عرض مشاركة واحدة
  #12  
قديم 11-23-2015, 09:00 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي متلازمة بارديه-بيدل البروتينات 1 و 3 تنظم الاتجار الهدبية من مرض الكلى المتعدد الكيسات 1 البروتين

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/23/20/5441.full

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) وراثي جسمي مرض الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) هما ciliopathies متميزة وراثيا ولكنها تشترك الظواهر الشائعة مثل الكيسات الكلوية. سبعة البروتينات BBS شكل مجمع يسمى BBSome التي يتم ترجمتها في الجسم الهدبي أو القاعدية الخيط المحوري وينظم دخول الهدبية أو الخروج سوطي من عدة جزيئات الإشارة. هنا، علينا أن نظهر أنه، على خلاف سبعة تمتد السوماتوستاتين مستقبلات 3 أو مستقبلات هرمون الليبتين الذي يتفاعل مع جميع مفارز من BBSome، البروتين ADPKD polycystin-1 (PC1) يتفاعل مع BBS1، BBS4، BBS5 وBBS8، وأربعة من السبعة مكونات BBSome. فقط نضوب أو تحور BBS1، ولكن ليس استنزاف BBS5 وBBS8، أو خروج المغلوب من BBS4، يضعف الاتجار الهدبية من PC1 في الخلايا الظهارية في الكلى. نضوب هذه BBS البروتينات يؤثر لا على طول الهدبية ولا غشاء البلازما استهداف PC1. التعبير عن BBS3 الممرضة / Arl6 متحولة (T31R) ان اقفال Arl6 في شكل الناتج المحلي الإجمالي يؤدي إلى أهداب التقزم وتثبيط PC1 على أهداب الابتدائي. نقترح أن 11 تمتد بروتين الغشاء PC1 هو شحنة BBSome وأن مكونات BBSome قد تمتلك وظائف فرعية محددة. وعلاوة على ذلك، والتفاعلات الفيزيائية بين BBS وADPKD البروتينات قد تبرز الظواهر الكلى المتداخلة في هذين المرضين.

مقدمة

أهداب الابتدائية ضئيلة، يشبه الشعر العضيات الحسية إسقاط من السطح القمي معظم الخلايا. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب المتنحية غير المتجانسة وراثيا من أهداب الابتدائي. يتميز BBS أساسا من السمنة، وتنكس الشبكية وضعف الإدراك، polydactyly، قصور الغدد التناسلية والعجز الكلوي بما في ذلك الكيسات الكلوية (1). على الرغم من أن تم تحديد 19 جينات BBS حتى الآن، ليست مفهومة تماما الوظائف الخلوية الدقيقة لهذه البروتينات BBS. وأفيد أن تشارك بعض البروتينات BBS في مجال النقل داخل الخلايا (2، 3) والنقل intraflagellar (4). اكتشفت الدراسات البيوكيميائية وBBSome، وهو بروتين معقد تجميعها من قبل سبعة من البروتينات BBS بما في ذلك BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9 (5). وBBSome يموضع وظائف في الجسم الهدبي أو القاعدية الخيط المحوري وتتفاعل مع عامل Rab8 GTPase-تبادل، Rabin8، وتسهيل دخول Rab8 في أهداب الابتدائي في BBS3 (Arl6) التي تعتمد على -GTP الطريقة. هذه العملية ينظم دخول الهدبية من جزيئات الإنذار (6، 7)، وأظهرت الحرجة لتكون الأهداب (8). بالإضافة إلى دخول البروتين الهدبية، BBSome يتحكم أيضا في خروج سوطي من البروتينات مما يشير إلى مثل فسفوليباز D نوع ج في كلاميدوموناس reinhardtii (9).
وراثي جسمي مرض تكيس الكلى (ADPKD) (10)، مما يؤثر على أكثر من 12 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، وتتميز التطوير التدريجي للالخراجات مبطنة الظهارية ومملوءة بسائل في الكلى مختلف شرائح أنبوبي (11). وينظر أيضا الكبد والبنكرياس الكيسي. الطفرات في اثنين من الجينات PKD1 (12، 13) وPKD2 (14)، ترميز على التوالي polycystin-1 (PC1) وpolycystin 2 (PC2)، تمثل ~85 و~15٪ من الحالات ADPKD. حتى الآن، وPC1 PC2 قد تورطت في تحوير عدد من الأحداث الخلوية مثل الكالسيوم 2+ الإشارات (15، 16)، JAK-STAT (17)، mTOR س (18)، AMP الحلقي (19)، الكنسي WNT (20 )، ID2 (21)، الخلية القطبية مستو (22)، cMET (23)، STAT3 (24)، PI3 / AKT (25)، اليشم-1 (26 مستقبلات)، إلى جانب البروتين G (GPCR) (27)، ابيديرمي epidermal عامل النمو مستقبلات (28، 29)، وكذلك توطين ونشاط الكيسي منظم تليف الغشاء تصرف (CFTR) (30، 31). كيف تعدل polycystins هذه المسارات لا يزال بعيد المنال. على الرغم من PC1 وPC2 تم الإبلاغ عن حصر للمواقع التحت خلوية متعددة (15، +32 - 34)، وقد تورط في هدب الأساسي باعتباره عضية الرئيسية لوظيفة polycystin والتسبب في ADPKD (15، 35). PC1 PC2 وتشكيل مجمع مستقبلات القنوات في هدب الابتدائي ودورها في transducing وخارج الخلية السوائل إجهاد القص تدفق الكالسيوم إلى 2+ إشارة في هذا الموقع قد يكون العيب الأساسي في ADPKD (10). كما تم اقتراح دور حسي كيميائي لPC1 وPC2 (36). توضيح من شبكة التفاعل polycystin هي طريقة واحدة لتحديد الأحداث القريبة في شبكات البيوكيميائية المعقدة للpolycystins وتسهيل التصميم الرشيد وتقييم العلاجات لADPKD.
من خلال الشاشة مشاركات باستخدام PC1 ذيل-C محطة كطعم، حددنا BBS8، وهو مكون من BBSome للتفاعل جسديا مع ADPKD. من خلال إنشاء نظام التعبير عن كامل طول PC1 وضربة قاضية lentiviral الفردية الجينات BBS، ونحن أيضا أنه PC1 يتفاعل مع أربعة من عناصر سبعة من BBSome وأن توطين الهدبية من PC1 يمكن تنظيمها من قبل عناصر محددة من BBSome. وجدنا أن BBS1، جين رئيسي BBS، مهم لإيصال الفعال للPC1 لأهداب ولكن ليس لغشاء البلازما. إعادة التعبير عن النوع البري لكنها ليست الإنقاذ BBS1 متحولة الاتجار الإمراض PC1 الهدبية. تعبير عن شكل متحولة المهيمنة السلبية المسببة للأمراض من BBS3 يؤثر أيضا PC1 الهدبية الترجمة. لأن كلا ADPKD وBBS المرضى من الكيسات الكلوية، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن التفاعلات الفيزيائية بين PC1 والبروتينات BBS قد تبرز الظواهر الكلى متداخلة في BBS وADPKD.

