الهيدروكسيل منتدى المجالس الرومانسية-31 الجانب للتنسيق من المغنيسيوم 2+، β- وγ الفوسفات من GTP، جزيء الماء مجانا، وجزيء الماء سد لآسيا والمحيط الهادئ-69، عن أهمية حاسمة للنشاط GTPase من ARL6 (الشكل 2 A). فمن الممكن أن تحور منتدى المجالس الرومانسية-31 إلى أرجينين يوفر بقايا الحفازة اللازمة في رابطة الدول المستقلة، وبالتالي يزيد من نشاط GTPase من ARL6. بدلا من ذلك، تحور منتدى المجالس الرومانسية-31 إلى الميثيونين قد تعيق ملزم من المغنيسيوم 2+ وγ-الفوسفات بسبب طبيعة مسعور من سلسلة الجانب الميثيونين. تم العثور على طفرة من بقايا الغليسين-169 إلى ألانين في بارديه-بيدل متلازمة 3 مرضى. بقايا الغليسين-169 تقع ضمن مربع G5 الحفظ (بقايا 162-165)، الذي يربط ليس فقط في حلقة جوانين GTP مباشرة ولكن أيضا تشكل شبكة الهيدروجين الترابط مع مخلفات مربع G4 والمخلفات التالية مربع G5. وتساهم هذه السندات الهيدروجين لتحقيق الاستقرار في النوكليوتيدات المربوطة (الشكل 2 B). ومن المثير للاهتمام، وبقايا الغليسين-169 يساهم في هذه الشبكة الرابطة الهيدروجينية، وتشكيل روابط هيدروجينية مع حمض الغلوتاميك-172 والغليسين-173 (الشكل 2 B). وأخيرا، تم العثور على بقايا لوي-170 لتكون جزءا من نواة مسعور مع سلاسل جانب إيل-33 ولوي-37 (الشكل 2 C). سوف تحور في بقايا لوي-170 إلى التربتوفان المرجح يعطل التعبئة والتغليف لهذه النواة مسعور وزعزعة استقرار البروتين.
ولذلك، التحليلات البنيوية لدينا ويتوقع أن الثريونين-31 الطفرات من المحتمل أن تؤثر على وجه التحديد النوكليوتيدات ملزمة، في حين توقع الغليسين-169 ولوي-170 الطفرات تؤثر في المقام الأول طي البروتين، مما أدى إلى عدم القدرة على ربط النوكليوتيدات والتحلل بواسطة الخلية الآلات. علاوة على ذلك، توقع كل الطفرات أن يؤدي إلى خسارة من وظيفة.
الإمراض ARL6 المتغيرات العرض المتغير النكليوتيد العيوب التجليد

للتحقق من صحة تجريبيا البيانات البلورات، أجرينا فحوصات ملزمة النوكليوتيدات على البروتينات المؤتلف ARL6. تم اختبار من النوع البري ومتحولة البروتينات ARL6 الموسومة GST في المقايسات نقطة وصمة عار للربط إلى [α- 32 P] GTP، وذلك باستخدام GST وحدها كوسيلة لمراقبة سلبية. كما هو الحال مع GST وحده، وARL6 الموسومة GST (T31M) وARL6 (G169A) المسوخ عرض ضئيلة أو معدومة ملزمة بالمقارنة مع من النوع البري ARL6، في حين أن ARL6 (T31R) متحولة ملزمة مستويات أعلى بكثير من النوكليوتيدات (التكميلي الشكل 1 ، A-C). على الرغم من أن [α- 32 P] تم استخدام GTP، وكمية صغيرة من [α- 32 P] الناتج المحلي الإجمالي موجود في قارورة المصدر. لذلك، لتحديد طبيعة النوكليوتيدات المربوطة، قدمنا ​​أيضا المتغيرات الموسومة ب [γ- 32 P] GTP، وفي هذه الحالة فقط من النوع البري ARL6 عرض النشاط ملزم النوكليوتيدات فوق ضبط GST حدها (التكميلي الشكل 1 D ). على الرغم من أن هذه النتائج قابلة للمقارنة مع تلك التي نشرت مؤخرا من قبل كوباياشي وآخرون (57)، الذي كان FLAG- أو البروتينات الموسومة GST، فمن المعروف أن GTPases الصغيرة غالبا ما تكون حساسة لإضافة الترميز المنطقة في اجتماعهم N أو C محطة و أن هذا يمكن أن تتداخل مع الاستقرار و / أو وظائفهم. لهذا السبب، نحن كما نفذت الدراسات التي تستخدم إصدارات لازال من النوع البري والبروتينات ARL6 متحولة (الشكل 3، A و B). وعلى غرار النتائج المقدمة أعلاه، ARL6 (T31M)، ARL6 (G169A)، وARL6 (L170W) المسوخ أظهرت ضئيلة أو معدومة ملزمة من النوكليوتيدات الموجودة في [α- 32 P] خليط GTP، في مقابل ARL6 (T31R) ، الذي عرض تقارب أعلى بكثير لالنوكليوتيدات (الشكل 3، C وF). وبعد ذلك تستخدم TLC لتحديد طبيعة النوكليوتيدات المسمى بد أن ARL6. أظهرت النتائج أنه على الرغم من النوع البري ARL6 لا بد في المقام الأول إلى GTP، ARL6 (T31R) يبدو المنضم بدقة إلى الناتج المحلي الإجمالي (الشكل 3 D). وبالتالي تظهر لدينا البلورات والبيوكيميائية النتائج مجتمعة أن كل من الخيارين ARL6 المسببة للأمراض يفترض، في الشكل الذي سيكون موجودا في المرضى (أي غير محدد)، عرض ألغى النوكليوتيدات ملزم، مع ضئيلة أو معدومة ملزمة في حالة ARL6 (T31M)، ARL6 (G169A)، وARL6 (L170W) وعلى سبيل الحصر في الناتج المحلي الإجمالي في حالة ARL6 (T31R) (الشكل 3 F).

الشكل 3.
BBS3 المتغيرات المسببة للأمراض تمتلك تلغى الأنشطة ملزمة النوكليوتيدات. A، Coomassie الملطخة جل SDS يظهر تحريض GST وحدها، غير محدد النوع البري ARL6، وT31M، T31R، وG169A المتغيرات ARL6. B، Coomassie الملون جل SDS-بولكرلميد يظهر على وقد رصدت نسبة من إجمالي المحللة خلية (T) التي لا تزال في جزء قابل للذوبان (S) لعينات من A بعد 3-ح الاستقراء. C، قسامة من الكسور القابلة للذوبان من B على نتروسليلوز وبحث مع [α- 32 P] GTP. GST، سيطرة سلبية، لا يلزم النوكليوتيدات، في حين ARL6 يربط. ARL6 (T31R) يربط أكثر بكثير من النوع البري ARL6، وT31M وG169A المتغيرات ربط ضعيف جدا. D، TLC تبين طبيعة النوكليوتيدات رديولبلد بد أن للذوبان ARL6 أو البديل أشكال ازال من ARL6. من النوع البري (غير محدد) ARL6 يربط كل من الناتج المحلي الإجمالي وGTP، ولكن المسوخ لازال (T31M وT31R) ربط أساسا الناتج المحلي الإجمالي. E، Coomassie الملطخة SDS هلام تظهر الكسور بيليه من النوع البري والبديل أشكال (T31M، T31R، G169A، L170W ) من البروتين ARL6، بفعل مماثل إلى A في تجربة منفصلة. F، كما هو الحال مع E إلا أنه بعد SDS-PAGE تم تحويل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز، سمح لإعادة أضعاف، وبحث مع [α- 32 P] GTP .
ARL6 يموضع إلى هيكل حلقة تشبه في القاصي نهاية الهيئات القاعدية في خلايا مهدبة

حتى الآن، تم العثور على جميع البروتينات BBS الثدييات درس في توطين إما في الجسيم المركزي / الجسم القاعدية أو في الأقمار الصناعية مريكزي المجاورة، التي تمثل مواقع رئيسية للبروتينات ذات دور الهدبية. على وجه التحديد، BBS2، BBS5، وBBS13 / MKS1 شارك في توطين مع الجسيم المركزي / القاعدية علامة الجسم γ تويولين (38، 58، -، 60)؛ BBS4، BBS8، وBBS14 / CEP290 شارك في توطين مع PCM1 في الأقمار الصناعية مريكزي (61، -، 63)؛ ويوجد BBS6 داخل أنبوب المحيطة centrioles المادية محيط بالمريكز (64). لدهشتنا، واثنين من الدراسات السابقة المتمركزة الأخضر الفلورسنت ARL6 البروتين الموسومة وهيماغلوتينين الموسومة في جولجي (65) أو في العصارة الخلوية (66) من خلايا nonciliated، على التوالي. لذا سعينا لتحديد توطين التحت خلوية من ARL6 الذاتية في خط خلايا مهدبة.
لإجراء تجارب مناعية لدينا، نحن العاملين الأجسام المضادة الموجهة ضد N- والحواتم C-الطرفية من ARL6 الإنسان (المسمى ARL6N وARL6C، على التوالي). من خلال تحليل لطخة غربية، سواء الاعتراف ARL6 لكن ليس البروتين ARF6 ترتبط ارتباطا وثيقا، وتستخدم كعنصر تحكم للخصوصية (الشكل التكميلي. 2).في الماوس النخاع جمع الخلايا الظهارية اصق (IMCD3)، وهما أضداد ARL6 وصمة عار على وجه التحديد نقاط وهما شبه النووية التي شاركت في توطين مع علامة centrosomal γ تويولين (الشكل 4، A وB). ويمكن ملاحظة إشارة ARL6 في centrosomes طوال دورة الخلية، مما يشير إلى وجود ارتباط محددة مع ديناميكية مركز أنيبيب المنظمة. في الطور البيني الخلايا، ارتبط ARL6 مع الجسم القاعدية، الذي الرياضية هدب أن يتم الكشف عن استخدام أجسام مضادة ضد تويولين الأسيتيل (الشكل 4 B). أكدنا على centrosomal / القاعدية توطين جثة ARL6 في خط خلايا مهدبة الثاني، الخلايا الظهارية الصباغية وهي الشبكية (hTERT-RPE) (الشكل 5). الأهم من ذلك، نحن أيضا لاحظ شارك في توطين ARL6 مع الهيئات القاعدية في عدة أقسام أنسجة الثدييات مهدبة، بما في ذلك الخصية والمخ والكلى (التكميلي الشكل 3، A-C). تظهر هذه البيانات التي الزميلة ARL6 / BBS3 مع الهياكل مريكزي / الهيئات القاعدية في مجموعة متنوعة من الخلايا المهدبة في الجسم الحي.

الشكل (4).
ARL6 هو حسن النية / القاعدية البروتين المرتبط الجسم centrosomal أن يموضع بشكل مستقل عن الشبكة أنيبيب أو المحرك الجزيئي داينين. A، ARL6 الذاتية، لاحظ باستخدام الأجسام المضادة ARL6C (الحمراء) في الخلايا IMCD3 مهدبة، لوحظ في نقاط وشبه النووية أن شارك في توطين مع γ تويولين (الخضراء)، وcentrosomal / القاعدية علامة الجسم (الصفراء في الصورة المدمجة). أقحم، 2 × التكبير من المنطقة الموضحة. اتسخت DNA الأزرق مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole. النصال أشر إلى ARL6 توطين لcentrosomes. B، ARL6 الذاتية (تصور باستخدام الأجسام المضادة ARL6N في الخلايا IMCD3؛ أحمر) لا يزال يرتبط مع الجسيم المركزي (ملحوظ باستخدام الأجسام المضادة ضد γ تويولين؛ الأخضر) في جميع مراحل دورة الخلية (الصفراء إشارة في الصورة المدمجة). لاحظ أن الخلية البيني ومهدبة (ملطخة الأجسام المضادة ضد الأسيتيل (ACET) تويولين؛ الأخضر). C والعلاج نوكودازول، ولكن ليس العلاج التحكم (DMSO)، إما 1 ساعة أو بين عشية وضحاها (O / N)، غير كافية ل تدمير شبكة أنيبيب في الخلايا IMCD3 يعاير كل α تويولين تلطيخ (الأخضر)، لكنه لا يملك أي تأثير على ARL6 (الأحمر) الترجمة. النصال أشر إلى ARL6 المترجمة إلى centrosomes في الخلايا تعامل مع بين عشية وضحاها نوكودازول. D، وتثبيط المحرك الجزيئي ويتحقق داينين ​​من خلال overexpression من الأخضر الفلورسنت الموسومة البروتين P50-dynamitin (الأخضر) الذي أبداه القدرة على mislocalize PCM1 (اللوحة اليمنى)، وهو بروتين المعروف أن تعتمد على داينين ​​للتوطين في centrosomal (لاحظ تلطيخ المشتتين في الخلايا معربا P50-dynamitin مقارنة مع الخلايا لا تعبر عن المانع داينين). ARL6 (اللوحة اليسرى لم يتم mislocalized) عندما هى overexpressed P50 dynamitin. النصال تشير إلى توطين السليم للARL6 في الخلايا معربا عن P50-dynamitin.


الشكل 5.
ARL6 يموضع في النهاية البعيدة من الجسم القاعدية في نمط على شكل حلقة. A، مناعية باستخدام الأجسام المضادة ARL6C يظهر ARL6 توطين إلى النهاية البعيدة من centrioles الأم والهيئات القاعدية في الخلايا hTERT-RPE. أقحم، صورة مكبرة للاختيار المنطقة. B والصور المجهري متحد البؤر باستخدام الأجسام المضادة ARL6N في الخلايا hTERT-RPE يدل على أن ARL6 يموضع في نمط يشبه عصابة، تماما البعيدة إلى centrioles الأم، في الخلايا nonciliated والمهدبة.

على غرار BBS6 (64)، ولكن على عكس BBS4 ومن البروتين التفاعل PCM1 (63)، وتوطين ARL6 إلى الجسيم المركزي / الجسم القاعدية هو-أنيبيب مستقل، وعلاج الخلايا IMCD3 مع أنيبيب depolymerizing نوكودازول المخدرات لا يؤثر هذا التعريب (الشكل 4 C). وعلاوة على ذلك، فإن توطين ARL6 هو أيضا يتأثر في الخلايا حيث تعطلت داينين ​​السيارات إلى الوراء من قبل overexpression من P50-dynamitin (الشكل 4 D). معا، وهذه النتائج تدعم بقوة فكرة أن ARL6 الذاتية / البروتين BBS3 هو حسن النية البروتين المرتبط مريكز التي هي موجودة في أنيبيب تنظيم مركز في تقسيم الخلايا وفي الجسم القاعدية في الخلايا المهدبة، في microtubule- وdynein- بطريقة مستقلة.
بهدف تحديد بدقة موقف ARL6 داخل الجسم القاعدية، أجرينا التصوير متحد البؤر على الخلايا hTERT-RPE ملطخة الأجسام المضادة على حد سواء المضادة للARL6. ومن المثير للاهتمام، تم العثور على بروتين ARL6 إلى التركز في نهاية واحدة من الهيكل القائم على أنيبيب. على وجه التحديد، والخلايا البيني تفتقر إلى هدب في وقت تظهر تثبيت ARL6 توطين في نمط تشبه الحلبة في نهاية البعيدة للمريكز واحد فقط، من المفترض ان مريكز الأم. للخلايا التي لا تمتلك هدب، يتم وضع حلقة من ARL6 مماثل، وتحديدا عند تقاطع بين الجسم القاعدية والخيط المحوري الهدبية (الشكل 5، A وB). هذه النتائج تشير إلى أن ARL6، وهي ليست موجودة في مجمع BBSome (37)، وتعمل ضمن منطقة متميزة وفريدة من نوعها من الجسم القاعدية مقارنة مع جميع البروتينات BBS مدروسة الأخرى. توطين موضوعه متفقا مع كونها قريبة أو في الألياف الانتقالية، التي تشكل جزءا من ما يسمى بوابة الهدبية.
التعبير عن نوع البرية وARL6 سلبي مهيمن / BBS3 المتغيرات النتائج في سيليا العيوب

اقترح توطين فريد من ARL6 الثدييات / BBS3 في قاعدة أهداب أن هذا GTPase صغيرة تمتلك دورا في تشكيل هدب في خلايا الثدييات، وربما عن طريق الاتجار الغشاء الهدبي. لتحقيق هذا الاحتمال، اتخذنا الاستفادة من حقيقة أن الإفراط في GTPase صغير أشكال متحولة غالبا ما تستخدم لتحقيقاتها في الجسم الحي وظائف (67). مصادفة، والطفرات المقابلة لبقايا الثريونين-31، التي وجدناها سابقا في ولاية متماثل في المرضى الذين يعانون BBS (28) ويؤدي إلى بروتين غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي (الشكل 3 D)، ويشيع استخدام كأشكال السلبية المهيمنة. ولذلك نحن على استعداد لبناء التعبير الثدييات لARL6 (T31R)، وكذلك تحمل طفرة آخر واحد من الأحماض الأمينية في GLN-73، وتوقع أن تسفر عن والشكل غير الساحلية GTP نشط بشكل جوهري من البروتين (68). وإن كان في معظم الحالات أشكال غير الساحلية GTP خلق GTPases صغيرة نشطة بشكل جوهري، في بعض الحالات يبدو أن هذا هو ركوب الدراجات من النوكليوتيدات ما هو ضروري من أجل وظيفة البروتين. في تلك الحالات، وشكل غير الساحلية GTP يتصرف أشبه سلبية المهيمنة، يشبه إلى حد كبير شكل غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي، كما هو الحال بالنسبة لشكل غير الساحلية GTP من ARL6 (انظر أدناه). ومن المثير للاهتمام، وشكل غير الساحلية GTP من ARF6 (Q67L)، والذي يحدث أيضا أن تكون GTPase صغيرة المنتدى الاقليمى للاسيان وفقا لأعلى درجة من الهوية إلى ARL6، يعرض أيضا هذه الخاصية (69، -، 71).
الإفراط في البرية من نوع ARL6، أو أي من المتغيرات، لم ARL6 (T31R) أو ARL6 (Q73L)، في الخلايا hTERT-RPE لا يؤدي إلى تغييرات ملموسة على الانقسام، أنيبيب الهيكل الخلوي، أو مورفولوجيا الخلايا مقارنة بالمجموعة الضابطة ( لا تظهر البيانات). ومع ذلك، باستخدام تويولين الأسيتيل كعلامة للأهداب، لاحظنا نسبة أعلى بكثير من الخلايا التي تملك أهداب في تلك مع transfected إما ARL6 (T31R) أو ARL6 (Q73L) بنيات overexpression بالمقارنة مع الخلايا السيطرة (41.5 ± 3.5 و 54.5 ± 6.5٪ مقابل 25 ± 4٪، ع <0.001 مقارنة مع الشاهد) (الشكل 6. A). ومن اللافت للنظر، تم الكشف عن النمط الظاهري المعاكس، وهي نسبة أقل دلالة إحصائية الخلايا مع أهداب، في تلك مع transfected من النوع البري ARL6 بناء (9 ± 2 مقابل 25 ± 4٪، ع <0.001 مقارنة مع الشاهد) (الشكل 6. A). كان النمط الظاهري آخر لاحظت فرقا كبيرا في طول الأهداب في الخلايا معربا عن أشكال متحولة من ARL6. في حين كان متوسط ​​طول أهداب من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع من النوع البري ARL6 لا يختلف كثيرا عن السيطرة، وأهداب من ARL6 (T31R) - كانت وARL6 (Q73L) خلايا -transfected لفترة أطول كثيرا (4.79 ± 0.19 و 5.21 ± 0.36 ميكرون مقابل 2.4 ± 0.09 ميكرومتر، ص <0.001) (الشكل 6. B). معا، وتشير هذه النتائج إلى أن BBS3 يعمل على تعديل وجود وبنية أهداب الابتدائي؛ من النوع البري النتائج BBS3 الزائدة في الخلايا المهدبة أقل، في حين أن إلغاء وظيفتها يؤدي إلى نسبة أكبر من الخلايا المهدبة مع أهداب طويلة.

الشكل 6.
overexpression من النوع البري ARL6 / BBS3 والمتغيرات النتائج في الشذوذ الهدبية. و transfected الخلايا hTERT-RPE مع واحدة من ثلاث بنيات، pCMV-BBS3 (overexpressing من النوع البري غير محدد وBBS3)، pCMV-T31R، أو pCMV-Q73L (overexpressing المتغيرات ازال). وتم قياس كمية الظواهر الناتجة أيام 2 بعد ترنسفكأيشن. A، تم تحديد نسبة الخلايا التي تمتلك هدب عن طريق عد عشوائيا> 100 خلية من كل السكان. وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري بين تجارب مكررة. B، تم تحديد طول هدب عن طريق قياس> 30 أهداب عشوائي من السكان. وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري بين تجارب مكررة. النجمة تمثل فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة مع الشاهد. C، صور تمثيلية تظهر الاختلافات في طول هدب بين الخلايا hTERT-RPE التي كانت وهمية transfected (السيطرة) أو transfected للتعبير عن إصدارات لازال من النوع البري ARL6، ARL6 (T31R)، أو ARL6 (Q73L) المتغيرات. دابي، 4، 6-diamidino-2-phenylindole.
من النوع البري ARL6، ولكن ليس المتغيرات المسببة للأمراض، ينظم إشارات Wnt

اكتشاف أن أهداب هي المركزية لمختلف مسارات الإشارات قد عززت بشكل كبير من فهمنا لدور هذه العضيات في التنمية والمرض. كجزء من وظيفتها في الإشارات بين الخلايا، وهدب يقمع بشكل طبيعي، β-تعتمد على catenin إشارات WNT الكنسي (72، 73) ومطلوب لnoncanonical، β-catenin مستقل يشير WNT. فقدان العديد من البروتينات BBS، بما في ذلك BBS2، BBS4، وBBS6، يؤدي إلى زيادة بيتا catenin النشاط النسخي عندما تحفزها إشارة Wnt3a الكنسي (73)، في حين لم يقم overexpression من BBS4 تأثير العلني على النشاط β-catenin. 5
لاستكشاف الدور المحتمل للARL6 / BBS3 في إشارات Wnt، عبرنا عن ARL6 / BBS3 في خط الخلية hTERT-RPE1 مع transfected مراسل البلازميد pTOPflash (الشكل 7) وخط HEK293T مستقر خلية مراسل WNT (التكميلي الشكل 4 A ). ومن المثير للاهتمام، وتأثير ARL6 / BBS3 على النشاط β-catenin هو تعتمد على الجرعة، لأن overexpression يؤدي إلى التقريبية 2- أو 6 أضعاف زيادة استجابة Wnt3a في hTERT-RPE1 (الشكل 7) وHEK293T (التكميلي الشكل 4 A) خط الخلية مقارنة مع خلايا من النوع البري، على التوالي. في المقابل، overexpression من ARL6 (T31R) وARL6 (Q73L)، التي تعرف الآن أن تسبب التشوهات الهدبية (الشكل 6)، لم يكن لديها تأثير على β-catenin النشاط النسخي (الشكل 7). على الرغم من ARL6 (T31R) يمثل طفرة المسببة للأمراض، ARL6 (Q73L) ليست طفرة المحددة في المرضى BBS3. لذلك، لمواصلة التحقيق أم لا يشير WNT قد تلغى في المرضى الذين يعانون BBS، اختبرنا ردا على Wnt3a يجند في متغيرات إضافية ARL6 overexpressed المسببة للأمراض، وهي ARL6 (G169A) وARL6 (L170W). وعلى غرار ARL6 (T31R) وARL6 (Q73L)، لاحظنا فقدان responsivity للإشارة Wnt3a وβ-catenin النشاط النسخي مقارنة عندما هى overexpressed من النوع البري ARL6 (التكميلي الشكل 4 B). معا، تظهر هذه النتائج أن ARL6 / BBS3 يمكن أن تعدل إشارات Wnt في خلايا الثدييات والتي قد يكون لها تأثير مختلف عن البروتينات BBS الأخرى (انظر أدناه).

الشكل 7.
overexpression من النوع البري ولكن ليس متحولة أشكال ARL6 / BBS3 يغير الاستجابة لWnt3a يجند. في الخلايا مراسل hTERT-RPE TOPflash، overexpression من ARL6 / BBS3 يؤدي إلى زيادة النشاط β-catenin ردا على Wnt3a يجند ولكن لا ديسريغولاتيون العالمي للβ يشير -catenin. في المقابل، overexpression من ARL6 (T31R) وARL6 (Q73L) ليس له تأثير ملحوظ على β-catenin النشاط النسخي. الخلايا باستمرار 70-80٪ متكدسة ومهدب كما لوحظ من قبل تلطيخ مع مضاد للالأسيتيل تويولين الأضداد (لا تظهر البيانات). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. فقط النوع البري (BBS3 WT عينات) تختلف إحصائيا من مكافحة ناقلات الفارغة (ع <0.05).

نقاش

BBS3 تمتلك الميزات الهيكلية الفريدة والخصائص النكليوتيد التجليد

هنا، نقدم التركيب البلوري للARL6 / BBS3، أول المعلومات الهيكلية عالية الدقة لبروتين BBS أو IFT. لأن GTPases المنتدى الاقليمى للاسيان وعادة ما يكون تقارب أعلى للناتج المحلي الإجمالي من GTP (على سبيل المثال ARL5A، رموز PDB 2H16 / 2H17؛ ARL8A، رموز PDB 2H18 / 1ZD9؛ ARL8B، رمز PDB 2AL7؛ وSAR1A، PDB كود 2GAO)، البيانات الهيكلية لدينا على ARL6 كانت غير متوقعة، خاصة وأننا كنا قادرين على حل هيكلها في ولاية محددة GTP (74). أحد الأسباب المحتملة لهذا العقار تبدو فريدة من ARL6 هو أن منطقتها التبديل II تفضل التشكل محددة GTP بسبب الرابطة الهيدروجينية بين سلسلة الجانب سر-71، والتي هي فريدة من نوعها بين GTPases صغيرة / ARF مثل المنتدى الاقليمى للاسيان، وأميد مجموعة من GLN-73 (الشكل 2 A). وبالتالي، قد يكون ARL6 أعلى النسب للGTP من الناتج المحلي الإجمالي، وهو الاكتشاف الذي يتم اعتماد كيميائيا (الشكل 3 والشكل التكميلي 1). بالإضافة إلى ذلك، فمن المتوقع لليسين الغنية N-14 محطة بقايا ARL6، لم يكن موجودا في كياننا لتشكيل مسعور α-الحلزون بدلا من الحلزون متقابلة الزمر، كما هو الحال مع غيرها من GTPases الصغيرة الأسرة المنتدى الاقليمى للاسيان. ومن المتوقع myristoylation من بقايا الغليسين-2 في ARL6 أيضا أن يكون من غير المحتمل (32). وبالتالي، فمن الممكن أن كلا من النوكليوتيدات خصائص الملزمة ARL6، وكذلك الطريقة التي الغشاء ينظم ملزمة، قد تكون مختلفة عن تلك التي أفراد الأسرة الآخرين.
الأهم من ذلك أن بيانات التركيب البلوري شرح تأثير الطفرات المسببة للأمراض قد أن على البروتين ARL6 / BBS3. هذه الطفرات إما تؤثر بقايا الحرجة اللازمة لGTP ملزم، أي الثريونين-31، أو أنها تؤثر على روابط هيدروجينية ضمجزيئي في مثل هذه الطريقة ربما لسبب misfolding المحلية / العالمية كذلك، أي الغليسين-169 ولوي-170. لدينا دراسات وظيفية تتفق مع هذه الفكرة. وARL6 (T31M)، ARL6 (G169A)، وARL6 (L170W) المتغيرات عرض ضئيلة أو معدومة النوكليوتيدات ملزمة، في حين لوحظ ARL6 (T31R) البديل في حالة غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي تختلف عن نظيرتها من النوع البري، الذي كان أساسا GTP محددة (الشكل 3). في ظل هذه الظروف، ومن المتوقع أنشطة GTPase صغير قد انخفضت، وهو احتمال، كما هو مذكور أدناه، أكدنا من خلال مراقبة الهدبية ويشير الظواهر.
ARL6 / BBS3 هو بروتين رواية بصل الهيئة التي يموضع في مدخل الهدبية حجرة

وتوضح النتائج التي توصلنا إليها أن ARL6 / BBS3 وجدت في نمط تشبه الحلبة في النهاية البعيدة من الجسم القاعدية ومعظم المنطقة القريبة من الخيط المحوري الهدبية (الشكل 5). هذا التعريب الجسم القاعدية للARL6 / BBS3 يتسق مع النتائج السابقة للبروتينات BBS الأخرى (38، 58، 60، -، 63). ومع ذلك، فإن الموقف الدقيق للARL6 / BBS3 في النهاية البعيدة من الهيئات القاعدية هي فريدة من نوعها بين البروتينات BBS لكن مماثلة لتلك التي ذكرت لالتهاب الشبكية الصباغي 2 (RP2) نديد في C. ايليجانس (34) والمثقبيات البروسية (75)، والتي تشكل أيضا هياكل على شكل حلقة في قاعدة الأهداب. ومن المثير للاهتمام، ومن المعروف RP2 للتفاعل معها، ويكون بمثابة-المنشط GTPase ل، وGTPase ARL3 صغيرة (76)، وظيفتها في تشكيل هدب تم توثيقه في الكائنات الحية المختلفة (33، -، 35).
الملاحظ أيضا هو حقيقة أن الموقع التحت خلوية عمل ARL6 إما في، أو على مقربة، والألياف الانتقالية في النهاية البعيدة من جميع الهيئات القاعدية. نصائح من هذه الألياف، التي تنضم إلى الغشاء الهدبي، يعتقد أنها مواقع لرسو السفن لجزيئات IFT (19، 22). وبالنظر إلى أن C. ايليجانس ARL-6 / BBS-3، مثل كل اختبار آخر C. ايليجانس البروتينات BBS (BBS-1، -2، -5، -7، و-8) (77، 78)، وشركاء مع الآلات IFT (أي تحركات بطريقة تشبه IFT في أهداب الحسية)، ونحن التكهن بأن ARL6 / BBS3 قد تتفاعل مع البروتينات BBS الأخرى والآلات IFT قرب أو في هذه المنطقة الألياف الانتقالية. تساعد الألياف أيضا تشكيل بوابة الهدبية، مما يحد من دخول الحويصلات في الفضاء الهدبي، مثل أن حويصلات جولجي المستمدة من تحمل قفص الاتهام البضائع الهدبي والصمامات على مقربة من الألياف (21، 22). لذلك، نظرا للدور أنشئت للبروتينات BBS في الاتجار داخل خلايا الجسم، وIFT في أهداب، يمكن ARL6 / BBS3 تسهيل تصور / تعدل الانتقال بين حويصلي والاتجار intraciliary. سيكون تحديا من نوع خاص لتشريح وظائف محددة من ARL6 / BBS3، باعتبارها واحدة سوف تحتاج إلى أن تأخذ في الاعتبار قبل القاعدية الجسم / الهدبية الاتجار غشاء فضلا عن الاتجار intraciliary (IFT) عمليات -associated. على الأرجح السابق يتضمن العديد من GTPases الصغيرة، بما في ذلك RAB8، RAB17، وRAB23، وربما لمجموعة فرعية من البروتينات (التي تحتوي على V X PX الزخارف)، ARF4 وRAB11 (37، 79، 80)؛ يعتمد هذا الأخير على مجموعة من اللاعبين الناشئة، بما في ذلك البروتينات RAB IFT25، RAB8، والإفتاء-2، فضلا عن ARL13B (34، 36، 37، 39).
ARL6 / BBS3 مايو تعدل هدب التفكيك و / أو طول تحكم

من خلال فائض الانتاج في الخلايا المهدبة كلا من النوع البري ARL6 وشكلين متحولة من GTPase صغير ARL6، وكشف لنا دور محتمل لهذا GTPase صغيرة في هدب التفكيك. على وجه التحديد، overexpression من النوع البري النتائج ARL6 إلى انخفاض في تشكيل هدب، لاحظ النمط الظاهري أيضا على الصغيرة بالتدخل RNA ضربة قاضية من BBS3 في مسح لجميع BBS الجينات (80)؛ من ناحية أخرى، overexpression من ARL6 (T31R) وARL6 (Q73L)، التي تمنع نشاط ARL6 الذاتية، يسبب زيادة في تشكيل هدب وطول (الشكل 6).
من هذه النتائج، فإننا نقترح أن ARL6 قد تسهل، يحتمل أن تكون من خلال تهريب بعض البضائع الهدبية، وارتشاف من الأهداب. مطلوب هذه العملية لتحرير centrioles (الجسم القاعدية)، لاستخدامها كمراكز أنيبيب المنظمة، قبل دورة الخلية إعادة دخول (81). على الرغم من أن هذه وظيفة ستكون الأولى من نوعها البروتينات BBS، البروتينات IFT هي ثيقا المعنية في ارتشاف الهدبية (17).
ومن المثير للاهتمام، الإفراط في ما يعادل (يفترض أن الناتج المحلي الإجمالي مقفلة) أشكال متحولة من ARL6 (T31R) (الشكل 6 B) وRAB8 (T22N) (37) وتنتج عيوب الهدبية المعاكس أساسا، مشيرا إلى وظائف معارضة لاثنين من GTPases الصغيرة. ومن المحتمل ذات الصلة التي في الشاشة الزرد عن التفاعلات الوراثية بين BBS الجينات، ARL6 تم العثور على التفاعل مع BBS1 (82)، الذين المنتج الزميلة جسديا مع RAB8 (الجين 37). على العموم، تشير هذه البيانات إلى جمعيات الوظيفية المحتملة بين BBSome، ARL6 / BBS3، وRAB8 في التوسط تكون الأهداب وهدب ارتشاف. الآن هناك علاقة بين BBSome والهدبية ارتشاف. وقد تبين أن البروتين BBIP10 BBSome المصاحب للتفاعل مع HDAC6، الذي أستلة أنيبيب النشاط يؤثر الهدبية التفكيك (83، 84). بالإضافة إلى ذلك، وتورط البروتينات BBS أيضا في إزالة البروتينات من أهداب في كلاميدوموناس (100)، بما يتفق مع دور محتمل في ارتشاف.
بدلا من ذلك، يمكن أن BBS3 المشاركة في هدب السيطرة طول، وهي عملية نعرف أن ينظم بإحكام في كلاميدوموناس reinhardtii. عندما كلاميدوموناس يتم تحفيز الخلايا لاستئصال الآفة، ويتم إجراء بدلاء لهم إلى ما قبل deflagellation أطوال في أقل من 2 ساعة (85). وعلاوة على ذلك، عندما يتم بتر السوط واحد فقط، فإن السوط المتبقية تقصير حتى يصل نظيرتها بنفس الطول، في الوقت الذي كل من سياط تنمو إلى طول محدد مسبقا من (85). لا يقل عن سبعة البروتينات، المشفرة بواسطة أربعة سياط طويلة (LF) وثلاثة أسواط (قصيرة الموجات الدقيقة) الجينات، وتنظيم هذه العملية في C. reinhardtii (86، -، 89). يتم وضع BBS3 من الناحية المثالية، عند أو بالقرب من بوابة الهدبية، لتعمل في مراقبة طول الهدبية. على وجه التحديد، فقد تم الافتراض أن الألياف الانتقالية والآلات الموجودة في هذه المنطقة قد فرض رقابة صارمة على حركة المكونات داخل وخارج المقصورة الهدبية، على سبيل المثال البروتينات IFT، بطريقة مماثلة لتلك التي من مجمع المسام النووي (19) .
ARL6 / BBS3 ينظم إشارات Wnt

فقدان البروتينات BBS، بما في ذلك BBS1، BBS4، وBBS6، يؤدي إلى استجابة تضاف إلى إشارات الكنسي WNT مثل Wnt3a مقاسا β-catenin النشاط النسخي (73). وبالنظر إلى هذه النتائج، فإنه لم يكن متوقعا أن overexpression، وليس ضربة قاضية، من بروتين آخر BBS، وهي BBS3، أدى إلى رد فعل المعزز مماثلة لWnt3a يجند الكنسي (الشكل 7). نقترح أن زيادة النشاط β-catenin ينظر في البرية من نوع الخلايا overexpressing BBS3 مرتبط نسبتهم أقل من أهداب (الشكل 6 A). وقد اقترح أن أهداب تؤثر على التوازن بين الإشارات WNT الكنسي وnoncanonical داخل الخلية من خلال تفضيل المسار noncanonical (73)؛ وبالتالي، زيادة التفكيك الأهداب في الخلايا overexpressing من النوع البري BBS3 يفضلون يشير WNT الكنسي، كما لاحظنا.
على الرغم من أن قد يتوقع المرء أن يرى أثر عكسي، انخفضت هما النشاط بيتا catenin في الخلايا overexpressing وARL6 (T31R) وARL6 (Q73L) المتغيرات، التي تبين أيضا هنا أن تسفر عن الظواهر الهدبية، لاحظنا أي تأثير كبير على β -catenin النشاط النسخي من overexpression من هذه الطفرات السائدة (الشكل 7). على الرغم من أن هذه النتيجة ليست بديهية على الفور، فإنه لا تتناسب مع دورنا المفترضة لBBS3، وهو ذلك الجزء من وظيفتها قد يكون للمساعدة في تهريب مكونات الغشاء الهدبي للخروج من مقصورة الهدبية. لتحقيق التوازن الديناميكي بين كل من WNT مسارات إشارات الكنسي وnoncanonical، والهدبية "التبديل" يجب أن تعمل بشكل صحيح، وأنه من المرجح أن يتطلب الاتجار الصحيح للمكونات الغشاء الهدبي ليس فقط في، ولكن أيضا من ومقصورة الهدبية. إذا مكونات الهدبية للمسار WNT (على سبيل المثال inversin) (90، -، 92) و، لا يتم الاتجار بهم بشكل صحيح من هدب، ومن المرجح أن يكون ضعف التحول إلى إشارات noncanonical، والنوع البري مستويات النشاط β-catenin يكون لاحظت، كما هو الحال مع نتائجنا. قد يوحي هذا أن التحول الهدبية التي تفضل قد يكون noncanonical إشارات Wnt مختلة عند منسوخ BBS3، وهو احتمال يحتاج إلى مزيد من التحقيق.
على الرغم من أن نتائجنا تتفق مع النماذج الحالية تشير إلى دور للأهداب في إشارات Wnt، فإنه سيكون فقط المناسب أن نعترف أن شرط أهداب في كبح إشارات WNT الكنسي لا يزال مثيرا للجدل. ينبع الخلاف من النتائج التي تظهر نماذج الماوس IFT معيب ونماذج الزرد-الأهداب أقل تظهر من النوع البري من أنماط التعبير الكنسي WNT مكونات الإشارات وتستجيب عادة للالكنسي WNT يجند (93، 94). لكن، وكما هوانغ وشير (94) الاعتراف، ضربة قاضية لهذه المكونات IFT النتائج حصرا في العيوب أهداب ويترك الجسم القاعدية أكثر أو أقل سليمة. لأن البروتينات BBS غالبا ما تكون القاعدية في المقام الأول، وفي بعض الحالات يشاركون في الاتجار العناصر الحاسمة centrosomal (المرتبط الجسم 61، 63)، فإنه يمكن أن تورط البروتينات BBS في إشارة WNT له علاقة مع دورها في الهيئات القاعدية، الأساس الذي بنيت أهداب. ولذلك، فإننا نؤكد أنه إذا لم أهداب ثم الهيئات القاعدية على أقل تقدير حاسمة لتقييد الكنسي إشارات Wnt من خلال التأثير على توازن ديناميكي بين الكنسي وnoncanonical إشارات Wnt.
ومن المثير للاهتمام، تعطلت التعبير عن Wnt3a في الخلايا العصبية في القلب قبل الهجرة قمة الزرد مع بوساطة morpholino ضربة قاضية من البروتين التفاعل ARL6 (ARL6IP) (95). وعلاوة على ذلك، فقد ARL6IP تحاكي العديد من الظواهر التي لوحظت في ضربة قاضية للبروتينات BBS في دانيو rerio، وهي تشوهات القحفي، وعيوب في التنمية برعم الطرف، عيوب القلب، وتصبغ غير طبيعي، وتنكس الشبكية (82، 95، -، 97). وبالتالي يمكن أن طبيعة هذا التفاعل الوظيفي بين ARL6 وARL6IP يثبت أنه مفيد لفهمنا العمليات الخلوية والجزيئية التي تنظم وظيفة هدب، وارتباطه مع إشارات Wnt.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #23  
قديم 11-23-2015, 09:54 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي استهداف التسلسل الإنتاجية العالية لتشخيص الأمراض غير المتجانسة وراثيا: الكشف عن الطفرات كفاءة في بارديه-بيدل وAlström المتلازمات

 

http://jmg.bmj.com/content/early/201...12-100875.full


لخص

خلفية متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب المتنحية عديد المظاهر التي تنتمي إلى العائلة المتنامية بسرعة من ciliopathies. وتشترك في الصفات المظهرية مع ciliopathies أخرى، مثل متلازمة Alström (زكاة المال)، سحاف الكلية (NPHP) أو متلازمة جوبير. وقد تم الكشف عن الطفرات BBS في 16 جينات مختلفة (BBS1 - BBS16) دون ارتباط واضح التركيب الوراثي إلى النمط الظاهري. هذا التغاير الجيني واسع هو مصدر قلق كبير للتشخيص الجزيئي والاستشارة الوراثية. في حين استراتيجيات مختلفة وقد اقترحت مؤخرا لتحسين الكشف عن الطفرات، فإنها إما تفشل في الكشف عن الطفرات في الغالبية العظمى من المرضى أو هي مضيعة للوقت ومكلفة.