النتائج

BBS8 وثلاث مفارز أخرى من BBSome تتفاعل مع PC1

لتحديد شبكة التفاعل من PC1، نحن فحص مكتبة الكلى الجنين البشري باستخدام الخميرة نظام هجين اثنين مع الذيل 198 الأحماض الأمينية حشوية (4106-4303) من PC1 الإنسان كطعم. BBS8، أول بروتين BBS التي تم تحديدها لربط ضعف الجسم القاعدية لقضية BBS (37) وأصبح لدينا شريك فوري ملزم مرشح العلوي من PC1 البشري. BBS8 يشفر بروتين مع تكرار tetratricopeptide متعددة (TPRs) وهي من بين البروتينات BBS السبع التي تشكل مجمع BBSome في الجسم القاعدية (8، 37). جزء من BBS8 معزولة عن مكتبة بترميز الببتيد من الأحماض الأمينية 281 إلى نهاية البروتين، الأحماض الأمينية 593.
لتأكيد هذا التفاعل في خلايا الثدييات، أجرينا شارك في مناعي في الخلايا HEK293 مع transfected الموسومة MYC على حد سواء BBS8 وHA الموسومة PC1-C محطة ذيل حشوية (PC1-CTT). وقد شارك immunoprecipitated-BBS8 مع PC1-CTT في هذه الخلايا (الشكل 1 A). في المقابل، في HEK293 المحللة الخلية مع transfected BBS8 وحده، وعجلت لا BBS8 من الأجسام المضادة لمكافحة HA، مما يدل على خصوصية التفاعل BBS8-PC1-CTT.

الشكل 1.
يتفاعل مع PC1 BBS8 وعدة مفارز BBSome أخرى. (A) التحقق من BBS8 كشريك التفاعل من PC1 في الخلايا HEK293. و transfected الخلايا مع BBS8-MYC وحدها أو BBS8-MYC بالإضافة إلى PC1-CTT-HA. تم immunoprecipitated لست] الخلية مع الأجسام المضادة ضد HA. تم الكشف عن BBS8-MYC (~63 كيلو دالتون، السهم) مع الأجسام المضادة ضد MYC. وimmunoprecipitated BBS8-MYC فقط في وجود PC1-CTT-HA. واستخدمت واحدة العشرين من الخلية لست] كإدخال. (B) PC1-CTT يتفاعل بشكل خاص مع BBS1، 4، 5 و 8. GST وPC1 C-ذيل تنصهر مع ضريبة السلع والخدمات (GST-PC1-CTT) استخدمت حبات لهدم كل من مفارز سبعة من BBSome بالإضافة إلى BBS3 أعربت في HEK293 الخلايا. استخدمت واحدة العشرين من الخلية لست] كمدخل لكل فحص المنسدلة. وقد نشف البروتينات BBS مع الأجسام المضادة ضد HA. جرى التحقيق (C) البقع أيضا مع الأجسام المضادة ضد GST. وتم قياس كمية كمية البروتينات BBS التي استولت عليها GST-PC1-CTT والمدخلات التي كتبها صورة J البرمجيات ونسبة البروتين القبض على مقابل وإدخال مؤامرة مع BBS1 لتعيين 100٪.

لتحديد ما إذا كانت مفارز أخرى من مجمع BBSome قادرة على ربط PC1، أجريت الجلوتاثيون S -transferase (GST) التجارب المنسدلة باستخدام GST-PC1-CTT البروتين الانصهار وخلية 293T لست] مع transfected كل من السبع التي تتألف منها البروتينات BBS BBSome (BBS1، 2، 4، 5 و 7 و 9)، وكذلك BBS3 / Arl6، وGTPase صغير بالغ الأهمية من أجل وظيفة BBSome. ومن المثير للاهتمام، بالإضافة إلى BBS8، تتفاعل على PC1-CTT أيضا مع BBS1 و 4 و 5 (الشكل 1 B).