طريقة نحن اختبار استراتيجية اكسون التقاط المستهدفة إلى جانب مضاعفة وعالية الإنتاجية تسلسل على 52 مريضا: 14 مع الطفرات المعروفة باسم إثبات صحة المبدأ و38 بدون الكشف عنها من قبل الطفرة. واستهدفت ثلاثين الجينات في المجموع بما في ذلك 16 الجينات BBS، 12 الجينات NPHP المعروف، واحد صدقات ALMS1 الجينات وCCDC28B التعديل المقترح.

النتائج سمحت هذه الاستراتيجية موثوقية الكشف عن الطفرات المسببة (بما في ذلك متماثل / الحذف اكسون متخالف) في 68٪ من المرضى BBS دون التشخيص الجزيئي السابق وفي جميع العينات إثبات صحة المبدأ. قامت ثلاث probands الطفرات اقتطاع متماثل في ALMS1 يؤكد التداخل المظهري كبير بين كل من الاضطرابات. ارتبط كفاءة الكشف عن الطفرات في المرضى بشكل إيجابي مع امتثالها لBBS النمط الظاهري الكلاسيكية (تم تحديد الطفرات في 81٪ من BBS 'الكلاسيكية' المرضى) مما يدل على أن تبقى سوى عدد قليل من الجينات BBS الحقيقية الكشف عن هويته. نحن لتوضيح بعض المشاكل التي تواجهها التفسير نظرا لتعدد المتغيرات التي تم تحديدها.

ختام هذه الاستراتيجية هي ذات كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة للأمراض مع عدم التجانس الوراثي عالية، ويضمن جودة التغطية في الترميز تسلسل الجينات المستهدفة مناسبة لأغراض التشخيص.

مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS؛ OMIM # 209900) هو اضطراب المتنحية عديد المظاهر مع ارتفاع التباين الوراثي غير أليلية. حدوثه يختلف من يقدر ب 1: 160 000 في شمال أوروبا إلى 1:13 500-17 000 في البدو وNewfoundlanders على التوالي 1 BBS ينتمي إلى عائلة كبيرة ومتزايدة من ciliopathies، وبالتالي، والصفات المظهرية أسهم مع جوبير (JBTS )، Alström (زكاة المال) وميكل (MKS) المتلازمات. 1، 2 وبالتالي قد يكون التفاضلية التشخيص السريري صعبا، خصوصا في probands الشباب الذين لا يظهرون إلا أن بعض مظاهر بداية محددة في وقت لاحق. 3، 4 على وجه الخصوص، وتبرز التقارير الأخيرة تداخل سريري كبير بين BBS وصدقات. 3، 5
الميزات المظهرية الرئيسية للBBS تشمل ضمور شبكية العين، polydactyly، والسمنة، وتأخر في النمو المعتدل، الكلى المتعدد الكيسات ونقص الأعضاء التناسلية. ويمكن ملاحظة ملامح أخرى ثانوية في المرضى، مثل تشوهات القلب، وغيرها من أرقام أو العين الشاذة، ومرض السكري وارتفاع ضغط الدم، وعيوب السمع، الشم. 6، 7 وحتى الآن، تم اكتشاف الطفرات في 16 جينات مختلفة (BBS1 - BBS16) ، ولكن لا علاقة واضحة التركيب الوراثي إلى النمط الظاهري ويمكن ملاحظة، إلى جانب استثناء المقترح BBS16. 8
وذكر متلازمة Alström (OMIM # 203800) لتكون أقل بكثير انتشارا من BBS، مع حدوث قدر من 1: 1 000 000. سماته المظهرية تتداخل مع تلك BBS في مرحلة الطفولة المبكرة، وتشمل: مخروط قضيب ضمور، والسمنة، ونوع السكري، وفقدان ولكن أيضا زيادة شحوم الدم، تمدد عضلة القلب، والرئة التدريجي، والكبد، أو الفشل الكلوي. السمع السكري 2 9 وحتى الآن، تم التعرف فقط جين واحد (ALMS1)، ولكن أظهرت التقارير الأخيرة بعض الأسر التي لديها موحية صدقات-تحمل طفرات في الجينات BBS. 3، 5 الحجم الكبير من ALMS1 تسلسل الترميز يبدو أن انخفاض قيمة الاختبارات التشخيصية واسع النطاق للصدقات.
شامل التقليدي التسلسل سانجر لBBS التشخيص باهظة التكاليف نظرا لوجود عدد كبير من الجينات المعنية، وذلك أيضا للصدقات نظرا لحجم كبير من ALMS1 الترميز تسلسل (12 كيلو بايت، 24 الإكسونات؛ الجدول 1). لقد تم اقتراح استراتيجيات واعية التكلفة البديلة لBBS التشخيص، مثل: الفحص الأولي من الطفرات المتكررة والجينات الطافرة في كثير من الأحيان (BBS1، BBS10، BBS12) جنبا إلى جنب مع رسم الخرائط جود زيجوت متماثلة الألائل للعائلات الأقارب 10، 11؛ أو صفائف تمديد التمهيدي لاختبار سلسلة من الطفرات BBS المعروفة. 5 نهج آخر اقترحت مؤخرا هو تجميع السلطات الوطنية المعينة المرضى مع احق PCR التضخيم وresequencing مواز الهائل من BBS1-12 الإكسونات الترميز، تليها الفرز مضاعف متغاير لتحديد الناقل الطفرة . 12 ويعرض هذا الأسلوب بعض القيود كما سيغيب الحذف اكسون وربما لا تكون مناسبة لأغراض التشخيص. وبالنظر إلى التداخل السريري مع ciliopathies الآخر، فإن نهج آخر يتمثل في اختبار بشكل منهجي في وقت واحد، كل الجينات المقابلة لهذه المتلازمات المتداخلة، والتي ستكون ذات أهمية خاصة للمرضى الذين يعانون من الظواهر السريرية شاذة أو غير كاملة. وصفنا هنا نتائج هذا النهج، استنادا إلى التقاط اكسون المستهدفة من 30 الجينات بالإضافة إلى الجيل المقبل من التسلسل (خ ع).

الجدول 1
الجينات المتضمنة في استراتيجية تخصيب المستهدفة والاضطرابات المرتبطة بها

المواضيع والأساليب

تتوفر في طرق التكميلية بروتوكولات مفصلة.
المواضيع

تم جمع عينات من الحمض النووي من 52 مريضا غير ذات صلة. وقد تم تناول معظم المرضى إلى مختبر التشخيص، أو إلى المركز الوطني المرجعي للأمراض النادرة ophtalmogenetic في ستراسبورغ. تنبع عينات من الحمض النووي من أحد عشر مريضا التونسي تضمينها في دراسة علم الأوبئة BBS مستقلة.
وتضمنت الفوج إثبات صحة المبدأ 14 مريضا غير التونسي مع BBS التشخيص الجزيئي وأكد (التي تم اكتشافها قبل هذه الدراسة من خلال سانجر تسلسل). دون الطفرات المعروفة، جندت في ستراسبورغ ستة وعشرين من 38 مريضا، وكان قد تم فرزهم مبدئيا لBBS1 وBBS10 الطفرات المتكررة، بالإضافة إلى تسلسل الترميز كامل BBS12.
لجميع المرضى، تم الحصول على موافقة خطية من أجل الاختبارات الجينية، سواء من الكبار أو probands من الممثل القانوني في حالة القصر.

إعداد مكتبة، والتقاط المستهدفة وتسلسلها

تم إعداد عينات من الحمض النووي والتحكم فقا للإجراءات العادية.
تم تنفيذ تصميم التقاط مع eArray باتباع إرشادات الشركة المصنعة (اجيلنت).
تم المنفصمة السلطات الوطنية المعينة (3 ميكروغرام) ميكانيكيا باستخدام Covaris E220 (دورة العمل: 10٪؛ شدة: 5؛ دورة في انفجار: 200؛ وقت: 300 ق).
للتجربة إثبات صحة المبدأ، تم إضافة محولات التسلسل على 500 نانوغرام من الحمض النووي المنفصمة باستخدام SPRIworks جزء مكتبة النظام الأول (بيكمان كولتر). بعد تقييم التضخيم والجودة، تم إجراء القبض المستهدفة على عينات فردية باستخدام SureSelect في حل الهدف إثراء نظام (اجيلنت) على 500 نانوغرام من مكتبة هيأهم DNA. تم تنفيذ خطوات إضافية من غسل وتنقية وشطف، وأضيفت محولات المتنوعة (الأرقام القياسية DNA TruSeq البورشيد) بواسطة PCR خلال خطوة التضخيم بعد القبض.
لجميع التجارب التالية، تم إضافة محولات مضاعفة في وقت واحد لمحولات التسلسل باستخدام نظام SPRIworks. المبالغ متساوي المولية للمكتبتين الموسومة كان يتم تجميع ثم مسبق للتفاعل الالتقاط. وظلت جميع الخطوات الأخرى التالية قبل التسلسل متطابقة. تم إجراء تسلسل واحد يقرأ 72-BP على الجينوم محلل منظمة شات (GAIIx، البورشيد).

خط أنابيب بيوينفورمتيك

قراءة أجريت رسم الخرائط والدعوة البديل فقا للإجراءات العادية. تم إجراء تصفية متغير باستخدام VaRank، وهو برنامج في المنزل الذي يجمع معلومات البديل محددة لتصنيفها وفقا لالإمراضية تنبأ بها (الشكل 1، طرق التكميلية).

الشكل 1
مخطط عالمي خط أنابيب بيوينفورمتيك تنفيذها للكشف عن الطفرات. اختصارات البرنامج: BWA، الجحور-ويلر أليجنر. SVA، تسلسل متغير محلل. فرزت؛ Polyphen2. HSF، الإنسان الربط الباحث. MaxEntScan، الحد الأقصى لالانتروبيا الضوئي. NNSplice. طفرة المتذوق. IGV، التكاملية الجينوم عارض.

تباين نسخ رقم (CNV) طريقة الكشف

وقد تم تحديد التنوعات في عدد النسخ باستخدام طريقة العمق من التغطية. 13، 14 بالنسبة لكل مريض، وقراءة التهم في ويندوز من 20 النيوكليوتيدات غير متداخلة محسوبة، تطبيع ثم مقارنة عشوائيا مع ثماني عينات أخرى من نفس التجربة (تعتبر يعيد) باستخدام حزمة DEseq Bioconductor (مصممة في البداية لبيانات RNA يليها). 15 مناطق المرشح لالتنوعات تم انتشال عندما كانت نسب log2 (الضوابط / عينة) إما ≥0.84 (أضعاف تغيير> 1.8، حذف المحتملين) أو ≤-0.51 (أضعاف التغيير <0.7، الازدواجية المحتملة)، وإذا القيم ص تعديل لاختبار متعددة (Benjamini وهوشبرج الداخلي) 16 وكان أصغر من 0.1.

الأساليب الإحصائية

تم احتساب فترات الثقة للتقديرات نسبة وأشار بين قوسين. تم حساب اختبار فيشر الدقيق للمقارنة بين توزيع السكان صغيرة. ونظرا لاحقة قيمة ص في α = 0.05.

النتائج والمناقشة

المناطق المستهدفة: استراتيجية التصميم

كان هدفنا الأساسي لوضع استراتيجية الطفرة الفرز فعالة لتشخيص المرضى الذين يعانون من الظواهر المثيرة للBBS، أو من ciliopathies تداخل سريريا. اخترنا نهج تخصيب الهدف إلى جانب NGS من أجل التركيز على التسلسل في المناطق الجينومية من الفائدة. نحن المستهدفة بكل exons (بما في ذلك 5 'و 3' UTRs) من 16 جينات BBS المعروفة (الجدول 1). بسبب تداخل طبي معروف، ونحن شملت أيضا الترميز الإكسونات من ALMS1، وكل 12 الجينات سحاف الكلية المعروفة. (NPHP1 - 12)، منذ تنكس الشبكية كثيرا ما يمكن لوحظ في هذا المرض الكلى محددة 9، 17 متواليات الترميز من AHI1 / JBTS3، TMEM216 / MKS2 / JBTS2، والمقترح BBS-معدل CCDC28B / MGC1203، واستهدفت أيضا. 18 لأن بعض هذه الجينات ترتبط مع الظواهر المتعددة، لدينا تصميم ويشمل 6 MKS، 7 JBTS و 4 متلازمة العليا-لوكن ( SLSN) الجينات (انظر الجدول 1).
مع هذا التصميم الأول، أردنا أن التحقيق ما إذا كان بما في ذلك سلاسل intron يمكن صلاحا، والكشف عن والتحجيم من الحذف اكسون. لذا أدرجنا سلاسل intron من BBS1 وBBS4 استهداف الطعم. وقد أملى هذا الاختيار من قبل اثنين من الملاحظات: وجود فائض واضح من المرضى متخالف لطفرة M390R-BBS1 المتكررة مع عدم وجود الطفرة الثانية الكشف، 11 وعدة تقارير BBS4 الحذف اكسون في المرضى. 4، 11، 19 A العتبة القصوى 200 كيلو بايت ل تم تعيين المناطق المستهدفة المتراكمة بسبب حدود تسعير الشركة المصنعة.
وجود تسلسل المتكررة يمنع الطعم تبليط في 19.7٪ من المناطق المستهدفة في البداية. هذا القلق، على وجه الحصر تقريبا، إنترونات من BBS1 وBBS4، إلى جانب عدد قليل من 3'UTRs، وفقط 128 سنة مضت من مناطق ترميز البروتين (داخل الإكسونات الأولى من ALMS1 وNPHP3؛ الجدول S1).

إثبات صحة المبدأ والنتائج الفنية

في تجربتنا إثبات صحة المبدأ، اخترنا 16 عينات من الحمض النووي، منها 14 مع الطفرات BBS المعروفة. في هذه التجربة الأولى، بعد المتوازية المكتبات التخصيب الهدف، ونحن التسلسل برك من أربع أو ثماني مكتبات في حارة من GAIIx (انظر طرق التكميلية). وأجري هذا إثبات لمبدأ تحليل أعمى، وهذا هو، من دون معرفة الجينات BBS المتورطين والطفرات المرتبطة بها. تم اختبار كوكبة من جميع أنواع الطفرات (missenses، nonsenses، والطفرات لصق، حذف الكبيرة وإعادة ترتيب معقدة) على مختلف جرعة أليلية (الشكل S1). كل 14 الطفرات التي تم تحديدها مسبقا، من بينهم اثنان من -deletions BBS1 متخالف (الشكل 2A)، تم الكشف في متخالف الصحيح على / الدولة متماثل (الجدول S2). على وجه الخصوص، في AKE12 المريض، يمكننا الكشف عن انخفاض المحلية غير طبيعي للتغطية في BBS12 بسبب نوع نادر طفرة (إدراج تسلسل ألو، الرقم S1A) على الرغم من أن الطبيعة الدقيقة للطفرة يمكن أن تحدده فقط سانجر التسلسل. ولوحظ وجود انخفاض مماثل في التغطية للمريض الثاني، AHX91، مع طفرة معقدة آخر الكشف من قبل سانجر تسلسل (الإدراج / انقلاب في BBS5).

الرقم 2
الكشف عن الحذف كبيرة في ثلاثة مرضى باستخدام طريقة العمق من التغطية. قمم سوداء: عمق تطبيع التغطية من عينات DNA المرضى. قمم فارغة: عمق يعني تطبيع التغطية عبر عينات من نفس التسلسل حارة. الساحات الرمادية: المناطق المغطاة الطعم. قمم سوداء: عمق تطبيع التغطية من عينات DNA المرضى. قمم فارغة: عمق يعني تطبيع التغطية عبر عينات من نفس التسلسل حارة. الساحات الرمادية: المناطق المغطاة الطعم. الساحات الضوء: المناطق حذفها. تمثيل الجينات: المربعات السوداء: الإكسونات، الخطوط المتقطعة: إنترونات. يتم إعطاء مناصب الجينومية وفقا للجينوم البشري إشارة hg19 / GRCh37. (A) حذف متخالف من BBS1 (اكسون رقم 10، 11) في AMV5 المريض. المقابلة نسب Log2 بين كل من أعماق التغطية (يعني تطبيع وAMV5 المريض) مزيد من تسليط الضوء على وجود الحذف. (B) الحذف متماثل الجينات من BBS3 (اكسون # 1، 2A، 2B، 3) في ALG42 المريض. (C) الحذف متماثل الجينات من BBS4 (اكسون # 4، 5، 6) في P3 المريض. (A و C): استهداف سلاسل intron يسمح بتقييد نقاط التوقف الحذف. (B) وC): قم بتسجيل 2 النسب بين كل من أعماق التغطية (يعني تطبيع والمرضى المقابلة) يمكن أن تسمح أيضا الكشف عن كل من الحذف ولكن لا تظهر (التكميلي الرقم S2).

في هذه التجربة الأولى، وصلنا بشكل شبه منتظم التغطية النظرية القصوى ل144x يتضح من تغطية متوسط ​​127 ± 4X بعد إزالة مكررة يقرأ (الجدول 2). ونظرا لهذه التغطية تشبع العالمية عندما يقرأ النظر فريدة من نوعها، وكنا كل يقرأ، بما في ذلك التكرارات، عند تطبيق أسلوب قائم على عمق دينا للكشف عن التنوعات.

الجدول 2
إحصاءات التسلسل كل من التغطية (في المناطق القبض) وكفاءة التقاط

هذه الواعدة العمق من التغطية النتائج (الجدول 2، الجدول S3) شجعنا على زيادة عدد العينات المجمعة. في التجارب القادمة استخدمنا التقاط رد فعل واحد لمدة المكتبات barcoded، مما يسمح كل من وفورات في التكاليف ومقاعد البدلاء في الوقت المحدد، والمجمعة 12 مكتبات في حارة التسلسل (اقترح الحد الأقصى لعدد الباركود في ذلك الوقت البورشيد).
تم تنفيذ هذا البروتوكول الجديد على الدفعة الثانية من 36 مريضا مع الطفرات غير معروفة. أدى التسلسل في تغطية متوسط ​​78 ± 17 × (283 ± 153x قبل رميه يقرأ مكررة) مع 91.4 ± 6.4٪ من المناطق المستهدفة التي تغطي أكثر من 40X (الجدول 2). هذا الانخفاض النسبي للتغطية على ما يبدو نتيجة لانخفاض كفاءة التقاط قد يكون راجعا إلى: (1) مبلغ مساهمة مكتبة الفردية بمقدار النصف، ويرجع ذلك إلى تجميع ما قبل القبض على و(2) إضافة الباركود قبل القبض، مما يؤدي إلى حجب أقل كفاءة وتهجين غير محددة. التغطية الناتجة عنها ما زالت يضمن موثوقية الكشف عن المتغيرات ومتماثل / دولتهم متخالف.
وتمت تغطية نسبة صغيرة من المناطق المستهدفة ضعيفة في بعض المرضى (أي عمق <10X بعد التكرارات تصفية)، مع عدد قليل جدا منهم بطريقة منهجية في المرضى الآخرين (الجدول S4). هذا المعنية فقط 0.63 ± 0.68٪ من مناطق ترميز البروتين، وتضمنت معظمها متواليات GC الغنية intronic (GC المحتوى: 68.3 ± 5٪ مقابل 40.2 ± 10٪ في جميع المناطق المستهدفة)، أو بعض الإكسونات الأولى (الجداول S3 و S4).

تصفية متغير: أهمية قواعد البيانات والبيانات التردد

في المناطق المستهدفة، اكتشفنا، في المتوسط، 170 المتغيرات (واحدة النكليوتيد المتغيرات (SNVs) وindels) لكل مريض. وقد تم تحليل جميع منهجي لتأثير المفترض على بنية البروتين والمواقع لصق باستخدام VaRank (الشكل 1، طرق التكميلية). حوالي 130 من هذه المتغيرات سجلت في dbSNP134 (الجدول S5)، ولكن تم التحقق من 20 فقط مع اثنين على الاقل من وسائل مستقلة، وبالتالي تخرج. في الواقع، في سياق اضطراب المتنحية النادرة، يمكن لبعض الطفرات الحقيقية تكون موجودة في التردد المنخفض جدا في حالة متخالف في الضوابط.
تم تقييم المرضية المحتملة من 150 المتغيرات المتبقية باستخدام أدوات بيوينفورمتيك والنظر في تواتر الصبغيات في عدد السكان الأوروبي الأمريكية، كما ورد في قاعدة البيانات Exome البديل خادم (EVSdb). ونتجت عن ذلك من صفر إلى ستة متغيرات مثيرة للاهتمام لكل عينة، كان من بينها مقطوعة واضح أو الطفرات المعروفة في بعض المرضى.
حقل "الأهمية السريرية" الجديد الذي بدأ العمل في dbSNP134 لابد من النظر بحذر منذ تأسيسها الطفرات يمكن الآن عنها في قاعدة البيانات ولكن لم يتم وضع علامة بشكل منتظم كما الإمراض (على سبيل المثال: rs179363897، p.R138H) طفرة في BBS5). على العكس من ذلك، اكتشفنا بعض الشروح إيجابية كاذبة: rs4784677 (p.N70S) في BBS2 ذكرت -initially كما أليل الثالث حسب hypothesis- triallelic 20 يتم الإشارة إليها العدوى، ولكن غير متكررة جدا ليكون طفرة توغل بالكامل (0.77٪ في EVSdb). مرشحات يجب أن تتكيف بعناية إلى اضطراب في المصالح، والتحديثات في تطور مستمر من قواعد البيانات.

الكشف عن الحذف اكسون

ميزة واحدة من الاستراتيجيات القائمة NGS، في مقابل سانجر تسلسل، هو فرصة للكشف، بالإضافة إلى SNVs وindels-التنوعات الصغيرة التي تؤثر على واحد أو أكثر من الإكسونات (الشكل 2 وS2). في التجربة إثبات صحة المبدأ، يمكن أن يتم الكشف عن اثنين من الحذف متخالف في BBS1. بين عينات غير معروفة، تم التعرف على اثنين الحذف متماثل في BBS3 / ARL6 وBBS4. على حد علمنا، ونحن نقدم هنا أول تقرير من الحذف كبيرة في BBS1 وBBS3 / ARL6، في حين أن العديد من عمليات الحذف التي تؤثر BBS4 وقد لوحظ سابقا. 4، 11، 19 وبما أننا استهدفت أيضا سلاسل intron من BBS1 وBBS4، كنا قادرين على تضييق حدود الحذف الكشف اللاحقة (الشكل 2). لAMV5 المريض، باستخدام إحداثيات الإكسونات المتضررين، ويقدر حجم BBS1 حذف سيكون بين 466 و 4707 سنة مضت، بينما مع دينا تصميم، ونحن يمكن حصرها في 1862-3841 سنة مضت (الشكل 2A، الجدول S2). في P3 المريض، ونحن يمكن أن تقلل من حجم مماثل المقدرة للحذف BBS4 4626-12 975 نقطة أساس على أساس مواقف اكسون وصولا الى 9376-10 469 سنة مضت (الشكل 2C، الجدول 3A). وأخيرا، لأن الحذف BBS3 / ARL6 في المريض ALG42 يشمل الإكسونات الثلاثة الأولى من هذا الجين (الشكل 2B)، ونحن اختبار ما إذا كان قد تمتد وتؤثر EPHA6 يقع المنبع، ترميز مستقبلات ephrin. اختبار PCR المباشر استبعاد هذا الحذف الموسعة (لا تظهر البيانات).

الجدول 3
الطفرات التي تم تحديدها وغيرها من المتغيرات المحرضة في 38 المرضى الذين يعانون من النمط الجيني لم تكن معروفة سابقا. A) المرضى الذين يعانون من الخيارين المسببة للأمراض بشكل واضح في جين واحد. B) المرضى الذين يعانون من واحد أو أي متغير الإمراض واضح في جين واحد. ووصف الطفرات وفقا لأحدث الاتفاقيات التسميات وصفها في HGVS

وبفضل هذه الطريقة، في ستة المرضى الذين اكتشفنا متخالف واحد يحتمل أن تكون الطفرة المسببة للأمراض، يمكننا التأكد من أن أي حذف متخالف موجود في العابرة، أو على الأقل لا تشمل تسلسل exonic.

توزيع الطفرات BBS الكشف عنها في 38 مريضا غير معروف

من 38 عينة الطفرات BBS غير معروفة (36 + 2 من التجربة إثبات صحة المبدأ) ونحن الكشف عن الطفرات المسببة للأمراض بوضوح biallelic في 26 حالة (68.4٪، الجدول 3A). على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن سبعة عشر من هذه الطفرات في السابق، مشيرا إلى أن الطفرة الطيف BBS هو أبعد ما يكون عن المشبعة على الرغم من العديد من التقارير طفرة BBS. تم العثور على طفرات متماثل في 88٪ (23/26) من المرضى تحور ومتماسكة مع عدد كبير من الأقارب probands المدرجة في الفوج (75٪، 25/33). في اثنين من المرضى من أصل الأقارب، ويقع طفرة BBS خارج المناطق متماثل الكشف عنها بواسطة SNP تحليل مجموعة مسبق، وسوف، وبالتالي، قد غاب باستخدام استراتيجية رسم الخرائط جود زيجوت متماثلة الألائل (المرضى AGL23، AKX44؛ الجدول 3A).
من بين 12 مريضا المتبقية مع عدم وجود الطفرات biallelic تم تحديدها (الجدول 3B)، وكان مريض واحد (AHR2) ومتخالف بشكل واضح طفرة الربط المسببة للأمراض في BBS3. وكان خمسة مرضى توقع missenses متخالف أن تكون ضارة عن طريق التدقيق، Polyphen2 و / أو الطفرة T @ ster يسود (AIY87، AIX45، AMO77، AMA28، AHL86) مع الأخيران تحمل هذه المتغيرات في اثنين من الجينات المختلفة. مريض واحد الأقارب ميلانيزيا، AKE98، قدم مع الكلاسيكية ميزات BBS-إدراج، بما في ذلك polydactyly. كان يحمل نوعين مختلفين متماثل التي ظهرت في البداية على أنها المحرضة: لانزياح الإطار البعيدة في INVS / NPHP2 توقع لإضافة 14 الأحماض الأمينية إلى C-محطة لأطول البروتين الإسوي، وP2679L غير المبلغ عنها مغلطة التي تؤثر على بقايا الحفظ في ALMS1 (الشكل S3). استبعد تحليل الفصل اللاحق من ضلوعهم في المرض منذ كانت كلا الخيارين متخالف في أخ تتأثر بشكل مماثل.
في خمسة مرضى، يمكن تحديد أي البديل المحتمل الإمراض في أي من 30 الجينات المستهدفة. هؤلاء المرضى هم بالتالي مرشح لexome التسلسل الذي قد إما مساعدة في تحديد جينات جديدة أو إعادة النظر في التشخيص السريري.

تحميل طفرة في BBS والجينات المستهدفة الأخرى: أهمية ALMS1

الحمل تحور الجينات بين BBS في فوج لدينا يبدو متسقا مع تقارير سابقة. 7، 11 الحوادث المرصودة لBBS1 (7/38، 18.4٪) والطفرات BBS2 (5/38، 13.2٪)، والأكثر تحور الجينات كثيرا في دراستنا ، وعلى غرار فيما يخصه ذكرت الأرقام من 16.9٪ و 12٪. 7 بالنظر الجينات الطافرة في كثير من الأحيان، كان منحازا دراستنا بقوة ضد BBS1، BBS10 وBBS12، لأن ثلثي السلطات الوطنية المعينة المرضى تم اختبارها سابقا سلبية لBBS1 وBB S 10 الطفرات المتكررة، بالإضافة إلى كل تسلسل الترميز BBS12 البروتين. وهذا ما يفسر الغياب التام للطفرات BBS12 في فوج لدينا، ومساهمة منخفضة نسبيا من BBS10 (5/38، 13.2٪) مقارنة مع الأدب (≥20٪). 7، 11 وكانت مساهمة الجينات BBS أخرى منخفضة، مع كثير من الأحيان المستلفت واحد فقط المعنية.
لم نجد أي تحور في الجينات BBS "الجديدة" (BBS13 - 16) مما يدل على أن، بشكل تراكمي، لديهم مساهمة صغيرة في مجموع الحمل طفرة تبين BBS13 / MKS1 الواقع أن تورط معظمهم في MKS منذ BBS واحد فقط. وذكر المريض مع اثنين من الطفرات متخالف ص [C492W]؛ [F371del] حمل آخرون فقط missenses متخالف، وأحيانا بالإضافة إلى متماثل اقتطاع الطفرات BBS1. 21 وبالمثل، لBBS14 / CEP290، طفرة اقتطاع متماثل (p.E1903 *) تم العثور عليها في BBS مريض واحد، 21 في حين الطفرات الأخرى بكثير في كثير من الأحيان المتورطين في جوبير، كبير وكن، ليبر الخلقي الكمنة أو متلازمات ميكل. ويمكن ملاحظات مماثلة لBBS15 / WDPCP وBBS16 / SDCCAG8 22، 23 كما هو الحال في جميع الدراسات الأخرى الأفواج BBS، تم تحديد أية طفرة في BBS11 / TRIM32 رفع قضية تورط الحقيقي في BBS: كان واحد فقط الطفرة مغلطة متماثل هو موضح في عائلة الأقارب واحدة، في حين تم تحديد عدة طفرات أخرى في أشكال المتنحية من طرف الزنار ضمور العضلات. 24
نتيجة واحدة جديرة بالذكر هي العثور على متماثل اقتطاع الطفرات ALMS1 في 3/38 مريضا (AIA84، AKO26، ALB64؛ 7.9٪). على وجه الخصوص، وهراء وجدت في AKO26 p.R3629 المريض * ويبدو أن طفرة ALMS1 المتكررة، منذ نشرت بالفعل في خمسة مرضى صدقات الآخرين. 25-27 ويبدو أن التداخل المظهري بين BBS وصدقات إلى أن تكون أكبر مما كان يعتقد سابقا، ومؤخرا اقترح مع أمثلة من المرضى Alström مع طفرات في الجينات BBS، 5 والوضع العكسي، كما هو الحال في دراستنا، من الطفرات ALMS1 في المريض مع المشتبه BBS. 3
وأخيرا، تم العثور على طفرة لا المسببة للأمراض بشكل واضح في أي الجينات NPHP أو JBTS في الفوج.

العلاقة بين الكفاءة والكشف عن الطفرات والنمط الظاهري السريرية

وأظهرت المقارنة بين النمط الظاهري السريرية بين المرضى الذين يعانون من أليلين المسببة للأمراض بوضوح متحولة (ن = 26) والذين يعانون إما البديل الإمراض ممكن واحد أو أي متغير المشبوهة الكشف عن (ن = 12) وجود علاقة واضحة بين عدد من المظاهر السريرية الرئيسية BBS و احتمال الكشف عن أليلين BBS تحور في المرضى (الشكل 3). تم الكشف عن الطفرات Biallelic في 81٪ (CI (60٪ إلى 92٪)) من المرضى تلبية معايير الاشتمال BBS. على وجه الخصوص، في المرضى التونسي المعينين على المعايير السريرية الصارمة، تم العثور على الطفرات في 11/11 الحالات وسبعة جينات مختلفة BBS، مستبعدا تأثير مؤسس المحتملين. على العكس من ذلك، بالنسبة لبعض من 12 مريضا دون طفرات واضحة، كان BBS واحد فقط تشخيص يشتبه غيرها. وعلاوة على ذلك، لدينا الاختيار المبدئي للمرضى دون الطفرات المتكررة في BBS1 أو BBS10، ودون أي طفرة في BBS12 قد أغنت فوج لدينا في المرضى الذين يعانون من الظواهر BBS غير نموذجي. تقدير الحالي نقلت على نطاق واسع أن تشكل الجينات BBS المعروف٪ فقط 70-75 من الحمل طفرة الإجمالي في المرضى BBS وبالتالي يمكن الاستهانة إذا النظر في المرضى فقط مع محددة بدقة BBS النمط الظاهري.

الشكل (3)
يرتبط الامتثال الكلاسيكية BBS النمط الظاهري بشكل إيجابي في الكفاءة للكشف عن الطفرات الرئيسية في الجينات BBS. (A) عدد BBS التشخيص معايير الاشتمال الرئيسية 6 يرتبط في المرضى الذين لكشف كفاءة من الطفرات BBS. (B) الكفاءة للكشف عن طفرة في المرضى الذين يعانون الوفاء BBS معايير الاشتمال المظهرية أو لا. . BBS معايير الاشتمال عرض مع ثلاث سمات رئيسية بالإضافة إلى اثنين على الأقل من القصر، أو تقديم أربع ميزات رئيسية وأكثر من 6 معايير رئيسية تشمل: ضمور قضيب مخروط، polydactyly، والسمنة، وصعوبات التعلم، قصور الغدد التناسلية والشذوذ الكلوي. وتشمل الميزات الثانوية تأخير الكلام والشذوذ العين الأخرى، قصر الأصابع أو ارتفاق الأصابع، وترنح، ومرض السكري، وتأخر في النمو، وتشوهات الأسنان، وتشوهات القلب والتليف الكبدي. 6

يظهر التوزيع من الميزات إدراج BBS مختلفة بين المرضى الذين يعانون من الطفرات BBS اثنين، واثنين من الطفرات ALMS1 أو أية طفرة biallelic المحددة (الجدول 4). المرضى الذين يعانون من أية طفرة الكشف قدمت مع أقل بكثير polydactyly، وهو BBS علامات سريرية رئيسية هي: فقط 25٪ مقابل 70٪ في المرضى الذين يعانون من الطفرات BBS الكشف عن (P = 0.029 *). يبدو أن المظاهر السريرية الأخرى على أن تحذو اتجاه المرضى BBS الكلاسيكية.

الجدول 4
تقرير الملامح الرئيسية BBS السريرية في 38 مريضا دون التشخيص الجزيئي معروفة سابقا، مع أو من دون الكشف عن الطفرات

وفيما يتعلق -mutated ALMS1 probands، 03/02 قد أرسلت للاشتباه BBS (برادر ويلي أو صدقات اعتبرت أيضا لAIA84 وAKO26، على التوالي)، ومعايير التشخيص BBS راضية. وتناول آخر واحد (ALB64) لضمور شبكية العين المتلازمة (جدول 4). 6 AIA84 يقدم BBS الكلاسيكية مع ضمور شبكية العين، والسمنة، وعيوب المعرفية، وقصور الغدد التناسلية وقصر الأصابع. AKO26 يعرض على BBS شاذة مع نفس الميزات جنبا إلى جنب مع الصمم الشديد غير الطبيعي، محددة للصدقات. وأخيرا، ALB64 يقدم صدقات نموذجية مع الصمم الشديد وضمور الشبكية. يقدم اي منهم مع polydactyly. كما اقترح سابقا، 3 على حد سواء، وغياب polydactyly وانتشار الصمم في ALMS1 -mutated المرضى، هي مفاتيح للتمييز الوراثي، النمط الظاهري بين زكاة المال والمرضى BBS تحور.

تقييم oligogenism في BBS

وقد نوقشت على نطاق واسع وجود وتأثير المحتمل لtriallelism أو oligogenism في BBS ويبدو المثير للجدل (18، 20، 28، 29 مقابل 30-32). في نهجنا، والتسلسل في وقت واحد من كل 16 الجينات BBS، و14 جينات أخرى تشارك في ciliopathies متداخلة، يسمح للكشف المنتظم من المتغيرات المحرضة الأكثر إضافية في هذه الجينات، وبالتالي تقييم غير متحيز للoligogenism.
من 52 مريضا تحليلها، وجدنا متخالف واحد فقط اقتطاع طفرة (p.K1870Nfs * 4)، وأليل الثالث في BBS14 / CEP290 في AKR68 المريض الذي يحمل طفرة مغلطة المسببة للأمراض في BBS10. مثل هذا التردد هو في الواقع في نطاق ما يمكن توقعه من قبيل الصدفة. . حسبنا سابقا من احتمال يحمل طفرة BBS الممرضة الحقيقية أن يكون حوالي 1:50 31 وبما أننا وشملت أيضا في التصميم لدينا جينات ciliopathy أخرى، واحتمال أن تحمل الطفرة المسببة للأمراض في واحدة من 30 الجينات هي بالأحرى بين 1: 20 و01:30 (حساب على أساس كل حالات المرض والإبلاغ عن أي مساهمات من الجينات المستهدفة في الحمل طفرة). يحتمل، تم العثور على missenses متخالف الإمراض (لم يبلغ عنها سابقا في المرضى أو في EVSdb) أيضا في ثمانية مرضى (ثلاثة من إثبات صحة المبدأ، الجدول S2، وخمسة من جماعة 'مجهولة'، الجدول 3).هذه المتغيرات قد يكون بمثابة المعدلات، ولكن من غير المرجح أن يطلب منهم للتعبير الكامل لBBS النمط الظاهري الكلاسيكية. على العكس من ذلك، في بعض المرضى حيث تم العثور على الطفرة المسببة للمرض بشكل واضح واحدة، والمتغيرات في جينات أخرى من نفس الطريق (وخاصة تلك البروتينات ترميز من نفس المجمع، مثل BBSome أو مجمع BBS-chaperonin) 33، 34 قد تسهم في الدولة المرض في وضع digenic الميراث المقترحة في عدد قليل من العائلات BBS. 20، 35، 36
ويتضح حالة محتملة من triallelism التي كتبها AIZ62 المريض، الذي هو متخالف مركب أو p.E191 هراء * وp.A242S مغلطة في BBS6 / MKKS. وكانت تسببها A242S البديل موضوعا للمناقشة. 37-39 تحليل في الزرد أشار إلى أنه يؤثر BBS6 / وظيفة MKKS واقترح لها تأثير سلبي المهيمن. 40 EVSdb يسمح للاستدلال ترددها عند 0.59٪ (CI (0،43-0،80٪ ))، أعلى من الطفرات الأكثر شيوعا BBS، M390R في BBS1 (0.24٪ CI (0،15-0،39٪)). A242S لا يمكن بالتالي أن تكون طفرة توغل للغاية لأنه ينبغي بعد ذلك وجدت بشكل متكرر أكثر في المرضى الذين يعانون من طفرة M390R، وهو ليس كذلك. في AIZ62 المريض، وقد تم تحديد متغير متخالف الثالث في BBS12 (p.Q620R، بقايا الحفظ في الثدييات، ولكن ليس في الفقاريات أكثر بعدا) مما يؤثر فرعية أخرى من مجمع BBS-chaperonin. 34 ونقترح أن A242S هو الأليل hypomorphic أن قد يؤدي إلى النمط الظاهري في حين عبر، مع طفرة اغية كاملة، ويمكن potentiated مزيدا من أليل hypomorphic تؤثر فرعية أخرى من نفس المجمع. لا يمكن إجراء تحليل الفصل في الأسرة AIZ62 لاختبار هذه الفرضية.
وأخيرا، ونحن ننظر في فوج لدينا لتردد أليلية من المقترح سابقا BBS-معدل متغير c.330C → T في CCDC28B / MGC1203، 18 والعثور على وتيرة بنسبة 3.85٪ (CI (1،56-9،47٪))، وهي ليست تختلف اختلافا كبيرا (ع = 0.17) من 2.07٪ (CI (1،76-2،43٪)) لاحظ في EVSdb.