إنشاء نموذج خلية لدراسة الاتجار الهدبية من PC1

الجمعية الفيزيائية بين PC1 ومفارز من BBSome دفعتنا لاستكشاف نتيجة الوظيفية لهذا التفاعل. تورط BBSome مجمع في استيراد عدة GPCRs سبعة تمتد (6، 38) ويبتين مستقبلات فترة واحدة في هدب من خلايا الثدييات وتصدير البروتينات مما يشير محددة من سياط من كلاميدوموناس reinhardtii (9). ولذلك، فإننا نهدف إلى دراسة دور مكونات BBSome في توطين الهدبية من PC1 والذي يعرف لدينا 11 المجالات عبر الغشاء. قدمنا ​​مجموعة من N-عضال و / أو بالطول بنيات الماوس PC1 C-عضال الموسومة (المواد التكميلية، الشكل S1 A). أدخلنا تعزيز الأصفر البروتين الفلوري (YFP) بعد مخلفات 34 الأولى المصب من الببتيد إشارة توقع و / أو علامة HA الثلاثي، وهو AviTag أو تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) إلى C-محطة من كامل طول PC1 . التعبير عن YFP-PC1 يبني هو تصور بسهولة باستخدام المجهر مضان في الخلايا HEK293 (المواد التكميلية، الشكل S1 B) وإن لم يكن في النخاع الداخلي جمع القناة 3 (IMCD3) خلايا الظهارية (المواد التكميلية، الشكل S1 C) نظرا ل انخفاض مستوى التعبير (التكميلي المواد، الشكل S1 D)، على غرار PC1-EGFP (لا تظهر البيانات). التعبير عن YFP-PC1-AviTag (YPC1A) يعزز tubulogenesis الخلايا IMCD3 (المواد التكميلية، الشكل S1 E)، بما يتفق مع دور ذكرت سابقا من PC1 في هذه العملية (39). باستخدام GFP أو HA العلامة الأجسام المضادة التي تعترف إما YFP / GFP أو علامة HA، والتعبير عن المؤتلف كامل طول PC1 هو كشفها بسهولة على أهداب الأساسي للخلايا IMCD3 (المواد التكميلية، الشكل S2 A). منذ يتعرض N-محطة من PC1 إلى الفضاء خارج الخلية، والتعبير سطح الخلية من YFP-PC1 يمكن تصور بوصف مباشر من الخلايا الحية مع الأجسام المضادة ضد GFP دون إجراءات تثبيت أو permeabilization. وينظر الهدبية التعبير عن YFP-PC1 في كل الخلايا المهدبة IMCD3 أن التعبير عن ثابت كامل طول PC1 (المواد التكميلية، الشكل S2 B).

يتأثر توطين الهدبية من PC1 بسبب نقص BBS1، ولكن ليس BBS5، BBS8 أو BBS4

نحن بعد ذلك حاول أن تستنفد BBS1، 4 و 5 و 8، ومفارز BBSome التي تم سحبها بنسبة PC1-CTT في الخلايا IMCD3 بواسطة lentiviral shRNA. باستثناء BBS4، كنا قادرين على تحقيق> 70٪ ضربة قاضية كفاءة تقييمها من قبل الكمي عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (RT-PCR) (التكميلية المواد، الشكل S3 A). وأكد ضربة قاضية من BBS8 أيضا في مستوى البروتين عن طريق التحليل الغربي (التكميلي المواد، الشكل S3 B و C)، كما كنا قادرين على الحصول على الضد العمل. استنزاف BBS1 أو 5 أو 8 لا تؤثر على عدد الهدبية ولا طول في IMCD3 الخلايا (المواد التكميلية، الشكل S3 D)، مما أدى إلى متوسط ​​طول هدب عند 4.2 ميكرون (التكميلي المواد، الشكل S3 E) ومعدل ciliation من 60٪ (المواد التكميلية، الشكل S3 F). لأن أيا من المواقع المستهدفة خمسة لBBS4 تحقيق الكفاءة ضربة قاضية كافية، وكنا سبق نشرها BBS4 الأساسي الماوس خروج المغلوب الكلى الخلايا الظهارية أنبوبي (2).
وجدنا أن في الخلايا السيطرة المخفوق، والخلايا المهدبة ~83٪ لديهم YFP-PC1 على أهداب (الشكل 2 ألف وباء). في الخلايا BBS1 ضربة قاضية، ومع ذلك، فإن الاتجار YFP-PC1 لأهداب وتضاءلت بشدة مع٪ فقط 40-50 الخلايا وجود YFP-PC1 على أهداب الخاصة بهم. على العكس من ذلك، كان نضوب BBS5 أو ثمانية في الخلايا IMCD3 أي تأثير على الاتجار الهدبية من YFP-PC1. النسبة المئوية للخلايا مهدبة YFP-PC1 إيجابية (~90٪) هي مماثلة لتلك الخلايا السيطرة المخفوق. والمثير للدهشة، لم تتأثر الهدبية توطين YFP-PC1 في الخلايا الأنبوبية الأساسي BBS4 الماوس خروج المغلوب الكلى.

الرقم 2.
BBS1، لا BBS4، BBS5 أو BBS8 أمر مهم للاتجار الهدبية من PC1. (A) YFP-PC1 غائب على أهداب الخلايا في BBS1 ضربة قاضية، على الرغم من تعبيرها عن جسم الخلية ما زال قائما. الاتجار YFP-PC1 لأهداب في BBS5 أو خلايا BBS8 ضربة قاضية وBBS4 خروج المغلوب الخلايا الظهارية الكلوية طبيعية. SCRB، سارعت السيطرة. كانت ملطخة YFP-PC1 من قبل الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء). وقد استخدم الأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر) للاحتفال أهداب. يمثل مقياس شريط 20 ميكرون. ومحاصر المنطقة المحيطة هدب وتوسيع. (B) النسبة المئوية لل-PC1 إيجابي أهداب هو مبين في (A). لا يقل عن 50 YFP-PC1 transfected واحصي الخلايا المهدبة لكل حالة. أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر. (C) وتوطين الهدبية من PC1 الذاتية غائب في الخلايا الليفية الجلد من مريض الإنسان مع طفرة BBS1 M390R. كانت ملطخة PC1 التي كتبها 96521 الأجسام المضادة (الخضراء). وقد استخدم الأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر) للاحتفال أهداب.

كما درسنا الاتجار الهدبية من PC1 في الخلايا الليفية الجلد من مريض مع طفرة BBS1 متماثل (M390R). وقد تبين BBS1 (M390R) أن يكون لها وظيفة ضعاف في نموذج الفأر (40). في الخلايا الليفية السيطرة، لاحظنا PC1 على أهداب الابتدائي في ~10٪ من الخلايا (الشكل 2 C). في المقابل، في الخلايا الليفية المستمدة من المريض BBS1، واقتصرت PC1 إلى منطقة الجسم القاعدية.

التعبير عن الشكل السائد سلبية من BBS3 / Arl6 يضعف PC1 التعريب على أهداب

لتقييم ما إذا BBS3 / Arl6، وGTPase صغير بالغ الأهمية من أجل وظيفة BBSome، يلعب دورا في توطين الهدبية من PC1، عبرنا عن مجموعة من HA الموسومة BBS3 الماوس / Arl6 يبني (من نوع البرية، وT31R متحولة المهيمنة سلبية المسببة للأمراض أو جوهري نشاطا Q73L متحولة) جنبا إلى جنب مع YFP-PC1. وجدنا أن YFP-PC1 بالاتجار إلى أهداب الابتدائي جنبا إلى جنب مع من النوع البري ونشط بشكل جوهري BBS3 / Arl6 (Q73L) (الشكل 3 والتكميلية المواد، الشكل. S4). أدى overexpression من متحولة المهيمن سلبية من BBS3 / Arl6 (T31R) في الخلايا IMCD3 لأهداب يعانون من التقزم، مشيرا إلى وجود خلل تكون الأهداب. ومع ذلك، كانت إشارة PC1 غائبة في الخلايا مع أهداب أقصر على الرغم من التعبير PC1 في خلايا الجسم واضحة للعيان.

الرقم 3.
BBS3 / Arl6 تسيطر على الاتجار الهدبية من PC1. (A) YFP-PC1 وشارك transfected مع إما HA الموسومة البرية من نوع (WT)، T31R أو Q73L BBS3 / Arl6 إلى خلايا IMCD3. كانت ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة ضد GFP لYFP-PC1 (الأخضر)، HA لBBS3 / Arl6 (الحمراء)، والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض والأزرق ولكن هو مبين في أبيض وأسود) للاحتفال أهداب. يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. (B) الكمي لنسبة الاتجار YFP-PC1 إلى أهداب الأساسي هو مبين في (A). لا يقل عن 30 YFP-PC1 transfected واحصي الخلايا المهدبة لكل حالة. أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر.

تفاعل PC1 وBBS1 مهم لPC1 لحركة المرور إلى أهداب الابتدائي

التجربة المنسدلة GST إلى أن BBS1 يتفاعل مع PC1 من خلال الذيل PC1 ل-C المحطة. لذلك، سعينا إلى تحقيق دور PC1-CTT في الاتجار الهدبية من PC1. لهذا الغرض، قدمنا ​​بناء YFP-PC1 دون آخر حمض أميني 198 من PC1 (YFP-PC1ΔCTT) (الشكل 4 أ) واختبار قدرتها على التفاعل مع BBS1 قبل فحص شارك في مناعي. بينما YFP-PC1 المشارك immunoprecipitated HA الموسومة BBS1، فشل YFP-PC1ΔCTT للقيام بذلك (الشكل 4 B). بالإضافة إلى ذلك، كما فشلت YFP-PC1 للمشاركة في immunoprecipitate متحولة الإمراض المشتركة من BBS1 في المرضى الذين يعانون BBS البشري، BBS1 (R146X) (41).

الرقم 4.
تفاعل PC1 وBBS1 مهم لPC1 لحركة المرور إلى أهداب الابتدائي. (A) رسم تخطيطي لكامل طول YFP-PC1 كما هو موضح في المواد التكميلية، الشكل S1 وYFP-PC1ΔCTT حذف متحولة. تم حذف حمض أميني 198 CTT من YFP-PC1، وتوليد YFP-PC1ΔCTT. يتفاعل (B) BBS1 مع YFP-PC1، ولكن ليس مع YFP-PC1ΔCTT. خلايا HEK293 وقد شارك transfected مع HA الموسومة BBS1 وYFP-PC1 أو YFP-PC1ΔCTT. تم immunoprecipitated لست] الخلية مع الضد GFP ونشف لPC1 (7e12) وBBS1 (HA). كامل طول BBS1 (BBS1-HA) وشارك immunoprecipitated من قبل YFP-PC1 لكن ليس YFP-PC1ΔCTT. YFP-PC1 لا يمكن أن يشارك في immunoprecipitate متحولة الإمراض من BBS1 (R146XHA). استخدمت عشر من الخلية لست] كإدخال. (C) آثار الحذف C-المحطة على الاتجار الهدبية من PC1. تم transfected YFP-PC1 أو YFP-PC1ΔCTT إلى IMCD3 كما هو موضح أعلاه، وجرى تقييم الهدبية التعبير عن هذه التركيبات التي تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء) والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر). وأظهرت صور الممثل من كل ترنسفكأيشن. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (D) الكمي لنسبة الاتجار الهدبية للبنيات هو مبين في (C). أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر. (E) التعبير عن WT ولكنها ليست متحولة الإمراض BBS1 (R146X) recues الاتجار الهدبية من PC1. كانت ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة ضد GFP لYFP-PC1 (الأخضر)، HA لBBS1 (الحمراء)، والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض والأزرق ولكن هو مبين في أبيض وأسود) للاحتفال أهداب. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون.

ومن المثير للاهتمام، فشل YFP-PC1ΔCTT للوصول إلى أهداب الأساسي عند transfected إلى IMCD3 الخلايا (الشكل 4 C و D). وعلاوة على ذلك، والعيب في الاتجار PC1 إلى أهداب الأساسي في الخلايا BBS1 ضربة قاضية يمكن انقاذ من قبل reexpressing وBBS1 الإنسان العادي (الشكل 4 E)، ولكن ليس متحولة اقتطاع BBS1 (R146X). ونظرا لعدم قدرة YFP-PC1ΔCTT للتفاعل مع BBS1 وYFP-PC1 للتفاعل مع BBS1 (R146X)، وهذه النتائج تشير إلى أن التفاعل الوظيفي بين BBS1 وPC1 من خلال PC1-CTT مهم للاتجار الهدبية من PC1.