النتائج

كان التباين الوراثي غير أليلية واسعة من متلازمة بارديه-بيدل مشكلة كبيرة للتطبيقات المشورة التشخيصية والوراثية الجزيئية. وقد تم اقتراح استراتيجيات مختلفة في السنوات الأخيرة لتحسين الكشف عن الطفرات، 5، 10-12 ولكن لديها إما منخفضة حساسية أو أيضا مضيعة للوقت ومكلفة في إعدادات التشخيص. وتتقاسم هذه المشكلة عن طريق كيانات أمراض أخرى مثل اعتلال عضلة القلب، وفقدان السمع، ومتلازمة آشر أو شاركو ماري الأعصاب الأسنان. ويمكن تقسيم الاستراتيجيات البديلة تلك القائمة NGS في كامل الجينوم / exome التسلسل، 41-43 أو التسلسل المستهدف، إما عن طريق استخدام متعدد PCR، 12 متعددة singleplex PCR 44-46 أو تخصيب القبض على النهج.
نحن نفذت في حل استراتيجية تستهدف القبض على 16 الجينات المعروفة BBS و 14 جينات أخرى متورطة في ciliopathies التي تشترك في السمات السريرية متداخلة مع BBS. نعرض هنا أن هذا هو فعالة جدا لأنه في ممر تسلسل واحد من واحد البورشيد GAIIx يمكن تحليل في وقت واحد أكثر من 99.4٪ من المستهدف ترميز البروتين متواليات من هذه الجينات في 12 مريضا، مع تغطية كافية لضمان موثوقية الكشف عن المتغيرات متخالف، صغيرة indels والحذف اكسون. في تشغيل لمدة أسبوع، يمكن للمرء أن يحتمل بالتالي تحليل 96 مريضا. التحقيق في 36 مريضا يمكن أن تكتمل في حوالي 3 أسابيع عندما بما في ذلك إعداد العينات وتحليلها بيوينفورمتيك الأولي. تحليل البيانات وزيادة التحقق من صحة طفرة وقتا أطول للحالات حيث لا يوجد سوى المتغيرات المرضية غير مؤكد موجودة. قدرنا تكاليف استهلاك الشاملة في إعدادات لدينا حوالي 600 $. هذا ويمكن حتى انخفض كذلك من خلال استخدام أحدث التعاقب أكثر قوة، مما يسمح للتحليل برك كبيرة من عينات barcoded مع الحفاظ على عمق عالية من التغطية. في الواقع، نحن التسلسل مؤخرا مجموعة جديدة من 24 مريضا (12 باستخدام ردود الفعل القبض) في حارة واحدة من البورشيد HiSeq2000 مع تغطية أعلى من تلك التي تم الحصول عليها في التجارب السابقة مع GAIIx (لا تظهر البيانات). في حين exome التسلسل هو واضح أكثر شاملة، من حيث التغطية الجينات في التطبيقات الحالية، لا تغطي 20-30٪ من الإكسونات المستهدفة بما فيه الكفاية لدقة التشخيص، وهذا هو، لضمان انخفاض معدلات نتائج إيجابية كاذبة / السلبية الكاذبة وموثوق بها الكشف عن الطفرات متخالف أو الحذف اكسون. وعلاوة على ذلك، فإن الموارد المعلوماتية اللازمة لexome / الجينوم تحليل تسلسل البيانات وتخزينها أهم بكثير من لتسلسل المستهدفة، وكثيرا ما يمكن وجود قيود.
هذه الاستراتيجية، ومع ذلك، ويعرض بعض العثرات محدودة. كانت مناطق قليلة البروتين الترميز لا تغطيها جيدا، إما بسبب الفشل في تصميم الطعم (وجود تكرار الأشكال) أو ضعف كفاءة القبض على (تسلسل معظمهم GC-الغنية والإكسونات الأولى). ثم، لدينا بروتوكول مع المتوازية الأولية المكتبات تليها القبض على العينات المجمعة قد تكون فعالة من حيث التكلفة، ولكن في الوقت الحاضر، يحد من كفاءة التقاط ويحتاج إلى مزيد من التحسين، وخصوصا إذا ما طبق على مجموعات الجينات أكبر. وأخيرا، مثل لجميع الاستراتيجيات اكسون المستهدفة، سيتم غاب عن الطفرات intronic عميقة. أما البديل لاستهداف الجينات كلها لا تزال تفوت على نسبة عالية من المناطق intronic تحتوي على تسلسل المتكررة، وسوف تزيد أيضا بصورة غير متناسبة على عدد من المتغيرات نادرة للتحليل مع لصق التنبؤ أدوات بيوينفورمتيك التي هي حاليا لا يمكن الاعتماد عليها بدرجة كبيرة. تسلسل الحمض النووي الريبي للجينات التي أعرب عنها في كريات الدم البيضاء أو الخلايا الليفية، سيتم اختيار بديل آخر (المخصب في محاضر الجينات وما شابه ذلك).
في حين استراتيجيات القبض مماثلة تم تطويرها مؤخرا لأمراض أخرى، معظمهم شملت مجموعة أصغر من ذلك بكثير، وذكرت الوحيد إثبات صحة مبدأ التحليل، 47-49 باستثناء والش وآخرون. 50 قد يكون النهج متعددة PCR الإمكانات تغطية الإكسونات أكثر باستفاضة، 46 بالنظر إلى أن التصميم التمهيدي هو أكثر مرونة من الطعم تهجين تبليط، ولكن يقتصر على لوحات الجين أصغر من لالتقاط اكسون. وقد استخدمت PCR تجميع دون المتوازية لBBS وNPHP، 12، 51 استراتيجية التي قد تكون فعالة من حيث التكلفة لتحليل عدد كبير من العينات في الدراسات الوبائية، ولكن يبدو غير مناسبة لأغراض التشخيص حيث الشغل الشاغل الرئيسي هو الحد / معدلات سلبية كاذبة إيجابية .
بشأن قضية محددة من BBS، تقترح دراستنا أنه عندما يتم الامتثال المعايير السريرية صارمة مع وتيرة الطفرات الكشف عن أعلى من نقلت عموما الرقم 70٪. 7، 11 وبالتالي قد يكون هناك سوى عدد قليل من الجينات BBS صارمة المتبقية الكشف عن هويته ، ولا سيما بالنظر إلى أنه مع معظم الاستراتيجيات، باستثناء تسلسل كامل الجينات، واحد سيغيب عن الطفرات المسببة للأمراض intronic عميقة. جينات إضافية ليتم اكتشاف قد تتوافق إلى حد ما البديل الظواهر BBS مثل من لBBS محددة بدقة. ، في الواقع لمرضى BBS16 / SDCCAG8، أظهر الطفرات التحليل الوراثي، النمط الظاهري للمرة الأولى خروجا واضحا من النمط الظاهري BBS نموذجي مع غياب polydactyly ومظاهره الكلى منهجية وخطيرة (عادة موجودة في 30٪ فقط من المرضى BBS). 7 ، 8 اكتشافنا من ALMS1 الطفرات في ثلاثة مرضى يؤكد تداخل سريري كبير مع BBS. وأخيرا، لم نعثر على أي دليل على triallelism لدينا في فوج من المرضى BBS.
الموارد على شبكة الإنترنت

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #24  
قديم 11-23-2015, 10:00 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Mkks فارغة الفئران لديها النمط الظاهري تشبه متلازمة بارديه-بيدل

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/14/9/1109.full




متلازمة McKusick-كوفمان (MKS) هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز polydactyly بعد المحوري، وعيوب خلقية في القلب وموه رحمي مهبلي، شذوذ خلقي الهيكلي من الأعضاء التناسلية للإناث. وقد تبين أيضا طفرات في الجين MKKS أن يسبب بعض حالات متلازمة بارديه-بيدل (BBS) التي تتميز البدانة، اعتلال الشبكية الصباغي، polydactyly، تشوهات الكلى ونقص الأعضاء التناسلية مع ميزات الثانوية من ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري. على الرغم من أن هناك تداخل في المظاهر السريرية بين MKS وBBS، والمرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة MKS ليست ولا تتطور اعتلال الشبكية أو لديك صعوبات التعلم. لمواصلة استكشاف الفيزيولوجيا المرضية لBBS وMKS اضطراب ذات الصلة، قمنا بتطوير Mkks - / - نموذج الفأر. يظهر هذا النموذج أن غياب Mkks يؤدي إلى تنكس الشبكية من خلال موت الخلايا المبرمج، فشل تشكيل الحيوانات المنوية سياط، ارتفاع ضغط الدم والسمنة. ويرتبط بالسمنة مع فرط الأكل وانخفاض النشاط. وبالإضافة إلى ذلك، وفحص عصبي يكشف عجز في الشم والهيمنة الاجتماعية. الفئران لا تملك polydactyly أو تشوهات المهبل. النمط الظاهري للMkks - / - الفئران يشبه النمط الظاهري من نماذج الماوس الأخرى من BBS (Bbs2 - / - وBbs4 - / -). وتشير هذه الملاحظات أن الغياب الكامل للMKKS يؤدي إلى BBS حين من المرجح أن يكون راجعا إلى حدوث طفرات محددة النمط الظاهري MKS.
مقدمة

متلازمة McKusick-كوفمان (MKS) هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز polydactyly بعد المحوري، عيوب القلب الخلقية وموه رحمي مهبلي، شذوذ خلقي الهيكلي من الأعضاء التناسلية الأنثوية (1، 2). تم تعيين في البداية الجين MKKS وحددت بشكل كبير طائفة الأميش المشابهة. يظهر البروتين MKKS توقع التماثل إلى الوحيدات ألفا من Thermoplasma acidophilum thermosome (1، 3)، مجمع chaperonin بدائيات النواة مع التشابه الهيكلي لchaperonin حقيقية النواة يسمى "مجمع مجمع خاتم ببتيد العديم الذيل" (TRIC)، وهو chaperonin-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات تشارك في للطي من العديد من البروتينات بما في ذلك تويولين والأكتين (4). وقد تبين أيضا طفرات في الجين MKKS أن يسبب بعض حالات متلازمة بارديه-بيدل (BBS) التي تتميز البدانة، اعتلال الشبكية الصباغي، polydactyly، والتشوهات الكلى، والتشوهات الوظيفية ونقص الأعضاء التناسلية مع ميزات الثانوية من ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري (5 - 9 ). على الرغم من أن هناك تداخل كبير في المظاهر السريرية بين MKS وBBS، ومرضى متلازمة MKS لا يعانون من السمنة المفرطة وعدم تطوير اعتلال الشبكية أو التعلم الإعاقة.
حتى الآن، تم تعيين ثمانية BBS المكاني وتم التعرف على الجين BBS في كل من هذه الامكنه بما في ذلك الجين MKKS (كما يشار إلى BBS6) (3، 10 - +18). باستثناء MKKS، وغيرها من البروتينات المعروفة BBS ليس لديهم تشابه كبير لchaperonins. ومع ذلك، BBS4 وBBS8 يحتوي على تكرار المجالات tetratricopeptide مما يشير إلى أنها قد تتفاعل مع بروتينات أخرى. الجين BBS3 حددت مؤخرا هو ADP-ribosylation عامل مثل الجين (17، 18).
وتشير البيانات الأخيرة التي تشارك الجينات BBS في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا، ويتم حفظها الجينات BBS في الكائنات مهدبة، ولكن ليس في الكائنات غير مهدبة (16، 17). وقد ثبت أن بعض البروتينات BBS في توطين إلى الجسم القاعدية من الخلايا المهدبة وأن تشارك في نقل intraflagellar (15، 19). نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن Bbs4- وBbs2 خروج المغلوب الفئران لها ملامح الفوضى البشري وأن غياب هذه البروتينات يؤدي إلى فشل تشكيل الحيوانات المنوية سياط، ولكن ليس تشكيل أهداب بشكل عام. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن غياب Bbs2 أو البروتينات Bbs4 لا يعطل تماما تطوير خلية مستقبلة للضوء الأولية، على الرغم من أن الشاذة التشكل القرص هو واضح. ربط أهداب موجودة أيضا في الحيوانات ناقصة لBbs2 أو Bbs4. ولكن المستقبلات الضوئية تخضع لموت الخلايا بسبب موت الخلايا المبرمج (20، 21). لمواصلة استكشاف الفيزيولوجيا المرضية لBBS وMKS اضطراب ذات الصلة، وقد وضعنا الآن وتتميز وMkks - / - نموذج الفأر.

النتائج

جيل من الفئران Mkks خروج المغلوب

تم إنشاء Mkks الفئران -deficient باستخدام بناء استهداف الجين مصممة لإزالة اكسون 3 من الجين Mkks في مجملها (الشكل 1 A). تم transfected في بناء الاستهداف إلى الجذعية الجنينية (ES) الخلايا وتم التنميط الجيني ل~1000 خطوط الخلايا ES لتحديد خمسة (0.5٪) recombinants مثلي. تم حقن اثنين من الحيوانات المستنسخة المستهدفة في الكيسات الأريمية والوهم التي تنتج كل. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Mkks متخالف (Mkks +/-) الفئران على خلفيات وراثية مختلطة والفطرية التي التزاوج مع C57BL / 6J و 129 الفئران / SvEv، على التوالي. تم مرمزة الفئران باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (الشكل 1 Mkks B) - / - ولدت الفئران أقل كثيرا مما كان متوقعا من قبل الميراث مندلية (P <0.05). 600 مرمزة الفئران، فإن نسبة من Mkks + / +، Mkks +/- وMkks - / - كان 26.5، 54.4 و 19.1٪ على التوالي. الندرة النسبية للMkks - / - من المرجح إما بسبب وفاة داخل الرحم للأجنة خروج المغلوب متماثل أو موت الحيوانات خروج المغلوب متماثل بعد فترة قصيرة من الولادة الفئران. لقد رصدها بعناية الفئران حديثي الولادة، وقد وجدت تسع حالات وفاة بعد الولادة، حيث تمكنا من استعادة الحيوان لالتنميط الجيني. وكان اثنان من هذه الفئران تسعة Mkks - / -، ثلاثة كانت متماثل وضعها الطبيعي وأربعة كانوا الزيجوت، والتوزيع التي لا تختلف كثيرا عن النسب المندلية. لقد ضحى أيضا ثلاثة الفئران الحوامل الإناث في 14 أيام الحمل ومرمزة الأجنة. وكانت ثلاثة أجنة متماثل وضعها الطبيعي، وتسعة كانت الزيجوت وستة كانوا Mkks - / -. وكانت جميع الأجنة الطبيعية بشكل صارخ على الفحص باستثناء واحد Mkks - / - الجنين الذي كان أصغر بكثير من الأجنة الأخرى. وتشير هذه البيانات إلى أن بعض Mkks - / - الفئران تموت في وقت متأخر من الحمل.

الشكل 1. تمثيل تخطيطي للMKKS استهدفت استراتيجية التعطيل. (A) خريطة للمكان MKKS (أعلى)؛ استهداف ناقلات الجينات (وسط). هيكل المتوقعة من مكان تحور (القاع). السهام تشير الاشعال المستخدمة لاختبار إعادة التركيب 5'- و3'-مثلي واختبار خروج المغلوب الداخلي. (B) PCR التنميط الجيني من النوع البري، متخالف (+/-) وBBS فارغة (- / -) الفئران. وamplimers أعلى ومنتصف تتوافق مع 5'- و3'مناطق من الجينات المقاومة بالنيوميسين. مشتق الفرقة السفلي من التضخيم باستخدام MKKS اكسون 3 الاشعال الداخلية. (C) تحليل الشمالي لطخة من Mkks التعبير في الكلى مجموع RNA الخلوية من النوع البري (+ / +)، متخالف (+/-) ومتماثل (- / -) الحيوانات. وهذا التحقيق هو Mkks كدنا] جزئي. (القاع) نفس وصمة عار إعادة بحثها مع β - الأكتين كعنصر تحكم التحميل.

Mkks الاستهداف أسفر عن أليل باطل كما يتبين من غياب Mkks مرنا عن طريق تحليل لطخة الشمالي (الشكل 1 C).

Mkks - / - الفئران تصبح بدينة ولديها مستويات اللبتين عالية

وكانت Mkks الفئران -deficient الطبيعية بشكل صارخ فيما يتعلق التشكل، على الرغم من أنها ظهرت لتكون أصغر عند الولادة من تتزاحم بهم. في وقت الفطام (3 اسابيع من العمر)، Mkks - / - وزن الفئران أقل بكثير من نظرائهم من النوع البري وتتزاحم متخالف. بواسطة ~8-12 أسابيع من العمر، الفئران Mkks -null وزن نفس Mkks + / + وMkks +/- الحيوانات. بعد 28 أسبوعا، Mkks - / - كانت الفئران أكبر بكثير من كل من البرية من نوع والزيجوت (الشكل 2 A). كان والضوابط أكبر في الإناث منها في ذكور الفئران - الفرق في الوزن بين Mkks - /.

الشكل 2. زيادة الوزن واستهلاك الأغذية البرية من نوع، Mkks +/- وMkks - / - الفئران. (A) زيادة الوزن في الفئران الإناث والذكور مقابل العمر. أدرج ما لا يقل عن سبعة حيوانات في كل مجموعة. كانت الفئران انخفاض وزن المواليد من Mkks +/- أو Mkks + / + الفئران ولكن بحلول الاسبوع 16 وكانت أثقل بكثير - MKKS - /. (B) استهلاك الغذاء بالنسبة للفئران الذكور والإناث، وبلغ متوسط ​​كل 7 أيام. أدرج ما لا يقل عن ستة حيوانات في كل مجموعة Mkks - / - الفئران تستهلك أكثر بكثير من الغذاء Mkks + / + وMkks +/- الفئران. (C) أربعة وعشرون بيانات النشاط ساعة مقاسا القياس Mkks - / - الفئران تبدي أقل بكثير الحركة بالمقارنة مع من النوع البري.

وأشارت دراسات التغذية الطولية التي Mkks - / - الفئران تأكل أكثر من متخالف والنوع البري تتزاحم (الشكل 2 وتظهر انخفاضا كبيرا في النشاط كما تقاس 24 ساعة القياس بالمقارنة مع من النوع البري الفئران (الشكل B). 2 C) Mkks - / - الفئران كان أعلى متوسط ​​مستويات اللبتين في الدم من النوع البري الضوابط (27 ± 15.3 SD و 2.3 ± 2.6 SD نانوغرام / مل على التوالي، N = 4).

Mkks - / - قد عزز الفئران ضغط الدم

Mkks - / - الفئران كانت أعلى بكثير الانبساطي، يعني وضغط الدم الانقباضي من الضوابط على النحو الذي يحدده 24 ساعة القياس عن بعد. كان متوسط ​​الفرق في الضغط الشرياني يعني بين خروج المغلوب ومراقبة الحيوانات 12 مم زئبق (الجدول 1).

الجدول 1.
ضغط الدم (مم زئبق) ومعدل ضربات القلب (نبضة في الدقيقة) من Mkks - / - الفئران والضوابط

Mkks - / - الفئران لا يحمل polydactyly

على الرغم من polydactyly هو سمة مشتركة لكلا MKS وBBS في البشر، لا Mkks - زيارتها الفئران polydactyly أو غيرها من تشوهات الأطراف البارزة - /. تم تحديد هذا عن طريق عد الأرقام من جميع الأطراف الأربعة 115 Mkks - / - الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل الأشعة السينية في 20 الكبار Mkks - / - الفئران. وكشف تحليل الأشعة السينية لهذه الحيوانات أن أيا كان الشذوذ الأطراف بما في ذلك polydactyly، ارتفاق الأصابع، قصر الأصابع والمفقودين أو العظام تتكرر في الأطراف.

Mkks - / - الفئران تمتلك العصبي الحسي والسلوكية الظواهر

تم تقييم التحليلات السلوكية والوظيفية من الفئران باستخدام بروتوكول SHIRPA المعدلة (22). وتمت مقارنة البيانات من 38 قياسات الرصد منفصلة بين Mkks + / +، Mkks +/- وMkks - / - الفئران. وتتلخص تلك التجارب تظهر فروق ذات دلالة إحصائية بين الأنماط الجينية في الجدول 1. وكان متوسط ​​عمر الفئران في وقت التقييم 23 أسبوعا. والفئة العمرية 16-34 أسابيع. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية عند مقارنة البيانات من Mkks +/- مع Mkks + / + الفئران من كلا الجنسين. وبالمثل، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين خروج المغلوب والسيطرة الفئران في العضلات وانخفاض وظائف الخلايا العصبية الحركية مثل وضع الجسم والتوازن والتنسيق، والمشية والسلبية الموضعية، وذيل الارتفاع، وقوة قبضة أو لهجة الجسم، ولا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في وظائف الحسية مثل قرصة اصبع القدم وردود الفعل. وأخيرا، لم يكن هناك تأثير كبير من النمط الجيني على وضع البصري (P = 0.43)، لوحظ الاختبار الذي يخفض الماوس لأسفل على شبكة الأسلاك وتمديد الذراعين.
/ - - كانت الفئران الإناث أقل صخبا أثناء المناولة بالمقارنة مع الضوابط (P <0.05) Mkks - Mkks. / - أظهرت الفئران الشم تتضاءل إذا ما قيست القدرة على الحصول على الغذاء مخفي (الجدول 2).

الجدول 2.
ملخص فروق ذات دلالة إحصائية بين MKKS-، Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة مقارنة مع هم تتزاحم من النوع البري في SHIRPA الشاشة الرئيسية الملاحظات السلوكية

كما Mkks - / - لوحظت الفئران أن تكون أكثر منصاع لمعالجة، تم إجراء اختبار الهيمنة الاجتماعية. في 33/46 تجارب (72٪؛ P <0.05)، وMkks + / + تم العثور على الفئران أن تكون مهيمنة على Mkks - / - في اختبار الهيمنة الاجتماعية المقترنة. عندما تم اختبار الفئران متخالف ضد Mkks - / - الفئران، كانت الفئران متخالف أيضا المهيمنة (35/46 المحاكمات؛ 76٪؛ P <0.05). كان هذا الاستنتاج صحيحا بالنسبة لكل من الحيوانات من الذكور والإناث. لم يكن هناك اختلاف في الهيمنة الاجتماعية بين النوع البري والحيوانات متخالف (P> 0.05).

Mkks - / - عرض الفئران انحطاط مبصرة

Mkks - / - ظهرت الفئران لشبكية العين الطبيعية في وقت مبكر من الحياة ولكن في وقت لاحق الخضوع تنكس الشبكية. عيون من Mkks - / - الفئران من مختلف الأعمار قيمت 2-11 أشهر تشريحيا (الشكل 3). في 2-3 أشهر من العمر، تم التفريق بين قطاعات الداخلية والخارجية بشكل واضح، تم تخفيض طبقة النووية الخارجي قليلا، وكانت نواة الخلية موجودة في الفضاء تحت الشبكية. تم تخفيض شرائح الداخلية والخارجية في الارتفاع (الشكل 3 A). في 4-5 أشهر من العمر، وأظهرت طبقة النووية الخارجي انخفاضا معتدلا وتضمنت 3-7 صفوف من النوى. وكان من بقايا المواد المقابلة لقطاعات الداخلية والخارجية سيئة متباينة لا تزال موجودة في هذا العصر بين طبقة النووية الخارجي وRPE (الشكل 3 B). في 6 أشهر من العمر، تم تخفيض طبقة النووية الخارجي إلى حد كبير، مع 1-2 فقط صفوف من نوى المتبقية وكميات متفاوتة من المواد الداخلية / الجزء الخارجي؛ كانت خلايا عديدة موجودة في الفضاء تحت الشبكية (الشكل 3 C). قبل 8 أشهر، وطبقة النووية الخارجي المتخلفة تماما ولا بقايا من قطاعات الداخلية أو الخارجية قابلة للكشف (لا تظهر البيانات).

الشكل 3. الهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ Mkks - شبكية العين الماوس / - - (C A). تم فحص الفئران في 2-3 أشهر من العمر (A)، 4-5 أشهر (B) و 6 أشهر (C). بعض التغيرات التنكسية في طبقة النووية الخارجي (ONL) واضحة في فئران عمرها 3 أشهر 2- ل، على الرغم من قطاعات الداخلية والخارجية يمكن تمييزها بوضوح. قبل 5 أشهر من العمر (B)، والتمييز بين القطاعات الداخلية والخارجية هو أقل وضوحا وطبقة النووية الخارجي هو أرق بكثير مما كانت عليه في Mkks + / + العينين. في 6 أشهر من العمر (C)، وطبقة النووية الخارجي قد تدهورت إلى حد كبير وليس قطاعات الداخلية أو الخارجية موجودة. تلطيخ المضادة للرودوبسين موجود في الجزء الخارجي من قبل 2 أشهر من العمر (D). IS، قطاعات الداخلية، OS، شرائح الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية. GCL، طبقة الخلايا العقدية.

تلطيخ المضادة للرودوبسين من شبكية العين من Mkks - / - الحيوانات مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة RetP1 قبل إكمال فقدان المستقبلات الضوئية كشفت مناعية أوبسين الطبيعي في قطاعات الخارجي في 2 أشهر من العمر. بالإضافة إلى ذلك، كان مترجم بعض رودوبسين إلى الخلية الهيئات في طبقة النووية الخارجي في Mkks - / - الفئران (الشكل 3 D).

Mkks - / - فشلت الفئران لتشكيل الحيوانات المنوية سياط

Mkks - / - فشل الفئران الذكور في تلقيح متخالف أو من النوع البري إناث الحيوانات. من أجل التحقيق في أسباب العقم، ونحن فحص الخصيتين من Mkks - / -. ولوحظ غياب الأسواط في شمعة أنبوب صغير المنوية في الخصيتين من Mkks - / - الفئران (الشكل 4 أ و ب). ولوحظ غياب الأسواط في Mkks - / - الفئران من جميع الأعمار فحص. كان نوى مع لونين مكثف للغاية تشبه رؤوس الحيوانات المنوية الحالي، ولكن سياط كانت غائبة.

الرقم 4. سيليا التي تحتوي على هياكل في Mkks - / - الفئران. أقسام من خلال الأنابيب المنوية البرية من نوع (A) وMkks - / - (B) الفئران تكشف عن أن الفئران تعاني من نقص في الجين MKKS تفشل في إنتاج سياط العادي (الهيماتوكسيلين يوزين وصمة عار، على نطاق وبار = 90 ميكرون). المجهر الإلكتروني للنبيب القاصي الكلوي (C) من Mkks - / - الفئران يكشف عن تشكيل طبيعي من أهداب الكلوي. مقياس شريط = 2 ميكرون. المتوقع Z-سلسلة من الخلايا الظهارية القصبة الهوائية مثقف البرية من نوع (D) وMkks - / - (E) الفئران التمايز التالية مع واجهة الهواء السائل. مورفولوجية أهداب في Mkks - / - الفئران مماثلة لتلك التي البرية من نوع الفئران. وصفت الخلايا مع أجسام مضادة موجهة ضد β تويولين-IV لتصور أنيبيب (الخضراء). نوى كانت ملطخة مكافحة مع TO PRO3 (الحمراء).

خلايا من Mkks - / - الفئران تطوير أهداب

تم فحص الكلى من الفئران الشابة التي كتبها المجهر الإلكتروني لتقييم الكلوي التشكل الهدبية الابتدائية في Mkks - / - الفئران. أهداب في Mkks - / - ظهرت العينات أن تكون من الحجم العادي والكثافة (الشكل 4 C). لمزيد من التحقيق ما إذا كان المنتج الجين MKKS يلعب دورا في نشوء حيوي أهداب، ونحن مثقف الخلايا الظهارية القصبة الهوائية من الصغار والكبار من النوع البري وMkks - / - الفئران. بعد الغرس، الخلايا الظهارية الماوس القصبة الهوائية (MTEC) انتشرت بسرعة وأصبح الاستقطاب. بعض الخلايا الظهارية القصبة الهوائية المتقدمة إلى خلايا مهدبة في ظل ظروف الثقافة التي تتعرض الخلايا إلى واجهة الهواء السائل (23). تم تقييم أهداب التي وصفها مناعي مع الأجسام المضادة لمكافحة β تويولين-IV. الخلايا الظهارية المستمدة من كلا البرية من نوع وMkks - / - الفئران طورت عددا مماثلا من أهداب والتشكل من أهداب يبدو طبيعيا عندما تصور مع المجهر متحد البؤر (الشكل 4 C).

نقاش

وتبين لنا أن MKKS الفئران -deficient تطوير السمنة وتنكس الشبكية وأن الذكور تفشل في تشكيل سياط. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الحيوانات لديها زيادة الضغط الشرياني، ضعف حاسة الشم والنمط الظاهري السلوكية مما يشير إلى التفاعل الاجتماعي الشاذ. نتائج السمنة، وتنكس الشبكية وفشل تشكيل سياط تشبه ملامح Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة، ولكن تنكس الشبكية لديه بداية لاحق من ذلك ينظر في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (20 ، 21).
النتائج المعلنة هنا لMkks - / - الحيوانات وسبق لBbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران تشير إلى أن البروتينات BBS لا حاجة على الاطلاق لتشكيل إما أهداب متحركة أو الأساسي. ويتضح ذلك من حقيقة أن الشباب Mkks-، Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة إنتاج خلايا مستقبلة للضوء التي هي بشكل صارخ طبيعية شكليا ولكن في وقت لاحق الخضوع انحطاط كاملة. في الدراسة الحالية، ونحن نقدم أدلة على أن القصبة الهوائية الخلايا الظهارية من Mkks - / - الفئران قادرة على توليد أهداب العادي شكليا في الثقافة. ومع ذلك، في كل من نماذج الماوس ثلاثة قمنا بحثت حتى الآن (Mkks - / -، Bbs4 - / - وBbs2 - / -)، للخطر تجميع الحيوانات المنوية سياط. عدم وحظ من سياط في الأنابيب المنوية قد يكون راجعا إلى الفشل الكامل لتشكيل هذه الهياكل، أو بدلا من ذلك، قد تنتج عن تحلل السريع لسياط التالية تأليفهم. ومع ذلك، في الحيوانات درسناه، ونحن لم يلاحظ أي الحيوانات المنوية مع الأسواط، مشيرا إلى أن سياط تتشكل أبدا. فشل تشكيل الأسواط أو صيانة خلال النطاف يشير إلى أن هناك اختلافات بين عمليات أهداب مقارنة مع الجمعية سياط.
تم الإبلاغ عن موه رحمي مهبلي، لاتكون المهبلي والتشوهات البولي التناسلي أخرى في كل من MKS والمرضى BBS (24). ولادة قدموا ما يقرب من 3٪ من المرضى BBS (24). وقد لوحظت حالات شاذة لا المهبلية في Mkks - / - الفئران، على الرغم من أنها على ما يبدو الخصوبة انخفضت. ثلاثة من خمسة Mkks - / - الإناث تزاوج أصبحت حاملا.
وعلى الرغم من التجمع العادي الأول من أهداب في Mkks الفئران -deficient، دليل على وظيفة الأهداب غير طبيعية موجودا. على سبيل المثال، على الرغم من أن قطاعات الخارجية للخلايا مستقبلة للضوء يبدو أن تتطور بشكل طبيعي، فإنها تصبح غير منظمة، وفي نهاية المطاف خلايا مستقبلة للضوء الخضوع انحطاط. ومواصلة دراسة هذه النماذج الحيوانية تساعد على توضيح الدور الدقيق للبروتينات BBS في هذه العمليات داخل الخلايا. الملاحظة أن مجموعة فرعية من أجسام الخلايا طبقة النووية الخارجي ظهرت لديك أوبسين mislocalized تتفق مع فكرة أن وظيفة الأهداب قد تنخفض قيمتها في خلايا مستقبلة للضوء. الملاحظة أن Mkks - / - الفئران تطوير تنكس الشبكية مما يؤدي إلى عمى الكامل يعني أيضا أن الدولة فارغة أكثر شبها الطفرات BBS المصاحب في الجين MKS من الطفرات مغلطة في MKS.
وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الفئران Mkks فارغة تطوير البدانة ترتبط بزيادة استهلاك الغذاء مماثلة للنتائج في Bbs2- وBbs4 خروج المغلوب الفئران. الزيادة في استهلاك الطعام تبدأ قبل بداية السمنة خلال فترة النمو اللحاق بالركب وتستمر بعد Mkks - / - الفئران تزن أكثر بكثير من النوع البري تتزاحم Mkks - / - لدى الفئران أيضا انخفاض في النشاط كما تقاس 24 ساعة القياس عن بعد. على أساس هذه المعطيات، يبدو أن البدانة الناجمة عن مزيج من فرط الأكل وانخفاض النشاط.
يتم إنتاج هرمون الليبتين الهرمون في الأنسجة الدهنية ويدور إلى ما تحت المهاد حيث يعمل على مستقبله. اللبتين هو عنصر هام في تنظيم الوزن على المدى الطويل. عندما نشط، فإنه يشير إلى انخفاض في الاستهلاك الغذائي وزيادة في استقلاب الطاقة مما يحد من درجة زيادة الوزن (25). ترتبط إلى حد كبير مستويات اللبتين مع BMI من الفئران والبشر (26). ويطلق على حالة من مستويات اللبتين مرتفعة الذي يحدث مع السمنة مقاومة اللبتين. وقد تم تحديد مقاومة اللبتين في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس السمنة (27). عند مقارنة تتزاحم طبيعية مع أربعة نماذج من الفئران من زيادة الوزن وراثيا، مافيي وآخرون. (26) وجدت ان مستويات هرمون الليبتين 10 أضعاف في فئرانا معدلة وراثيا آغوطي السكري والأصفر، 5 أضعاف أكثر في فئرانا معدلة وراثيا الدهون و 2 أضعاف يصل في فئرانا معدلة وراثيا بدين. في نموذج الفأر السمنة أخرى تفتقر إلى الببتيد neuromedin U، ومستويات هرمون الليبتين هي <2 أضعاف أعلى من التحكم من النوع البري (28). وقد تبين هذا النموذج لتكون مستقلة عن طريق اللبتين الإشارات. Mkks لدينا - / - الفئران لديها مستويات اللبتين في الدم 10 مرة من مستوى التحكم. وقد أفيد أن الشيخوخة النتائج في حالة مقاومة اللبتين في القوارض يعانون من السمنة المفرطة (29)، ولكن في Mkks لدينا -null الفئران، ونرى مستويات اللبتين مرتفعة في الفئران لا تتجاوز أعمارهم 9-12 أسابيع من العمر، قبل ظهور السمنة. ويبدو أن هذا يشير إلى أن مقاومة اللبتين تطور قبل السمنة.
زيادة ضغط الدم لوحظ في Mkks - / - الفئران يتسق مع التقارير السريرية لارتفاع ضغط الدم في المرضى الذين يعانون BBS (9، 30)، وكذلك مع رابطة قوية بين السمنة وارتفاع ضغط الدم (30). ارتفاع مستويات هرمون الليبتين تعميم يمكن أن تسهم في زيادة ضغط الدم لوحظ في Mkks السمنة - / - الفئران. في الواقع، إلى جانب تأثيره على الشهية والتمثيل الغذائي، ليبتين تعمل في منطقة ما تحت المهاد إلى زيادة ضغط الدم من خلال تفعيل الجهاز العصبي الودي (31).
وMkks -null سهم الماوس العديد من النتائج السريرية وجدت في المرضى الذين يعانون BBS البشري (الجدول 3). وMkks - / - نموذج الفأر يلخص النمط الظاهري لوحظ في نماذج الماوس BBS2- وBBS4 خروج المغلوب، على الرغم من بعض جوانب النمط الظاهري قد تكون أقل حدة. وتشير هذه الملاحظات أن الغياب الكامل للMKKS يؤدي إلى BBS، في حين من المرجح أن يكون النمط الظاهري MKS بسبب نتيجة الوظيفية للمركب His84Tyr / Ala24Ser أليل ذكرت في المرضى الذين يعانون MKS. (3). لقد تم الافتراض بأن الطفرة MKS هو ناقص المفعول، في حين أن الطفرات في MKKS تسبب BBS تمثل خسارة كاملة وظيفة (24). على الرغم من أن النتائج التي لوحظت في نموذجنا MKKS الماوس تتفق مع هذه الفرضية، والحالة الوظيفية للالمفترضة العديد من الطفرات BBS6 مغلطة لا يزال يتسم. وسوف تكون ذات فائدة لتحديد كيف تؤدي بعض الطفرات Mkks إلى انحطاط مبصرة والسمنة حين أن البعض الآخر لا يؤدي إلى هذه الظواهر.

الجدول 3.
مقارنة Mkks الماوس النمط الظاهري لBbs2 وBbs4 KO الفئران وMKS الإنسان وBBS الظواهر المرضى

المواد والأساليب

جيل من الفئران MKKS -knockout

تم استخدام 129 / SVJ الحمض النووي الجيني كقالب لاستنساخ شظايا PCR المشتقة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استنساخ A جزء 3.6 كيلوبايت تمتد الإكسونات 2-3 من الجين MKKS في الموقع كبن I / سال الأول، تليها الجينات المقاومة بالنيوميسين يحيط بها مواقع LoxP لاختيار إيجابية. كانت المنطقة المحيطة 3 "1.9 كيلوبايت NHE I / القانون المدني I تفتيت تمتد الإكسونات 3-4. تم استخدام كاسيت القاصي ثيميدين كيناز إلى 3'ذراع لاختيار السلبية. تم خطي متجه مع عدم I و electroporated إلى خلايا ES R1 (129X1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). وقد تم تحديد استنساخ مقاومة G418، والذي ناقلات تستهدف قد انضما إلى الجين MKKS، وذلك باستخدام تحليل PCR مع الاشعال تقع خارج المنطقتين 5'- والتي تستهدف 3'وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES لتوليد خطوط الماوس على C57BL / 6 الخلفية.

التنميط الجيني لفئران

تم مرمزة الفئران عن طريق PCR باستخدام الحمض النووي الجيني الذي أعد من الخزعات الذيل أو الأنسجة الجنينية. ولدت لنا 4.1 كيلوبايت 5'-جزء محدد لخروج المغلوب الفئران متخالف ومتماثل باستخدام التمهيدي خارج المنطقة المستهدفة (5'-TGCAGTTTTCAGGTAAGTTCCA-3 ') وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين (5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3). تم إنشاء A جزء 2.9 كيلوبايت مع التمهيدي خارج المنطقة المستهدفة 3'(5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 ') وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين (5'-AGCCAACGCTATGTCCTGAT-3). وقد تم تحديد الفئران خروج المغلوب متماثل باستخدام اثنين من أزواج التمهيدي في المنطقة المحذوفة (بمعنى 5'-TCGAAACCTTTCAGTCACCC-3 "، العقاقير 5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 '؛ والشعور 5'-TTCGAATCCCAGTTGACTTCAG-3"، العقاقير 5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 " ). وقد تم قالب طويل PCR في 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها 35 دورة في 94 مئوية لمدة 15 ثانية، 60 مئوية لمدة 30 ق، 68 C لمدة 5 دقائق والنهائي تمديد 7 دقيقة في 68 C.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل لطخة الشمالي

الأنسجة من فئران بالغة تم تجميد بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. أجريت مجموع استخراج الحمض النووي الريبي الخلوية، هلام الكهربائي، النشاف والتهجين وتصوير الإشعاع الذاتي خارج كما هو موضح سابقا (32). ولدت فأر الجزئي Mkks [كدنا التحقيق والمهجنة مع وصمة عار الشمالية. تم تجريده من لطخة من النشاط الإشعاعي وإعادة تهجين مع التحقيق [كدنا لβ -actin للتحقق من التحميل على قدم المساواة من الحمض النووي الريبي.

دراسات الوزن

لتقييم أوزان الأولية وزيادة الوزن، وتم وزن الحيوانات في 3 و 4 أسابيع من العمر، وعلى أساس شهري بعد ذلك. للدراسات الاستهلاك الغذائي، وأضيف على وزن ثابت من المواد الغذائية إلى كل قفص يحتوي على حيوان واحد، وكان وزنه الطعام المتبقية في 5 أيام من كل أسبوع. ثم تم حساب متوسط ​​الاستهلاك الغذائي للكل أسبوع.

مصل مستويات هرمون الليبتين

وقد تم جمع المصل من Mkks أنثى - / - الفئران (اثنان في 11 أسبوعا ويومين في 26 أسبوعا) والضوابط المطابقة سنهم. تم قياس مستويات اللبتين في الدم باستخدام متعدد تحليلها الشخصي (لاب نهر تشارلز).

شاشة المراقبة السلوكية الأولية

شاشة المراقبة الأولية هو تعديل لبروتوكول SHIRPA (22). التفاصيل الكاملة لإجراء التجارب ويمكن الاطلاع على الموقع الإلكتروني لشركاء الائتلاف الماوس الطفرات: لجنة نهر الميكونج الثدييات علم الوراثة وحدة هارويل، سميثكلاين بيتشام الصيدلة، كلية امبريال في لندن والملكة ماري ويستفيلد كلية، لندن، المملكة المتحدة (HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية. mgc.har.mrc.ac.uk/mutabase/). وتم قياس كمية البيانات من 38 ملاحظات منفصلة، ​​وسجل لكل حيوان. بدأ تقييم كل حيوان مع ملاحظة السلوك دون عائق في أسطواني واضحة جرة العرض (ارتفاع 20 سم، وقطره 11 سم). ثم تم نقل الفئران إلى الساحة (45 × 25 سم 2) لمراقبة السلوك الحركي. وأعقب ذلك سلسلة من التلاعبات التي قيمت رؤية، قوة قبضة، المنعكس التقويمي، انجذاب بالجاذبية السلبية، لهجة الجسم، وردود الفعل، أطرافهم لهجة، وأثار العض واللعاب. طوال هذا الإجراء، وسجلت حالات شاذة السلوك، والخوف، والتهيج، والعدوان أو النطق. ومتشكلة الإجراء على ما مجموعه 57 فئران بالغة، 10 من الذكور والإناث تسع الفئران Mkks خروج المغلوب ومتغايرة والنوع البري في العمر كعينة ضابطة بهم. تم تقييم عدد مماثل من Bbs4 فارغة، وBbs2-اغية والفئران متخالف والنوع البري. كانوا ملثمين المراقبين الأساسي للبيانات التنميط الجيني.

هيمنة الاجتماعية أنبوب الاختبار

تم اختبار (14 ذكرا وتسع إناث لكل منهما) ثلاثة وعشرين Mkks البرية من نوع، متغايرة وخروج المغلوب الفئران كما هو موضح سابقا (33) في 30 سم × 3.5 سم القطر (3.0 سم قطر للفئران الأصغر، 4.5 سم القطر للحصول على أكبر الفئران) أنبوب. اثنين من الفئران نفس الجنس العمر المتطابقة، من نوع البرية، ومتغايرة أو بالضربة القاضية وضعت، على طرفي نقيض من الأنبوب وأفرج عنه. أعلن وهناك موضوع ل"الفائز" عند خصمه المدعوم من الأنبوب. تم تنفيذ كل الاقتران مرتين في ترتيب عشوائي لما مجموعه 138 مباراة الصعود. تم اختبار ثلاثين الفئران Bbs4 و 33 الفئران Bbs2 بطريقة مماثلة.

اختبار حاسة الشم

تم اختبار اثني عشر من النوع البري، متغايرة وخروج المغلوب الفئران (خمسة ذكور وسبع إناث لكل منهما) كما هو موضح سابقا (34). تم تقييم قدرة حاسة الشم مباشرة بعد فترة 3 ساعات من الحرمان من الطعام. كانت مخبأة قطعة صغيرة من دوريتوس ناتشو الذرة رقاقة تحت 1-3 سم من الفراش في قفص الماوس نظيفة. وأطلق سراح كل الماوس في قفص وسجلت الوقت اللازم لتحديد موقع رقاقة لمدة أقصاها 20 دقيقة. وبالمثل، تم اختبار 16 الفئران Bbs4 فارغة (10 إناث وستة ذكور) و 13 الفئران Bbs2 (ستة من الذكور والإناث سبعة) مع وجود ضوابط متغايرة والبرية من نوع الخاصة بهم.

ضغط الدم والنشاط

تم استخدام نظام راديو القياس عن بعد لتسجيل الضغط الشرياني ومعدل ضربات القلب والنشاط. تم تخدير الفئران مع الكيتامين (91 ملغ) وزيلازين (9.1 ملغم) كوكتيل البريتونى. تم عزل الشريان السباتي المشترك اليسار وتم إدراج القسطرة وتعادل بشكل آمن باستخدام الحرير. وقد تراجع الارسال تحت الجلد وصولا إلى 'جيب' الحرة تشريح على طول الجهة أقرب إلى hindlimb الصحيح ممكن. تم إغلاق شق الرقبة باستخدام الحرير وزيادة مختومة مع لاصق الأنسجة. بعد أن سجلت 1 أسبوع للتعافي من الجراحة، والضغط الشرياني ومعدل ضربات القلب والنشاط في الدولة غير المقيد واعية لمدة 5 أيام.

التحليل الصرفي من Mkks - / - الفئران

أجريت الدراسات المورفولوجية كما هو موضح سابقا (19، 20). تم فحص المقاطع من اثنين على الأقل خروج المغلوب والبرية من نوع الحيوانات في نقطة زمنية. وتشمل الأنسجة فحص العيون، والخصيتين والكلى. كانت ملطخة الأكريلاميد أقسام جزءا لا يتجزأ مع الهيماتوكسيلين يوزين وصمة عار وجمعت photomicrographs باستخدام أوليمبوس BX-41 المجهر مع الكاميرا الرقمية SPOT-RT. تم إصلاح الكلى من الشباب الفئران خروج المغلوب القديمة 2-أسابيع عن طريق الغمر في نصف قوة تثبيتي Karnovsky بين عشية وضحاها، وكانت شظايا القشرية نقطة حرجة المجفف وتفل المغلفة قبل تصوير مجهري باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح هيتاشي S4000 (مرفق المركزية المجهر البحوث، جامعة ولاية ايوا ).

ثقافة MTEC

تم إجراء ثقافة MTEC (22). لفترة وجيزة، كان المثقف خلايا القصبة الهوائية إما من عمره 6 أسبوع أو 8 أشهر من العمر من النوع البري وBbs6 خروج المغلوب الفئران عند 37 مئوية مع CO 2 5٪ في المعدل المتوسط ​​النسر Dulbecco و(DMEM) / هام في F12 المتوسطة تستكمل مع 4 m m glutamine, 10 U/ml penicillin, 10 µg/ml streptomycin, 5% fetal bovine serum (all Gibco BRL), 10 µg/ml insulin (Roche), 5 µg/ml human transferrin, 62 µg/ml cholera toxin, 10 n m retinoic acid (all Sigma), 5 ng/ml epidermal growth factor and 0.03 mg/ml bovine pituitary extract (both BD Biosciences), on rat-tail-collagen (BD Biosciences) coated Transwell-membranes (CoStar).مرة واحدة وصلت إلى ثقافة confluency، تم إنشاء واجهة الهواء السائل عن طريق إزالة المتوسطة من المقصورة العلوية وإضافة DMEM / F12 المتوسطة مع 2٪ فقط NuSerum (BD) و 10 ن م حمض الريتينويك إلى انخفاض المقصورة. تم تغيير مستنبت في مجلس النواب مرتين في الأسبوع. لتصور ميكروتثبول الهدبية، وخلايا ثابتة في وقت واحد وpermeabilized لمدة 5 دقائق في المخزن PHEM (60 م م أنابيب، 25 م م HEPES، 10 م م EGTA، 2 م م MgSO 4، ودرجة الحموضة 7.0) تحتوي على 0.5٪ الفورمالديهايد، 0.1٪ غلوتارالدهيد و 0.5٪ تريتون X-100، تليها تثبيت لمدة 10 دقيقة في PHEM العازلة التي تحتوي على 1٪ الفورمالديهايد. وتصور أهداب التي وصفها immunocytochemical مع β-IV تويولين الأضداد (Biogenex) وكان ينظر باستخدام مجهر multiphoton بيو راد.

تحليل البيانات

تم تحديد أهمية استخدام الطالب ر -test. عند الاقتضاء، على سبيل المثال مع بيانات المحجمة من الملاحظات السلوكية الأساسية، أجريت تحاليل اللامعلمية باستخدام اختبار فيشر الدقيق.

شكر وتقدير

نشكر P. كارب، K. بوغه، M. Olvera، C. ايستمان، R. سويديرسكي، R. بيرى، A. فيشر وK. فولكن للحصول على المساعدة الفنية وD. أغيار كراوتش للمساعدة الإدارية. علينا أيضا أن نعترف جامعة أيوا، قسم علم الأمراض ومرفق المركزية المجهر الإلكتروني البحوث في جامعة ولاية ايوا للحصول على المساعدة. وأيد هذا العمل من قبل المنح والمنظمات التالية: المنح NIH P50-HL-55006 (VCS) وR01-EY-11298 (VCS وEMS)، كارفر كارنيغي للطب العيون الجزيئية (EMS وVCS) والبحوث للوقاية من العمى، نيو نيويورك، NY (قسم العيون بجامعة أيوا). VCS ونظم الإدارة البيئية المحققين من معهد هوارد هيوز الطبي.
  • © المؤلف 2005. نشرت من قبل مطبعة جامعة أكسفورد. جميع الحقوق محفوظة. لضوابط، يرجى البريد الالكتروني: journals.permissions@oupjournals.org
المراجع

  • ↵
    الحجر، DL، Slavotinek، A.، بوفارد، GG، بانيرجي-باسو، S.، Baxevanis، AD، بر، M. وBiesecker، LG (2000) تحور الجين ترميز chaperonin المفترض تسبب متلازمة McKusick-كوفمان. نات . جينيه.، 25، 79 -82.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    روبينوف، M. وشو، A. (1979) ومتلازمة McKusick-كوفمان: رتق ورثت مقهور المهبل، موه رحمي مهبلي، الازدواجية رحمي مهبلي، الشذوذ الشرجية، polydactyly خلف المحور، وأمراض القلب الخلقية J. Pediatr.، 94، 776 -778.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Slavotinek، AM، حجر، EM، Mykytyn، K.، Heckenlively، JR، أخضر، JS، هيون، E.، Musarella، MA، Parfrey، PS، شيفيلد، VC وBiesecker، LG (2000) الطفرات في MKKS تسبب Bardet- متلازمة بيدل. نات. جينيه.، 26، 15 -16.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    فريدمان، J.، Nimmesgern، E.، Erdjument-Bromage، H.، الحائط، JS، Tempst، P. وهارتل، FU (1992) وظيفة في طي البروتين من TRIC، مجمع خاتم عصاري خلوي يحتوي على TCP-1 وما يتصل بها من الناحية الهيكلية مفارز. EMBO J.، 11، 4767 -4778.
    ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    أخضر، JS، Parfrey، PS، هارنيت، JD، فريد، NR، كريمر، BC، جونسون، G.، هيث، O.، McManamon، PJ، أوليري، E. وPryse فيليبس، W. (1989) المظاهر الأساسية للمتلازمة بارديه-بيدل، وهو شكل من متلازمة لورنس-مون بيدل. N ENGL. J. ميد.، 321، 1002 -1009.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • بيدل، A. (1922) عين geschwisterpaar معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا adiposo-genitaler dystrofie. Dtsch. ميد. Wochenschr.، 48، 1630.
  • بارديه، G. (1920) سور الامم المتحدة متلازمة دي obesite الطفلي AVEC poldactylie آخرون retinite مصطبغ. أطروحة دكتوراه، جامعة باريس، باريس، ص 479.
  • Elbedour، K.، زوكر، N.، Zalzstein، E.، بركي، Y. وكرمي، R. (1994) تشوهات القلب في متلازمة بارديه-بيدل: دراسات تخطيط صدى القلب من 22 مريضا (انظر التعليق). آم. J. ميد. جينيه.، 52، 164 -169.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    هارنيت، JD، أخضر، JS، كريمر، BC، جونسون، G.، الإنزعاج، L.، McManamon، P.، فريد، NR، Pryse فيليبس، W. وParfrey، PS (1988) الطيف من المرض الكلوي في لورانس-مون بيدل متلازمة. N. ENGL. J. ميد.، 319، 615 -618.
    ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Mykytyn، K.، براون، T.، كرمي، R.، حيدر، NB، Searby، CC، شاستري، M.، بيك، G.، رايت، AF، يناكوني، A.، Elbedour، K. وآخرون. ( 2001) تحديد الجين الذي، عندما تحور، يسبب متلازمة السمنة الإنسان BBS4. نات. جينيه.، 28، 188 -191.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • نيشيمورا، DY، Searby، CC، كرمي، R.، Elbedour، K.، فان Maldergem، L.، فولتون، AB، لام، BL، باول، BR، سويديرسكي، RE، بوغه، KE وآخرون (2001) الموضعية استنساخ الجين الرواية على الصبغي 16q تسبب متلازمة بارديه-بيدل (BBS2). همهمة. مول. جينيه.، 10، 865 -874.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • Katsanis، N.، Beales، PL، وودز، MO، لويس، RA، أخضر، JS، Parfrey، PS، انسلي، SJ، ديفيدسون، WS وLupski، JR (2000) الطفرات في MKKS تسبب السمنة، وضمور الشبكية وتشوهات الكلى المرتبطة متلازمة بارديه-بيدل. نات. جينيه.، 26، 67 -70.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • Mykytyn، K.، نيشيمورا، DY، Searby، CC، شاستري، M.، الين، HJ، بيك، JS، براون، T.، Streb، LM، Cornier، AS، كوكس، GF وآخرون (2002) تحديد الجين (BBS1) تشارك الأكثر شيو

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #25  
قديم 11-23-2015, 10:05 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تثبيط الهجرة قمة العصبية راء dysmorphology القحفي والمرض هيرشسبرونغ في متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/105/18/6714.full




التعرف على الوجه أمر أساسي لتشخيص العديد من المتلازمات، وربما تعكس أنماط القحفي مسببات المشتركة. في متلازمة عديد المظاهر بارديه-بيدل (BBS)، وciliopathy الابتدائية يعانون من ضعف النقل intraflagellar، المرضى الذين لديهم الوجه "الجشطالت" المميز الذي dysmorphologists وجدت صعوبة في تميز. هنا، فإننا نستخدم النمذجة السطحية كثيفة (DSM) لتكشف عن أن المرضى BBS والمسوخ الماوس لديها عيوب منتصف الوجه التي تشمل الهياكل المستمدة من قمة العصبية المتجانسة التي تتقاسمها morphants الزرد. تنشأ هذه العيوب من القحفي (CF) هيكل عظمي من الجمجمة الشاذة خلية قمة العصبية (NCC) الهجرة. ولا تقتصر هذه الآثار إلى المنطقة القحفي، ولكن تفشل البلدان المساهمة الصافية العصب الحائر المشتقة لتجميع الجهاز العصبي المعوي، وبلغت ذروتها في المختلين الأمعاء على الحركة. وعلاوة على ذلك، morphants عرض بصمات تعطلت سونيك القنفذ (Shh على) يشير من خلاله البلدان المساهمة الصافية تأخذ العظة الموضعية. نقترح نموذجا حيث البروتينات BBS تعدل الهجرة NCC، والمساهمة في التشكل القحفي وتطوير الجهاز العصبي المعوي. كما شرح هذه العيوب الهجرة جمعية مرض هيرشسبرونغ (HD) مع BBS. وعلاوة على ذلك، وهذا هو أسلوب غير موصوف سابقا من استخدام توصيف dysmorphology الوجه كأساس للتحقيق في ميكانيكية حدوث تنمية CF في متلازمات تشوه.
الاعتراف ب "الجشطالت" الوجه أمر أساسي لتشخيص كثير من الأمراض الوراثية، ولكن التقلب الكبير في ملامح غالبا ما يعيق تصنيف الناجح (1). dysmorphology مؤخرا، وقد تميزت موسع التصوير 3D سطح في متلازمات (2، 3). لا شيء، ومع ذلك، فقد استخدمت لتحديد الوجه إما خلل البنية؛ شوهة أو المساعدات التحقيق خفية من آليات dysmorphology القحفي.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) يسبب تنكس الشبكية، آخر polydactyly المحوري، والسمنة، والفشل الكلوي، وضعف الادراك. وقد تم اكتشاف اثني عشر BBS الجينات (BBS1-BBS12)، والتسبب في خلل يكمن أهداب الابتدائي (4). يتم التعبير عن BBS4، BBS6، وBBS8 (التحقيق في هذه الدراسة) في ظهائر مهدبة وتوطين للهيئات الجسيم المركزي والقاعدية من الخلايا المهدبة (5 - 7). وقد تم الإبلاغ عن حالات الشذوذ القحفي خفية في المرضى (8 - 10). من بين ميزات إضافية عديدة من BBS هو مرض هيرشسبرونغ (HD)، اضطراب في الجهاز المعوي العصبي (ENS) (11).
تيارات الخلايا قمة العصبية (البلدان المساهمة الصافية) من النموذج الدماغ الذيلية معظم من القحفي (CF) هيكل عظمي (انظر المرجع 12 للمراجعة). الجمجمة البلدان المساهمة الصافية (CNCC) تتبع مسارات محددة لتجميع بروز جبهي أنفي وخيشومي قوس اللحمة المتوسطة. هنا، فإنها تتكاثر وتتمايز إلى هياكل الوجه والجمجمة. سونيك القنفذ (Shh على) أعرب في الدماغ بطني والأديم الظاهر الشفوي ضروري لتشكيل معظم الهياكل الوجه (12). الفئران التي تعاني من نقص SHH لها خسارة فادحة في العظام القحفي، و، في البشر، والطفرات SHH تسبب عيوب خط الوسط CF مع اندماج مقدم الدماغ (HPE) (12).
وENS ينظم حركية الجهاز الهضمي وإفراز. انها تستمد من البلدان المساهمة الصافية العصب الحائر والقطنية العجزية (13). في HD، وتتميز تضخم القولون، وهناك انخفاض أو العقد المعوي غائبة في القولون البعيدة.
على الرغم من وفرة الأدلة الحديثة تشير إلى خلل وظيفي الهدبي في BBS، سواء عيوب الوجه و الجهاز الهضمي يصعب التوفيق على هذا الأساس وحده. في هذه الدراسة، وتبين لنا أن البروتينات BBS مطلوبة للهجرة NCC، وبلغت ذروتها في العيوب القحفي Shh على التي تعتمد، واضطراب الأمعاء على الحركة، من المحتمل وراء جمعية HD مع BBS.
النتائج

ثلاثي الأبعاد الكثيفة النمذجة السطحية (DSM) تكشف عيوب الوجه والجمجمة المقارنة في الإنسان والفأر.

لتقييم عيوب CF في BBS، أجرينا 3D DSM تحليل الوجه على 83 مريضا (بغض النظر عن الطفرات) و 230 الضوابط. لمراعاة الفروق النمو، وأجريت التحليلات بشكل منفصل عن مواضيع <20 عاما. تم المشروح بمسح الوجه مع المعالم الرئيسية [المعلومات الداعمة (SI) الشكل. S1]، حسبت DSMs من مناطق الوجه والأنف لمجموعات فرعية من وجوه، وتم قياس الفروق بين السيطرة والمعالم BBS. العديد من القياسات بين المعالم أو كانت أهم طول الشاذة وعرض الوجه (الشكل S2). لتجنب آثار الأنسجة الرخوة المفرطة في وجوه المرضى، ونحن المقيد الأول تحليل شكل لمنطقة الأنف حيث السمنة لديه الأقل تأثير. أظهرت اللون لمسافات تلوينها مقارنات متوسط ​​BBS وأنوف السيطرة للأطفال والكبار الأنف تنسج الجسر وتقصير الانف / انخفاض bulbosity في طرف الأنف (الأحمر والأصفر، الشكل 1 A و B). نقرأ ديناميكية بين BBS والسيطرة تعني أنوف تظهر هذه الخلافات وشكل أخرى في جناح الكبير الأنف وcolumella (انظر أفلام S1 و S2). اختبار Multifolded باستخدام نمط خوارزميات الاعتراف أقامت تمييزا كبيرا [المتلقي مشغل خاصية (ROC) تحليل]، وذلك باستخدام شكل الأنف وحدها (الجدول S1). في المرضى البالغين، وأظهرت مقارنات مرمزة المسافة من متوسط ​​شكل الوجه مع أن من الضوابط النزوح التصاعدي النسبي للأنف والشفة العليا (المناطق الزرقاء في الشكل 1 C)، في منتصف الوجه تنسج وretrognathia معتدل (المناطق الأحمر والأصفر من الشكل 1 D).

تين. 1.
لون لمسافات تلوينها التشكل نفسه من المرضى BBS (الأنف والوجه) وBbs6 فئرانا معدلة وراثيا (جماجم الجافة) مقارنة مع الضوابط WT. (A و B) مقارنة وضعها الطبيعي على السطح للأطفال BBS (A) / بالغين (B) مع بقع حمراء والأصفر يظهر نقص تنسج على جسر الأنف وتقليل طول / bulbosity في طرف الأنف. (C) مقارنة الرأسية للمرضى البالغين من الذكور مع التصحيح الأزرق يظهر تقصير منتصف الوجه. (D) عمق الحكمة للمرضى الكبار أنثوية المنطقة الحمراء الأصفر تظهر تسطيح منتصف الوجه وretrognathia معتدل. المقارنة (E) عمودي للأطفال BBS مع التصحيح الأزرق يظهر تقصير منتصف الوجه. (F) مقارنة العمق الحكمة للأطفال BBS مع المنطقة الحمراء الأصفر تظهر تسطيح منتصف الوجه وretrognathia معتدل. (G) عادي على السطح بالنسبة للفئران Bbs6 مع الأحمر والأصفر المنطقة للحد من يظهر في المناطق القاطعي والفكين (ملاحظة: تم إزالة الفك السفلي قبل التصوير). عرض (يسار) Dorasl. (يمين) عرض جانبي.

المكون الرئيسي 3 من DSM للأطفال تحكم يعكس التسطيح من منتصف الوجه، وارتبط توضع خلفي الفك السفلي بقوة [بيرسون حظة المنتج الارتباط (PPMC) = 0.81] مع الموقف تصنيف وجها فيما يتعلق السيطرة متوسط ​​وBBS الأطفال وجوه (الشكل S3). و/-تعديل حجم المقارنة عمر متوسط ​​أثرت BBS وأظهرت وجوه الأطفال التحكم أكبر عرض الوجه والأنف النزوح التصاعدي (الشكل 1 E)، وكذلك تسطيح منتصف الوجه وretrognathia (الشكل 1 F). نتائجنا تشير إلى أن هذه التقنية يمكن أن يميز الظواهر الوجه خفية تتحدى حتى dysmorphologists خبرة.
نحن التحقيق المقبل ما إذا كانت نماذج الماوس BBS (Bbs4 - / - وBbs6 - / -) قد يكون التشوهات القحفي مماثلة Bbs4 - / - (ن = 31)، متخالف (ن = 30)، وWT (ن = 20) وكانت الفئران تصوير باستخدام الليزر الماسح الضوئي 3D (الشكل S2). على الرغم من الخلافات الجسيمة في علم التشريح القحفي بين البشر والفئران، وهناك أوجه تشابه كبيرة في النسب الرئيسية، بما في ذلك أكبر عرض منتصف الوجه إلى ارتفاع (P <0.01)، وخطم أقصر (P <0.01). شوهدت تشوهات مماثلة في سطح Bbs6 الفئران -null (الجدول S2). وأظهرت الزيجوت لم الشذوذ التاريخي.
لتحديد أصول العظمية مفصلة للتغيرات القحفي، فإننا 3D المقبل ليزر سطح الممسوحة ضوئيا Bbs6 - / - (ن = 9) وWT (ن = 15) الجماجم. مرمزة مقارنات بين الأسطح الجمجمة يعني تؤكد أن تقصير يعزى إلى نقص تنسج طليعة الفك العلوي والفك العلوي، مما أدى إلى خطم أقصر بكثير، على غرار عجز الإنسان (الشكل 1 F و G والسينما S3).
BBS Morphants الزرد لديها عيوب الوجه والجمجمة انعكاس المسوخ الثدييات.

على الرغم من الاختلافات الشكلية بين الجماجم الثدييات والأسماك، وكثير من نفس الجزيئات يشير تنظيم تنميتها، وتنظيم الهيكل العظمي الجمجمة يشبه بشكل ملحوظ (12). وneurocranium الأمامي (ANC) ويتكون من الترابيق ولوحة الغربالية، وكلاهما NC مستمدة ومماثلة للفك العلوي الثدييات (14).
لتقييم مسببات العيوب CF الإنسان والفأر، ونحن حقن الأجنة الزرد مع bbs4، bbs6، وmorpholinos bbs8 (MO) وتصور الغضاريف في الجمجمة في 5 أيام postfertilization (إدارة الشرطة الاتحادية). وعلى الرغم من التقارب والإرشاد (CE) عيب (15، 16)، وكان morphants bbs4 التشكل CF طبيعي إلى حد كبير (الشكل 2 B، G، وL و A، F، K و) على الرغم من ان الفك السفلي أوسع وأقصر. في morphants bbs6، وتقصير ANC، ضغط الوجه (الجدول S3). وقد تقلص إلى حد كبير في الفك السفلي، وكان هناك عدد أقل من الأقواس خيشومي مصبغ (الشكل 2 وأعرب على نطاق واسع C، H، وM). bbs8 في الجنين الزرد (الشكل. S4).

تين. 2.
عيوب قمة القحفي والعصبية في BBS الزرد morphants. (A-E) وجهات النظر بطني من wholemount، الألسيان الأزرق الملون، الزرد 5 DPF. morphants bbs8 هم أشد (D)، مع فقدان جهاز البلعوم (2D رأس السهم)، الفك السفلي، وتقصير من القحف الغضروفي. (F-J) إطلالة جانبية على اليرقات التي تبين الحد من الأقواس خيشومي وتقصير من الفك السفلي في bbs6 وbbs8 morphants. (K-O) Flatmounts من neurocrania من الضوابط وmorphants. morphants bbs8 غالبا ما يكون انصهار الترابيق في خط الوسط (رأس السهم) مماثلة لسيو المسوخ. (P-T) Crestin في الموقع في الأجنة 20ss يكشف تيارات الهجرة البلدان المساهمة الصافية في الضوابط (رأس السهم) مع عدد أقل من تدريجيا تيارات في bbs4، bbs6، وmorphants bbs8، على التوالي. (U-X) Sox10: EGFP التعبير في الهجرة تيارات (السهام) يظهر انخفاض مماثل في عدد من تيارات إلى التعبير crestin. (Y) الكمي لعدد من تيارات في morphants يؤكد وجود خلل الهجرة قمة العصبي الشديد في morphants bbs8 التي يمكن انقاذهم من قبل مرنا البشري. (Z و AA) التعبير DCT في 27 HPF الأجنة التحكم (Z) وmorphants bbs8 (AA). [الحانات مقياس: 500 ميكرون (A-J)، و 100 ميكرون (K-O)، و 100 ميكرون (P-X).]

وقد لوحظت العيوب أشد باستمرار مع MO bbs8: تصبغ، تصقلب جزئية، والحد من القحفي الذي تم تقصير ANC مع خط الوسط انصهار الترابيق (الشكل 2 D، I، وN). في ≈20٪ من الحالات، كان الغضروف غائبة تماما في الرأس (الشكل 2 D أقحم). وكانت الفك السفلي والأقواس خيشومي غائبة تماما في 5 DPF (الشكل 2 D)، وSox10 التعبير في 72 HPF (انظر الشكل S5 A) أظهرت هذه فشلت في تشكيل. Coinjections مع bbs8 الإنسان مرنا انقاذ هذه العيوب تماما (الشكل 2 E، J، وO)، كما فعل bbs4 وbbs6 مرنا (لا تظهر البيانات). عن طريق حساب النسبة بين حزب المؤتمر الوطني الافريقي وطول الجسم، وأظهرت أن حزب المؤتمر الوطني الافريقي تقصير مستقلة عن عيوب CE (الشكل. S6 A).
NCC الهجرة يكمن وراء النمط الظاهري الجمجمة في الزرد.

الغالبية العظمى من هيكل عظمي رئيس مستمد من CNCC، والتي تهاجر الخلايا بطريقة النمطية إلى الأقواس الخيشومية وعملية الجبهي الأنفي. لمعرفة ما إذا كانوا متورطين البروتينات BBS في الهجرة NCC وCF التشكل، ونحن التحقيق ثلاث مراحل رئيسية في وقت مبكر NCC التنمية: المواصفات، والصيانة، والهجرة في morphants BBS. كانت تعبيرا عن foxd3 وsox10 العادي في مرحلة 5 الجسيدة (اس اس)، تثبت أن تلك المواصفات دون تغيير (الشكل S7). في الشمس 12ss، تدل التعبير عن crestin أن صيانة NCC كانت طبيعية (الشكل S7).
ومع ذلك، في 20ss، تعطلت تيارات crestin -expressing البلدان المساهمة الصافية التي تهاجر عادة من الناحية البطنية من الأنبوب العصبي (NT) في الجذع في BBS morphants. درجة الهجرة ترتبط مع مستوى CF عيب (أشد في morphants bbs8) (الشكل 2 P-S). الكمي للتيارات الهجرة (الشكل 2 Y) يرتبط مباشرة مع نسبة تناقص طول قحفي عصبي إلى العرض في bbs4، bbs6، وmorphants bbs8، على التوالي (الشكل. S6 B). لإثبات هذه البيانات في الموقع التهجين، لاحظنا وجود نمط مماثل للهجرة NCC باستخدام Sox10: EGFP الزرد، التي تعبر عن GFP في البلدان المساهمة الصافية (هدية من R. Kelsh) (الشكل 2 U-X) (14). مرة أخرى، تم انقاذ النمط الظاهري bbs8 مع مرنا البشري (الشكل 2 T). وفرة من البلدان المساهمة الصافية في NT تشير إلى أن الاستقراء، والصيانة، أو الانتشار لا يتأثر. بدلا من ذلك، هناك تثبيط هجرة الخلايا.
دعما لدور مشتبه بهم لBbs8 في تطوير NC، وmorphants bbs8 التي عرقلت التشكل القحفي وتقريبا لا الجذع NC الهجرة، يفتقر أيضا الخلايا الصباغية، النسب آخر NC مشتقة. لم يكن هناك أي تعبير عن DCT، علامة السلائف الصباغية، في morphants bbs8 في 27 HPF مقارنة مع الضوابط (الشكل 2 Z و AA).
اخترنا لدراسة morphants bbs8 أبعد من ذلك، باستخدام Sox10: الزرد المعدلة وراثيا EGFP. في التحكم في الشمس 12ss، البلدان المساهمة الصافية قد بدأت للتو إلى الهجرة من المنطقة وراء العين في الرأس (الشكل 3 A). بواسطة 20ss، والبلدان المساهمة الصافية هاجروا إلى المنطقة الأمامية الأكثر من الجنين، ≈250 ميكرون (الشكل 3 B). في morphants bbs8، فشلت الهجرة ليبدأ بحلول الشمس 12ss (الشكل 3 C). بواسطة 20ss، قد الخلايا هاجروا فقط في منتصف العين، ≈80 ميكرون (الشكل 3 D).

تين. 3.
الهجرة قمة العصبية في morphants bbs8. (A و B) Sox10: GFP الزرد المعدلة وراثيا تظهر هجرة CNCCs الأمامية بين 12 (A) و20ss (B). ويمثل كمية الحركة خلال الفترة 4-ساعة في B عن طريق الفرق بين الأبيض (الموقف في الشمس 12ss) والأحمر (الموقف في 20ss) النصال، ≈250 ميكرون. (C و D) تثبيط الهجرة CNCC في morphants bbs8. انتقلت على بعد مسافة صغيرة (80 ميكرون) فقط في الفترة 4-ساعة. (E و E ') البلدان المساهمة الصافية من السيطرة الأجنة المحقونة MO المطعمة إلى المضيفين السيطرة تهاجر الأمامية لملء الرأس. يظهر السهم في موضع الخلية anteriormost يظهر تغير في الموقف خلال الفترة 4-ساعة. (F و F ') الخلايا المأخوذة من متبرعين morphant bbs8 تفشل في ترحيل عند زرعها في المضيفين السيطرة، مما يشير إلى أن الخلل الهجرة غير خلية مستقلة. (G و G ') خلايا مراقبة زرعها في bbs8 المضيفين morphant الهجرة كالمعتاد. (H) وانا مراقبة والأجنة morphant في 48 HPF تظهر Sox10: EGFP التعبير في الترابيق النامية التي تفشل في استطال في morphants. (J) المهاجرة CNCCs التحكم في 14ss تظهر نتوءات filopodial الاستقطاب (السهام) أساسا في اتجاه الهجرة (السهم كبير). تبقى (K) CNCCs bbs8 morphant تتجمع بإحكام وعدم وجود نتوءات الاستقطاب. (L) في المختبر الصفر التئام الجروح فحص على 3T3 الخلايا يظهر الإغلاق المتأخر من الفجوة في Bbs8 خلايا ضربة قاضية مقارنة مع الضوابط. (M) الرسم البياني قياس عرض الفجوة على مدار الساعة 48 ساعة. (N) نفس التئام الجروح فحص باستخدام الخلايا الليفية الأولية المأخوذة من يتأثر وBBS8 - / - المرضى يظهر أيضا الهجرة تأخر. الخلايا (O) BBS8 المرضى تهاجر أبطأ من السيطرة. (P) الاستقطاب microfilaments الأكتين في السيطرة 3T3 الخلايا المهاجرة إلى الفجوة الجرح. خلايا ضربة قاضية (Q) Bbs8 لها الأكتين الهيكل الخلوي المختلين. (R و S) ولخص هذا الاضطراب في هجرة الخلايا الليفية الأولية للمرضى. [الحانات مقياس: 100 ميكرون (A-G)، 100 ميكرون (H وI)، 20 ميكرون (J و K)، و 200 ميكرون (L و N)، و 20 ميكرون (P-S)]

لتحديد ما إذا كان هذا الاضطراب الهجرة غير خلية مستقلة أو نتيجة لتثبيط الأنسجة المجاورة، أجرينا تجارب التطعيم. تم coinjected EGFP الأجنة وراثيا مع عنصر تحكم أو bbs8 MO: Sox10. في 4 HPF، تم زرع خلايا من متبرعين حقنها التحكم أو المضيفين morphant. تم تصوير عملية زرع ناجحة في الشمس 12ss لمدة 4 ساعات. على زرع ضبط MO حقن الخلايا في المضيفين السيطرة، والبلدان المساهمة الصافية هاجر الأمامية ≈150 ميكرون (الشكل 3 E وE '). ومع ذلك، الخلايا المانحة bbs8 morphant زرعها في المضيفين السيطرة فشلت في الهجرة، مما يوحي بأن فقدان Bbs8 لها دور خلايا مستقلة في تثبيط الهجرة (الشكل 3 F وF '). الخلايا المانحة السيطرة زرعها في المضيفين morphant هاجرت عادة، مما يثبت أن تثبيط الهجرة غير الثانوي إلى تثبيط الأنسجة (الشكل 3 G و G ').
لاستبعاد احتمال وجود فشل في وقت مبكر من انتشار NC، نحن FACS فرز كاملة Sox10: السيطرة EGFP والأجنة morphant في 16ss و20ss. وكانت نسبة البلدان المساهمة الصافية في morphants مماثلة لضوابط في 20ss (4.4٪ مقابل 4.7٪، P = 0.23) (الشكل. S6 G و H). نحن أيضا استبعاد موت الخلايا NC كما أن العامل المسبب، وذلك باستخدام 7AAD لتحديد عدد الخلايا الميتة Sox10 إيجابية (الضوابط 0.5٪ مقابل 0.7٪ morphants). وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام علامة PH3 الإنقسامية، ونحن لا نرى أي اختلاف في انتشار الخلايا Sox10 إيجابية في 24 HPF أو 72 HPF في morphants (الشكل S5 A-D).
استبعدنا بجانب إمكانية misdifferentiation من البلدان المساهمة الصافية. على الرغم من أن جذع morphant البلدان المساهمة الصافية بقي في NT، فإنها لم تفرق بشكل غير لائق في الخلايا العصبية في 30 HPF (HUC / D) (الشكل S5 E و F).
في 48 HPF، لاحظنا عدم تمديد الترابيق البدائية وعدم وجود لوحة الغربالية في تأسيس المؤتمر الوطني الأفريقي في morphants bbs8 في Sox10: الأجنة EGFP (الشكل 3 H وI)، مما يدل على أن dysmorphology CF ينشأ من انخفاض في في وقت مبكر الهجرة NCC، مما يؤدي إلى فشل خلايا لتجميع لوحة الغربالية.
التصوير عالية الطاقة من CNCCs المهاجرة الأمامية حول العين يظهر نتوءات خلية الاستقطاب أساسا في اتجاه الهجرة في التحكم في الشمس 12ss (الشكل 3 J). في morphants bbs8، كانت هذه الخلايا متفاوت بإحكام وتفتقر إلى نتوءات رأيت على الخلايا السيطرة (الشكل 3 K).
بعد ذلك، درسنا الهيكل الخلوي أكتين في الهجرة CNCCs، NIH 3T3، والخلايا الليفية الأولية من المرضى BBS8. على الرغم من الصعوبات في حل الهيكل الخلوي من CNCCs في الجسم الحي، لاحظنا microfilaments غير منظم في morphants (لا تظهر البيانات). وكان الهيكل الخلوي أكتين mispolarized أكثر وضوحا في Bbs8 تعاني من نقص الخلايا الليفية 3T3 والابتدائية (الشكل 3 L-O). وأظهرت هذه الخلايا نقص حاد في استقطاب الهيكل الخلوي. في البداية المقايسات التئام الجروح، تم تخفيض الهجرة في المسوخ كل أنواع الخلايا، مقارنة مع الضوابط (الشكل 3 P-S).
شاذ Noncanonical WNT اشارة قد تكمن وراء النمط الظاهري هجرة.

وينظم الهجرة NCC في وقت مبكر عن طريق الإشارات WNT noncanonical (17). الأعلى وإلى الأسفل تنظيم noncanonical WNT يشير كلا تمنع الهجرة NC (17). في ضوء الأدلة مسبق من تورط من البروتينات BBS في هذا المسار (16)، ونحن اختبار ما إذا كان هذا الدور قد يمتد إلى البلدان المساهمة الصافية.
نحن الناجم عن noncanonical يشير WNT في الزرد بالإعراب عن شكل اقتطاع من Dishevelled (DVL Δ N) (18). في 20ss، أظهرت الأجنة المحقونة مع DVL Δ N تثبيط الهجرة تيارات من البلدان المساهمة الصافية من NT (crestin في الموقع؛ الشكل 4 أ و ب). حقن bbs8 MO أيضا الهجرة تحول دون (الشكل 4 C). ومع ذلك، coinjecting 3 نانوغرام من bbs8 MO وDVL Δ N مرنا انقاذ جزئيا الخلل الهجرة NCC (الشكل 4 D). كان هذا الإنقاذ الجرعة التي تعتمد على لحقن 2 نانوغرام من bbs8 MO فشلت في إنقاذ عيب الهجرة (الشكل 4 E).

تين. 4.
Noncanonical يشير WNT والهجرة NC. (A-C) حقن كل من DN مرنا DVL وbbs8 MO ينتج بشكل فردي في تثبيط NCC الهجرة بالنسبة للضوابط. (D) Coinjection من 3 نانوغرام من bbs8 MO مع نتائج DVL DN في عمليات الإنقاذ الجزئي للهجرة NCC التي كتبها ≈4 أضعاف نسبة إلى morphants bbs8. فشل (E) Coinjection من DN DVL مرنا مع 2 نانوغرام من bbs8 MO لانقاذ الهجرة NCC. (F) حقن 50 خريج من MYR / بال الأسباب DVL تثبيط الهجرة NCC. (G) Coinjection من MYR / بال DVL مع 3 نانوغرام من bbs8 MO أيضا ينقذ جزئيا هجرة NC الكبت. (H) رسم بياني تحديد عدد من تيارات crestin -positive البلدان المساهمة الصافية المهاجرة من خلال الجذع. (شريط مقياس: 200 ميكرون).

نحن تأكدت هذه النتائج عن طريق حقن DVL التي تستهدف غشاء بناء (MYR / PAL DVL) (19)، وهو ما تسبب أيضا تثبيط للهجرة، ومرة أخرى تم انقاذ جزئيا coinjection مع 3 نانوغرام من bbs8 MO (الشكل 4 F و G) . معا، وتشير هذه النتائج إلى أن اضطراب مسار WNT noncanonical يمكن أن تسهم في تثبيط الهجرة NC.
عدم وجود المعوية الخلايا العصبية في Morphants النتائج في العيوب الأمعاء على الحركة.

النظر في دور الملاحظة لBbs8 في الجذع والجمجمة الهجرة NC، ونحن التحقيق التالي إذا كان لديها دور في تنمية ENS. هذا السؤال هو المناسب في ضوء ارتباط نشرت من BBS مع HD، فشل الخلايا العصبية المعوية لتجميع المعى المؤخر.
درسنا ENS الاستعمار من الأمعاء باستخدام علامة العصبية HUC / هود. في اليرقات تحكم في 4 DPF الخلايا العصبية المعوية بالسكان على طول القناة الهضمية لفتحة الشرج (الشكل 5 A). في morphants bbs8 (2 نانوغرام)، امتدت هذه الخلايا في منتصف الطريق على طول المعى المؤخر، أبدا الوصول إلى فتحة الشرج (الشكل 5 B). مع 4 نانوغرام من MO، فشل الخلايا العصبية للدخول في المعى المؤخر (الشكل 5 C). تم تخفيض كمية من الخلايا العصبية في المنطقة بين فتحة الشرج وبداية ساق صفار من 108 في الضوابط إلى 22 و 5 في 2 نانوغرام من و4 نانوغرام من والأجنة MO حقن، على التوالي (ن = 10 في كل الحالات ؛ P <0.001 لmorphants) (الشكل 5. D).

تين. 5.
تطوير المعوية الجهاز العصبي في BBS morphants. الأجنة (A) تحكم في 4 DPF تظهر الخلايا العصبية المعوية ملء طول القناة الهضمية من الأمامي (الجانب الأيسر) إلى فتحة الشرج (رأس السهم). (B) مع 2 نانوغرام من bbs8 والهجرة MO من الخلايا العصبية المعوية تتوقف في منتصف الطريق على طول القناة الهضمية (النجمة)، وليس الخلايا العصبية تصل إلى فتحة الشرج (رأس السهم). (C) أربعة نانوجرام من bbs8 MO تسبب غياب كامل للخلايا العصبية المعوية، مما أدى إلى عيوب القناة الهضمية الحركة (انظر الفيلم S4 وفيلم S5). (D) الكمي لخفض عدد الخلايا العصبية المعوية مع الجرعات الكبيرة تدريجيا من bbs8 MO. (E و F) البلدان المساهمة الصافية الخروج من منطقة العصب الحائر تصور من قبل crestin تظهر أي فرق بين الرقابة وmorphant. (G و H) التعبير phox2b في 48 HPF يظهر عدد محدود من البلدان المساهمة الصافية في الأقواس الخيشومية. (I و J) عرض جانبي من الأجنة في G و H يدل على فشل الخلايا لترك الأقواس البلعومية وإدخال أنبوب الأمعاء. (K) phox2b الخلايا العصبية المعوية -positive ملء طول القناة الهضمية على طول الطريق إلى فتحة الشرج. يظهر السهم على مدى تأخرا من الهجرة، وتمثل النجمة فتحة الشرج. (L و M) حقن 2 نانوغرام من و4 نانوغرام من، bbs8 MO، على التوالي، يسبب الخلايا العصبية للهجرة في منتصف الطريق فقط على طول القناة الهضمية (2 نانوغرام) أو تفشل في دخول القناة الهضمية على الإطلاق (4 نانوغرام). [الحانات مقياس: 500 ميكرون (A-D)، و 100 ميكرون (E و F)، 200 ميكرون (G-J)، و 300 ميكرون (K-M).]