لا يتأثر الاتجار PC1 إلى غشاء البلازما أو الجسم القاعدية من قبل نضوب BBS1

لا PC1 يتراكم في بعض المقصورات غشاء عندما يفشل في حركة المرور إلى أهداب الابتدائي؟ منذ البروتينات قد حركة المرور إلى أهداب إما عن طريق الاستقطاب استهداف الجسم القاعدية أو انتشار الأفقي من غشاء البلازما (42)، درسنا ما إذا كان نضوب BBS1 يؤدي إلى تراكم PC1 في هذه المواقع. على عكس CD8a-SSTR 3i3 التي تتراكم على الغشاء البلازمي للخلايا المنضب من Arl6 أو BBS4 (8)، لم يكن هناك تراكم واضح من PC1 سواء على الجسم القاعدية أو الغشاء البلازمي في الخلايا المنضب BBS1 (الشكل 5 ألف وباء ).

الرقم 5.
آثار استنفاد BBS1 عن الاتجار PC1 إلى الهيئات القاعدية أو غشاء البلازما ونموذجا للتنظيم BBSome الاتجار PC1 إلى هدب الأساسي. (A) الاتجار YFP-PC1 إلى الهيئات القاعدية في الخلايا IMCD3 المنضب BBS1. تم الكشف عن YFP-PC1 مع الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء في الصور المدمجة)، وγ تويولين (الرمز بواسطة السهام، والحمراء في الصور المدمجة) كان يستخدم كعلامة الجسم القاعدية. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. لا يتأثر (B) الاتجار سطح قمي من YFP-PC1 في الخلايا المنضب BBS1. كان تلطيخ الخلايا الحية باستخدام الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة لمكافحة GFP (الأخضر، مع وضع علامة *) أول إجراء للكشف عن خلية PC1 السطح. بعد تثبيت وpermeabilization، تم استخدام الأجسام المضادة الثاني الماوس وحيدة النسيلة ضد GFP (الحمراء) للكشف عن PC1 المؤتلف بما في ذلك بركة سباحة داخل الخلايا. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (C) السطح biotinylation الفحص. تم إجراء biotinylation السطح كما هو موضح في المواد وطرق. تم الكشف عن سطح YFP-PC1 مع الأجسام المضادة ضد GFP، وكان يستخدم β1-إنتغرين كمجموعة تحكم. (D) الكمي لPC1 السطح هو مبين في (C). PC1 سطح تطبيع في الخلايا سارعت تم تعيين إلى 100٪ لإنتغرين بيتا. (E) ويسر الاتجار الهدبية من PC1 من خلال BBSome الاعتراف PC1-CTT في BBS3 / الطريقة التي تعتمد على ARL6. PC1 (باللون الأحمر) التي تحتوي حويصلات تستهدف إلى غشاء البلازما (المسمى من قبل ①) أو قاعدة periciliary (المسمى من قبل ②) وتدخل أهداب إما من غشاء البلازما عبر انتشار الأفقي أو من قاعدة periciliary عبر استهداف الاستقطاب. (F) تعطيل وظيفة البروتين PC1-BBSome معقدة مثل نضوب BBS1، خلل في BBS3 / ARL6 أو حذف / تحور PC1 C-الذيل (ΔCTT) يضعف الاتجار الهدبية من PC1.

وأكد تأثير استنزاف BBS1 على غشاء البلازما استهداف PC1 أيضا كيميائيا من قبل biotinylation فحص سطح الخلية. biotinylation سطح الخلية إما سارعت كشفت السيطرة أو خلايا IMCD3 المنضب BBS1 مع transfected YFP-PC1 أنه لا يوجد انخفاض كبير في PC1 سطح الخلية في الخلايا المنضب BBS1 (الشكل 5 C و D)، مما يوحي بأن الاتجار التي تحتوي على PC1 الحويصلات الموجهة للغشاء البلازما لا تعتمد على وجود BBS1.