للتحقيق في سبب هذا النمط الظاهري، درسنا على مدار الساعة من العصب الحائر الهجرة NC. في 36 HPF، البلدان المساهمة الصافية هاجروا من منطقة العصب الحائر عادة في morphants bbs8، كما يتضح من crestin التعبير (الشكل 5 E و F). في 48 HPF، ويظهر التعبير phox2b انخفاض في عدد الخلايا في الأقواس الخيشومية (شرح عدم وجود الأقواس الخيشومية في morphants bbs8) (الشكل 5 G و H). يظهر منظر جانبي أن هناك خلايا المهاجرة في أنبوب الأمعاء في morphants في هذا الوقت (الشكل 5 الأول وJ)، مما يشير إلى أن عدم وجود ENS ينشأ من فشل الخلايا على الهجرة من منطقة العصب الحائر، من خلال الأقواس وداخل القناة الهضمية، وليس من فشل مواصفات أو الخروج من منطقة العصب الحائر.
أكدنا نتائج HUC من قبل في الموقع التهجين لphox2b في 72 HPF. في الضوابط، وخلايا -positive phox2b ملؤها الأمعاء إلى فتحة الشرج (الشكل 5 K). مع 2 نانوغرام من MO، خلايا تصل إلى منتصف المعى المؤخر (الشكل 5 L) في حين أن الجرعات العالية (4 نانوغرام من MO) أدى إلى غياب الخلايا -positive phox2b من المعى المؤخر (الشكل 5 M).
لأن يرتبط GI الحركة مع الأرقام الخلايا العصبية المعوية، استخدمنا المجهري الفيديو لمراقبة منتصف الأمعاء في اليرقات عند 4.5 DPF. في كل morphants (2 نانوغرام من MO)، لاحظنا عدم وجود التمعج ربط مع قلة الخلايا العصبية المعوية (أفلام S4 و S5). وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs8 أمر مهم لالمعوي السكان الجهاز العصبي من خلال البلدان المساهمة الصافية المهاجرة من منطقة العصب الحائر وعلى الأرجح ما يفسر جمعية HD مع حالات BBS.
القنفذ اشارة تشعر بالانزعاج في BBS Morphant السمك.

وأخيرا، فإننا التحقيق في آلية محتملة لmispatterning المنطقة القحفي في BBS morphants. الانصهار من الترابيق في الأجنة morphant bbs8، جنبا إلى جنب مع تصقلب الجزئية (الشكل 2 D أقحم)، وكان يذكرنا Shh على المسوخ ممرا أو أجنة الأسماك المعالجة سايكلوبامين (12). غضاريف الرئيسيان لحزب المؤتمر الوطني الافريقي اليرقات، لوحة الغربالية والترابيق (الشكل 2 N؛ رأس السهم)، تنشأ من السلائف NCC متميزة، وكلاهما يعتمد على Shh على إشارات لتنميتها (14). والجدير بالذكر أن المرضى BBS يكون polydactyly ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك وجود نسبة منخفضة من عيوب الجسم الثفني والقاطعة مركزي واحد (الملاحظة الشخصية)، بصمات الشاذة يشير SHH.
أثناء الهجرة، Shh على توجيه الهجرة والزخرفة من البلدان المساهمة الصافية (12). دراسات في الزرد وفرخ تشير إلى أن Shh على من الأديم الظاهر الوجه يعزز الفك وثمرة الجبهي الأنفي (12). نحن التحقيق Shh على إشارات في BBS morphant الزرد. Patched1 (ptc1)، في حد ذاته هدفا النسخي من Shh على الإشارات، هو علامة موثوقة عن الاستجابات الخلوية لShh على (20). في 24 HPF morphant الأجنة، كان هناك انخفاض عام في ptc1 التعبير في جميع morphants النسبي لضوابط، الأكثر لفتا في bbs8 (تخفيض 64٪ بحلول QRT-PCR) (الشكل S8 A-D). كما أظهرت QRT-PCR Gli1 أن ينظم إلى أسفل إلى 52٪ من السيطرة التعبير في morphants bbs8. على النقيض من ذلك، فإن العامل pax6 النسخ، وقمع عادة Shh على الإشارات، والمتابعة تنظيما وأعرب ectopically في جميع أنحاء الأنبوب العصبي في morphants bbs8 (الشكل S8 E-H) (21)، مما يدل على misregulation من Shh على الإشارات.
حقن ptc1 MO (أو SHH مرنا، لا تظهر البيانات) التي يسببها مسار Shh على (الشكل S8 I.)، وcoinjection مع bbs8 MO انقاذ جزئيا هذا الاستقراء (الشكل S8 J.)، مشيرا إلى أن وظائف Bbs8 المصب Ptc1 لكن ليست ضرورية لShh على تنبيغ.
ويلزم البروتينات IFT لكلا GLI المنشط وكاظمة وظائف النسخي، والبروتينات جلي لا تعير اهتماما لسمو يجند في غياب البروتينات IFT. نحن اختبار ما إذا كان Bbs8 ينظم معالجة جلي في خلايا الثدييات. إضافة ناهض Purmorphamine Shh على الخلايا NIH 3T3 يحفز مسار Shh على المؤلمة التي كتبها مباشرة مملس. والموهن ردا على التحفيز في ضربة قاضية shRNA بوساطة من Bbs8 التي كتبها ≈40٪ (P <0.01) (الشكل S8 M). تحليل لطخة غربية لGli3A: نسب Gli3R في هذه الخلايا كشفت ردود اضعافها لSHH منبهات (الشكل S8 N و O.). وهذا ما أكده في الجسم الحي من قبل coinjecting الأجنة الزرد مع المهيمن السلبي PKA مرنا (الذي يعطل Gli3 الفسفرة)؛ bbs8 مرنا انقاذ النمط الظاهري (الشكل S8 K و L.). هذه النتائج تشير إلى أن bbs8 أمر مهم، ولكنه ليس أساسيا، لسمو الإشارات من خلال العمل المصب من Ptc1 وتنظيم وتجهيز Gli3.
الخلايا العصبية كريست الدب سيليا الابتدائية.

ونظرا لأهمية أهداب لShh على وnoncanonical إشارات Wnt، أن Shh على أمر ضروري لتوجيه خط الوسط المهاجرة CNCCs، ودور noncanonical WNT في الهجرة NCC، نحن مسبب أن تهاجر البلدان المساهمة الصافية يجب أن يتحمل أهداب الأولية التي شعروا التدرجات محدثة التخلق وربما تنظيم الخلية القطبية (14، 17، 22). بعد تسليخ مجهري مضان من Sox10: EGFP البلدان المساهمة الصافية، لاحظنا أهداب اضح القمي الأساسي (ملطخة تويولين الأسيتيل) بما يتفق مع متطلبات تعتمد على أهداب Shh على التنبيغ (الشكل S9 A، B، و B '.).
أكدنا أن Shh على لم يكن مهما للاوائل الهجرة NCC التي كتبها استعداء Shh على الإشارات باستخدام سايكلوبامين. CNCCs لا يزال هاجر عادة في 19 HPF على الرغم من الزخرفة تعطلت بنسبة 30 HPF (الشكل S10).

نقاش

في هذه الدراسة، لقد أظهرنا أن تحليل DSM يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد خلل البنية؛ شوهة الوجه خفية في كل من البشر والفأرة. DSM يمكن تسليط الضوء على الاختلافات الرئيسية في سحنة من الأمراض الوراثية مثل متلازمة سميث Magenis، متلازمة فيلو-القلب والوجه، والمتلازمات ويليامز، والآن BBS (2، 3).
مزايا استخدام تحليل DSM مورفولوجيا الوجه BBS الإفراط في الاعتماد على الملاحظة البشرية هي الموضوعية والقدرة على ضبط حجم بحيث لا يسيطر المرصودة الزخرفة منتصف الوجه من قبل أنسجة الوجه المفرطة. يمكننا الآن التأكد لفك تسطيح مع متوسط ​​على أنف أصغر وretrognathia معتدل توفير وسيلة موضوعية لم يسبق وصفه من التعرف على الوجه في BBS (فيلم S1). يحلل التمييز مؤخرا من وجوه الضوابط والأفراد المتطابقة مع الظروف الوراثية أدوا عند مستويات دقة ما بين 85٪ و 95٪ (2)، والآن منطقة الأنف وحدها في BBS تقدم دقة مماثلة. مددنا أيضا التحليل القائم DSM-على الفئران وأظهرت تشوهات مقارنة القحفي في الماوس، فضلا عن الأسماك، ونماذج من BBS. هذه النتائج تشير إلى أن الجينات BBS دورا حاسما في التنمية CF.
على الرغم من الاختلافات الشكلية بين الجماجم السمك الإنسان، والماوس، والعديد من نفس مسارات الإشارات وتسلسل الجنينى تنظيم تطوير CF بهم (12). أصبح الزرد نموذجا صالحا لدراسة تطوير CF (14).على غرار النماذج الزرد ذكرت سابقا من الأمراض الوراثية البشرية، الظواهر وحظ في كثير من الأحيان أكثر وضوحا على الأرجح بسبب التطور السريع والحساسية المرتبطة اضطراب وراثي (23، 24).
وقد لاحظنا التطور المعيبة في مناطق الهيكل العظمي مماثلة من منتصف الوجه في كل من الفأر وتحور الجينات البشر لBBS. في السمك، وحددنا شرط Bbs8 للهجرة CNCC في لقسم الأمامي من الرأس. العيوب القحفي مثل SHH في bbs8 أدت morphants لنا لإثبات أن هناك حاجة أيضا البروتينات BBS لكفاءة مما يشير SHH. في ضوء الدراسات الحديثة تشير إلى أهمية أهداب وIFT في نجاح Shh على التنبيغ (22، 25، 26)، ومعرفة أن البروتينات BBS تنظم عمليات التحويل غير الرسمية (5، 27)، ويمكن نقص BBS شرح dysmorphology القحفي.
لم تقتصر هذه العيوب المهاجرة إلى CNCCs: أظهرنا عدم وجود تنمية ENS وفقدان الأمعاء على الحركة في morphants BBS ربما يفسر ارتباط HD مع BBS (8، 28، 29). ينشأ HD نتيجة لعيوب الهجرة NCC وارتبط لسمو رفع القيود. SHH فئرانا معدلة وراثيا تطوير كولون بانعدام العقد والتشوهات الشرجية (30، 31)، وعلاوة على ذلك، ارتبط HD مع العيوب البعيدة أطرافهم، والتشوهات الشرجية، وHPE (11).
على الرغم من أوائل الهجرة NC هي Shh على المستقلة، وتبين لنا أنه قد تعتمد، على الأقل جزئيا، على noncanonical إشارات Wnt. ولذلك، فإننا نقترح فرضية لتطوير dysmorphology CF وHD حيث نقص البروتينات BBS يشوش noncanonical WNT يشير ضروري لأوائل الهجرة NCC. لأن Shh على إشارات في CNCCs أمر ضروري لتنميط العادية (12)، ونحن التكهن بأن البلدان المساهمة الصافية وصوله في الرأس لديهم رد فعل من الاكتئاب إلى SHH يفرز من الأديم الظاهر الوجه، وبلغت ذروتها في ضعف الفك وثمرة الجبهي الأنفي. مزيج من تثبيط للهجرة وShh على عدم الاكتراث في BBS-نقص البلدان المساهمة الصافية يوفر آلية لتطوير قطاعات اعقدي في HD BBS المصاحب.

طرق

ماوس الجمجمة دراسة الإنسان و.

تعرض المرضى BBS والضوابط تتأثر لمسح الوجه 3D، و"يعني" حسبت الوجه. Bbs4 - / - ورسمت الفراء WT الفأر مع نشا الذرة ومسحها ضوئيا لالتشكل الوجه الإجمالي. وباستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم إعداد جماجم ومسحها على الماسح الضوئي الفوق الليزر. وقد تم تجميع قياس الأشكال سطح كثيف باستخدام برامج مخصصة في المنزل.

الزرد.

Morpholinos ضد bbs4، bbs6، وbbs8 تم حقنها في أجنة الزرد. لwholemount في الموقع التهجين، واستخدمت البروتوكولات القياسية مع تحقيقات التالية: ptc1، pax6، phox2b، foxd3، sox10، وcrestin. تم تنفيذ المناعية باستخدام البروتوكولات القياسية. تم تصوير الأجنة على المجهر متحد البؤر ايكا SPUV. لتحليل FACS، تم فصل الأجنة مع التربسين وtriturated قبل الفرز مع آلة بيكتون ديكنسون FACS.

زراعة الخلايا.

خلايا NIH 3T3 التعبير عن ثابت وshRNA ضد bbs8 وقد حفزت أو السيطرة التسلسل مع purmorphamine (Calbiochem) أو المؤتلف Shh على (R & D الأنظمة)، وتعرض لفحص luciferase المراسل (PROMEGA). بدلا من ذلك، كانت هي lysed الخلايا، وكانت electrophoresed البروتينات ونشف مع الأجسام المضادة لمكافحة Gli3 (سانتا كروز). لفحوصات شفاء الجروح، وقدم الصفر على مثقف NIH 3T3 أو الخلايا الليفية الإنسان الأساسية. كانت ملطخة الهيكل الخلوي الأكتين مع Phalloidin-594 (إينفيتروجن) وتصويرها على زايس AxioImager. المواد كاملة وأساليب يمكن العثور عليها في مواد SI وطرق.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #26  
قديم 11-23-2015, 10:09 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي التحليلات الفنية من المتغيرات تكشف عن وجود دور كبير للالأليلات السلبية والمشتركة السائدة في قليل الجينات متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/107/23/10602.full




التقدم التكنولوجي تبشر من تحفيز بسرعة اكتشاف المتغيرات المسببة للأمراض لمرض وراثي. ومع ذلك، خفف هذا الاحتمال القيود في تفسير العواقب الوظيفية الاختلاف الجيني في مواضع مرشح. هنا، نقدم أسلوب منهجي، ترتكز على فحوصات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، لتقييم المحتوى تغيري (125 الأليلات) من 14 الجينات المرتبطة مع متلازمة بارديه-بيدل (BBS). مزيج من في الجسم الحي المقايسات مع احقا في التحقق من صحة المختبر تشير إلى أن جزءا كبيرا من الطفرات BBS المصاحب لديهم النمط السائد سلبية للعمل. وعلاوة على ذلك، نجد أن مجموعة فرعية من الأليلات المشتركة، التي سبق بحثها إلى تكون حميدة، هي، في الواقع، يضر وظيفة البروتين، ويمكن أن تتفاعل مع الأليلات نادرة قوية لتعديل العرض المرض. وتمثل هذه البيانات إجراء تقييم شامل لتحميل الجيني في مرض multilocus. الأهم من ذلك، التراكب هذه النتائج إلى بيانات الوراثة البشرية يشير إلى وجود تعقيد تقدير كما في السابق في مجال العمارة الأمراض التي قد تكون مشتركة بين الظواهر السريرية المتنوعة.
Exome وكامل الجينوم resequencing من المرجح أن تحفيز نقلة نوعية في تحديد الآفات الوراثية في المرضى (1). في نفس الوقت، حتى ضمن حدود الجينوم الترميز، هذه التكنولوجيات تشكل مشكلة تفسيرية، في أن ترشيح الإمراض من الطفرات يمكن أن تستمد إلا من خلال نماذج وراثية ضيقة ومحدودة أدوات التنبؤ الحسابية، وكلاهما من المرجح أن كيل وإساءة تفسير تأثير بعض الطفرات. وعلاوة على ذلك، وتقلب المشترك بين وداخل الأسرة، وهي ظاهرة سائدة في معظم الصفات الوراثية، يبقى عامل التباس كبير لأن كلا الاختلاف الأليلي في مكان واحد وموقع ثاني معدلات غير المشبعة يمكن أن تمارس تأثيرا كبيرا على انتفاذ والتعبيرية من خلال المضافة وروكبي الآثار ( 2).
بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو نموذج مفيد لتشريح قشوة لأن معظم الجينات 14 BBS يمكن أن تسهم أيضا الأليلات روكبي (+3 - +17). BBS هو أيضا ممثل الطيف مرض ciliopathy، مجموعة من الاضطرابات التي تتميز عيوب في بنية الهدبية و / أو إخراج إشارة الهدبية (18). وتشمل السمات المميزة لBBS تنكس الشبكية، والسمنة، وقصور الغدد التناسلية، polydactyly، الفشل الكلوي، والتخلف العقلي (19).
نحن وغيرنا قد أظهرت أن الزرد يوفر نماذج الانقياد تجريبيا وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من الجوانب الهامة من اختلال وظيفي الهدبي (2، 15، 17، 20 - +23). وعلاوة على ذلك، يمكن مرنا البشري للجينات ciliopathy انقاذ كل من morphant ومتحولة الظواهر الزرد بكفاءة، وتوفير منصة قوية لتفسير أهمية المرضية من الأليلات مغلطة المحددة، التي لاضطراب العلاقة السببية لا يمكن إثباتها بشكل قاطع بحجج وراثية وحده (15، 17 ، 22، 23).
هنا، لدينا المتكاملة متعددة مستقلة في المقايسات الجسم الحي، تليها في المختبر التصديقات، لاستجواب جوانب وظيفة كل من 125 الأليلات وتحديد مساهمتها في مرض وراثي بوصفها وظيفة من مجموع الحمل تغيري عبر جميع الجينات BBS المعروفة.
النتائج

النمذجة BBS العيوب التنموية في الزرد.

حقن morpholino ضد كل BBS النتائج الجينات في العيوب تكون المعيدة.

لقد أظهرنا سابقا أن قمع بعض البروتينات BBS في الزرد يسبب العيوب تكون المعيدة التي تشمل تقصير محاور الجسم، ويعد القطع البدنية النمطية، وnotochords اسعة ومتلوى (14، 16، 17، 20، 21). هذه الظواهر هي متسقة مع مستو غير طبيعي الخلية القطبية (PCP) يشير إلى (21، 22، 24، 25)، والتي من المرجح يكمن وراء العديد من الظواهر السريرية في المرضى الذين لديهم BBS، بما في ذلك عيوب السمع (20)، العصبية تشوهات إغلاق الأنبوب (26)، تشكيل الكلوي الكيس (27)، وربما السمنة وضعف الادراك (28). حقيقة أن هذه الملاحظات هي ذات الصلة الأرجح إلى الباثولوجيا السببية من BBS (20، 21، 23 - 25)، والحقيقية لجميع BBS orthologues سبعة اختبار (bbs1، bbs4، bbs6، bbs10، bbs12، mks1، وcep290) وكذلك ل كما الثلاث BBS معدلات mgc1203، mks3، وrpgrip1l، اقترح أن أنها قد تمثل المقايسات مفيدة لجميع الجينات BBS. ولذا فإننا مصممة حجب ترجمة morpholinos (موس) ضد bbs1 - 12 (وSI الملحق، الجدول S1) وحقن كل في الأجنة WT بتركيزات متفاوتة لإنشاء منحنى بقاء (SI الملحق، الجدول S3) يمكن من خلالها استخلاص العمل الأمثل تركيز MO (الحد الأدنى من السمية الخلوية، النمط الظاهري القصوى). التهديف من 8-10 الأجنة مرحلة الجسيدة كشفت أن ضربة قاضية لكل النتائج BBS الجينات في عيوب مماثلة لتلك التي سبق وصفها (الشكل 1 A). من غير المرجح أن يكون سبب التسمم غير محددة لأنها استنسخت بشكل كامل عن طريق الحقن من المنظمات الأعضاء حجب لصق، والتي ضربة قاضية فعالة يمكن أن يدل على RT-PCR (هذه الظواهر SI الملحق، الشكل. S1 A-C والجدول S3). ودعمت هذه الآثار عن طريق القياس الكمي لمحور الجسم تقصير عيب بواسطة التهجين في الموقع (SI الملحق، الشكل S2) والكمي لعيوب في الحركات تكون المعيدة (SI الملحق، الشكل S3).

تين. 1.
قمع BBS4 تنتج عيوب محددة. (A) حقن المنظمات الأعضاء ضد BBS الفردية الجينات (bbs4 هو موضح هنا) في الأجنة الزرد تنتج العيوب تكون المعيدة، بما في ذلك محور قصيرة الجسم، والحبل الظهري اتسعت ومتلوى (*)، والقطع البدنية النمطية توسيع (رأس السهم)، والتي يمكن انقاذهم من قبل WT مرنا البشري. Coinjections من من mRNAs متحولة إنتاج مجموعة متنوعة من العيوب. (B) في حين WT RNA ينقذ الظواهر MO (WT RNA)، coinjection من الطفرات hypomorphic (N165H) ينقذ جزئيا النمط الظاهري. ومع ذلك، والطفرات فارغة (D102G، N274H، وM472V في BBS4) لا إنقاذ، والطفرات السائدة سلبية (L327P) تفاقم النمط الظاهري وتنتج العيوب عن طريق الحقن من RNA وحدها.
الإنسان BBS مرنا ينقذ الظواهر morphant.

وبالنظر إلى الحفاظ على ارتفاع بين orthologues BBS الزرد البشرية و(SI الملحق، الجدول S2) والانقاذ ذكرت سابقا من bbs11، mks1 / bbs13، وcep290 / bbs14 مع من mRNAs الإنسان (15، 17)، ونحن مسبب هذا التعبير من الآخرين BBS البشري وينبغي أيضا أن يكون قادرا على إنقاذ الظواهر morphant البروتينات. لذا أجرينا تجارب الانقاذ لكل BBS MO (bbs1 - 12) مع كامل طول مرنا البشري.
على التهديف من تسعة (± 1) الأجنة مرحلة الجسيدة، وجدنا الإنقاذ فعال في كل حالة [SI الملحق، التين. S1-S4 والجدول S4، وقاعدة بيانات على شبكة الإنترنت (http://misc.ciliaproteome.org/bbs_mutations؛)]، والتي أكدتها الكمي بواسطة التهجين الموضعي فضلا عن التهديف الحركات اكتفار، كل واحدة منها كانت مشابهة لضوابط uninjected في (التين. 2 و3 وSI الملحق). لمزيد من التحقق من خصوصية كل BBS مرنا لانقاذ BBS المقابلة MO، نحن coinjected كل BBS MO مع مختلف BBS مرنا، والعكس بالعكس، ولم ير أي الانقاذ (SI الملحق، الشكل. S1 D). الأهم من ذلك، في المقارنة بين الأجنة سجل عمياء، الظواهر بين الأفواج الجنين انقاذ وباستمرار تحسن إحصائيا من الفوج MO (SI الملحق، الجدول S4).

تين. 2.
في التحقق من صحة المختبر من آثار الطفرة. (A - C) توطين الموسومة MYC WT BBS4 البروتين (الحمراء) في الخلايا IMCD3 يظهر وجود في الجسم القاعدية، كما يتبين من colocalization مع γ تويولين والأسيتيل α تويولين (الخضراء). (D - F) مقدمة من طفرة N165F اصطناعية في BBS4 ليس له تأثير ملحوظ على الترجمة. التعبير عن متحولة D102G، وصفها بأنها باطلة في الجسم الحي التهديف، غير قابل للكشف د 2 بعد ترنسفكأيشن (G - I)، في حين يتم التعبير عن البديل N165H hypomorphic لكن mislocalized (J - L). نتائج طفرة L327P المهيمنة سلبية في mislocalization في الخلايا تالية للتفتل (M - O) ولكن ليس في تقسيم الخلايا (P - R). (S) التعبير عن ثوابت-MYC الموسومة 4 د بعد ترنسفكأيشن غير قابل للكشف عن الطفرات فارغة (D102G، N274H، وN165H)، على الرغم من أن RT-PCR أظهرت الرسالة في كل حالة.


تين. 3.
تأثير مهيمن سلبية من BBS4 L327P. (A) Coinjection من 3 نانوغرام من bbs4 MO و 100 خريج من WT مرنا البشري ينقذ النمط الظاهري morphant، وcoinjection من 100 خريج من L237P تحمل BBS4 مرنا تنتج عيوب مماثلة، أو أشد من، MO حدها. إدخال كميات متساوي المولية (50 خريج لكل منهما)، ولكن من كلا WT ومرنا متحولة خفف قدرة 50 خريج من WT مرنا وحده لانقاذ جزئيا النمط الظاهري morphant. (B) حقن جرعة دون المستوى الأمثل (10 PG) من L327P مرنا تنتج الظواهر الهامة. (C) overexpression من المهيمنة سلبية L327P طفرة BBS4 ولكن ليس من الخسارة من وظيفة أليل تنشيط الكنسي إشارات Wnt من قبل luciferase الفحص سوبر TOP-فلاش بطريقة مماثلة لBBS4 قمع. overexpression من L327P مرنا في تركيز عال (300 خريج) النتائج في الأجنة dorsalized ومحاور مزدوجة (السهام) (D) وخارج الرحم التعبير chordin (E). (F) وفي سياق الميراث قليل الجينات، والابتدائي (المتنحية) موضع لديه احتمال زيادة كبيرة كونها hypomorphic (P <0.0001)، في حين من المرجح أن تكون شديدة، مع إثراء كبير من الآفات المهيمنة السلبية (موضع روكبي P = 0.0004).
إنقاذ الظواهر تكون المعيدة ينتج طائفة من الشدة.

إنقاذ BBS morphants مع مرنا البشري لجميع الجينات BBS أتاح لنا الفرصة لاختبار تأثير كل التغييرات الأحماض الأمينية nonsynonymous وجدت في المرضى الذين يعانون في سياق تسلسل البروتين البشري. أولا، نحن المهندسة بنيات متحولة عن طريق إدخال تغييرات النوكليوتيدات واحدة في كل الجينات البشرية (ن = 109). نحن ثم يعاير كفاءة إنقاذ كل بناء عن طريق حقن الأجنة WT إما (ط) لمراقبة سلبية، (ب) MO وحدها، (ج) MO بالاضافة الى كمية المولي محدد سلفا من WT RNA البشري، (د) MO بالإضافة إلى نفسه مقدار المولي مرنا متحولة، (ت) WT من mRNAs وحده، أو (السادس) من mRNAs متحولة وحدها. وسجل كل coinjection وعلى سبيل المقارنة مع MO وحدها أو مع الانقاذ WT (قيم P في SI الملحق، الجدول S4).
وأظهرت أربعة عشر الأليلات عدم وجود فروق ملموسة في كفاءة الإنقاذ (SI الملحق، الشكل. S4 والجدول S5)، مما يدل على أنهم كانوا حميدة فيما يتعلق وظيفة (ق) يعاير. على سبيل المثال، BBS6 R518H مرنا إنقاذهم بالكامل النمط الظاهري morphant (SI الملحق، التين. S2-S4). على النقيض من ذلك، حققت 15 الأليلات الظواهر تحسن كبير من الأجنة MO حقن لكن أسوأ من الأجنة coinjected مع WT مرنا، مما يشير إلى أن هذه الأليلات هي hypomorphs وظيفي، كما يتضح من BBS4 N165H (الشكل 1). مجموعة ثالثة من 45 الأليلات لم تسفر عن أي الانقاذ، وأنها بالتالي وسجل كما بلا قيم (على سبيل المثال، BBS4 D102G، N274H، الشكل 1). الظواهر أخيرا، 35 الأليلات أنتجت أسوأ بكثير من MO وحده، ومرنا تنتج الظواهر متحولة مماثلة أو أسوأ من MO وحدها، مما يوحي بأن هذه قد تكون الأليلات السائدة سلبية (على سبيل المثال، BBS4 L327P؛ الشكل 1). الأهم من ذلك، نحن يعاير عشوائيا 26 الطفرات من خلال تتبع اكتفار القياسات الكمي والجسيدة طول الجذع وجدت التوافق الكامل في جميع المقايسات، مما يوحي بأن يحرز التحيز غير المرجح أن يعرض نتائج إيجابية كاذبة.
هذا التقييم المنهجي، بالإضافة إلى سابقا لدينا أفادت بيانات لBBS13-14، MKS3، وRPGRIP1L (17، 23)، مكنتنا من إنشاء سلسلة أليلية كاملة ل 125 المتغيرات الترميز nonsynonymous في جميع الجينات المرتبطة BBS (الشكل 1 و SI الملحق، الشكل. S4 والجدول S5).
حساسية وخصوصية: إثبات وراثية.

وقد وفرت الفصل والتحليل القائم على السكان أو في البيانات الوظيفية المختبر لمجموعة فرعية من الطفرات وجدت في المرضى الذين لديهم BBS أدلة قوية على الإمراضية، وتكفل لنا الفرصة لاختبار حساسية في الجسم الحي لدينا التهديف. لذا اخترنا 49 الأليلات المرضية المعروفة في البشر وسألت عن كيفية وسجل انهم في الجسم الحي (SI الملحق، الجدول S5). باستثناء أليل S329L في BBS10 (سجل حميدة)، وتوقع 48 من 49 الأليلات بشكل صحيح المسببة للأمراض كما، مما يدل على أن المقايسات في الجسم الحي لديها حساسية من 98٪.
يمكن تنفيذها نهج مماثل لاختبار خصوصية. اخترنا 12 التغييرات (BBS2 123 IV؛ BBS6 C517R؛ BBS9 A455T؛ BBS10 D142N؛ BBS12 I170V، R235M، Q386R، وS429T؛ MKS1 L491I؛ MKS3 D261N، وL437V وRPGRIP1L G1025S) شائع في البشر (تردد أليل طفيفة> 15 ٪)، وبالتالي وجدت في كثير من الأحيان الآباء تتأثر والأشقاء المرضى، وأحيانا في زيجوت متماثلة الألائل. نحن أيضا اختبار أليل ال13، BBS4 N165F، وهو التغيير الناجم عن ذلك لا يغير من خصائص البروتين (انظر أدناه)، وأربعة الأليلات BBS6 (G52D، I339V، S511A، وR518H) التي تصرف indistinguishably من WT في الخلايا المستزرعة ( 29)؛ وكانت 14 من 17 التغيرات حميدة في جميع المقايسات الثلاثة في الجسم الحي، مما يشير إلى خصوصية> 82٪.
في فحوصات المختبر.

وقد لوحظت الظواهر تتعلق ببعض البروتينات BBS في الخلايا المستزرعة (+8 - 10، +29 - 34). لذا، طلبنا ما إذا كانت بعض النشاط الشاذ في الأجنة الزرد يمكن تفسير السلوك خلل في خلايا الثدييات.
ركزنا في البداية على BBS4 لأنه، على النقيض من البروتينات BBS أخرى، التعريب لها بالقرب من centrioles اثنين يمكن أن يتحقق بتكاثر التي كتبها overexpression من البروتين الموسومة في مختلف خطوط الخلايا تحولت (31، 32). نحن المهندسة ستة الطفرات BBS4 مغلطة إلى MYC N-محطة -tagged متجه التعبير الثدييات. وتوقع ثلاثة لاغيا (D102G، N274H، وM472V)، وكان واحد ناقص المفعول (N165H)، كان واحدا المهيمنة سلبية (L327P)، وكان واحدا حميدة البديل N165F. وبعد ترنسفكأيشن في الخلايا IMCD3، وجدنا ملاحظاتنا أن تكون متطابقة مع التقييمات في الجسم الحي. على الرغم من أن بناء N165F حميدة أظهرت نمطا من التوطين لا يمكن تمييزها عن تلك التي WT (الشكل 2 A - F)، كل من سبع طفرات nonneutral أظهر الظواهر استنساخه الحالية في> 70٪ من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. كانت D102G وN274H الطفرات فارغة لا يمكن الكشف عنها 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الشكل 2 G - I وS.)، في حين كان تدهور أليل N165H hypomorphic أيضا، وإن كان بوتيرة أبطأ (96 ساعة بعد ترنسفكأيشن، الشكل 2 J - L وS.) . أخيرا، أظهرت أليل المهيمنة سلبية على L327P الاستقرار لا يمكن تمييزها عن تلك التي WT (الشكل 2 S.) لكنه فشل في colocalize مع γ تويولين في الخلايا تالية للتفتل (الشكل 2 M - O). ومن المثير للاهتمام، لاحظنا توطين مريكزي من L327P في المغزل الإنقسامية من الخلايا المنقسمة، مما يشير إلى أن هذه الطفرة تمارس تأثيرا تالية للتفتل معين (الشكل 2 P - R). تم التحقق من التعبير عن كل بناء من قبل RT-PCR ومع علامة GFP cotransfection (SI الملحق، التين. S2 و S6).
وكانت هذه الملاحظات لا تقتصر على BBS4. نحن المهندسة بنيات التعبير الثدييات لمجموعة عشوائية من 17 الطفرات BBS (14٪). على الرغم من أن معظم البروتينات WT overexpressed تظهر نزع فتيل باستمرار توزيع حشوية، على غرار التقارير السابقة (34)، كنا لا نزال قادرين على تقييم الاختلافات بين WT ويبني متحولة. أظهرت عدة الأليلات يتوقع أن تكون ضارة وظيفة البروتين نمط توطين متميز من WT (SI الملحق، الشكل. S6). والجدير بالذكر أن لاحظنا العديد من الأمثلة التي تحور قاد توطين البروتين إلى المناطق التحت خلوية لم يسبق له مثيل مع بنيات وزن. على سبيل المثال، تم الكشف عن WT BBS7 في جميع أنحاء السيتوبلازم ولكن تم استبعاد حد كبير من النواة (SI الملحق، الشكل. S6 L). على النقيض من ذلك، وجدنا المسوخ T211I وH323R في نواة لنسبة كبيرة من الخلايا (SI الملحق، الشكل. S6 M و N).
نحن لم تجد نتيجة واحدة متفاوتة: كان أليل BBS6 T112A حميدة في الزرد، بعد أن أظهر بناء 112A، معربا عن التعريب الشاذة في النواة في خلايا الثدييات (SI الملحق، الشكل S6.). على الرغم من أنه ليس من الواضح أي من فحوصات اثنين من أكثر بالمعلومات، فإننا نخلص إلى أنه متحفظ، لدينا استراتيجية في الجسم الحي لديها معدل دقة بالمقارنة مع في المختبر بيانات الخلية الثديية من 94٪ (مقارنة مع مستوى حساسية لوحظ عبر ثلاثة في المقايسات فيفو). الأهم من ذلك، ملاحظاتنا من خلايا IMCD3 تم إثباتها بشكل كامل من قبل دراسات الترجمة في ARP19 وhTERT الخلايا المهدبة الإنسان (قاعدة بيانات على الإنترنت).
الطفرات المهيمنة سلبية.

وكشفت دينا في الدراسات المجراة 35 مرشح الأليلات السائدة سلبية (28٪). لدراسة هذا الاحتمال، أجرينا دراستين مستقلة. نحن إعادة النظر أولا في الجسم الحي الزرد فحص ومعللا أنه إذا كانت هذه الأليلات السائدة سلبية، يجب أن تكون البيانات التاليين صحيحا: حقن مرنا ترميز الأليلات السائدة سلبية وحدها أن نسخة مظهرية النمط الظاهري morphant، وحقن متساوي المولية من المهيمنة سلبية و WT مرنا يجب تخفيف من تأثير إنقاذ الرسالة WT.
وجدنا البيان الأول أن يكون صحيحا لجميع الأليلات السائدة سلبية. حقن مرنا المهيمن سلبية تنتج وحدها الظواهر مماثلة لMO حدها لكل من 35 الطفرات (الشكل 3 A، SI الملحق، الشكل. S7 A-E، وقاعدة بيانات على الإنترنت). وهذا صحيح حتى بتركيزات دون المستوى الأمثل، الذي WT مرنا تنتج الحد الأدنى من العيوب (الشكل 3 B و SI الملحق، الشكل. S7 F و G). وعلاوة على ذلك، اقترح إجراء مزيد من التجارب البيان الثاني أيضا ليكون صحيحا. على سبيل المثال، لbbs4، coinjection من MO و 100 خريج من WT مرنا أنقذت بكفاءة النمط الظاهري morphant. Coinjection من 100 خريج من 327P مرنا مع MO، ومع ذلك، أدت إلى النمط الظاهري الجنين أسوأ بكثير مما كانت عليه عندما MO حدها تم حقن، كما فعل حقن 100 خريج من مرنا متحولة وحدها. وعلاوة على ذلك، في حين coinjection من bbs4 MO و 50 خريج من WT مرنا انقاذ جزئيا النمط الظاهري morphant، إضافة 50 خريج من 327P الترميز مرنا (أي ما مجموعه 100 خريج من مرنا) قلصت قدرة WT مرنا لانقاذ النمط الظاهري (الشكل 3. A). لاحظنا سيناريوهات مماثلة لجميع الأليلات اختبار (SI الملحق، الشكل. S7 A-E).
البحث عن أدلة إضافية، لجأنا إلى الثدييات خلية القاعدة مقايسة البيوكيميائية. لقد أظهرنا سابقا أن قمع BBS4 يؤدي إلى ارتفاع الكنسي النشاط الإشارات WNT، كما رصدتها luciferase الفحص سوبر TOP-فلاش، في حين overexpression من WT BBS4 ليس له أي تأثير (21). وإذا كنا قد تفسر البيانات الزرد بشكل صحيح، توقع BBS4 الأليل الوحيد لتكون مهيمنة سلبية، L327P، يجب transactivate مراسل β-catenin بطريقة مماثلة لBBS4 shRNA. ولذلك عبرنا عن L327P وكذلك WT، أربعة الخسارة من وظيفة الطفرات BBS4 (D102G، N165H، N274H، وM472V)، والبديل محايد الاصطناعي N165F. وتوقع تحليل أعمى من البيانات بشكل صحيح L327P أن تكون مهيمنة سلبية في ثلاثة تجارب منفصلة (الشكل 3 C). لتحديد ما إذا كان هذا التأثير يمكن تكرارها في الجسم الحي، ونحن overexpressed L327P مرنا في تركيز عال (300 خريج) وdorsalization احظ، بما في ذلك تشكيل محور مزدوج في نسبة صغيرة من الأجنة (الشكل 3 D)، وهي السمة المميزة ليصل التنظيم من الكنسي إشارات Wnt. باستمرار، هذه الأجنة يحمل التعبير خارج الرحم من الكنسي WNT الجين المستهدف، chordin (21)، في مراحل midepiboly (3 الشكل E).
اكتشاف عدد كبير من الطفرات السائدة سلبية لا يتفق مع فكرة المفاهيمية من الخسارة من وظيفة الآثار في مرض المتنحية. أن الملاحظات الفنية من غير المحتمل بسبب استنساخ بهم عبر التكرار متعددة وفحوصات مستقلة. لذا سألنا عما إذا رؤى الوراثية يمكن أن تستشف من خلال دراسة توزيع مرشح الأليلات المهيمنة سلبية في 218 المرضى وعائلاتهم في فوج لدينا. وجدنا أن الأليلات السائدة سلبية تشكل أقلية (18٪) من كل الأليلات BBS. ومع ذلك، نحن وغيرنا وأفادت العديد من الأسر التي طفرة غير المشبعة الثالثة تتفاعل وراثيا مع الأليلات المتنحية في موضع الأساسي لتعديل انتفاذ المرض والتعبيرية (+34 - +37). عند تعيين موقف الأليلات السائدة سلبية (موضع الابتدائي مقابل موضع روكبي)، وجدنا زيادة كبيرة من الطفرات السلبية المهيمنة في مواضع روكبي (33٪ في معدلات مقابل 18٪ مساهمة في إجمالي الطفرات؛ P = 0.0004؛ الشكل 3 F)، مما يدل على أن غالبية الظواهر معدل ويورث.
المتغيرات المشتركة في BBS.

لم تقتصر دينا المقايسات الفنية إلى حدوث طفرات نادرة أو خاصة ولكن متكاملا يعرف كل الألائل في الجينات BBS. وأشارت سواء في الجسم الحي الاختبارات والدراسات توطين الخلية أن 7 من 14 الأليلات المصنفة رسميا باسم الأشكال (> 1٪ تردد السكان) هي أيضا ضارة وظيفة البروتين، وبالتالي قد تشارك في عملية المرض (SI الملحق، الشكل S5 والجدول S6 ). وبالنظر إلى أن معظم هذه المتغيرات يمكن العثور عليها في زيجوت متماثلة الألائل في الأفراد تحكم يوحي بأنها غير كافية لتسبب المرض. ومع ذلك، تساءلنا عما إذا كانوا قد تتفاعل مع طفرات قوية لتحفيز BBS، كما هو مبين في الآونة الأخيرة عن واحد منهم، وأليل A229T في RPGRIP1L (23).
وأشارت هذه البيانات إلى أن تردد سكان الأليلات ليس بالضرورة مؤشرا على وظيفة، مما دفعنا للاستعلام عن الفصل بين كل الأشكال nonsynonymous (ن = 18) في عائلاتنا. ليس من المستغرب، فصلت ما بين سبعة تعدد الأشكال الحميدة في أنماط لا علاقة لهذا المرض (SI الملحق، الشكل S5 والجدول S6). لالأليلات أخرى، ومع ذلك، كان الجمع بين في الجسم الحي البيانات والفصل يحتمل أن تكون قادرا على حساب لنقل الفوضى في الأسر. نحن وغيرنا وذكرت العديد من الأنساب التي تم العثور احدة فقط الطفرة المسببة للأمراض متخالف في أي BBS جين معين (4، 5، 7، 14، 16، 17، 38). وقد تم افتراض أن الطفرة الثانية قد تكمن في عنصر تنظيمي. ومع ذلك، بياناتنا تقدم الفرضية البديلة، الذي، بالنسبة لبعض الأسر، وهذا المرض يمكن تفسير noncomplementation nonallelic بين الأليلات النادرة والمشتركة. على الرغم من أن معظم هذه الأليلات كانت نادرة جدا في فوج لدينا لأداء الاختبارات الجينية رسمية لهذه الفرضية، لم يكن هذا هو الحال بالنسبة ل123 IV في BBS2 [13.3٪ في الضوابط لدينا (ن = 240)، و 13٪ في سكان يوتا مع أصل من أوروبا الشمالية والغربية (CEU) هاب ماب]. في شمال AR186 الأسرة الأوروبية، وكان المريض haploinsufficient لBBS1 (مع وجود الحسنة الخسارة من وظيفة طفرة Q128X النية، على النحو الذي يحدده الفحص في الجسم الحي (الشكل 4 B و C)، لم يكن لديها الحذف واضح في الآخر ومع ذلك، كان أليل (كما تقرره SNP تغاير على مستوى ~ 1 كيلو بايت من القرار عبر مكان)، وليس لديها أي الأليلات المسببة للأمراض أخرى مرشحة في BBS1. هذا المريض أيضا متماثل ل123 IV SNP في BBS2، وظيفية ناقص المفعول (الشكل 4 A - C). الأهم من ذلك، على الرغم من أن أليل 123V قد تبدو كافية لالمرضية في هذه العائلة، وجود أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل 123V في عموم السكان (3٪ في الضوابط لدينا، 3.3٪ في CEU هاب ماب) ويقول أن الجمع بينها وبين هراء أليل BBS1 قد تحفيز الدولة المرض.

تين. 4.
إعادة تقييم البيانات الوراثية باستخدام المجراة التهديف. وتشير آثار الطفرات استنادا في الجسم الحي التحليلات أن شدة الطفرات BBS تتفق مع العزل من المرض في العائلات مع BBS. (A) على الرغم من أن هراء متخالف BBS1 طفرة Q128X موجودة في شخص لديه BBS في AR186 الأسرة باطل وظيفيا (B و C)، وجودها لا يأخذ في الحسبان تماما لهذا المرض. (B و C) تتأثر فرد، ومع ذلك، هو أيضا متماثل لتعدد الأشكال BBS2، I123V، وتوقع أن يكون ناقص المفعول معتدل. (D) حقن إما bbs1 أو bbs2 MO حده في النتائج تركيزات دون المستوى الأمثل في الأجنة تتأثر بشكل معتدل. Coinjection كل من المنظمات الأعضاء تنتج معا الأجنة المصابة بشدة مع الظواهر لم أر عن طريق الحقن إما MO وحده، بما في ذلك شبه كاملة فقدان تعريف أجسودي (المسمى من قبل myoD) وفقدان الحقل العين (المسمى من قبل pax2).

لأن التغيير 123 IV هو متكررة بشكل كاف في أوروبا، كنا قادرين على اختبار ما إذا كان التنبؤ في الجسم الحي من nonneutrality صحيح بالسؤال عما إذا كان إثراء أليل 123V من BBS2 وovertransmitted في المرضى الذين لديهم BBS. لاحظنا على حد سواء ليكون صحيحا: لقد وجدنا 123V في 55 (19.3٪) من 284 الكروموسومات من المرضى شمال أوروبا الذين BBS مقارنة مع 32 (13.3٪) من 240 الكروموسومات من الضوابط عرقيا المتطابقة، وهو فارق كبير (χ 2 = 8.78، P = 0.003)، على الرغم من أن اختبار اختلال التوازن انتقال أظهر أن 25 ثلاثيات بالمعلومات تحليلها (أي متماثل الأم لأليل طفيفة وباستثناء "اكتشاف" AR186 الأسرة)، وأحيلت 123V للفرد المصاب في 22 من الحالات (88٪؛ P = 0.02).
هذه البيانات، على الرغم من الأرقام متواضعة، وكلاهما يتفق مع المجراة التحليلات وموحية للتفاعل بين BBS1 وBBS2. لذا نحن اختبار ما إذا كان فقدان subeffective من BBS2 يمكن أن تعدل النمط الظاهري من فقدان BBS1 وظيفة. وجدنا دليلا قويا على أن هذا صحيح: حقن كل من bbs1 وbbs2 المنظمات الأعضاء تنتج الظواهر بشكل ملحوظ أكثر حدة من حقن إما MO وحدها، وبعضها، مثل فقدان شبه كامل للتعريف الجسيدة وفقدان مجال العين، كانت لم يلاحظ في أي حقن MO واحد، حتى في تركيزات أعلى (الشكل 4 D).

نقاش

استخدمنا واسع وشامل في استراتيجية التحليلية الجسم الحي التصديق عليها من قبل عدة مستقلة في المختبر والأدوات الوراثية لتقييم العواقب الوظيفية من المتغيرات nonsynonymous في الجينات BBS. تطبيق مثل شاملة في الجسم الحي المقايسات ليست فريدة من نوعها. على سبيل المثال، تم استخدام misexpression من جينات الإنسان في ذبابة الفاكهة لتقييم إمكانات المسببة للأمراض من الجينات / الأليلات المرتبطة اعتلال عضلة القلب (+39 - 41). وتشمل مزايا نظامنا استخدام الفقاريات التي يشترك في العديد من العمليات التنموية والميزات التشريحية مع البشر ويعاير من النمط الظاهري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ذات الأهمية المعروفة للمرض بين البشر. نلاحظ أننا يعاير فقط هذا الجانب من النمط الظاهري BBS وغيرها من عناصر الفوضى التي هي من PCP مستقلة قد لا يتم التقاطها. والجدير بالذكر، ومع ذلك، كانت البيانات المتوفرة لدينا أيضا متسقة مع جميع الملاحظات التي نشرت من أليل المرضية، مما يوحي بأن هذه المقايسات هي بدائل معقولة. لقد وجدنا 48 من 49 الطفرات يتوقع أن تكون ممرضة من التحليل الجيني البشري ليكون مثل، في حين أن تفسيرنا للأليل BBS1 M390R باعتباره ناقص المفعول يتسق مع M390R الضربة القاضية في نموذج الفأر (42) وتوقعاتنا BBS11 P130S أن تكون الممرضة يتسق مع تقرير سابق من فشل هذه أليل لإنقاذ النقل جسيم ميلانيني (15). وعلاوة على ذلك، في الجسم الحي لدينا بيانات عن BBS3 وBBS6 متفقة مع اثنين من الدراسات البيوكيميائية الأخيرة (29، 30).
لقد فوجئنا في البداية لإيجاد رجحان عال من الأليلات المهيمنة سلبية. رأيناها لأول مرة إمكانية أن هذا قد يكون قطعة أثرية للنظام في الجسم الحي، ربما بدافع من مستويات عالية من التعبير عن متحولة مرنا / البروتين. ومع ذلك، والحقن متساوي المولية من WT / مرنا متحولة قلصت ولكنها لم تطفئ تأثير مهيمن سلبية، والتعبير حتى بتركيزات دون المستوى الأمثل تنتج عيوب شديدة. هناك ثلاث آليات المرجح أن تفسر هذه الملاحظات. أولا، تم العثور على وجود فائض من الطفرات السلبية المهيمنة في العلاقات معدل الموقع الثاني، مما يشير إلى أن التعديل روكبي هو مرض وراثي جسمي، في حين أن المرض في حد ذاته لا يزال المتنحية. ثانيا، نتوقع أن الناقلين من الأليلات السائدة سلبية سوف تظهر تحت الإكلينيكي الظواهر BBS المصاحب. وتمشيا مع هذه الفكرة، تم الإبلاغ عن آباء المرضى الذين لديهم BBS أن تكون أكثر عرضة للبدانة وخلل في شبكية العين (43، 44). يثير الاهتمام والفضول، وجدنا طفرة BBS6 A242S أن يكون الاستنتاج السائد سلبية. وقد ارتبط هذا التحول مع السمنة في ولاية متخالف في دراسة على أساس السكان (45). وأخيرا، نعتقد أن الأليلات السائدة سلبية قد يؤدي الى تأثيرات على المستوى الكيمياء الحيوية، وربما عن طريق تعطيل BBSome (31) أو عن طريق التأثير في الكنسي / noncanonical توازن الإشارات WNT، كما كان الحال بالنسبة لBBS4 L327P. فمن الممكن أن مثل هذه التفاعلات من البروتينات متحولة إلى تفاقم النمط الظاهري المرض ولكن هذا التفاعل من متحولة والبروتين WT، على الرغم من أن تضر WT ظيفة البروتين، لا في حد ذاته يؤدي إلى المرض. هذه الصيغة هي متسقة مع التقرير الأخير للطفرة المهيمنة سلبية في β اميلويد البروتينات السلائف في رثت مقهور مرض الزهايمر (46).
تشير البيانات المتوفرة لدينا أيضا أن الأليلات المشتركة يمكن أن يكون ضارا وظيفة البروتين، وأنه في العديد من الحالات، والتفاعل تعتمد على سياق الأليلات النادرة ومشتركة يمكن تحديد النمط الظاهري. نحن التكهن بأن هذه التفاعلات هي على الارجح وفيرة في اضطرابات وراثية، وأنه ينبغي تقييم وجود والنسبية مساهمة الأليلات مع ارتفاع وتيرة أليل طفيفة بعناية في سياق المتغيرات النادرة إضافية.
وأخيرا، استفادت الدراسة من الطفرات BBS من مزيج من الحفظ التطوري قوي وفهم مسبق لبعض الممرات المشتركة في إمراض المرض. ومع ذلك، فمن المرجح أن هذا النهج هو ممكن من الناحية النظرية لمجموعة واسعة من الظواهر السريرية الأخرى. وسيكون من المهم لتطوير الأدوات التجريبية التي يمكن تقييم أثر الاختلاف على إخراج آليات المرض واضحة، أو على نطاق أوسع، على عواقب المظهرية لأنظمة بأكملها. سوف توفر على نطاق واسع resequencing يستلزم تطوير وتطبيق اختبارات بيولوجية مثل تلك المذكورة هنا لتقييم أهمية وظيفية من المتغيرات المحددة في الأفراد مع الظواهر المثيرة للاهتمام.

المواد والأساليب

المنظمات الأعضاء والتلاعب الأجنة.

المنظمات الأعضاء ضد الزرد bbs1 - 12 (SI الملحق، الجدول S1 تم الحصول عليها) والسيطرة MO من أدوات الجينات. تم حقن واحدة نانولتر كل الحل في الأجنة الزرد WT في واحد- إلى مرحلة الخلية يومين. مرنا WT ومتحولة البشري لBBS1 - 12 تم نسخه في المختبر مع عدة آلة SP6 رسالة (AMBION). MO ومرنا تركيزات (SIالملحق، الجدول S3 تم تحديد) على أساس الجمع التي WT مرنا انقاذ بكفاءة النمط الظاهري morphant. استخدمت تركيزات نفسها للانقاذ مع مرنا متحولة أو حقن مرنا وحدها. متوفرة عند الطلب البيانات منحنى الجرعة والاستجابة الكاملة لكل MO.

تصنيف وتسجيل النقاط من الأجنة.

تم تصنيف الأجنة تتأثر إلى قسمين الظواهر متدرج على أساس شدة النسبية مقارنة مع العمر المتطابقة الضوابط uninjected من نفس القابض، كما هو موضح في SI الملحق. وأجريت مقارنات بين حقن MO حدها، مرنا وحده، والإنقاذ متحولة، وWT الإنقاذ عن طريق χ 2 الاختبار.

كامل جبل RNA في الموقع التهجين.

جبل بأكمله في الموقع التهجين أجريت، تليها تركيب مسطحة، وتطهير في الساليسيلات الميثيل، والتصوير الفوتوغرافي في التكبير من × 10، والقياس، كما هو موضح في SI الملحق.

رصد حركات تكون المعيدة.

تم رصد تحركات تكون المعيدة عن طريق الحقن قسيم أرومي واحدة من 10000-M R-ديكستران مترافق الأخضر النسب الفلورسنت التتبع (إينفيتروجن) في المرحلة 16 خلية ورصد المواقع من الخلايا الفلورسنت من خلال مراحل اكتفار.

زراعة الخلايا الثديية.

وقد نمت الخلايا على coverslips الزجاج في DMEM وسائل الإعلام / F12 (10٪ المجلد / المجلد FBS). بعد ترنسفكأيشن عابرة مع Fugene 6 (روش)، تم إصلاح الخلايا في الميثانول بعد 48 ساعة وimmunostained مع مكافحة Myc على ومكافحة γ تويولين الأضداد الأرنب بولكلونل (سيغما).

شكر وتقدير

نشكر اندي McCallion، جيم Lupski، والمختبر Katsanis لمراجعة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل عن طريق منح R01HD04260 من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية. منح R01DK072301، R01DK075972 (لNK)، وR01DK52431 (لRLL) من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. مؤسسة البقعي الرؤية البحوث (NK)؛ والبصرية زمالة برنامج تدريب العلوم العصبية (NAZ)؛ ومؤسسة Berrie راسل (RLL). NK هو جان وجورج BRUMLEY أستاذ.

الحواشي

  • 1 لمن ينبغي أن تعالج المراسلات. البريد الإلكتروني: katsanis@cellbio.duke.edu.
  • الكاتب المساهمات: NAZ، ECO، JLB، وNK مصممة البحوث؛ NAZ، YL، JMG، CG، ECO، CCL، YB، JB، يقوم AS، وJLB البحوث؛ NAZ، YL، JMG، CG، ECO، CCL، YB، JB، RLL، AS، JLB، وNK تحليل البيانات؛ وNAZ، YL، ECO، RLL، كتب JLB، وNK ورقة.
  • الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
  • * كان تقديم هذه المادة المباشرة محرر مسبقا.
  • تحتوي هذه المقالة على معلومات داعمة على الانترنت في http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi...DCSupplemental.

المراجع

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #27  
قديم 11-23-2015, 10:12 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي السرطان والتشوهات الكلوي في أقارب المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل

 

http://ndt.oxfordjournals.org/content/15/12/1977.full




الخلفية. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب وراثي جسمي مقهور مع خمسة مواضع التعرف عليهم حتى الآن. الطيف من الأمراض تشمل تشوهات متنوعة في الكلى والمسالك البولية السفلي. الإصابة BBS حوالي 1/100 000 مع تردد متغايرة المتوقعة لل1/160، وقد اقترح أن الزيجوت هي في زيادة خطر الإصابة بالسمنة وارتفاع ضغط الدم.
طرق. وصفنا المرض الكلوي في أقارب من 109 مريض في المملكة المتحدة BBS. باستخدام PCR مع الواسمات الوراثية الفلورسنت نحن تضخيم DNA المستمدة من أورام الكلى من الآباء المتضررين لتحديد ما إذا كان هناك فقدان تغاير في أي من أربعة مواضع BBS واثنين من مواضع الجينات الأخرى المرتبطة خلية واضحة سرطان الخلايا الكلوية (CC-RCC).
النتائج. تم تشخيص CC-RCC في ثلاث من 180 الآباء BBS، وكان هناك فقدان تغاير في BBS1 (11q13) في أنسجة الورم واحد من هذه المواضيع. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك تم تحديد وجود نسبة عالية من عدم تخلق الكلوي في الأشقاء المرضى BBS وعائلتين BBS مع الإرث المهيمن على ما يبدو من تشوهات الكلى. في عائلة واحدة كنا قادرين على إثبات أن تشوهات الكلى فصلت مع موضع BBS2 (16q21).
الاستنتاجات. وبما أن جميع الآباء والأمهات وثلثي الأشقاء المرضى BBS يجب أن يكون متخالف للطفرات BBS، ملاحظاتنا قد تورط الجينات BBS في التسبب في كلا سرطان الكلى والتشوهات، سواء اضطرابات في نمو الخلايا السلائف والتمايز. نقترح قد يكون هذه الملاحظات آثار هامة لفحص ناقلات BBS المحتملة لأمراض الكلى، وقد تؤدي إلى فهم أفضل للعوامل المسببة لأمراض الكلى في عموم السكان.
الكلمات الدالة

مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) (MIM 209900) هو شرط مقهورة مع طائفة واسعة من المظاهر السريرية. المظاهر الأساسية في متماثل الأفراد (المتضررين) تشمل، ضمور قضيب / مخروط، والسمنة، polydactyly، قصور الغدد التناسلية، وصعوبات التعلم وعيوب الكلى [1، 2]. وتشمل الميزات طفيفة داء السكري، تليف كبدي، عجز الكلام، بتشوهات في الأسنان والسلوك المغاير. يتم التشخيص من خلال وجود أربعة معايير رئيسية [3].
وقد وصفت تشوهات الكلى في ما يصل الى 100٪ من المرضى BBS [2]، والفشل الكلوي هو السبب الرئيسي للمرض والوفاة المبكرة في BBS [2]. وقد تم الإبلاغ عن خلل التنسج، التهاب كبيبات الكلى المزمن، ومرض أنبوبي الكيسي، وكأسي وانخفاض تشوهات المسالك البولية، وعيوب أنبوبي التركيز قدرة [4].
BBS هو مرض غير متجانسة وراثيا مع مواضع التي أمكن التعرف عليها حتى الآن على 11q13 (BBS1)، 16q21 (BBS2)، 3p13 (BBS3)، و15q23 (BBS4)، كل منها مرتبط مع النمط الظاهري مماثلة في الدراسات حتى الآن [+5 - +8]. مؤخرا جدا، تم تعيينها موضعا الخامس ل2q31 (BBS5) في عائلة نيوفاوندلاند واحدة [9].
في العديد من الحالات المتنحية، وقد لوحظت مظاهر المرض جزئية في ناقلات متغايرة. ناقلة للترنح توسع الشعريات عرضة لخطر متزايد للإصابة بسرطان الثدي [10]، وحملة راثي متنحي من نوع متلازمة آلبورت قد يكون البيلة الدموية "حميدة" [11]. وقد اقترحت الآثار الناقل في الأسر BBS مع زيادة في حدوث السمنة، وارتفاع ضغط الدم ومرض السكري [12، 13]. أكملنا دراسة سريرية 109 مريض BBS وأقاربهم الذين يعيشون في المملكة المتحدة [14]، ولاحظ ارتفاع معدل انتشار واضح خلية سرطان الكلى الخلية (CC-RCC) وتشوهات الكلى بين الأقارب تتأثر. نحن الآن وصف عدة حالات واثنان من الأنساب من تشوهات الكلى وتقديم نتائج بحث عن فقدان الأليل في BBS المكاني في ثلاث الآباء الناقل تلزم الذي طور CC-RCC. نقترح أن الأفراد متخالف للطفرات BBS معرضون لخطر متزايد من هذه الاضطرابات. ملاحظاتنا آثار لفهم التسبب في اضطرابات النمو الكلى والتمايز، ولها آثار العملية تنطوي على أهمية لفحص أقارب BBS.

المواد والأساليب

المواضيع

وأجريت مقابلات مع أفراد BBS وأقارب من الدرجة الأولى من خلال الاستبيان من خلال قاعدة بيانات غي مستشفى بارديه-بيدل وقائمة أعضاء لورانس-مون بارديه-بيدل المجتمع "، وقد ذكرت في مخطوطة منفصلة [14]. وتشكل هذه الدراسة أكبر استطلاع واحد من الذين يعيشون المرضى BBS. تناول الاستبيان معرفة مسبقة من التاريخ الطبي للعائلة كبيرة. وقد سعى الملاحظات الطبية، مع موافقة المرضى، للتحقق من التشخيص والعلاج وأمراض الكلى. في حالات التشوهات ذكرت الكلى، والتقارير الإشعاعية والتصوير بالموجات فوق الصوتية وpyelograms تم الحصول عليها عن طريق الوريد. ومع ذلك، تم إجراء أي التصوير بالموجات فوق الصوتية الكلوي المنتظم على أقارب probands BBS. تم إرسال مائة وخمسة وعشرين probands من 105 أسرة الاستبيانات مع رسالة تفسيرية دعوة المشاركة، وعاد منهم 111 الانتهاء. لم المرضى اثنين فقط لا تفي معايير الاشتمال. حيث شوهدت المناسب والمرضى وأقاربهم في العيادة أو في المنزل، أو تم الاتصال به هاتفيا للحصول على مزيد من التفاصيل. أجريت جميع التحاليل النسيجية من قبل الأطباء الكلى.
استخراج الحمض النووي

كنا استراتيجيتين الجزيئية للتحقيق في قبائل وأفراد مختارين. أولا، سعينا دليل على فقدان تغاير في ثلاث عينات الورم في BBS1-4 (مواضع المعروف أن تترافق مع BBS في وقت هذه الدراسة)، وهيبل لينداو فون (VHL) و3p14 المنطقة (المنطقتين المرتبطة العائلية RCC). تم استخراج DNA من كتل جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين الكلى طبيعية وورم كلوي. بعد الدقيقة تشريح للأقسام 20 ميكرون، وعثر على الحمض النووي من الورم والأنسجة الكلى طبيعية، وذلك باستخدام طريقة استخراج الفينول كلوروفورم. لفترة وجيزة، تم إلغاء مشمع-العينة في الزيلين لمدة 30 دقيقة ثم يغسل ممهى متتابعة في 100، 80، 50٪ من الإيثانول وأخيرا في الماء المقطر. ثم خضع العينة الهضم من خلال إعادة تعليق في تحلل العازلة (150 ملي كلوريد الصوديوم، و 25 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) مع بروتين K (10 ملغ / مل) و 10٪ SDS. وحضنت المزيج على 55 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. وقد تحقق تنقية، أولا عن طريق إضافة الفينول، كلوروفورم، isoamylalcohol (25: 24: 1) إلى الأنبوب ثم الطرد المركزي لبيليه. وطاف ثم إزالتها، وأضاف أن حجم مساو من كلوروفورم، isoamylalcohol (24: 1). بعد الطرد المركزي أخرى، يضاف 2.5 مجلدات من الايثانول البارد لتترسب في الحمض النووي. كان هذا ثم غسلها في 70٪ من الإيثانول ومعلق في TE جاهزة للاستخدام في PCR.
ثانيا، سعينا ربط الكلوي تشوه النمط الظاهري إلى BBS مواضع الأربعة التي تم الاعتراف بها في وقت الدراسة. لهذا، تم استخراج DNA من الكريات البيض في الدم الطرفية ومرمزة كما هو موضح سابقا [15].
الاشعال

واستخدمت خريطة Genethon المستمدة تسلسل التمهيدي كما وصفها Beales وآخرون. [15]. وكان الاشعال تصنيعه تجاريا (لايف تكنولوجيز شركة) وكان يسمى التمهيدي واحد من كل زوج في موقف 5 'مع phosphoramidite صبغ (FAM، HEX أو النظم البيولوجية TET التطبيقية). وأخيرا تم تنقيته كل التمهيدي باستخدام HPLC.
البلمرة سلسلة من ردود الفعل والكهربائي للهلام

تم تضخيم كل تسلسل الحمض النووي الهدف من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تتضمن الواسمات الوراثية fluorescently المسمى المرافقة مواضع معروفة. تم تضخيمه في حجم رد فعل 10 ميكرولتر تحتوي على 1 ميكرولتر PCR العازلة (× 10) (670 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 166 ملي NH: أربعون نانوجرام من الحمض النووي الجيني أو قسامة 1 ميكرولتر من الحمض النووي المستمدة من الورم (20 المخفف 1) 4 SO 4، 67 ملي MgCl 2، 1،7 ملغ / مل BSA)، 5 ملي من كل dNTP (dATP، dCTP، dGTP، dTTP)، 2 بمول من كل التمهيدي فلوري (LTI) و 0.6 U من بوليميريز طق (شركة PROMEGA) . تم تنفيذ PCR في أحد الحرارية cycler على PTC-100 (الوراثية البحوث الأجهزة المحدودة). وكانت ظروف التفاعل النموذجية على النحو التالي، تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم 24 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، درجات الحرارة الصلب 54-60 درجة مئوية لمدة 45 ق والإرشاد عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها مباراة نهائية تمديد 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تم تحسين عدد دورة لكل عينة DNA المشتقة من الأنسجة لتوليد قمم المنتجات المماثلة في تقرير من فقدان الأليل.
بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام

وقد تم جمع عينة (1 ميكرولتر) من الناتج PCR مع 2 ميكرولتر من غير المتأينة الفورماميد و 0.5 ميكرولتر من حجم علامة فلوري (GS500-طمرة، النظم البيولوجية التطبيقية). بعد 3 دقائق تمسخ في 94 ° C، تم تحميل العينة على هلام 6٪ بولي أكريلاميد تغيير طبيعة (Sequagel-6، تشخيص الوطني) في 1 × TBE العازلة. تم تشغيل الجل على الآلية DNA الفلورسنت جزء محلل (نموذج 373A، النظم البيولوجية التطبيقية) لمدة 5 ساعات في 35 W و 40 درجة مئوية. تم تعيين الأليلات الأحجام، ومرتفعات النسبية ومجالات القمم باستخدام GENESCAN وGENOTYPER البرمجيات (ABI).
نسب أليل وتحديد LOH

تم تحديد ارتفاع ذروة أعلى أليلين (إذا متخالف) في الاقتران عينات طبيعية والورم. في حالة واحدة (متماثل) الذروة، تم تحديد منطقة لعينات المزدوجة. تم احتساب نسبة الأليلات لكل عينة طبيعية وورم كما وصفها Cawkwell وآخرون. [16]. يتم التعبير عن النتائج في مجموعة 0،00-1،00، حيث نسبة 0.50 أو أقل تشير فقدان أليلية كبيرة. كان PCR المتكررة للمرة الثانية لاستبعاد القطع الأثرية.
الكشف عن الطفرات VHL

وقد سعى سلالة الجرثومية الطفرات الجينية VHL كما هو موضح سابقا [17]. باختصار، تم إجراء التحليل الجنوبي لأول مرة على DNA الدم للكشف عن الجينات الحذف، وأجريت ضفيرة واحدة التشكل تعدد الأشكال (SSCP) تحليل للكشف عن الطفرات داخل الجين. تم تنفيذ التسلسل المباشر في المنطقة الترميز كاملة لتوصيف طفرة في المرضى الذين يعانون من الفرقة التحول SSCP واستبعاد طفرة في تلك مع تحليل SSCP العادي. ويتوقع لهذه التحقيقات إلى تحديد الطفرات في 80٪ على الأقل من سلالة الجرثومية الطفرات VHL الجينات [17].
إحصائيات

حسبت خمسة وتسعين في فترات الثقة في المائة (CI) لالخطر النسبي للوضع CC-RCC. لمقارنة النسب، استخدمنا الاختبار الدقيق ذي الحدين أو χ 2 الاختبار. -values ​​P <اتخذت 0.05 لتكون كبيرة.

النتائج

السرطان

وكان ثلاثة من 180 الآباء، كل القوقازيين، الذين تتراوح أعمارهم بين 37 عاما (الأم 1، الذكور)، 52 سنة (الأم 2، الذكور) وأنثى عمرها 40 عاما (الأم 3) غدية الكلى، مع كل الأنسجة الخلية واضحة. كان الوالد 1 بدون أعراض، وتشخيص عن طريق الفحص بالموجات فوق الصوتية عندما طلب منه المشاركة في برنامج البحوث التي تنطوي على ابنته، الذي لديه BBS والمزمن الفشل الكلوي. كان هذا الأصل أيضا أدلة من تشوه، مع الكلى والحالب الوجهين. سرطان بلده مقطوعة تماما وانه لا يزال خالية من الأمراض بعد 3 سنوات استئصال الكلية (الشكل 1 ⇔). عند التشخيص، كان الوالد 2 أعراض، مع المرض المنتشر، وتوفي بعد فترة وجيزة. تم تشخيص سرطان في الأصل 3 خلال تقييم الإشعاعي للتبرع بالكلى المحتملين لها BBS ابنة، الذي كان الفشل الكلوي في نهاية المرحلة. هذه الأم على قيد الحياة وبصحة جيدة 3 سنوات بعد استئصال الكلية. كانت تعرف أيا من هؤلاء الآباء والأمهات لديهم ما يلي عوامل الخطر المعترف بها لسرطان الكلى على النحو الذي استعرضه VOGELZANG وستادلر [18]: غسيل الكلى المزمن، والسمنة، التدخين، ارتفاع ضغط الدم الشرياني، الاستروجين، والتعرض المهني للمعادن الثقيلة والمنتجات النفطية.
كانت نسبة الآباء الذين لديهم أورام الكلى 1.67٪ (3/180). خطر السكان عموما من CC-RCC يرتفع بشكل حاد بعد 55 سنة [19]، في حين أن خطر التراكمي لتطوير CC-RCC تحت 55 سنة من العمر في عموم السكان 1 في 1041 [19]. هؤلاء الآباء الثلاثة، الذين كانوا صغار السن نسبيا في وقت التشخيص من CC-RCC، لذلك، لديهم خطر متزايد من CC-RCC (P = 0.0007، ثنائية nomial الاختبار المحدد (على الوجهين)). استقراء من هذا، فإن خطر التراكمي النسبي للآباء الأطفال BBS تطوير CC-RCC تحت 55 سنة هو 17 مرات (95٪ CI = 3،6 حتي 49،9) أن من عامة السكان.
ومن المهم تحديد ما إذا كان أي من هؤلاء الآباء والأمهات كانوا يحملون طفرة سلالة الجرثومية في جين VHL، والتي قد تساهم في تطوير CC-RCC. تم العثور على احد الوالدين (الأم 2) أن يكون طفرة مغلطة متخالف في جين VHL (C470G، Pro86Arg) على الرغم من أنه لم يكن هناك أي التاريخ الطبي أو العائلة سابقة تشير إلى مثل هذا التشخيص، وكما هو معروف في هذه الحالة. ولكن، حتى إذا تمت إزالة هذه الأم من التحليل، لا تزال هناك زيادة كبيرة في مخاطر CC-RCC. وعند مقارنة هذه النسبة من 1.11٪ (2/180) مع RCC مع خطر التراكمي العام للسكان تطوير RCC تحت 55 سنة (1/1041)، ويصبح الخطر النسبي 11 أضعاف (P = 0.017، اختبار دقيق ذي الحدين (اثنين -sided)).
باستخدام PCR (كرر مرة واحدة)، ونحن تضخيم DNA الورم مع الواسمات الوراثية من BBS1-4 ومن 3P. وكانت خسارة كبيرة أليلية الحالية في اثنين من الآباء BBS (2 و 3) مع CC-RCC (الشكل 2 ⇔). أظهر الأم 2 LOH في D11S480 (BBS1) مع نسبة أليلية من 0.33 وعلى D3S1300 (3p14) مع نسبة 0.50. تم العثور على الوالد 3 أن يكون LOH كبير في D3S1263 (VHL) مع نسبة 0.27 (ولكن لا تحور سلالة الجرثومية من VHL وجدت). لم يتم العثور على الوالدين 1 أن يكون LOH كبير في BBS1-4 ومواضع VHL. وبالإضافة إلى ذلك، كما نقوم بكتابته الآباء 2 و 3 باستخدام 38 STRPs عشوائي متباعدة بشكل متساو عبر الجينوم (في المتوسط ​​واحد لكل ذراع الكروموسوم) (الجدول 1 ⇔) وموثقة لا LOH كبير.

تين. 1.
(A) الموجات فوق الصوتية فحص ابنته مع BBS والفشل الكلوي في نهاية المرحلة تظهر صغيرة والكلى التنسج. (B) الموجات فوق الصوتية والد المريض BBS (A) يصور الورم الكيسي الكلوي. (C، D) هي أقسام ملطخة haematoxylin وحمض الدوري شيف من استئصال الكلية في الكلى هو مبين في (B). (C، D) منخفضة على التوالي (× 20) وارتفاع (× 63) صور قوة طبيعية أنسجة الكلى بالقرب من الورم تصور الكبيبات والأنابيب القريبة. (E، F) صور منخفضة وعالية الطاقة من ورم مجاور تظهر الأنابيب واصطف مع الخلايا مع السيتوبلازم واضح: ينظر إلى أي الكبيبات العادية أو الأنابيب القريبة.


تين. 2.
تم العثور على خسائر كبيرة في تغاير في D11S480 BBS1 علامة (11q13) في الأصل 2، في D3S1300 (3p14) في الأصل (2) وD3S1263 (VHL المنطقة 3p25) في الأصل 3. تم الكشف لا LOH في أي مكان في الأم 1.


الجدول 1.
الواسمات الوراثية المستخدمة في الدراسة
التشوهات

من 109 المواضيع BBS، وكان خمسة من 123 الأشقاء غير المصابين (4.1٪) واحد أو أكثر التشوهات الخلقية الكلى. وكان اثنان (1.6٪) عدم تخلق الكلوي من جانب واحد، منهم واحد لديه تشوه معقد المسالك البولية الانفرادي تتألف من الازدواجية وureterocoele (الجدول 2 ⇔). وفقا لKiprov وآخرون. في مسح 9200 التشريح وقوع عدم تخلق الكلوي من جانب واحد في عموم السكان حوالي واحد في 1000 [20]. لذلك، وقوع غياب من جانب واحد تعمل أنسجة الكلى في 2/123 الأشقاء BBS يمثل زيادة بنسبة 20 أضعاف (P = 0.007). وبالإضافة إلى ذلك، كان ثلاثة (2.4٪) جزر مثاني حالبي وثلاثة (2.4٪) لديهم ازدواجية في الحالب والحوض. ومع ذلك، قد تكون هذه الحوادث تقع في تلك المعترف بها لعامة الناس [21، 22]. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المثير للاهتمام أن نلاحظ أن هذه الأشقاء الخمسة، وكان جد واحد لاتكون الكلوي من جانب واحد، مع الكلى الانفرادي في الفشل الكلوي في نهاية المرحلة، وكان آخر الأصل (الأم 1 أعلاه) على الجهاز الكلوي مزدوج. وكانت هذه التقارير من تشوه الكلوي كل العرضية، وكان قد تم فحص لا الوالدين ولا الأشقاء بهدف مراقبة تشوهات الكلى. وبالإضافة إلى ذلك، سجلنا تاريخ بارز من تشوهات الكلى في اثنين من القبائل، الآن وصفا تفصيليا.

الجدول 2.
مجموعة من التشوهات الكلى ذكرت في 123 الأشقاء المرضى BBS
الأسرة A

والمستلفت تتميز في البداية من قبل رونج وآخرون. [23]، كان صبيا BBS البالغ من العمر 4-الذين لقوا حتفهم من الفشل الكلوي الثانوي إلى خلل التنسج الكلوي. توفي والده (الأم 2) من CC-RCC، ولكن لم يكن معروفا لديهم أي تشوه الكلوي وليس هناك تاريخ تشوه الكلوي في أسرته. والدة المستلفت هي صحية، ولكن لديها تاريخ عائلي قوي من تشوهات الكلى، والتي يبدو أنها ورثت بطريقة جسمية مهيمنة مع التعبير متغير (الشكل 3 ⇔). وتشمل هذه التشوهات مجموعات من عدم التخلق الكلوي وخلل التنسج الكلوي المقابل أو الازدواجية الجهاز الكلوي. الأم نفسها لديها بنية طبيعية الكلى وظيفة (المقررة من قبل الفحص بالموجات فوق الصوتية والكرياتينين البلازما). ومن المؤسف أن عينات من الحمض النووي أو المواد بعد الوفاة لم تكن متاحة من أي عضو من أعضاء الأم المشابهة كما فرضيتنا يمكن أن تدعم مزيدا من تبادل واحدة أو أكثر BBS الأليلات بين الأم وأقاربها مع تشوهات الكلى.

تين. 3.
الأسرة A. يوضح هذه النسب والميراث المهيمن اثنين من تشوهات الكلى. الازدواجية في الكلى والكلى المسالك وطرف واحد / لاتكون الكلوي الثنائي في عائلة الأم والمستلفت ل. لم يكن هناك تاريخ عائلي من تشوهات الكلى على الجانب الأبوي. ومع ذلك، فقد تم العثور على والد المستلفت لتحمل طفرة VHL سلالة الجرثومية.
الأسرة B

هذه العائلة (الشكل 4 ⇔) يتألف التوائم ثنائي الزيجوت مع BBS. اشتكى شقيقة يتأثر بهم من آلام الخاصرة اليسرى عندما كان مراهقا، ووجد أن ارتفاع ضغط الدم. على التحقيق، تم العثور على الكلى خلل التنسج صغير اليسار وفيما بعد إزالتها، وارتفاع ضغط الدم لها حل. وقالت انها أيضا جزر مثاني حالبي الى بلدها الكلية اليمنى، مع التهاب الحويضة والكلية المتكررة. ابنها الأصغر (الآن 2 سنة من العمر) كان التضيق الأبهري حرجة وتتطلب بضع الصمام في يوم 5. Antenatally، لوحظ ان لديه خلل التنسج multicystic يقم الكلى، والتي كانت غير وظيفية (أكد بعد الولادة عن طريق النظائر المشعة المسح الضوئي) وصورة المثانة micturating كشف الجزر المثاني الحالبي، في نظام المقابل. بعد ستة أشهر، قد الكلى multicystic ملتف حيث تم الإبلاغ عنها في غيرهم من الأفراد [24]. ووجد تحليل النمط الفرداني هذه الأسرة أن تكون متسقة مع الربط BBS2 (16q21)، الذي يحظى بدعم من جراء الاستبعاد من ثلاثة مواضع أخرى [15]. لتحديد حالة الناقل للأخت غير متأثر، والتنميط الجيني أيضا هي وعائلتها (الشكل 4 ⇔). انها، ابنها وابنة أخرى قد ورثت الجزء الكروموسوم نفسه، وهو من أصل الكبرى، الأب، كما أن تتقاسمها التوائم المتضررة. ويبدو أنها تحمل كل المنطقة التي تحتوي على الجين BBS2. ومع ذلك، فإن ابنة لديها بنية الكلى العادي على تصوير الحويضة الوريدي.

القسم السابق القسم التالي

تين. 4.
الأسرة B. هذه النسب مع اثنين من التوائم غير المتطابقة المتضررة (4.1 و 4.2) يتسق مع الربط BBS2 على 16q21 (استبعاد من BBS1، 2، 3 و 4). والنمط الفرداني في 4.1 يظهر الحدث إعادة التركيب بين D16S3034 وD16S408. يظهر مزيد من التحليل أختهم تتأثر (4.3) واثنين من أطفالها (4.7، 4.8) يحملون BBS2 الجينات المحتملة (بعد أن ورثت المرض grandpaternal يحمل كروموسوم). 4.7 لديها هيكل الكلى الطبيعية.