نقاش

آلية دقيقة التي PC1 تصل إلى أهداب الابتدائي لا تزال بعيدة المنال. هنا، وتبين لنا، للمرة الاولى، من خلال شاشة مشاركات باستخدام PC1 ذيل C-محطة كطعم، أن PC1 البروتين ADPKD يتفاعل مع البروتينات المشفرة بواسطة الجينات BBS. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن الاتجار الهدبية من PC1 ينظمه البروتينات BBS متميزة (الشكل 5 E). وبالنظر إلى الأهمية البالغة لتوطين السليم وظيفة polycystins في علم وظائف الأعضاء الجهاز العادي، وتوفر النتائج التي توصلنا إليها الأساس لمزيد من فهم النمط الظاهري عديد المظاهر والمسببات من BBS.
نص كبير نسبيا من PKD1 (~14 كيلوبايت) أعاق دراسات PC1. هنا، قمنا بتأسيس نظام تعبيرا عن n و C-محطة الموسومة كل من كامل طول PC1، وهو أمر مفيد لدراسة الاتجار، الحيوي وظيفة كامل طول PC1 في الخلايا الظهارية الكلوية. وجدنا كل من N- وC-تيرميني من PC1 على أهداب الابتدائي. واقترح PC1 للخضوع حدث انشقاق الشق الشبيهة التي يتم تحريرها ذيل صغير-C محطة (43، 44). جنبا إلى جنب مع الدور الحاسم للPC1-CTT في الاتجار الهدبية لها، وتشير البيانات المتوفرة لدينا إما أن جزء كبير من PC1 لا المشقوق أو الانقسام من PC1 في دورته C-محطة يحدث بعد وصوله الى أهداب الابتدائي.
وتشير البيانات المقدمة هنا دور BBSome في استيراد PC1 إلى أهداب الأولية بدلا من تصدير PC1 من أهداب الابتدائي منذ PC1 يتم تقليل، وليس المتراكمة في أهداب الأساسي للخلايا IMCD3 عند فقدان BBSome وظيفة. ومن المثير للاهتمام، مع ذلك، أن الاتجار PC1 ضعاف إلى أهداب الابتدائي وينظر فقط في ضربة قاضية BBS1، ولكن ليس في BBS5 وBBS8 ضربة قاضية أو BBS4 خروج المغلوب الخلايا الظهارية. هناك ما مجموعه 19 (45) الجينات التي تسبب BBS الطفرات. BBS1 هي واحدة من الجينات BBS الرئيسية الثلاثة تحور في 20-30٪ من الحالات BBS بعد الولادة (46). أحد الاحتمالات هو أن BBS1 قد يكون لها دور متميز من مفارز BBSome الأخرى حتى أن التفاعل بين PC1 وBBS1 هو العامل الأكثر أهمية المساهمة في توطين الهدبية من PC1. وقد اقترحت ظائف فريدة من نوعها من الجينات BBS مختلفة يرجع ذلك إلى حقيقة أن الاختلافات المظهرية أو تقلب كثيرا ما لوحظ بين مختلف BBS فئرانا معدلة وراثيا أو المرضى (47). بياناتنا تتفق أيضا مع نموذج التجمع BBSome التي استنزاف BBS1 و 2 و 7 و 9 كان لها أثر بارز في جمعية المجمع BBSome في حين أن استنزاف BBS4 و 5 و 8 قاصر أو أي تأثير في شبكية العين الصباغ الظهارية الخلايا (48). ويشير تقرير صدر مؤخرا أن BBS2 و 7 و 9 شكل المكونات الأساسية للBBSome بينما BBS1، تضاف 4 و 5 و 8 كما مفارز محيط (49). يتفاعل PC1 فقط مع مفارز الطرفية كما هو مبين في هذه الدراسة. BBS4 وBBS8 وتتكون أساسا من عدة زخارف تفاعل البروتين البروتين، وهي TPRs، والتي تشكل الهيكل اللولبي (8). منذ صيد BBS8 الخروج من الخميرة شاشة يومين الهجين باستخدام PC1-CTT كطعم، وPC1-BBS8 أو التفاعل PC1 BBS4 من المرجح المباشر، وربما بوساطة الزخارف TPR. BBS1 وBBS5 تختلف هيكليا من BBS4 وBBS8. لدينا في المقايسات المنسدلة، يظهر PC1 C-ذيل للتفاعل مع BBS1 بقوة كما مع BBS8 (الشكل 1 B). وأكد تفاعل PC1 مع BBS1 أيضا شارك في immunoprecipitations (الشكل 4 B). ونظرا لطبيعة زائدة عن الحاجة المحتملة للتفاعل PC1 مع مفارز BBSome مختلفة، ونحن نعتقد أنه في غياب بعض مفارز BBSome مثل BBS4 أو 5 أو 8، مجمع BBSome المتبقية حفظه النشاط الكافي لاستهداف PC1 للأهداب. وأظهر تقرير صدر مؤخرا أنه في غياب BBS7، وهو BBSome subcomplex لا يزال أشكال والاتجار الهدبية من polycystins تبدو طبيعية بشكل فاضح ويحتمل أن تكون وظيفية (47) كما يدعم فرضيتنا.
BBS1 يتوسط تفاعل BBSome مع Rabin8 (5)، واقترحت أن تكون الوحيدات الاعتراف البضائع من BBSome لدخول الهدبية للفترة واحدة مستقبل الليبتين (7). تعطى فقط استنزاف BBS1 يؤثر على الاتجار الهدبية من PC1، فمن الممكن أيضا أن BBS1 يلعب دورا حاسما في الاعتراف PC1 كما شحنة BBSome وبالتالي فإن تسليم لاحق من PC1 للأهداب. الاعتراف البضائع عن طريق BBS1 قد تكون بوساطه الذيل-C محطة حشوية من PC1 منذ حذف هذا الجزء النتائج أيضا في فشل الاتجار PC1 إلى أهداب (الشكل 5 F). وبالمثل، فإن حلقة الخلايا الثالثة من سبع تمتد السوماتوستاتين مستقبلات 3 (SSTR3) تمتلك سلسلة استهداف أهداب الذين اعتراف BBSome أمر حاسم لتوطين SSTR3 لأهداب (8).
تجارب مع BBS3 / Arl6 توفر دعما إضافيا لتنظيم توطين الهدبية من PC1 بواسطة بروتين آخر BBSome (الشكل 5 F). دراسة أنيقة جين وآخرون. (8 أظهرت) أن شكل محدد GTP من BBS3 / Arl6 هو أمر حاسم لتجنيد BBSome بلمرة إلى الحويصلات الدهنية بمثابة معطف واستهداف BBSome لأهداب، ولكن ليس للجمعية BBSome. في هذه الدراسة، وأظهرت أن الإفراط في الإنتاج من الكفاءة من النوع البري BBS3 ملزم GTP أو النموذج النشط جوهري من BBS3 (Q73L) كان قادرا على المرافق الاتجار PC1 لأهداب بكفاءة. ومع ذلك، overexpression من BBS3 T31R، وهو غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي، متحولة الإمراض المهيمنة سلبية وجدت في المريض BBS البشري، يؤدي إلى أهداب حيلة في الخلايا IMCD3 وفشل PC1 لحركة المرور إلى أهداب. والجدير بالذكر أن BBS3 / Arl6 يتفاعل أكثر كفاءة مع الوحيدات BBS1 من BBSome من خلال الربط إلى N-محطة من BBS1 (8).
النمط الظاهري السريرية للمرضى BBS متغير بدرجة كبيرة، حتى بين الأشقاء مع نفس الطفرات (50). وعلاوة على ذلك، فإن الطيف من BBS النمط الظاهري قد تتداخل مع غيرها من ciliopathies سريريا ومتميزة وراثيا (50). وقد تبين التفاعلات أليلية متعددة بين BBS المكاني أو BBS المكاني مع الجينات ciliopathy أخرى للمساهمة في التباين في التعبير السريري من الطفرات BBS (41، 51). على الرغم من هنا وجدنا أن نقص فقط من BBS1 وBBS3 ضعاف الاتجار PC1 الهدبية، فإنه لن يكون من المستغرب إذا الجينات BBS متعدد الألائل أو بالاشتراك مع الأليلات ciliopathic أخرى تؤثر على الاتجار الهدبية و / أو وظيفة polycystins وبالتالي تؤدي إلى الظواهر ذات الصلة polycystin مثل الكيسات الكلوية.
قد تتراكم البروتينات في موقع معين عندما فشلوا في حركة المرور إلى وجهتها (7، 8). في تجاربنا، إلا أننا لا يمكن أن نلاحظ زيادة ملحوظ من إشارة YFP-PC1 في الجسم القاعدية، غشاء البلازما أو مواقع أخرى فحصها (لا تظهر البيانات) في خلايا BBS1 ضربة قاضية. لأن الغشاء الهدبي لا يمثل سوى جزء صغير من غشاء البلازما الهائل للخلايا IMCD3، وغياب PC1 من أهداب قد لا يؤدي إلى زيادة بارزة في كثافة إشارة PC1 في البلازما أو الأغشية عضية أخرى. العادي توزيع غشاء البلازما من PC1 في الخلايا المنضب BBS1 يوحي بأن الحويصلات المحتوية على PC1 قادرة على برعم من شبكة عابرة للجولجي (TGN)، قفص الاتهام، والصمامات إلى غشاء البلازما في ظل هذه الظروف. وقد تم مؤخرا تبين أن مملس تتحرك من خلال مسار النقل الجانبي رواية من غشاء البلازما إلى الغشاء الهدبي (52). مع البيانات الحالية لدينا، فإننا لا نستطيع التمييز بين الاحتمالات أن المجمع BBSome نقل الشحنات التي تحتوي على PC1 المقيمين في الغشاء البلازمي للأهداب الابتدائي أو مباشرة إلى من TGN إلى غشاء periciliary في الخلايا الظهارية الكلوية.
وباختصار، علينا أن نظهر أن PC1 البروتين ADPKD، وهذه العملية من غير نمطية 11 تمتد، يستهدف إلى أهداب الابتدائي بطريقة BBSome التي تعتمد على. تفاعل PC1 مع BBS1 هو خطوة حاسمة لنقل الحويصلات المحتوية على PC1 كفاءة لأهداب الابتدائي. وهذا يشكل التفاعل مثيرة للاهتمام بين اللاعبين حاسما وراء اثنين من أمراض وراثية متميزة genotypically لكن جزئيا متداخلة ظاهريا. PC1 موجود أيضا على أهداب الأساسي من الخلايا البطانية حيث انها تتوسط mechanosensation والنيتريك الافراج أكسيد (53). ومن المرجح أن مجموعة فرعية من الظواهر التي لوحظت في مرضى BBS مثل الخراجات الكلى وارتفاع ضغط الدم تنتج عن PC1 mistargeted. كما توفر البيانات فهمنا رواية من مسارات الإشارات التي تسيطر عليها BBSome.