نقاش

خلية واضحة سرطان الخلايا الكلوية

حساب سرطان الكلى لمدة 2٪ من جميع حالات السرطان وعن 80-85٪ من الأورام الخبيثة الكلى [25]. وتشمل عوامل الخطر المعروفة لCC-RCC غسيل الكلى المزمن، والسمنة، التدخين، ارتفاع ضغط الدم الشرياني، الاستروجين، والتعرض المهني للمعادن الثقيلة والمنتجات النفطية [18]. يتم التعرف على العوامل الوراثية بشكل متزايد على أنها حاسمة في التسبب في العديد من الأورام، وخطر الإصابة CC-RCC يزيد على متوسط ​​1.6 أضعاف حيث هناك المتضررة من الدرجة الأولى النسبية [18].
الشكل الأكثر شيوعا من العائلي RCC خلية واضح هو مرض VHL، ولكن تم التعرف على عدم VHL المتغير خلية واضحة أيضا [26]. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا من تسع قبائل مع خلية واضحة غير VHL-الأسرية مجلس قيادة الثورة (HCRC) أن معظم المرضى تطوير RCC <50 سنة من العمر (EM، الملاحظات غير منشورة). الأساس الجزيئي للHCRC غير معروف ولكن هذا المرض لا أليلية مع مرض VHL أو العائلي حليمي سرطان الخلايا الكلوية [26؛ EM، الملاحظات غير منشورة] وأنه من الممكن أن BBS مواضع قد تكون متورطة في HCRC أو تمثل منخفضة انتفاذ خلية واضحة RCC قابلية أليل.
فيما يتعلق بالملاحظات رواية المحرز في هذه الدراسة، وهناك سؤالين رئيسيين للنظر فيها. أولا، هو وقوع غدية الكلى أعلى مما هو متوقع عن طريق الصدفة؟ ملاحظتنا من ثلاث حالات CC-RCC في كان 180 الآباء ذات دلالة إحصائية (P = 0.0007) مقارنة مع، التراكمي الخطر السكاني العام المرتبط بالعمر. حتى إذا أردنا إزالة الوالدين 2 على أساس أن الاستعداد له لمجلس قيادة الثورة وكان من المقرر بالكامل لنقل طفرة VHL وأنه لا يوجد أي مساهمة BBS، تبقى الملاحظات ذات دلالة إحصائية. وعلاوة على ذلك، فإن سن مبكرة نسبيا من التنمية من CC-RCC في هؤلاء الآباء والأمهات (37 و 40 و 52 عاما) لافت للنظر (CC-RCC تسود عادة في عقود 7-8TH الحياة [25])، ويشير إلى وجود المسببات المرضية الوراثية. حيث وصل سعر الناقل للBBS في المملكة المتحدة ما يقرب من 1 في 160، فإننا نتوقع أن يكون هناك نحو 350 000 ناقلات الجينات BBS (سكان المملكة المتحدة ~56 مليون دولار). وبناء على هذه الأرقام، 1 في 90 من شركات الطيران قد تكون في خطر لتطوير CC-RCC (3889 في المجموع). نسبة المبكر بداية RCC الذي يمكن أن يعزى إلى الزيجوت BBS قد يكون مرتفعا كما 6،9٪.
ثانيا، هناك أدلة الجزيئي لتوريط BBS مواضع في التسبب في هذه السرطانات؟ منذ BBS هو متلازمة المتنحية، كل من الوالدين هو متخالف لطفرة BBS. العديد من الاضطرابات الوقاية من الاصابة بالسرطان ناتجة عن ورم القامع تعطيل الجينات وفقدان البرية من نوع أليل (الكشف عن طريق تحليل LOH) غير متكررة في الورم. سيكون لدينا دليل على LOH كبير في موضع BBS في سرطان الكلى من الأم 2 تدعم الفرضية القائلة بأن الأليلات BBS متورطة في التسبب في RCC خلية واضح. على الرغم من أن الأم 2 زيارتها طفرة VHL سلالة الجرثومية، وLOH في BBS1 هو موح من تأثير المعدلة. واعتبر LOH أيضا في الأنسجة السرطانية الأم 2 لفي 3p14 (D3S1300)، وهي منطقة تورط سابقا في CC-RCC التنمية ولكن ليس على 3p25 (D3S1263 بالقرب من VHL). خرائط BBS3 إلى 3p13. ترتبط طفرات في جين سلالة الجرثومية VHL مع ارتفاع مخاطر من المبكر بداية وعديد المراكز CC-RCC وجسدية الطفرات الجينية VHL أو مثيلة وجدت في ما يصل إلى 70٪ من خطوط الخلايا CC-RCC والأورام الأولية [27]. ومع ذلك، VHL تثبيط الجين غير كاف لبدء CC-RCC وLOH في 3p12-P21 غير متكررة في CC-RCC مع وبدون تعطيل VHL الجينات [27]. الفاصل الزمني 3p12-P21 يحتوي على العديد من المناطق المرشحة CC-RCC TSG: 3p12 و3p21.3 الذي يتم حذف homozygously في خطوط خلايا الثدي وسرطان الرئة و3p14 الذي يحتوي على موقع FRA3B الهش [28] وهذا الجين FHIT [29]. ومن المثير للاهتمام أن D3S1300 (3p14) حذفت في الورم الأم 2، ولكن من غير الممكن معرفة مدى أهمية هذا التطور CC-RCC في هذه الحالة. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك ربما LOH في BBS4 في نفس الورم، إلا أن نسبة أليلية من 0.65 لن تبلغوا المستوى التقليدي للأهمية. على الرغم من أن المناطق ما يصاحب ذلك من LOH تم وصفها بشكل جيد في العديد من الأورام [30، 31]، وأهمية، والتفاعل بين، ومواضع مختلفة غير معروفة.
نستنتج أن LOH في BBS مواضع في CC-RCC في الزيجوت BBS من غير المرجح أن نشأت عن طريق الصدفة، والتحليل على نطاق كروموسوم عشوائي لم تكشف LOH على نطاق واسع (الجدول 1 ⇔). إذا ظيفة الجينات BBS كما ورم المكثفات، ثم يجب أن يكون أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل BBS في خطر متزايد من CC-RCC. لقد واجهنا حالة واحدة فقط من CC-RCC في المريض BBS (PLB، والمراقبة الشخصية) وذكرت حالة واحدة فقط في الأدب [32].
الفرضية البديلة قد يكون أن هناك تفاعلات روكبي بين BBS المكاني (والجينات التنموية الكلى ربما غيرها) بحيث فقدان أليل الطبيعي في مكان واحد أو أكثر يزيد من خطر CC-RCC. إذا كان الأمر كذلك، ثم الخطر النسبي لتطوير CC-RCC في كل الزيجوت وأصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل سيتوقف على وتيرة فقدان أليلية في موضع الثاني (interactor ل). النتيجة طفرة مغلطة VHL في الأصل 2، وكذلك LOH في علامة -associated VHL في الأصل 3 يتسق تماما مع هذه الفرضية. الآن أن الجينات BBS الخامس (2q31) تم تعيين [9]، سيكون من المثير للاهتمام أيضا لدراسة هذا الموضع في هذه الأورام.
تشوهات الكلى

مصطلح "تشوه الكلى" يصف الشذوذ المختلفة [33]. في عدم تخلق الكلوي الكلى غائب. وتشير "الكلى خلل التنسج" إلى أجهزة سيئة متباينة، والتي تحتوي على كثير من الأحيان الخراجات ('الكلى خلل التنسج multicystic'). وتشمل التشوهات التي تؤثر على المسالك البولية السفلي الازدواجية، جزر مثاني حالبي وureterocoele. كما تجدر الإشارة إلى أن الكلى خلل التنسج multicystic يمكن مطوي قبل أو بعد الولادة [24]، مدفوعا الخلايا الزائدة [33]، لإعطاء مظهر "عدم تخلق". قد تكون موروثة تشوهات الكلى الإنسان، إما في عزلة أو كجزء من متلازمات (على سبيل المثال عدم تخلق الكلوي وحاسة الشم لمبة تشوه في متلازمة كالمان [33]، وجزر مثاني حالبي مع ثلامات العصب البصري في هذه المتلازمة الكلوية-ثلامة [33]). الجينات المشفرة بواسطة BBS مواضع ربما يؤثر على نمو الخلايا السلائف والتمايز في الكلى الجنينية. لكن، وكما أمراض الكلى في المرضى الذين يعانون BBS يتراوح بين، وحتى داخل القبائل، جينات أخرى أو العوامل البيئية يجب أن تشارك في تحديد النمط الظاهري النهائي.
حالات التشوهات الكلى في عموم السكان هي عدم تخلق الكلوي من جانب واحد، 1/1000. من جانب واحد الكلى خلل التنسج multicystic، 1/5000. عدم تخلق الثنائية و / أو النمو الشاذ، 1 / ​​5000-10 000؛ جزر مثاني حالبي، 1/100. الحالب مزدوج من جانب واحد، 1/20 [20 - +22، 36]. لذلك، وقوع غياب من جانب واحد من نسيج الكلى تعمل في اثنين من الأشقاء 123 BBS يمثل زيادة بنسبة 20 أضعاف كبيرة. كما لا الفحص بالأشعة أو الموجات فوق الصوتية الرسمي للأقارب في هذه الدراسة وقعت، ومن المرجح أن تكون تحت تقدير هذه المخاطر. شاشة الموجات فوق الصوتية المنهجية لهؤلاء الأقارب هو مخطط لها ويمكن أن تكشف عن وجود نسبة أعلى بكثير من تشوهات الكلى. العثور ارتداد مثاني حالبي في 3/123 الأشقاء BBS المثير للاهتمام، ولكن ارتفاع نسبة هذا الاضطراب في عموم السكان يحول دون أي استنتاجات قاطعة فيما يتعلق BBS.
لدينا وصف عائلتين مع تشوهات الكلى على ما يبدو يورث هو فضول. في الأسرة A (الشكل 3 ⇔)، توفي والد المستلفت من CC-RCC لكن كان له تاريخ عائلي عادي خلاف ذلك، في حين أن والدته لا يوجد لديه تشوه الكلى نفسها، لكن لديه تاريخ عائلي قوي من تشوه الكلوي. الأم قد تمثل عدم انتفاذ-لاتكون الكلوي / عسر تصنع الجينات [35، 36]. عائلة B (الشكل 4 ⇔) يدل بوضوح على أن شريحة الكروموسومات من أصل الكبرى، الأب، التي تحتوي على BBS2 على 16q كان، شارك في رثته التوائم ثنائي الزيجوت المتضررة، أختهم تتأثر (مع ارتداد مثاني حالبي وخلل التنسج الكلوي)، ابنها الأصغر مع ملتف multicystic الكلى خلل التنسج وجزر مثاني حالبي، وابنتها التي تبدو طبيعيه الكلى. مرة أخرى، انتفاذ غير مكتملة قد تفسر السبب في أن ابنة لديها بنية الكلى العادي. ومع ذلك، فإن نمط الميراث أدلة دامغة لتشغيل الجينات التنموي الكلوي شيوعا في هذه العائلة. الاخوة التوأم في هذه العائلة لها نموذجي التركيبية الكلى (أي تفصص الجنين والخراجات كأسي) ولكن وظيفة الكلى طبيعية. فشلت دراسات الربط السابقة لتمييز أي اختلافات في أمراض الكلى في المرضى المتضررين من موضع [15، 37، 38].
الآثار المترتبة على الفحص الصحي

ويبدو أن ناقلات متخالف الجينات BBS لتكون في خطر متزايد من CC-RCC والمسالك البولية والتشوهات. إذا يمكن تأكيد هذه النتائج في مزيد من الأسر BBS، نقترح أن جميع الأقارب من الدرجة الأولى من حالات BBS ينبغي فرزها مع التصوير بالموجات فوق الصوتية للغامض تشوهات الجهاز الكلوي، لأن هذه قد تترافق مع ارتفاع ضغط الدم أو الفشل الكلوي. وعلاوة على ذلك، فإن سرطان الكلى يجب أن تكون مستبعدة في جميع الآباء والأمهات المرضى BBS، لأن الاكتشاف المبكر والعلاج قد تؤدي إلى تحسين أحوال الطقس.

ملاحظة المضافة في الدليل

منذ قبول هذه الورقة، ونحن قد ذكرت رسم الخرائط لمكان جديد BBS (BBS6) والتعرف على الجينات وما شابه ذلك. تم العثور على طفرات حادة في MKKS (McKusick-كوفمان متلازمة) الجين على 20p12 في 40٪ من الأسر نيوفاوندلاند BBS. الآلية المقترحة من التعطيل من قبل الجمعية مثل chaperonin المشفرة تشير إلى أن misfolding من البروتينات الوليدة حاول التعمق في الكلى، وشبكية العين والأطراف برعم والدماغ تنمية يحدث [39].

شكر وتقدير

ونود أن نشكر الدكتور كاثرين لويس، والدكتور شيلا فيشر للحصول على الدعم الإحصائي، وملكة جمال آه مون كوان لحساب المعدل التراكمي للسرطان الكلى تصل إلى 54 عاما، والدكتور ستيوارت بلاكي لتوفير عينات المرضية، والدكتور روز دي بروين، للحصول على المشورة الإشعاعية و السيدة جنيفر اليسون للمساعدة في جمع العينات. وأيد PLB من قبل زمالة من مجلس الأبحاث الطبية وحاليا، ويلكوم ترست. مشروع بحث عمل جرانت (S / P / 8178) تدعم ASW. ونحن ممتنون للجمعية لورانس-مون بارديه-بيدل متلازمة لما قدموه من مساعدة والتشجيع وللمرضى وأقاربهم الذين شاركوا في هذه الدراسة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #28  
قديم 11-23-2015, 10:23 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي IFT27، ترميز مكون GTPase صغيرة من جزيئات IFT، وتحور في عائلة الأقارب الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/23/12/3307.full



IFT27، ترميز مكون GTPase صغيرة من جزيئات IFT، وتحور في عائلة الأقارب الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل

+ الكاتب الانتماءات
  • 1 قسم الوراثة و
  • 2 قسم طب وجراحة العيون في مستشفى الملك فيصل التخصصي ومركز الأبحاث، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 3 قسم علم الوراثة و
  • قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية 4 من والكيمياء الحيوية، جامعة ييل، نيو هافن، CT، الولايات المتحدة الأمريكية
  • 5 السريرية في طب الأطفال، الأمير سلطان المدينة الطبية العسكرية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • قسم 6 لطب العيون، كلية الطب، جامعة الإمام محمد بن سعود الإسلامية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 7 قسم طب الأطفال، مستشفى الملك فهد المركزي بجازان، المملكة العربية السعودية
  • 8 السريرية لطب العيون، كلية الطب، جامعة الملك سعود، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • قسم 9 من التشريح وبيولوجيا الخلية، كلية الطب، جامعة الفيصل، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 10 قسم العيون، كلية الطب، جامعة الفيصل، الرياض، المملكة العربية السعودية،
  • قسم 11 من الوراثة الطبية، مستشفى الملك فهد العام، جدة، المملكة العربية السعودية و
  • 12 قسم أمراض كلى الأطفال، الأمير سلطان المدينة الطبية العسكرية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • ↵ * لمن ينبغي أن تعالج المراسلات على العنوان التالي: قسم العيون في مستشفى الملك فيصل التخصصي ومركز الأبحاث، الرياض، المملكة العربية السعودية. البريد الإلكتروني: falkuraya {في} kfshrc.edu.sa (FSA)؛ البريد الإلكتروني: zhaoxia.sun {في} yale.edu (ZS)
  • تلقى 26 نوفمبر 2013.
  • تلقى مراجعة 16 يناير 2014.
  • قبلت 27 يناير 2014.

ملخص

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي ciliopathy مقهورة مع إصابات أجهزة متعددة. حتى الآن، تم تحديد 18 جينات BBS والغالبية منهم من الضروري لوظيفة BBSome، وهو بروتين معقد تشارك في نقل البروتينات الغشاء من وإلى أهداب. بعد العيوب في الجينات المحددة ليست بقادرة على جميع الحالات BBS. تباين وراثي لهذا المرض يشكل تحديا كبيرا في تحديد الجينات BBS إضافية. في هذه الدراسة، ونحن إلى جانب علم الوراثة البشرية مع التحقق من صحة وظيفية في الزرد وIFT27 تحديدها على أنها رواية BBS الجين (BBS19). وهذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تورط لنقل intraflagellar (IFT) الجينات في التسبب في BBS، وتسليط الضوء على التعقيد الجيني لهذا المرض.

مقدمة

وهدب هو، عضية بغشاء القائم على أنيبيب أن يبرز من معظم الخلايا حقيقية النواة بعد الإنقسامية. في العقد الماضي، وتراكم أدلة تدعم الدور الحاسم من هذه العضية مصغرة بمثابة الهوائي إشارة للخلية حيوان فقاري، وقد تم ربط عيوب الهدبية إلى قائمة متزايدة من الأمراض التي تصيب الإنسان يشار إليها مجتمعة ب ciliopathies (1، 2).
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي واحدة من أفضل ciliopathies درس (3، 4). بل هو نادر وراثي جسمي اضطراب المتنحية التي تتميز إصابات أجهزة متعددة، بما في ذلك العين (نمط معين من تنكس الشبكية المعروفة باسم التهاب الشبكية الصباغي)، الطرف (polydactyly) والكلى (الكلى المتعدد الكيسات)، والتي يمكن تفسيرها عن عيوب الهدبية (2، 5). وتشمل المظاهر الرئيسية الأخرى السمنة، والإعاقة الذهنية ونقص الأعضاء التناسلية، على الرغم من ارتباطها ضعاف هدب أقل وضوحا (5). BBS غير المتجانسة وراثيا. حتى الآن، تم تحديد 18 جينات (3، +6 - +23).
وعلى الرغم من تحديد 18 جينات BBS، دليل يدعم وجود جينات BBS مجهولة (24). بحثنا السابق عن رواية جينات المرض BBS في 29 عائلة ولكن وجدت أنهم جميعا تؤوي الطفرات الجينية المعروفة (25، 26). في هذه الدراسة، ونحن نعرب تحليلنا لتسع عائلات جديدة. في واحدة من هذه الأسر، تم استبعاد جميع الجينات BBS المعروفة. أجرينا كذلك تسلسل كامل exome (WES) إلى جانب التحقق من صحة وظيفية في الزرد للبحث عن رواية BBS الجينات في هذه العائلة. بشكل غير متوقع، حددنا لنقل intraflagellar (IFT) الجينات، IFT27، ورواية BBS الجين (BBS19). IFT الجين يشفر مكونات الجزيئات IFT التي هي ضرورية لنشوء حيوي أهداب وصيانة (27 - 29). على الرغم من أن الجينات IFT ترتبط ارتباطا وثيقا مع وظائف الهدبية، عملنا هو أول من ربط الجين IFT إلى BBS.

النتائج

يحدد تحليل الطفرات الموجهة Autozygome الطفرات BBS سببية

اجتمع تسع عائلات متعددة غير موصوف سابقا التعريف السريري للBBS وكانوا مسجلين في هذه الدراسة. فإن الطبيعة الأقارب من جميع الأسر تسعة من الممكن استخدام autozygosity باعتباره معلما من الجين المرض المحتمل لأنه من المحتمل جدا أن الطفرات المسببة سوف يقيم في أليل الأجداد التي تم تقديمها ذاتي الأمشاج جنبا إلى جنب مع توضيح النمط الفرداني أجداده (30) . لذلك، استخدمنا autozygome المشتركة لكل عائلة لتوجيه تحليل تحور الجينات BBS كما هو موضح سابقا (25، 26). يسمح هذا النهج لنا للتعرف على طفرة السببية في ثمانية من أسر تسعة و، بما يتفق مع عملنا السابق، كان التباين الوراثي واضح. الجدول 1 يلخص النتائج السريرية والجزيئية في هذه الحالات.

الجدول 1.
ملخص النتائج السريرية والجزيئية في مجموعة الدراسة

التعرف على عائلة BBS مع رواية BBS الجينات

الأسرة BBS DG_7 هي عائلة سعودية الأقارب التي تتكون من الأصحاء الآباء ابن عم الأول وطفلين مع BBS فضلا عن ثلاثة أطفال أصحاء (الشكل 1). أقدم اثنين من الأشقاء المتضررة هو صبي يبلغ من العمر 15 عاما مع السمنة المرضية، إعاقة ذهنية خفيفة، polydactyly من جميع الأطراف، والفشل الكلوي الشريط الحدودي والتهاب الشبكية الصباغي. وبالإضافة إلى ذلك، لديه سحنة نموذجية، الكبد الدهني، نقص الشم، تأتب ونقص الأعضاء التناسلية. أخته البالغة من العمر 14 عاما هي مشابهة جدا في أن لديها السمنة المرضية (ق / ع تكميم المعدة)، polydactyly من ثلاثة أطراف، والفشل الكلوي في نهاية المرحلة تتطلب غسيل الكلى والتهاب الشبكية الصباغي (الشكل 1). لديها أيضا سحنة نموذجية، الكبد الدهني، نقص الشم وتأتب الشديد. وبالتالي، يتم تأكيد التشخيص من BBS الكلاسيكية على أسس سريرية. ويشارك autozygome من الأشقاء اثنين تتداخل مع اثنين من المعروف BBS مواضع: BBS7 وBBS12. ومع ذلك، تتابع على المستوى الجيني وRNA كشف أي المتغيرات، مما يدل على أن الرواية BBS الجينات قد تكون لهم علاقة في التسبب في المرض. التكميلية المواد، الجدول S1 يسرد الاشعال كدنا] تستخدم لاستبعاد الطفرات الربط في BBS7 وBBS12 التي قد يكون لها ضاعت على المستوى الجيني.

الشكل 1.
التعرف على عائلة BBS أن يعين موضعا الرواية. نسب الأسرة تبين طبيعة الأقارب وجود اثنين من الأطفال المتضررين (اللوحة العليا). وأظهرت الطرز الوراثية للطفرة IFT27 لكل عضو. صور الممثل polydactyly (اللوحة السفلى اليسرى) والتغيرات قاع (اللوحة السفلى اليمنى) (صورة قاع العين اليمنى تظهر الأوعية الشبكية الموهنة، شاحب القرص البصري، ضمور البقعي والتغيرات RPE منتشر) ترد. العائلة لم يوافق على عرض الصور في الوجه.

ويحدد كامل exome التسلسل طفرة جديدة في IFT27

من أجل التعرف على الطفرات المسببة في الأسرة BBS DG_7، وقد تابعت WES في المؤشر. فحص دقيق لجميع الجينات المعروفة BBS تحديد أي تغييرات المسببة للأمراض. نحن ثم يصفى مجموع 71 670 المتغيرات لتحديد الترميز متماثل / المتغيرات الربط (باستثناء التغييرات مرادفة) التي تكون موجودة داخل المشتركة autozygome من الأشقاء اثنين، ولكن تغيب في خادم Exome البديل و+357 السعودية في منزل exomes كما هو موضح سابقا (31، 32). هذا النهج القضاء على جميع ولكن متغير واحد في IFT27 [NM_006860.4. c.296G> A: ص (Cys99Tyr)] (الشكل 2). تم الحفظ جدا بقايا المتضررة، وتوقعت أن يكون البديل الإمراض التي كتبها في سيليكون وتحليل (PolyPhen 1.0، فرزت 0.0) (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، نفذنا النمذجة التماثل للهيكل IFT27 البشري باستخدام التركيب البلوري للمثلي كلاميدوموناس reinhardtii IFT27 كقالب (33). وأظهرت النتيجة أن الأحماض الأمينية C99 من IFT27 الإنسان يبدو أن تقع في قلب جزيء ويحتمل أن تشارك في استقرار التفاعلات إلى بقايا لوي الحفظ جدا قريب (الشكل 3 A). ان الطفرة C99Y يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير سلسلة جانبية (السيستئين إلى صور) الذي قد يؤدي إلى اشتباكات الفراغية مع سلاسل الجانب يسين الحفظ (الشكل 3 B)، يحتمل أن تسبب زعزعة الاستقرار في بنية البروتين.

الرقم 2.
WES يحدد IFT27 كما رواية BBS مكان. وتظهر اللوحة العليا سير العمل لتصفية متكررة من المتغيرات WES. لاحظ أن المتغير الوحيد الذي يبقى بعد التصفية هو البديل في IFT27، ويتم عرض اللوني تسلسله جنبا إلى جنب مع الضابطة للمقارنة. تظهر لوحة المتوسطة كرتون من بنية البروتين. وتظهر اللوحة السفلى محاذاة متعددة الأنواع لتسليط الضوء على الحفظ قوي من بقايا المتضررة.


الرقم 3.
3D تقديم تناظر غرار IFT27 هيكل. يقع C99 في قلب جزيء ويحتمل أن تشارك في استقرار التفاعلات إلى الحفظ جدا المخلفات لوي قريب (A). ان الطفرة C99Y يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير سلسلة جانبية (السيستئين إلى صور) الذي قد يؤدي إلى اشتباكات الفراغية مع سلاسل الجانب يسين الحفظ (B)، يحتمل أن تسبب زعزعة الاستقرار في بنية البروتين.

IFT27 C99Y هو الأليل الخسارة من وظيفة

تقديم أدلة قاطعة على أن C99Y هو أليل الإمراض، ونحن استغلال نموذجا الزرد أن نشرنا سابقا (34). يتم حفظها عاليا البروتين Ift27 الزرد مع نظيرتها الإنسان مع 54٪ مخلفات متطابقة. الأهم من ذلك، هو يحفظ بقايا C99 في الإنسان (C100 في الزرد) أيضا (الشكل 2). وبالتالي فإننا شيدت متجه التعبير عن ift27 C100Y الزرد. الأجنة الزرد شارك حقن مع morpholino بنسبة ضئيلة المنشأة ضد ift27 والسيطرة EGFP مرنا عرض الظواهر ciliopathy نموذجية. على وجه التحديد، أظهر 58.3٪ morphants (الحيوان ضربة قاضية الناتجة عن morpholino حقن) وجود عيوب تجانب، 52.3٪ مع بطني انحناء الجسم و 36.1٪ مع الكلى الكيسي (الشكل 4). وتمشيا مع السابق الدراسة، وشارك في حقن ift27-EGFP مرنا انقاذ morphants بشكل ملحوظ، مع 18.9٪ من الأجنة المحقونة تظهر العيوب تجانب، 15.5٪ مع انحناء و 13.3٪ مع الكلى الكيسي (الشكل 5). في المقابل، فشل شارك في حقن ift27C100Y-EGFP مرنا لإنقاذ أي من الظواهر. تظهر جنبا إلى جنب، وهذه النتائج أن هذا الأليل مع انخفاض شديد النشاط، إن لم يكن الخسارة من وظيفة أليل كاملة.

الرقم 4.
الظواهر من ift27 morphants. (A - C) تجانب كما يتضح من موقف القلب في 1 DPF. وتظهر الأجنة في وجهات النظر بطني. L: اليسار جانب. M: المتوسط؛ R: الجانبين الأيمن. (D) الجنين حقن مع morpholino السيطرة على ift27 مع قواعد متطابقة (C MO) في 3 DPF. (E) وهو morphant ift27 (ift27 MO) في 3 DPF. (F و G) نظرا الموسع من المناطق محاصر في D و E، على التوالي. الحمراء نقاط السهم إلى الكيس الكلى.


الرقم 5.
C100Y هو الأليل الخسارة من وظيفة. (A - C) الصور مجموعة من 4 DPF الأجنة شارك حقن مع ift27 MO وGFP مرنا (A، GFP)، ift27 MO وift27 GFP مرنا (B، ift27 GFP) وift27 MO وift27 C100Y GFP مرنا (C، C100Y GFP)؛ (D - F) الرسوم البيانية التي تبين مدى فعالية ift27 GFP أو ift27 C100Y GFP في إنقاذ العيوب تجانب (D، نسبة مشتركة من القلب المتوسطة والجانب الأيمن)، انحناء الجسم (E) والخراجات الكلى (F) لوحظ في ift27 morphants من ثلاث تجارب مستقلة. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. * P <0.05؛ ** P <0.01.

راقبنا التعبير عن النوع البري وC100Y Ift27 عن طريق التفتيش إشارات EGFP في الأجنة المحقونة، ولاحظت أن الأجنة المحقونة مع ift27C100Y-EGFP مرنا تظهر تخفيض إشارة GFP (الشكل 6 A). للتحقق من صحة هذه النتيجة، نحن حقن دفعتين مستقلة مرنا ترميز من النوع البري ومتحولة Ift27 إلى البرية من نوع الأجنة، استخراج البروتين وإجراء التحليل الغربي. وأظهرت النتائج أن مستوى البروتين الطافر وانخفاض كبير مقارنة مع النوع البري (الشكل 6 B)، مما يشير إلى أن البديل C100Y يقلل من استقرار Ift27، بما يتفق مع التنبؤ من 3D النمذجة.

الرقم 6.
يؤثر استبدال C100Y استقرار Ift27. (A) إشارة GFP في 7.5 ساعة الأجنة بعد الإخصاب حقنوا ift27 GFP (WT) أو ift27 C100Y GFP (C100Y) مرنا. (B) لطخة غربية تظهر مستوى Ift27-GFP (WT) أو Ift27 C100Y GFP (C100Y) في الجنين لست] كاملة. تم حقن الأجنة مع دفعتين مستقلة من mRNAs. واستخدمت تويولين كعنصر تحكم التحميل.

وقد تبين في وقت سابق ان في عدة نماذج BBS الزرد، والتشكل من حويصلة في كوبفر (KV)، وهي ضرورية الجهاز مهدبة لإقامة التماثل بين اليسار واليمين، ونقل إلى الوراء الأجسام الصباغية معيب (35، 36). للتحقيق في ما إذا كانت تشارك ift27 في هذه العمليات، ونحن التفتيش أولا KV التشكل في ift27 morphants وجدت لا يوجد فرق كبير (الشكل 7 A و B). درسنا كذلك النقل إلى الوراء الأجسام الصباغية بإخضاع morphants للعلاج الادرينالين. ومن المثير للاهتمام، تأخر الاستجابة جسيم ميلانيني التجميع بشكل كبير في ift27 morphants (الشكل 7 C و D)، مما يوحي بأن Ift27 قد تلعب دورا في نقل الحويصلة خارج أهداب.

الرقم 7.
ift27 هو الاستغناء عن KV التشكل ولكنه يشترك في النقل إلى الوراء الأجسام الصباغية استجابة لالادرينالين. (A) مورفولوجية KV. (B). التحليل الإحصائي لقطر KV في morphants التحكم (ن = 10) وift27 morphants (ن = 12). (C). الأجنة مع وبدون علاج ادرينالين تبين مورفولوجيا الخلايا الصباغية. (D) التحليل الإحصائي للزمن الاستجابة في ثواني للعلاج الادرينالين في السيطرة (ن = 10) وift27 morphants (ن = 13). شريط النطاق في A: 20 ميكرون. CMO: حقن الأجنة مع morpholino السيطرة مع قواعد متطابقة. MO، ift27 morphant. برنامج التحصين الموسع والعلاج الادرينالين. ** P = 0.0014.

نقاش

كشفت توصيف الكيمياء الحيوية المنوي من البروتينات المشفرة بواسطة الجينات BBS أن سبعة البروتينات BBS (المشفرة بواسطة BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكل نواة لمجمع بروتين، يدعى BBSome، أساسي للبروتينات غشاء الاتجار، مثل كما مستقبلات البروتين يقترن G-Somastatin مستقبلات 3، من وإلى أهداب (4، +37 - +39). بالإضافة إلى ذلك، Arl6، المشفرة بواسطة BBS3، مطلوب لاستهداف BBSomes إلى هدب (37)، وBBIP1، المشفرة بواسطة BBS18، هو مكون من BBSome ومطلوب لBBSome التجمع (20، 40). جنبا إلى جنب، وتشير هذه النتائج إلى أن عيب BBSome يمكن أن تكون الآلية الكامنة وتوحيد لBBS.
بشكل غير متوقع، في هذه الدراسة، حددنا IFT27 كما رواية BBS الجينات. IFT27 يشفر المكون من المجمع IFT-B اللازم لنقل تقدمي البروتينات الهدبية. على الرغم من البروتينات IFT هي من بين المجموعات الأولى وأفضل درس البروتينات التي تؤثر في وظائف الهدبية، والطفرات ذلك الإنسان حتى في الجينات IFT اقتصرت في عواقب المظهري لciliopathies الهيكل العظمي (41 - 48). هناك تفاعلات موثقة بين المجمعات IFT وBBSomes. في ايليجانس انواع معينة، والبروتينات BBS الجسور IFT-A والمجمعات B (49، 50). ربما الأكثر أهمية، في كلاميدوموناس، وBBSome هو شحنة من IFT (39). ومن المثير للاهتمام، ويظهر IFT27 البروتين العديد من المزايا الفريدة مقارنة مع البروتينات IFT أخرى. وهو GTPase الصغيرة التي تحمل شبها قويا لRab8 وRab11 (33)، وتشكل subcomplex مع IFT25 (51). وخلافا لمعظم البروتينات IFT، لا يتم الحفاظ على حد سواء IFT25 وIFT27 في C. ايليجانس والدروسوفيلاميلانوجاستر (52، 53)، مما يشير إلى دور أكثر تخصصا في IFT. وعلاوة على ذلك، IFT25، الشريك ملزم من IFT27، في حين يمكن الاستغناء عنها لتكون الأهداب، لتغطية تكاليف القنفذ الإشارات المناسبة (52)، تشبه بروتينات BBS متعددة (54). جنبا إلى جنب مع هذه النتائج، النتيجة في أن IFT27 تشارك في BBS يثير احتمال إثارة للاهتمام أن هذا GTPase صغير قد ربط البضائع BBSome إلى آلية IFT.
على الرغم من عدم التجانس الوراثي للBBS لم يقدر تماما، وتشير الأعمال السابقة أن أي رواية BBS الجين المرجح أن يفسر سوى نسبة صغيرة من المرضى (25). ويؤيد ذلك من قبل القليلة الماضية الجينات BBS وصف (BBS15 و ​​17 و 18) التي كانت تستند جميع على الأسر واحدة أو المرضى واحد في بعض الأحيان (10، 14، 20). وبالمثل، وتبين لنا أن واحدا فقط من تسع عائلات في هذه الدراسة يمكن تفسير الطفرات في IFT27. إذا جمعنا هذه المجموعة مع شركائنا سابقا فوج من 29 عائلة (25)، مساهمة IFT27 هو <3٪ في الأسر BBS السعودية. على الرغم من أن مساهمة IFT27 الطفرات إلى تجمع طفرة BBS في السكان الأباعد غير معروف، نشك في أنها سوف تكون صغيرة بالمثل، وتمشيا مع بعض الجينات BBS وصف مؤخرا أنه حتى الآن لم يتم تحديدها خارج الأسر الأصلية / الحالات التي كانوا تحديدها. ومع ذلك، وتحديد رواية نادرة الجينات BBS مهم حيث أنه يوفر معلومات مفيدة في أهداب البيولوجيا وciliopathies بشكل عام، والتسبب الجزيئي للBBS على وجه الخصوص.
وخلاصة القول، أن نحدد IFT27 كما رواية BBS جين المرض باستخدام الخرائط الموضعية، WES وتأكيد وظيفية في نموذج الزرد. وهذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تورط بروتين IFT في التسبب في BBS.

المواد والأساليب

بالكائن البشري

تم تشخيص المرضى الذين يعانون من BBS وفقا للمعايير المحددة التي تأخذ بعين الاعتبار عدد من المظاهر السريرية الكبرى والصغرى (5). تم تجنيد جميع المرضى وأفراد العائلة ذات الصلة باستخدام بروتوكول المعتمد IRB مع الموافقة المسبقة. تم جمع الدم الوريدي في أنابيب EDTA، وعند الاقتضاء، في PAXGene لاستخراج DNA و RNA، على التوالي.

Autozygome تحليل تقرير والجينات مرشح

وكان تقرير لمجموعة كاملة من فترات ذاتي الأمشاج للفرد (autozygome) أساسا كما هو موضح سابقا (30). لفترة وجيزة، تم إجراء التنميط الجيني الجينوم على نطاق على منصة اكسيوم باتباع إرشادات الشركة المصنعة. وأعقب ذلك تحديد أشواط من زيجوت متماثلة الألائل كبديل للautozygosity باستخدام برنامج autoSNPa (55). تم فحص قائمة 18 تعرف جينات المرض BBS عبر إحداثيات autozygome المشتركة الأفراد المتضررين لتحديد أي الجينات لتضخيم والتسلسل (56). متوفرة عند الطلب الاشعال PCR والظروف.

كامل exome التسلسل

تم تنفيذ القياسي تسلسل كامل exome باستخدام TruSeq Exome إثراء مجموعة (البورشيد) تليها إعداد مكتبة التسلسل البورشيد، مع إثراء للهدف المطلوب باستخدام بروتوكول إثراء البورشيد Exome. والتسلسل المكتبات استولت باستخدام IlluminaHiSeq 2000 التسلسل. ويقرأ تم تعيينها ضد UCSC hg19 من قبل التحالف. تم الكشف عن تعدد الأشكال وIndels التي كتبها SAMTOOLS.

في النمذجة سيليكون

وأجري النمذجة تناظر من IFT27 الإنسان من استخدام كل من المنمذج برنامج وخادم النمذجة الآلية I-TASSER، التي صنفت كأفضل الخادم في تقييم نقدي الأخير من تقنيات لبنية البروتين المسابقات النمذجة التنبؤ (+57 - 59). يتم النمذجة عن طريق المنمذج في الخطوات التالية. قبل النمذجة، ومحاذاة تسلسل IFT27 الإنسان مع أن من كلاميدوموناس reinhardtii IFT27، الذين الكريستال هيكل وقد تم تحديد (PDBID: 2YC2) (33). وفي وقت لاحق، وكانت متواليات الانحياز مدخلات المنمذج للنمذجة تناظر باستخدام البنية البلورية كلاميدوموناس IFT27 كقالب باستخدام وظيفة المدمج في لالمنمذج. هو ممنوح الثقة في النمذجة تناظر بنسبة (ط) درجة عالية من التماثل تسلسل بين الجزيئات الإنسان وكلاميدوموناس IFT27 (الهوية ~37٪ و~54٪ تشابه)، و (ثانيا) تشابه النماذج الناتجة تنتجها المنمذج وI -TASSER. النموذج الناتج هو موثوق بها وخاصة بالنسبة للمنطقة حول بقايا C99، التي تحيط بها بقايا لوي الحفظ جدا في IFT27 البروتينات.

تربية الزرد

واستمر الزرد وفقا لبروتوكولات القياسية (60). وقد تم الحصول على البيض من خلال التفريخ الطبيعي.

ضربة قاضية، وتحليل النمط الظاهري والإنقاذ التجارب في الزرد

A morpholino بنسبة ضئيلة المنشورة سابقا (5 'GGAGGTAATAGTGTGTGTCTACGTG 3') ضد الموقع الشروع متعدية ift27 (34 تم استخدام) لضربة قاضية للتعبير عن ift27. تم استخدام morpholino مع خمس قواعد mispaired (5 'GGA ج GTAATA ج TGT ج ز TGT TAC ج TG 3'، وحالات انخفاض ومسطرة) باعتباره morpholino السيطرة. تم الحصول على GFP بناء ift27 C100Y بواسطة الطفرات موقع الموجه بناء على البلازميد ift27 GFP (34). ift27 GFP أو تم تصنيعه ift27 C100Y GFP مرنا في المختبر باستخدام عدة mMESSAGE mMACHINE (AMBION، AM1340).
للمقايسة الإنقاذ، كان 150 خريج من ift27 GFP مرنا أو ift27 C100Y GFP مرنا شارك في حقن 2 نانوغرام من ift27 morpholino إلى الأجنة خلايا مرحلة واحدة. وقد لوحظت الأجنة لعيوب تجانب على أساس موقف القلب في 1 DPF (يوم بعد الإخصاب)، للانحناء الجسم على 2 إدارة الشرطة الاتحادية، والخراجات سليفة الكلوة في 3-4 DPF.
لتفقد مورفولوجية KV، وقد شنت الأجنة الحية في جميع أنحاء مرحلة 14 الجسيدة في 3٪ ميتيل، تصوير باستخدام تدخل الفرق النقيض المجهري، وتم قياس قطر في برنامج فوتوشوب. تم تأكيد فعالية morpholino عن طريق التفتيش نفس دفعة من الأجنة المحقونة للجسم انحناء النمط الظاهري في 1 DPF.
تم إجراء فحص النقل جسيم ميلانيني باستخدام بروتوكول نشرت سابقا (35) مع تعديلات طفيفة. على وجه التحديد، تعرضوا 2 DPF الأجنة إلى 3.75 م م الادرينالين في المتوسط ​​الجنين وتفتيشها تحت نطاق تشريح. تم تسجيلها في وقت والاستجابة لكل جنين.

استخراج البروتين والنشاف الغربي

تم deyolked الأجنة في برنامج تلفزيوني يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز (روش، REF11836170001) والمتجانس في تريس العازلة تحلل (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 150 م م كلوريد الصوديوم، 0.5٪ NP40، 0.1 م م DTT) يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز . تم التشويه والتحريف البروتينات في SDS عينة العازلة عند 100 درجة مئوية لمدة 7 دقائق وتطهيرها عن طريق الطرد المركزي في 12 000 ز لمدة 3 دقائق. لالنشاف الغربي، كانت تستخدم الماوس مكافحة GFP مفتش (روش) والفأر مكافحة تويولين (المسابر الجزيئية، A11126) في 1: 1000 كما الأجسام المضادة الأولية. تم استخدام الأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق الفجل الثانوية (جاكسون المناعية للبحوث) في 1: 2000. تعرض الأغشية لتعزيز الكشف عن معان كيميائي باستخدام الإضاءة الغربية بالإضافة إلى ECL مجموعة (بيركن، إلمر علوم الحياة).

التحليل الاحصائي

وقد تم الحصول على -values ​​P من خلال ر الطالب -test باستخدام Microsoft Excel.

المواد التكميلية


التمويل

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة دبي هارفارد للأبحاث الطبية التعاونية منحة بحثية (لFSA)، R01 DK092808 من المعهد الوطني للصحة ومنحة بحثية RSG-10-247-01-DDC من الجمعية الأمريكية للسرطان (لZS) و الأساسية الحيوان لمركز البحوث تكيس أمراض الكلى في جامعة ييل (DK090744).

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #29  
قديم 12-02-2015, 09:40 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي الطفرات في عضو من الفصيلة رأس من البروتينات ملزم gtp صغيرة يسبب متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.nature.com/ng/journal/v36...ll/ng1414.html


RAB، والعوامل ADP-ribosylation (ARFs) وARF مثل (ARL) بروتينات تنتمي إلى الفصيلة رأس من البروتينات ملزم GTP صغيرة وضرورية لمختلف الاتجار غشاء المرتبطة داخل الخلايا العمليات 1، 2. أي من وترتبط 50 أعضاء معروفين من هذه العائلة إلى الأمراض التي تصيب البشر. باستخدام شاشة بيوينفورمتيك للجينات الهدبية في تركيبة مع التحليلات طفرية، حددنا ARL6 كما الجينات الكامنة بارديه-بيدل نوع متلازمة 3، وهو اضطراب multisystemic تتميز السمنة، والعمى، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الادراك 3، 4. وكشف لنا أربعة بدائل متماثل مختلفة في ARL6 في أربع أسر لا علاقة المصابين بمتلازمة بارديه-بيدل، اثنان منها تعطيل بقايا ثريونين هامة لGTP ملزمة 5 وظيفة 5، 6، 7 من عدة بروتينات ملزمة GTP صغيرة ذات الصلة. تحليل homolog انواع معينة ايليجانس ARL6 يشير إلى أن يتم التعبير عن ذلك على وجه التحديد في الخلايا المهدبة، وأنه، بالإضافة إلى وظائف حشوية المفترضة من البروتينات ARL، فإنه يخضع النقل intraflagellar. هذه النتائج توريط بروتين ملزمة GTP صغيرة في النقل الهدبية والتسبب في اضطراب عديد المظاهر.

أهداب والأسواط والقديمة، والعضيات حقيقية النواة الحفظ تطويريا أن المشروع من الخلايا والتي تم تكييفها من قبل الكائنات الحية من الاضطلاع بوظائفها البيولوجية المتنوعة 8. الجمعية والصيانة وظيفة الأهداب والأسواط تعتمد على وسائل النقل intraflagellar (IFT)، وترتبط عيوب في هذه العملية النقل القائم على أنيبيب وظيفة الأهداب مع العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك متلازمة بارديه-بيدل (BBS) 8، 9 ، 10. وقد تم تحديد الجينات الكامنة سبعة من ثمانية مواضع المعروف أن تترافق مع BBS 4، 11؛ فقط الجين المتحور في نوع BBS 3 (وتسمى BBS3)، المعين من قبل ل3p12 (الحكام. 12، 13)، ظلت مجهولة الهوية. ويعتقد BBS أن يؤدي إلى حد كبير من اختلال وظيفي الهدبي، لأن الخسارة من وظيفة الطفرات في C. ايليجانس BBS-7 و BBS-8 بنية حل وسط الأهداب وتعمل 14 والتدخل RNA النتائج كلاميدوموناس BBS5 في فقدان سياط 11. والجدير بالذكر أن جميع المعروفة C. ايليجانس يتم التعبير عن الجينات BBS حصرا في الخلايا مع أهداب، وذلك بسبب وجود DAF 19 RFX موقع ملزمة عامل النسخ (X مربع) في المروجين لها 10، 11. افترضنا أن C. سوف ايليجانس ortholog من BBS3 الإنسان يحتوي أيضا هذا العنصر التنظيمي، والتي من شأنها أن تسمح لنا لتحديد المرشحين من> 90 الجينات التي تعين الفاصل BBS3 النقدي 12، 13، 15. ولدت لنا تسلسل إجماع X-مربع من مجموعة تدريب 14 C. الجينات ايليجانس تحتوي على صناديق X أن من المعروف أن أعرب بدقة في الخلايا المهدبة واستخدمتها لمسح C. ايليجانس الجينوم. حددنا 368 الجينات مع تسلسل X-مربع خلال 1.5 كيلوبايت من كودون البداية، 168 من الذي كان له ortholog الإنسان الحقيقيين (قيمة E 10 -6)؛ ثلاثة من هذه وقعت في الفترة الحرجة BBS3 (الشكل 1A). الجين الأول، ESRRBL1، وربما كان ortholog البشري من C. وأعرب عن ايليجانس تشي-13. تشي-13 حصريا في الخلايا العصبية المهدبة وله دور مهم في IFT 16، وهكذا كان ESRRBL1 مرشح ممتاز لBBS3. الجين الثاني بترميز DKFZp761H079 البروتين افتراضية، وهو عضو في الأسرة ARL من الملزم GTP بروتينات صغيرة 1، 2. يرتبط تسلسله ارتباطا وثيقا ARL2، وكنا نسميها ARL2 مثل البروتين 1 (ARL2L1). بترميز الجينات الثالث ARL6، وآخر أفراد العائلة ARL 17.

الشكل 1. مواقف وتحليل التعبير عن الجينات المرشحة في المنطقة الحرجة BBS3.

(أ) ويحيط المنطقة الحرجة BBS3 على الصبغي 3 من D3S1302 علامات وD3S1595 (الحكام. 12، 13)، على الرغم من إعادة التركيب في واحدة من الأنساب تشير إلى أن علامة qter هو في الواقع D3S1753 (المرجع 12). وتظهر المواقف النسبية من الجينات الثلاث المرشحة في المنطقة الحرجة BBS3 جنبا إلى جنب مع المعلومات المتعلقة بهم C. homologs ايليجانس. (ب، ج) التعبير عن ARL-6 وY37E3.5 في C. ايليجانس. للصحفيين GFP النسخي وأعرب عن ARL-6P :: GFP (ب) وY37E3.5p :: GFP (ج) في الخلايا العصبية المهدبة للرئيس دودة (على سبيل المثال، amphid والخلايا العصبية الشفوية الداخلية والخارجية) وذيل دودة (phasmids). هو موضح في لوحات هي تدخل الفرق النقيض (DIC)، GFP مضان واندمجت صور من دودة كاملة، وكذلك الصور التكبير أعلى من الرأس والذيل المناطق للديدان معربا عن ARL-6P :: GFP. وأشار رئيس وفصمية الخلايا العصبية المهدبة الذيل بأقواس مربعة ورؤوس سهام، على التوالي. إشارات الفلورسنت على طول أوسط الجذع من الديدان معربا عن ARL-6P :: GFP هو بسبب تألق ذاتي غير محددة من حبيبات الأمعاء.


كامل الشكل وأسطورة (56K) لتقييم احتمال أن ARL6 أو ARL2L1 هو BBS3، نحن مصممون على أنماط التعبير من C. بهم ايليجانس orthologs (ARL-6 وتوقع Y37E3.5 الجينات، على التوالي). ولدت لنا خطوط المعدلة وراثيا معربا-المروج الخضراء بروتين فلوري (GFP) بنيات الانصهار (ARL-6P :: GFP أو Y37E3.5p :: GFP) وتحليلها GFP مضان. مثل المروج تشي-13، والمناطق 5 'غير مترجمة (UTRs) من ARL-6 وY37E3.5 الموجهة التعبير إلى مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا الحسية التي مهدبة (الشكل 1B، ج). لكل من الجينات المحورة، لاحظنا إشارات GFP في عدة الخلايا العصبية المهدبة amphid في الرأس وكل من الخلايا العصبية فصمية مهدبة (PHA وPHB) في الذيل (الشكل 1B، ج)، كما ذكرت سابقا عن الجينات الأخرى المرتبطة BBS 10، 11 . نحن أيضا الكشف عن التعبير في غيرها من الخلايا العصبية الحسية مهدبة، بما في ذلك الخلايا العصبية الشفوية الداخلية والخارجية (الشكل 1B، ج) والذكور الخلايا العصبية راي ذيل (لا تظهر البيانات). في حالة Y37E3.5p :: التحوير GFP، ونحن أيضا الكشف عن مضان GFP في أوسط الجذع PDE مهدبة الخلايا العصبية وPQR ذيل مهدبة الخلايا العصبية.

كما أنماط التعبير من C. ايليجانس تشي-13، ARL-6 وY37E3.5 متطابقة أساسا لتلك الخمسة المعروفة C. orthologs ايليجانس الجينات المرتبطة BBS 10، 11، درسنا orthologs الإنسان عن الطفرات في الأسر التي لديها BBS. نحن التسلسل الأطر قراءة كاملة وحدود اكسون-إنترون من ESRRBL1 وARL2L1 في الحمض النووي للفرد المتضررين من عائلة تتسم جيدا من نيوفاوندلاند مع BBS3 (NF-B2؛ المرجع 13)، ولكن لا توجد الطفرات المسببة للأمراض. ومع ذلك، فعلنا تحديد مغلطة متماثل الطفرة 859G C (مما أدى إلى استبدال الحمض الأميني G169A) في ARL6 في هذا الشخص (التين. 2 و3A). فصلت ما بين طفرة مع النمط الظاهري BBS في الأسرة NF-B2 (الشكل 2)، وكانت غائبة عن 100 الكروموسومات السيطرة. درسنا القادم في التركيب الجيني لجميع الأسر الأقارب المتاحة فيما يتعلق BBS مواضع ثمانية. كان الفرد المصاب في عائلة سعودية (KK29) متماثل فيما يتعلق علامات عبر فترة حرجة BBS3، وتكوين الجمعيات للمرض مع جميع مواضع أخرى استبعدت في هذه العائلة. أظهر التسلسل والفصل اللاحق في هذه العائلة أن الأفراد المتضررين، ولكن أيا من أقاربهم تتأثر، كان متماثل فيما يتعلق 445C الطفرة T، مما أدى إلى غير محافظ الأحماض الأمينية تغيير T31M (التين. 2 و3A). للتحقيق عما إذا كانت ARL6 هو BBS3 وتحديد مساهمتها في BBS، قمنا بتوسيع نطاق تحليل الطفرات جهدنا لفوج متعددة الأعراق من 230 عائلة مع BBS وتعرف على اثنين اخرين أسر مع الطفرات التي ربما تكون المسببة للأمراض. في أمريكا الشمالية AR390 الأسرة ويشتبه القرابة، والفرد المصاب، ولكن أيا من أقاربهم تتأثر، كان متماثل فيما يتعلق 862T الطفرة G، مما أدى إلى تغيير غير محافظ الأحماض الأمينية L170W (التين. 2 و3A). وبالإضافة إلى ذلك، حددنا عائلة الأقارب الايرلندية، PB140، الذين حملوا الطفرات 445C متماثل G تؤثر على بقايا Thr31 (مما أدى إلى استبدال الحمض الأميني T31R؛. التين 2 و3A). تم الكشف عن أن أيا من هذه التغييرات في 184 الكروموسومات السيطرة عرقيا يقابل.

الشكل 2. تحليل النسب تبين الفصل بين الطفرات مغلطة في أربع أسر لا علاقة لها مع BBS: طفرة 859G C (مما أدى إلى G169A تغيير الأحماض الأمينية) في الأسرة NF-B2. طفرة 445C T (T31M) في الأسرة KK29. طفرة 862T G (L170W) في الأسرة AR390؛ والطفرة 445C G (T31R) في الأسرة PB-140.
وتستند مواقف النوكليوتيدات للطفرات المذكورة أعلاه على تسلسل ARL6 من بنك الجينات. WT، من النوع البري.


كامل الشكل وأسطورة (10K) الشكل 3. وبقايا تحور في المجموعة ARL6 في أو بالقرب من موقع ملزم GTP في بنية غرار ARF6.
(أ) تخطيطي لARL6 الجينات التي تبين مواقع الطفرات وجدت في الأفراد المتضررين من أربع عائلات مع BBS3. وترد الإكسونات مربعات مظللة. الطفرات تشير إلى نص يتضمن اكسون 2A لكن ليس اكسون 2B. الحفظ (ب) تسلسل للموقع ملزم النوكليوتيدات (P حلقة) في البروتينات ملزم GTP صغيرة. يتم وضع علامة Thr31 من HsARL6 بعلامة النجمة. (ج، د) النمذجة التماثل من ARL6 على أساس التركيب البلوري للARF6 (المرجع 21) يبين الهيكل المزعوم من ARL6. الأحماض الأمينية التي الهيدروجين السندات مع GTP النوكليوتيدات وتظهر S (برتقالي مظللة) باللون الأزرق. وتظهر التغييرات الأحماض الأمينية الناتجة عن الطفرات التي تم تحديدها في الأسر التي لديها BBS3 باللون الأحمر.


كامل الشكل وأسطورة (44K) الطفرات في ARL6 فصل مع BBS في أربع عائلات مستقلة، مشيرا إلى أن ARL6 هو BBS3. ويدعم هذه الفكرة أيضا بمقارنة تسلسل الحمض الأميني ARL6 من الكائنات الحية المختلفة (التكميلي الشكل 1 على الانترنت). Gly169 غير ثابتة، وبقايا Thr31 وLeu170 يتم حفظها للغاية: بقايا 31 هو من الأحماض الأمينية مع سلسلة جانبية الهيدروكسيل (يفضل ثريونين بقوة على سيرين)، وبقايا 170 هي ليسين (باستثناء حمض أميني أساسي واحد) في 12 متواليات (الشكل التكميلي 1 على الانترنت). من المذكرة، وبقايا Thr31 يكمن في P حلقة الحفظ جدا من البروتينات ملزم GTP (الشكل 3B). طفرة T31N مماثلة في ARF1 يلغي تماما GTP ملزم في المختبر 5. وعلاوة على ذلك، overexpression من عدة بروتينات ملزمة GTP صغيرة تحور في المقابلة بقايا Thr31 تنتج الظواهر الخلوية بما يتفق مع فقدان أو خفض، وظيفة. لذلك، وقد استخدم هذا overexpression على نطاق واسع لدراسة وظائف مختلف أعضاء الأسرة ARF-ARL في الجسم الحي، بما في ذلك ARF1، ARF5، ARF6، ARL1، ARL3 وARL7 (الحكام. 5، 6، 7، 18، 19، 20). لتحديد الآثار المحتملة للتغيرات الأحماض الأمينية التي وجدناها، ونحن على غرار ARL6 على بنية homolog 21، ARF6، وهو 43٪ مطابقة و 62٪ مماثلة في تسلسل الأحماض الأمينية. جميع المخلفات المتغيرة ثلاثة التجمع قرب، أو هي جزء من، موقع ملزمة GTP (الشكل 3C، د)، وربما تؤثر على النشاط ملزم GTP وبالتالي وظيفة ARL6. معا المتخذة، هذه النتائج تشير كذلك إلى أن الملاحظة استبدال الحمض الأميني في ARL6 هي المسببة للأمراض.

هناك أدلة متزايدة على أن نقل BBS معقد في بعض العائلات، مع طفرة الثالثة في موضع الثاني بوصفها لتعديل أي من انتفاذ أو التعبيرية 4، 22، 23. حددنا عائلة، NF-B10، والتي شقيقتين المتضررة متماثل فيما يتعلق 1179T الطفرة G في BBS1 (مما أدى إلى استبدال الحمض الأميني M390R)؛ واحد منهم هو أيضا متخالف فيما يتعلق 859G طفرة C في BBS3 (التكميلي الشكل 1 على الانترنت). وأشار التقييم السريري أن شقيقة مع ثلاثة تحولات يتأثر أشد فيما يتعلق ببعض المظاهر السريرية لBBS (الجدول 1)، مما يشير إلى أن طفرة إضافية في BBS3 قد يكون بمثابة معدل.

الجدول 1. مقارنة بين المظاهر السريرية لشقيقتين المتضررة في الأسرة NF-B10 مع BBS

الجدول الكامل وتورط RAB، ARF وARL البروتينات في مختلف جوانب الاتجار غشاء حيوي 1، 2، على الرغم من أنه لم يتم استكشافها وظيفة ARL6 في الكثير من التفاصيل. ARL6 الموسومة راصة دموية في الغالب عصاري خلوي، والزميلة مع الأغشية في المختبر في وجود GTP nonhydrolyzable التناظرية GTP S 17. يتفاعل مع ARL6 الوحيدات من heterotrimeric قناة البروتين استيراد SEC61 (المرجع 17)، ولكن أهميتها الفسيولوجية لهذه النتيجة غير واضحة. لتسليط الضوء على وظيفة ARL6، ولدت لنا C. خطوط المعدلة وراثيا ايليجانس معربا عن GFP الموسومة ARL-6. وأظهر تحليل هذه الخطوط التي ARL-6-GFP هو عصاري خلوي، حيث وجد في أجسام الخلايا، التشعبات، المناطق المنطقة الانتقالية (أقرب إلى الهيئات القاعدية التي عثر عليها في قاعدة أهداب) والهياكل المهدبة في الخلايا العصبية الحسية (الشكل 4A ). في توطين الخلية بالتالي مماثلة لتلك التي GFP أعرب وحده في الخلايا العصبية الحسية (التكميلي فيديو 1 على الانترنت). لتحليل ما إذا كان ARL-6 يمكن أن تشارك في العمليات الاتجار داخل الخلايا الحيوية، قمنا بتحليل خطوط المعدلة وراثيا عن طريق الوقت الفاصل بين المجهري. لاحظنا أن البروتين GFP الموسومة خضع IFT في ciliaryaxoneme (الشكل 4B والتكميلي عن مقطع فيديو 1، 2، 3، 4، 5، 6 على الانترنت). وقعت حركة ARL-6-GFP في كلا الاتجاهين الوراء وتقدمي على طول هدب عند 0.82 و 0.64 مللي ثانية -1 على التوالي. هذه المعدلات هي مماثلة لتلك التي من dynein- الآخر ويرتبط كينيسين البروتينات IFT 8.

الرقم 4. التعريب وIFT من ARL-6 في الخلايا العصبية المهدبة من C. ايليجانس.
(أ) تدخل الفرق النقيض (DIC)، GFP مضان، ودمج الصور من مناطق الرأس والذيل من الديدان تعبر عن الموسومة GFP ARL-6 الانصهار البروتين. ARL-6-GFP المترجمة في قاعدة أهداب في الهياكل ذات الصلة إلى الهيئات القاعدية (المناطق الانتقالية؛ TZ) وعلى طول axonemes الهدبية (CIL). ويلاحظ إشارات أيضا على طول التشعبات (دن) والمحاور (لا يظهر) وداخل خلايا الجسم الرئيسي (البنك التجاري). وتظهر أجسام الخلايا العصبية فقط لذيل المهدبة. (ب) Kymographs تظهر حركة الجسيمات ARL-6-GFP. ويظهر شريط النطاق أسفل كل لوحة، وثلاثة أطر زمنية (كل 1000 مللي ثانية) تظهر حركة الجسيمات واحد (السهام) في اتجاه تقدمي، بعيدا عن المناطق الانتقالية (تلطيخ مكثفة على اليسار في كل لوحة).


كامل الشكل وأسطورة (21K) اكتشافنا أن BBS3 يشفر بروتين، ARL6، التي يتم التعبير على وجه التحديد في الخلايا المهدبة ويخضع IFT في C. ايليجانس لديها العديد من الآثار الهامة. ARL6 هو أول بروتين BBS المرتبطة الكشف عن هويته التي تقترح وظيفة الخلوية، وهي أن من بروتين ملزمة GTP صغيرة المتورطين في الاتجار غشاء المرتبطة داخل الخلايا العمليات على الفور تسلسل الحفظ تطويريا 1. ARL6 هو أيضا عضو معروف أول من الأسرة RAB SAR-ARF-ARL من البروتينات ملزم GTP صغيرة لتترافق مع المرض الوراثية البشرية. الرابط بين ARL6 وIFT يمتد دور هذه العائلة البروتين المتنوعة لتشمل الاتجار ليس فقط في العصارة الخلوية السليم، ولكن أيضا في الخيط المحوري الهدبية. وبالنظر إلى أن BBS4 تساعد استهداف بروتين centrosomal، PCM1، بطريقة تعتمد على داينين ​​24، وأن الآخرين C. ايليجانس البروتينات BBS المصاحب الخضوع IFT 14، فإننا نقترح أن البروتينات BBS المصاحب حصة عموما وظيفة مشتركة تتعلق عمليات الاتجار داخل الخلايا، مثل نقل المكونات الخلوية (على سبيل المثال، أو غيرها من البروتينات المرتبطة الحويصلة) إلى جسيم مركزي، ل الجسم القاعدية والجهاز الهدبية. ومن المتوقع هذه الوظيفة الخلوية المشتركة للبروتينات BBS المصاحب، حيث أن الظواهر المرتبطة الطفرات في مختلف BBS مواضع لا يمكن تمييزها 4. البروتينات الصغيرة الأخرى ملزمة GTP، مثل ARL2L1 المحددة في هذه الدراسة، قد يكون لها وظائف أهداب محددة مماثلة. ويتم التعبير عن ذبابة الفاكهة السوداء البطن ARL3 وARL6 تحديدا في الخلايا chemo- وميكانيكية حسية مهدب 25، ومطلوب الليشمانيا ARL3 لسوطي سلامة 6. وبالمثل، ARL3 الثدييات يموضع إلى مبصرة ربط هدب في قضبان الشبكية والأقماع وعلى هذا النحو، يمكن أن تكون متورطة في التهاب الشبكية الصباغي 26. كما تم الكشف عن العديد من GTPases RAB في الأسواط من الطحالب الخضراء Volvox الراجعية 27. ولذلك سيكون موضع اهتمام خاص إلى التركيز على البروتين الأسرة ملزم GTP صغيرة لتحديد كيفية أعضاء مختلف تسهيل النقل بين الخلايا القائم على أنيبيب، والعمليات cilia- والمتعلقة سياط، وخاصة فيما يتعلق اضطرابات الإنسان التي لها الهدبية أو العصبية مكون.

طرق
تحديد BBS3 الجينات المرشحة.
أنشأنا الشخصي ماركوف المخفية النموذجي (HMM) باستخدام HMMER v1.8.4 (المرجع 28) لتحديد C. الجينات ايليجانس تحتوي اكس بوكس المواقع التنظيمية في مناطق المروج المنبع بهم. نحن شيدت HMM الشخصي من مجموعة تدريب 14 X التي تحتوي على مربع الجينات التي يقتصر على الخلايا العصبية المهدبة التعبير: Y105E8A.5، F20D12.3، Y75B8A.12، T25F10.5، Y41G9A.1، T27B1.1، R31. 3، F02D8.3، F38G1.1، F59C6.7، F33H1.1، K08D12.2، Y110A7A.20 وF40F9.1a. استخدمنا هذا الملف HMM لمسح كامل C. ايليجانس الجينوم (wormbase نسخة WS110) وحددت 368 الجينات مع تسلسل إجماع X-مربع (درجة الخام> 14.0) الحالي ضمن 1.5 كيلوبايت من كودون البداية. نحن تحميلها من Ensembl ملف تنسيق FASTA واحد يحتوي على سلاسل الببتيد جميع C. ايليجانس X الجينات التي تحتوي على المربع الذي حددنا باستخدام EnsMart. نحن تحميل مجموعة من هومو فريدة من نوعها مجموعات العاقل من بناء 119 من UniGene من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية. باستخدام مستقل BLAST من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية، قارنا C. ايليجانس تسلسل البروتين مع H. مجموعات العاقل UniGene التي كتبها TBLASTN مع قطع ذات قيمة E وضعت في 1 10 -6. لكل C. البروتين ايليجانس، جمعنا كبار H. ضرب العاقل من إخراج BLAST وفرز هذه وفقا لعدد الصبغيات والموقف. ثلاثة H. انخفضت مجموعات العاقل UniGene ضمن الفترة الحرجة BBS3 (الشكل 1A).

GFP مضان المجهري C. ايليجانس النسخي ومتعدية يبني.
لإنتاج بنيات GFP النسخي لBBS-3 مرشح الجينات (ARL-6 وY37E3.5)، كنا الانصهار PCR لإدخال 5 'تسلسل UTR من كل جين من المنبع تسلسل GFP الكامل الترميز (بما في ذلك تسلسل إشارة توطين النووية ) وUNC-54 3 'UTR 10. و-6P ARL :: بناء GFP يتضمن 1197 سنة مضت من 5 'UTR (وبي بي 14 الأولى من اكسون 1) وY37E3.5p :: بناء GFP يتضمن 1160 سنة مضت من 5' UTR (وبي بي الأول من 14 اكسون 1). أنشأنا بنيات GFP متعدية لBBS-3 (ARL-6P :: GFP) من خلال دمج تسلسل كامل exonic وintronic من ARL-6 (بما في ذلك 1197 سنة مضت من 'UTR 5) من المنبع GFP (بدون تسلسل توطين النووية) و قيادة الأمم المتحدة-54 3 'UTR. تم التعبير عن هذه الجينات المحورة GFP كما صفائف خارج الصبغي في dpy-5 (e907)؛ مثال [dpy-5 (+)] الديدان، ولدت كما هو موضح سابقا 10. للتصوير لايف، ونحن يجمد الديدان (باستخدام 15 ملي الليفاميزول)، التي شنت عليها على منصات الاغاروز وتصور لهم على المجهر الفلورسنت زايس Axioskop 2+ مركب. تم التقاط الصور ومقاطع الفيديو باستخدام الإصدار الشمالية الكسوف 6.0 البرمجيات.

المواضيع.
تم تشخيص الأفراد مع BBS إذا كانت إرضاء وضع معايير +3. اجتمعنا لفيف متعددة الأعراق كبيرة، تضم 300 عائلة مع BBS. حصلنا على عينات الدم مع الموافقة، وفقا للبروتوكولات التي وافق عليها المواضيع الإنسان لجان أخلاقيات المناسبة في كل مؤسسة مشاركة، واستخراج الحمض النووي باستخدام الأساليب القياسية.

تحليل طفرية من BBS3 الجينات المرشحة.
نحن محاذاة تسلسل ARL6، ESRRBL1 وARL2L1 مع المقابلة تسلسل الجينوم البشري وتحديد الحدود اكسون-إنترون. حددنا التسلسلات المرافقة بكل exons الترميز واستخدمها لتصميم الاشعال (تسلسل المتاحة حسب الطلب) ان تضخيم الإكسونات والحدود اكسون-إنترون من كل جين. تم تنقيته منتجات التضخيم PCR، التسلسل وتحليلها كما هو موضح 23.

تحليل تسلسل البروتين والنمذجة التماثل.
حصلنا على ARL6 تسلسل البروتين من بنك الجينات والانحياز لهم باستخدام الإعدادات الافتراضية مع ClustalX. H. والعاقل ARF6 الانحياز يدويا لARL6 بناء على التقرير السابق 2. وقد تم وضع نماذج التماثل من HsARL6 باستخدام السويسري الموديل مع HsARF6 كقالب. تم التلاعب ARL6 نموذج ثلاثي الأبعاد الناتجة عنها، وتقديمها في PyMOL.

عناوين المواقع.
وراثة مندلية على الانترنت في الإنسان هو متاح في http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi؟db=OMIM. Wormbase يتوفر في http://www.wormbase.org/. Ensembl يتوفر في HTTP: //www.ensemblorg/. السويسري الموديل متاح في http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html. بروتين بنك المعلومات غير متاحة في http://www.rcsb.org/pdb/. المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية يتوفر في http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. ماركوف المخفية النموذجي متاح في http://hmmer.wustl.edu/. PyMOL يتوفر في http://www.pymol.org.

أرقام الانضمام.
بنك الجينات: ESRRBL1، NM_018010؛ ARL2L1 (ترميز افتراضية البروتين DKFZp761H079)، NM_182896؛ ARL6، NM_032146. بروتين بنك المعلومات: HsARF6، 1HFV.

ملاحظة: معلومات تكميلية يتوفر على موقع علم الوراثة الطبيعية.

أعلى تلقى 1 يونيو 2004؛ وقبلت 19 يوليو 2004، نشرت على الانترنت: 15 أغسطس 2004.

المراجع
  • تاكاي، Y.، ساساكي، T. & Matozaki، T. البروتينات الصغيرة GTP ملزم. الفيزيولوجيا. القس 81، 153-208 (2001).
  • Pasqualato، S.، رينو، L. & Cherfils، J. المنتدى و، ARL، آرب وسار البروتينات: عائلة من البروتينات ملزم GTP مع جهاز الهيكلي للاتصالات "الظهير الأمامية" EMBO النائب 3، 1035-1041. (2002). | المادة |
  • Beales، PL، Elcioglu، N.، وولف، AS، باركر، D. & Flinter، معايير FA الجديدة من أجل تحسين تشخيص متلازمة بارديه-بيدل: نتائج مسح السكان J. ميد. جينيه. 36، 437-446 (1999).
  • Katsanis، N. خصائص قليل الجينات متلازمة بارديه-بيدل. همهمة. مول. جينيه 13، R65-R71 (2004). | المادة |
  • Dascher، C. & بالش، WE المسوخ المثبطة المهيمنة من كتلة ARF1 الشبكة الإندوبلازمية إلى جولجي النقل والتفكيك الزناد من جهاز جولجي. J. بيول. كيم 269، 1437-1448 (1994).
  • Cuvillier، A. وآخرون. LdARL-3A، وهو الليشمانيا المشيقة محددة ADP-ribosylation عامل مثل البروتين، ضروري لسلامة السوط. J. خلية العلوم 113، 2065-2074 (2000).
  • إنجل، T. وآخرون. هو فعل عامل ADP-ribosylation (ARF) تشبه 7 (ARL7) الكوليسترول التحميل ويشارك في ئي AI-تعتمد تصدير الكولسترول. FEBS بادئة رسالة. 566، 241-246 (2004). | المادة |
  • روزنباوم، JL & Witman، GB Intraflagellar النقل. نات. القس خلية بيول. 3، 13-825 (2002).
  • Pazour، GL & روزنباوم، والنقل، والتي تعتمد على أهداب الأمراض JL Intraflagellar. بيول اتجاهات خلية 12، 551-555 (2002). | المادة |
  • انسلي، SJ وآخرون. ضعف الجسم القاعدية هو السبب المحتمل للعديد المظاهر متلازمة بارديه-بيدل. الطبيعة 425، 628-633 (2003). | المادة |
  • لي، BJ وآخرون. تحديد الجينومي المقارن من سوطي الحفظ والبروتينات الجسم القاعدية التي تتضمن الجينات رواية لمتلازمة بارديه-بيدل. CELL 117، 541-552 (2004). | المادة |
  • شيفيلد، VC آخرون. التعرف على متلازمة موضع بارديه-بيدل على الكروموسوم 3 وتقييم نهج فعال لرسم الخرائط جود زيجوت متماثلة الألائل. همهمة. مول. جينيه. 3، 1331-1335 (1994).
  • الشباب، TL آخرون. الكندية الأسرة متلازمة بارديه-بيدل يقلل من المنطقة الحرجة من BBS3 (3P) وتقدم مع النمط الظاهري متغير. آم. J. ميد. جينيه. 78، 461-467 (1998). | المادة |
  • Blacque، عمر الفاروق وآخرون. فقدان C. ايليجانس BBS-7 و BBS-8 النتائج ظيفة البروتين في العيوب أهداب والنقل intraflagellar خطر. الجينات ديف 18، 1630-1642 (2004). | المادة |
  • غدامي، M. وآخرون. بارديه-بيدل نوع متلازمة 3 في الأسرة الإيرانية: دراسة سريرية وتأكيدا لتوطين المرض AM. J. ميد. جينيه 94، 433-437 (2000). | المادة |
  • Haycraft، CJ، شافر، JC، تشانغ، وفاء، Taulman، PD ويودر، BK تحديد CHE-13، وهو بروتين النقل intraflagellar رواية اللازمة لتشكيل أهداب. إكسب. خلية الدقة. 284، 251-263 (2003). | المادة |
  • Ingley، E. وآخرون. رواية ADP-ribosylation مثل عامل (ARL-6)، يتفاعل مع قناة SEC61beta الوحيدات التي تضطلع البروتين. FEBS بادئة رسالة 459، 69-74 (1999). | المادة |
  • هيكسون، GR آخرون. Arfophilins هي مزدوجة المنتدى و/ راب 11 البروتينات الملزمة التي تنظم توزيع الاندوسوم إعادة التدوير وترتبط ذبابة الفاكهة الغبار النووي. مول. بيول. خلية 14، 2908-2920 (2003). | المادة |
  • هوانغ، CF، ليو، YW تونغ، L.، لين، CH & لي، FJ دور لArf3p في تطوير الأقطاب، ولكن ليس الإلتقام، في خميرة الخباز. مول. بيول. خلية 14، 3834-3847 (2003). | المادة |
  • لو، L.، هورستمان، H.، نغ، C. & كونغ، تنظيم WJ هيكل جولجي وظيفة من قبل ARF مثل البروتين 1 (Arl1). J. خلية العلوم 114، 4543-4555 (2001).
  • Pasqualato، S.، Menetrey، J.، فرانكو، M. & Cherfils، J. دورة الناتج المحلي الإجمالي / GTP الهيكلية للالبشري Ar

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #30  
قديم 12-02-2015, 09:50 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي متلازمة بارديه-بيدل

 

http://humpath.com/spip.php?article977

2003

تعريف: متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب وراثي جسمي عديد المظاهر المتنحية مع الميزات الأساسية للسمنة، اعتلال الشبكية الصباغي، polydactyly، والتشوهات الكلى، والتخلف العقلي، ونقص الأعضاء التناسلية.
وتتميز متلازمة بارديه-بيدل (BBS) من خلال اعتلال الشبكية الصباغي التدريجي، والسمنة، ونقص الأعضاء التناسلية، تأثر الكلى (بما في ذلك الخراجات، وفقدان القشرية الكلوية أو انخفاض القدرة على تركيز البول)، والتخلف العقلي البسيط وpolydactyly خلف المحور من الأيدي والقدمين.
BBS غير المتجانسة وراثيا مع لا يقل عن 12 المكاني و10 الجينات التي تم تحديدها، جميع المشاركين في وظيفة الهدبية. المرض هيرشسبرونغ تم الإبلاغ عنها في عدة حالات BBS.
BBS وMKS، على الرغم من أن سريريا متميزة، هي أشكال أليلية من نفس الطيف الجزيئي (MKS1، MKS3 وCEP290-NPHP6 الطفرات سلالة الجرثومية).
ملخص
الشذوذ النظامية
الشذوذ العين
  • ضمور شبكية التقدمية
  • ضمور قضيب مخروط، بداية تكون نهاية العقد 2ND (الكبرى)
  • التهاب الشبكية الصباغي
  • الحول
  • إعتام عدسة العين
الشذوذ القحفي
  • الحنك يتقوس عالية
  • الازدحام الأسنان
  • مشقوق
  • جذور الأسنان الصغيرة
الشذوذ القلب والأوعية الدموية
التليف الكبدي
  • مع انتشار الصفراء-القناة
  • دون انتشار الصفراء-القناة
مرض هيرشسبرونغ (<10٪) (10602122)
قصور الغدد التناسلية (الكبرى)
الشذوذ الكلوي (الكبرى)
  • النخاع-الغالبة الكلى الكيسي
كلوي مرض السكري الكاذب
داء السكري
polydactyly خلف المحور (الكبرى)
قصر الأصابع
المسببات (سبعة مواضع)
وقد تم تحديد ثمانية جينات BBS المصاحب حتى الآن استنساخ الموضعية. وبالنسبة لمعظم البروتينات المشفرة وتبين أنهم توطين للهيئات القاعدية و / أو centrosomes.
BBS1 (11q13) (12524598) (30-40٪)
BBS2 (16q21)
BBS3 (3p13-P12) (ARL6)
  • باستخدام شاشات بيوينفورمتيك للجينات الهدبية في تركيبة مع البيانات من الاستنساخ الموضعية، والطفرات في ADP-ribosylation تم تحديد عامل مثل 6 (ARL6) مسؤولة عن BBS3.
  • ARL6، وهو GTPase صغير، وأعرب تحديدا في الخلايا المهدبة ويخضع النقل intraflagellar.
BBS4 (15q22 0.3-Q23)
  • البروتين BBS4، كما BBS8، (المعروف أيضا باسم tetratricopeptide تكرار نطاق 8، TTC8) يتفاعل مباشرة مع المواد محيط بالمريكز 1 (PCM1)، وهو مكون من المواد محيط بالمريكز.
  • BBS4 ضروري لتجنيد البروتينات إلى المصفوفة pericentrosomal، مؤكدا على دور وظيفة centrosomal في التسبب في BBS.
BBS5 (2q31)
BBS6 (20p12)
BBS7 (12567324)
BBS8
- * البروتين BBS8 (المعروف أيضا باسم tetratricopeptide تكرار نطاق 8، TTC8)، كما BBS4، يتفاعل مباشرة مع المواد محيط بالمريكز 1 (PCM1)، وهو مكون من المواد محيط بالمريكز.
BBS9
BBS10
BBS11
BBS12 (17160889)
وقد أشارت التحليلات الوراثية وطفرية أنه في بعض الأسر، وهو مزيج من ثلاثة الأليلات الطافرة على اثنين من مواضع (الميراث triallelic) ضروري لإمراض (قليل الجينات انتقال المرض).
معظم متلازمة بارديه-بيدل يتم التعبير (BBS) orthologues البروتين في الهيئات القاعدية للأهداب متحركة طوال التطور، بما في ذلك في سياط الكائن الحي وحيدة الخلية كلاميدوموناس reinhardtii. الطفرات في هذه الجينات تؤدي إلى معيبة النقل intraflagellar (IFT) أو الدفع.
المرضية
BBS هو اضطراب عديد المظاهر التي تتميز تنكس الشبكية، والسمنة، وصعوبات التعلم وpolydactyly، فضلا عن تشوهات الغدد التناسلية والتشوهات الكلى بما في ذلك أمراض الكلى الكيسي (CKDs). ويعتقد أن هذه العيوب أن يكون سبب الخلل centrosomal والهدبي.
وهكذا، أبرزت أهمية الجسيم المركزي والهيئة القاعدية في تنسيق وربما تنظيم الاتجار البضائع للحفاظ على سلامة الهدبية الهيكلية والوظيفية التي كتبها الدراسات الحديثة في BBS.
في خطوط الخلايا الثديية، واثنين على الأقل من ثمانية البروتينات BBS المعروفة، BBS4 وBBS8، توطين لcentrosomes والهيئات القاعدية.
الخميرة المقايسات يومين الهجينة والمشترك مناعي في خلايا الثدييات تبين أن هذه البروتينات تتفاعل مع PCM1، وهو عنصر معروف من الأقمار الصناعية محيط بالمريكز.
في المختبر والدراسات المجراة أظهرت أن BBS4 مطلوب من أجل توطين الصحيح من PCM1 للأقمار الصناعية محيط بالمريكز واستنزاف BBS4 من خلال رني يؤدي إلى تضليل شبكة أنيبيب منظمة.
وانسجاما مع دور البروتينات BBS (شبكات لوحات الاعلانات) في الجسيم المركزي / منظمة الجسم الأساسية وظيفة الهدبية، متعدية الجينات المحورة BBS، GFP لBBS-1، BBS-2، BBS-7 و BBS-8 إشارات تظهر محددة على الهدبية الانتقال المناطق (الهيئات القاعدية) وaxonemes، BBS-GFP البروتينات الانصهار تخضع IFT، وفقدان وظيفة BBS-7 و BBS-8 يؤدي إلى أهداب تقصير وخلل IFT بعض البروتينات IFT.
على سبيل المثال، وفقدان BBS-7 و BBS-8 في ايليجانس انواع معينة تسبب خلل IFT من OSM-5 وCHE-11 - البروتينات التي تشارك في تجنب ناضح والكيميائي على التوالي.
وعلى غرار inversin (INVS)، وبعض من البروتينات BBS ويمكن أيضا تقديم وصلة وظيفية بين أهداب والداخلية للخلية.
يظهر BBS8 التشابه محدود لفي مهدها بروتين الخميرة cdc23، وهو عضو في APC، على الرغم من أهميتها البيولوجية لهذه النتائج تحتاج إلى مزيد من التقييم.
BBS3 هو عضو في الأسرة ARF من البروتينات ملزم GTP الصغيرة التي تنظم الاتجار حويصلة. في C. ايليجانس، BBS-3 يموضع إلى السيتوبلازم، منطقة انتقالية (الجسم القاعدية) وأهداب الحسية مهدبة الخلايا العصبية ويخضع IFT، مما يوفر الممكن وجود صلة مباشرة بين axonemal والنقل حشوية من البضائع محددة.
أنظر أيضا

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
إضافة رد
صفحة 3 من 4 12 3 4

« الموضوع السابق | الموضوع التالي »
أدوات الموضوع
طريقة عرض الموضوع
العرض العادي العرض العادي

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك
BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة
الانتقال السريع

 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع |  المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية


الساعة الآن 04:17 AM.

الاتصال بنا - موقع أطفال الخليج ذوي الاحتياجات الخاصة - الأرشيف - الأعلى

Powered by vBulletin® Version 3.8.2
Copyright ©2000 - 2024, Jelsoft Enterprises Ltd

a.d - i.s.s.w