المواد والأساليب

زراعة الخلايا وshRNA ضربة قاضية

تم شراء الماوس النخاع جمع خلايا القناة الداخلية (mIMCD3) من ATCC (CRL-2123) والمثقف في DMEM / F12 50/50 تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS). كانت خلايا HEK293 و293EBNA مثقف في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco ولل(DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS. كانت البشرية تحكم الخلايا الليفية الجلد والخلايا M390R (التي قدمها الدكتور Beales) مثقف في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. تم شراؤها البلازميدات تحتوي على خمسة المواقع المستهدفة ضد كل جين من سيجما. تم تجميع الجزيئات Lentiviral في 293EBNA الخلايا التالية تعليمات في المصنع. والخلايا المصابة بفيروسات IMCD3 تليها ليلة وضحاها عن طريق الانتقاء مع بوروميسين بتركيز 2 ميكروغرام / مل. تم اختبار كفاءة ضربة قاضية في الخلايا مستقرة الكمي RT-PCR أو النشاف الغربي. العثور على تسلسل الهدف ShRNA من سيغما أن تكون فعالة في هذه الدراسة هي: BBS1 (TRCN0000252354 وTRCN0000252355)، BBS5 (TRCN0000248514 وTRCN0000248517) وBBS8 (TRCN0000113210 وTRCN0000113212).
لتحليل تكون الأهداب، وكانت المصنفة الخلايا في 70٪ التقاء وجوعا لمدة 48 ساعة في DMEM وسائل الإعلام / F12 تحتوي على 0.5٪ FBS بعد الوصول إلى نقطة التقاء. لتحليل الاتجار الهدبية من PC1، كانت المصنفة الخلايا في 60٪ التقاء وعابر. مع مختلف بنيات بين عشية وضحاها. كانت خلايا ثم المصل جوعا في DMEM وسائل الإعلام / F12 تحتوي على 0.5٪ FBS لمدة 48 ساعة.

البلازميدات والأجسام المضادة

وPCR تضخيم PC1 ذيل-C محطة البشري (PC1-CTT) ترميز جزء 198 الأحماض الأمينية من cDNAs الكلى الإنسان وإدراجها في pACT2 لخلق pACT2-hCTT الطعم البلازميد. تم إدراج هذا الجزء أيضا إلى pGEX-4T-1 لإنشاء pGEX-hCTT بناء لإنتاج GST-PC1-CTT البروتين الانصهار في البكتيريا. كان BBS8 الموسومة MYC هدية المقدمة من الدكتور نيكولاس Katsanis في جامعة ديوك. وHA الموسومة BBS1، 2، 3، 4، 5 و 8 و 9 كانوا الهدايا السخية من الدكتور فال شيفيلد في جامعة ولاية ايوا. تم إنشاء BBS1 اقتطاع HA الموسومة (R146X) من HA-BBS1 بواسطة PCR الطفرات. تم تضخيم BBS3 الماوس من [كدنا الكلى والفأرة المستنسخة في pcDNA3.1-HA ناقل لخلق HA الموسومة BBS3 (pcDNA3.1-BBS3-HA). وقدم T31R ونقطة Q73L طفرة لpcDNA3.1-BBS3-HA بواسطة PCR الطفرات. لتوليد YFP-PC1، تم إدراج إطار القراءة المفتوح من YFP في الماوس PKD1 كدنا] بناء على الفور بعد أول 34 الأحماض الأمينية التي المؤتلف PCR في البلازميد التتراسيكلين محرض التعبير (pcDNA4.1، إينفيتروجن). تم إنشاء YFP-PC1ΔCTT من YFP-PC1 بحذف مشاركة 198 الأحماض الأمينية من PC1 C-المحطة. وقد أكد متواليات من جميع التركيبات ولدت في هذه الدراسة من خلال تحليل تسلسل الحمض النووي.
كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة: مكافحة GFP الأرنب بولكلونل (Abcam) 01:20 000؛ مكافحة GFP وحيدة النسيلة الماوس (كوفانس) 1: 1000 تخفيف، ومكافحة HA حيدة النسيلة الفئران 3F10 (روش) 1: 1000 تخفيف؛ مكافحة HA الماوس وحيدة النسيلة 12CA5 (روش) 1: 100 التخفيف؛ مكافحة MYC الماوس وحيدة النسيلة 9e10 (إينفيتروجن) 1: 1000 تخفيف؛ مكافحة γ تويولين (سيغما) الماوس وحيدة النسيلة 1: 2000 تخفيف؛ لمكافحة الأسيتيل-α تويولين الماوس وحيدة النسيلة (سيغما) 01:50 000 التخفيف؛ مكافحة PC1 الأرنب بولكلونل 96521 (15) 1: 500 ومكافحة PC1 الماوس وحيدة النسيلة 7e12 (سانتا كروز) 1: 2000، ومكافحة BBS8 بولكلونل الأرنب (سانتا كروز) 1: 500 التخفيف.

المناعية والمناعي المجهري

للتحاليل مجهرية، تم إصلاح الخلايا المستزرعة مع 4٪ لامتصاص العرق، permeabilized مع 0.5٪ تريتون X وسدت مع 5٪ ألبومين المصل البقري. خلايا Permeabilized ثم تم ملطخة الأجسام المضادة الأولية المطلوبة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بعد الغسل الكامل، وأضيفت الأجسام المضادة الثانوية مع وضع العلامات المناسبة لآخر ساعة من الحضانة. وقد شنت الشرائح مع إطالة ® الذهب Antifade الكاشف مع أو بدون 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي). لتلطيخ الخلايا الحية، وتشطف الخلايا أولا مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وحضنت مع GFP الأضداد على الجليد. بعد 1 ساعة، وكانت تغسل الخلايا، ثابتة مع 4٪ لامتصاص العرق، واستمر مع بروتوكول تلطيخ العادية المذكورة أعلاه.
تم الحصول على الصور الفلورسنت مع epifluorescence المجهر نيكون 1000 (نيكون، طوكيو، اليابان). وقد اتخذت جميع الصور في نفس المجموعة من التجربة مع ظروف مماثلة وتعرض لسطوع أو تعديل التباين على قدم المساواة في فوتوشوب.

الخميرة فحص اثنين من الهجين

تم تنفيذ الخميرة اثنين الهجين باستخدام Clontech الخاطبة III نظام الخميرة اثنين الهجين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحولت البلازميد الطعم pACT2-hCTT إلى سلالة الخميرة AH109 أولا، وتحولت مكتبة [كدنا الكلى الجنين البشري من إينفيتروجن إلى AH109 / pACT2-hCTT. وقد تم اختيار المستعمرات شكلت على لوحات عالية التشدد-SD / -Ade / العاهل / -Leu / -Trp / XA-غال. تم انتشال البلازميدات من الحيوانات المستنسخة الإيجابية وإرسالها للتسلسل الحمض النووي.

شارك في مناعي

والمتجانس خلايا HEK293 مع transfected مختلف بنيات مع M-PER (بيرس) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (روش) و 1 م م DTT. للمشاركة في مناعي، وحضنت 2-4 ملغ من الخلية لست] إما 2-4 ميكروغرام الأجسام المضادة أو مبلغ مساو من مفتش عادي مع هزاز لطيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أضيفت البروتين الخرز A سيفاروز (إينفيتروجن) وحضنت لمدة 2 ساعة في آخر 4 ° C. تم solubilized حبات غسلها في حجم مساو من 2 × الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) عينة العازلة، وكان مزال البروتينات التي المغلي لمدة 5 دقائق وتحليلها بواسطة النشاف الغربي. استخدمت عشر واحد إلى 1/20 من لست] كمدخلات، ما لم ينص على خلاف ذلك.

GST المنسدلة الفحص

تم إنشاء GST وGST البروتينات الانصهار كما هو موضح سابقا (54). لGST تحليل المنسدلة، وحضنت 500 ميكروغرام من 293 لست] T-خلية التعبير عن مختلف البروتينات BBS HA الموسومة مع GST تنقية البروتينات الانصهار ثبتوا على الجلوتاثيون سيفاروز الخرز (أمرشام فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية) في 4 درجات مئوية خلال الليل. تم طرد الخرز وتم غسلها ثلاث مرات مع الثلج الباردة PBS غسل العازلة التي تحتوي على 1٪ NP-40. تم solubilized حبات غسلها في حجم مساو من 2 × SDS عينة العازلة، والبروتينات مزال من قبل الغليان لمدة 5 دقائق وتحليلها بواسطة النشاف الغربي. استخدمت واحدة العشرين لللست] كمدخلات، ما لم ينص على خلاف ذلك.

سطح biotinylation فحص

تم إجراء biotinylation سطح الفحص كما هو موضح سابقا مع بعض التعديلات (55). و transfected الخلايا بين عشية وضحاها والمصل جوعا لمدة 24 ساعة بعد الوصول إلى نقطة التقاء. وبعد ذلك وصفت بروتينات سطح الخلية في تعليق خلية في درجة حرارة الغرفة مع 0.5 ملغ / مل من NHS-PEG4-البيوتين (الحرارية العلمية) لمدة 30 دقيقة. وهي lysed الخلايا في المخزن الترسيب المناعي الشعاعي، وكانت انسحبت البروتينات المعقدة البيروكسيديز بنسبة حبات streptavidin. ومزال الخرز مع 2 م م حرة د -biotin (بيرس)، وتم حل عينات مزال على 7.5٪ دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام لاحقا التحليل.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس