عرض مشاركة واحدة
  #26  
قديم 11-23-2015, 10:09 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي التحليلات الفنية من المتغيرات تكشف عن وجود دور كبير للالأليلات السلبية والمشتركة السائدة في قليل الجينات متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/107/23/10602.full




التقدم التكنولوجي تبشر من تحفيز بسرعة اكتشاف المتغيرات المسببة للأمراض لمرض وراثي. ومع ذلك، خفف هذا الاحتمال القيود في تفسير العواقب الوظيفية الاختلاف الجيني في مواضع مرشح. هنا، نقدم أسلوب منهجي، ترتكز على فحوصات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، لتقييم المحتوى تغيري (125 الأليلات) من 14 الجينات المرتبطة مع متلازمة بارديه-بيدل (BBS). مزيج من في الجسم الحي المقايسات مع احقا في التحقق من صحة المختبر تشير إلى أن جزءا كبيرا من الطفرات BBS المصاحب لديهم النمط السائد سلبية للعمل. وعلاوة على ذلك، نجد أن مجموعة فرعية من الأليلات المشتركة، التي سبق بحثها إلى تكون حميدة، هي، في الواقع، يضر وظيفة البروتين، ويمكن أن تتفاعل مع الأليلات نادرة قوية لتعديل العرض المرض. وتمثل هذه البيانات إجراء تقييم شامل لتحميل الجيني في مرض multilocus. الأهم من ذلك، التراكب هذه النتائج إلى بيانات الوراثة البشرية يشير إلى وجود تعقيد تقدير كما في السابق في مجال العمارة الأمراض التي قد تكون مشتركة بين الظواهر السريرية المتنوعة.
Exome وكامل الجينوم resequencing من المرجح أن تحفيز نقلة نوعية في تحديد الآفات الوراثية في المرضى (1). في نفس الوقت، حتى ضمن حدود الجينوم الترميز، هذه التكنولوجيات تشكل مشكلة تفسيرية، في أن ترشيح الإمراض من الطفرات يمكن أن تستمد إلا من خلال نماذج وراثية ضيقة ومحدودة أدوات التنبؤ الحسابية، وكلاهما من المرجح أن كيل وإساءة تفسير تأثير بعض الطفرات. وعلاوة على ذلك، وتقلب المشترك بين وداخل الأسرة، وهي ظاهرة سائدة في معظم الصفات الوراثية، يبقى عامل التباس كبير لأن كلا الاختلاف الأليلي في مكان واحد وموقع ثاني معدلات غير المشبعة يمكن أن تمارس تأثيرا كبيرا على انتفاذ والتعبيرية من خلال المضافة وروكبي الآثار ( 2).
بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو نموذج مفيد لتشريح قشوة لأن معظم الجينات 14 BBS يمكن أن تسهم أيضا الأليلات روكبي (+3 - +17). BBS هو أيضا ممثل الطيف مرض ciliopathy، مجموعة من الاضطرابات التي تتميز عيوب في بنية الهدبية و / أو إخراج إشارة الهدبية (18). وتشمل السمات المميزة لBBS تنكس الشبكية، والسمنة، وقصور الغدد التناسلية، polydactyly، الفشل الكلوي، والتخلف العقلي (19).
نحن وغيرنا قد أظهرت أن الزرد يوفر نماذج الانقياد تجريبيا وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من الجوانب الهامة من اختلال وظيفي الهدبي (2، 15، 17، 20 - +23). وعلاوة على ذلك، يمكن مرنا البشري للجينات ciliopathy انقاذ كل من morphant ومتحولة الظواهر الزرد بكفاءة، وتوفير منصة قوية لتفسير أهمية المرضية من الأليلات مغلطة المحددة، التي لاضطراب العلاقة السببية لا يمكن إثباتها بشكل قاطع بحجج وراثية وحده (15، 17 ، 22، 23).
هنا، لدينا المتكاملة متعددة مستقلة في المقايسات الجسم الحي، تليها في المختبر التصديقات، لاستجواب جوانب وظيفة كل من 125 الأليلات وتحديد مساهمتها في مرض وراثي بوصفها وظيفة من مجموع الحمل تغيري عبر جميع الجينات BBS المعروفة.
النتائج

النمذجة BBS العيوب التنموية في الزرد.

حقن morpholino ضد كل BBS النتائج الجينات في العيوب تكون المعيدة.

لقد أظهرنا سابقا أن قمع بعض البروتينات BBS في الزرد يسبب العيوب تكون المعيدة التي تشمل تقصير محاور الجسم، ويعد القطع البدنية النمطية، وnotochords اسعة ومتلوى (14، 16، 17، 20، 21). هذه الظواهر هي متسقة مع مستو غير طبيعي الخلية القطبية (PCP) يشير إلى (21، 22، 24، 25)، والتي من المرجح يكمن وراء العديد من الظواهر السريرية في المرضى الذين لديهم BBS، بما في ذلك عيوب السمع (20)، العصبية تشوهات إغلاق الأنبوب (26)، تشكيل الكلوي الكيس (27)، وربما السمنة وضعف الادراك (28). حقيقة أن هذه الملاحظات هي ذات الصلة الأرجح إلى الباثولوجيا السببية من BBS (20، 21، 23 - 25)، والحقيقية لجميع BBS orthologues سبعة اختبار (bbs1، bbs4، bbs6، bbs10، bbs12، mks1، وcep290) وكذلك ل كما الثلاث BBS معدلات mgc1203، mks3، وrpgrip1l، اقترح أن أنها قد تمثل المقايسات مفيدة لجميع الجينات BBS. ولذا فإننا مصممة حجب ترجمة morpholinos (موس) ضد bbs1 - 12 (وSI الملحق، الجدول S1) وحقن كل في الأجنة WT بتركيزات متفاوتة لإنشاء منحنى بقاء (SI الملحق، الجدول S3) يمكن من خلالها استخلاص العمل الأمثل تركيز MO (الحد الأدنى من السمية الخلوية، النمط الظاهري القصوى). التهديف من 8-10 الأجنة مرحلة الجسيدة كشفت أن ضربة قاضية لكل النتائج BBS الجينات في عيوب مماثلة لتلك التي سبق وصفها (الشكل 1 A). من غير المرجح أن يكون سبب التسمم غير محددة لأنها استنسخت بشكل كامل عن طريق الحقن من المنظمات الأعضاء حجب لصق، والتي ضربة قاضية فعالة يمكن أن يدل على RT-PCR (هذه الظواهر SI الملحق، الشكل. S1 A-C والجدول S3). ودعمت هذه الآثار عن طريق القياس الكمي لمحور الجسم تقصير عيب بواسطة التهجين في الموقع (SI الملحق، الشكل S2) والكمي لعيوب في الحركات تكون المعيدة (SI الملحق، الشكل S3).

تين. 1.
قمع BBS4 تنتج عيوب محددة. (A) حقن المنظمات الأعضاء ضد BBS الفردية الجينات (bbs4 هو موضح هنا) في الأجنة الزرد تنتج العيوب تكون المعيدة، بما في ذلك محور قصيرة الجسم، والحبل الظهري اتسعت ومتلوى (*)، والقطع البدنية النمطية توسيع (رأس السهم)، والتي يمكن انقاذهم من قبل WT مرنا البشري. Coinjections من من mRNAs متحولة إنتاج مجموعة متنوعة من العيوب. (B) في حين WT RNA ينقذ الظواهر MO (WT RNA)، coinjection من الطفرات hypomorphic (N165H) ينقذ جزئيا النمط الظاهري. ومع ذلك، والطفرات فارغة (D102G، N274H، وM472V في BBS4) لا إنقاذ، والطفرات السائدة سلبية (L327P) تفاقم النمط الظاهري وتنتج العيوب عن طريق الحقن من RNA وحدها.
الإنسان BBS مرنا ينقذ الظواهر morphant.

وبالنظر إلى الحفاظ على ارتفاع بين orthologues BBS الزرد البشرية و(SI الملحق، الجدول S2) والانقاذ ذكرت سابقا من bbs11، mks1 / bbs13، وcep290 / bbs14 مع من mRNAs الإنسان (15، 17)، ونحن مسبب هذا التعبير من الآخرين BBS البشري وينبغي أيضا أن يكون قادرا على إنقاذ الظواهر morphant البروتينات. لذا أجرينا تجارب الانقاذ لكل BBS MO (bbs1 - 12) مع كامل طول مرنا البشري.
على التهديف من تسعة (± 1) الأجنة مرحلة الجسيدة، وجدنا الإنقاذ فعال في كل حالة [SI الملحق، التين. S1-S4 والجدول S4، وقاعدة بيانات على شبكة الإنترنت (http://misc.ciliaproteome.org/bbs_mutations؛)]، والتي أكدتها الكمي بواسطة التهجين الموضعي فضلا عن التهديف الحركات اكتفار، كل واحدة منها كانت مشابهة لضوابط uninjected في (التين. 2 و3 وSI الملحق). لمزيد من التحقق من خصوصية كل BBS مرنا لانقاذ BBS المقابلة MO، نحن coinjected كل BBS MO مع مختلف BBS مرنا، والعكس بالعكس، ولم ير أي الانقاذ (SI الملحق، الشكل. S1 D). الأهم من ذلك، في المقارنة بين الأجنة سجل عمياء، الظواهر بين الأفواج الجنين انقاذ وباستمرار تحسن إحصائيا من الفوج MO (SI الملحق، الجدول S4).

تين. 2.
في التحقق من صحة المختبر من آثار الطفرة. (A - C) توطين الموسومة MYC WT BBS4 البروتين (الحمراء) في الخلايا IMCD3 يظهر وجود في الجسم القاعدية، كما يتبين من colocalization مع γ تويولين والأسيتيل α تويولين (الخضراء). (D - F) مقدمة من طفرة N165F اصطناعية في BBS4 ليس له تأثير ملحوظ على الترجمة. التعبير عن متحولة D102G، وصفها بأنها باطلة في الجسم الحي التهديف، غير قابل للكشف د 2 بعد ترنسفكأيشن (G - I)، في حين يتم التعبير عن البديل N165H hypomorphic لكن mislocalized (J - L). نتائج طفرة L327P المهيمنة سلبية في mislocalization في الخلايا تالية للتفتل (M - O) ولكن ليس في تقسيم الخلايا (P - R). (S) التعبير عن ثوابت-MYC الموسومة 4 د بعد ترنسفكأيشن غير قابل للكشف عن الطفرات فارغة (D102G، N274H، وN165H)، على الرغم من أن RT-PCR أظهرت الرسالة في كل حالة.


تين. 3.
تأثير مهيمن سلبية من BBS4 L327P. (A) Coinjection من 3 نانوغرام من bbs4 MO و 100 خريج من WT مرنا البشري ينقذ النمط الظاهري morphant، وcoinjection من 100 خريج من L237P تحمل BBS4 مرنا تنتج عيوب مماثلة، أو أشد من، MO حدها. إدخال كميات متساوي المولية (50 خريج لكل منهما)، ولكن من كلا WT ومرنا متحولة خفف قدرة 50 خريج من WT مرنا وحده لانقاذ جزئيا النمط الظاهري morphant. (B) حقن جرعة دون المستوى الأمثل (10 PG) من L327P مرنا تنتج الظواهر الهامة. (C) overexpression من المهيمنة سلبية L327P طفرة BBS4 ولكن ليس من الخسارة من وظيفة أليل تنشيط الكنسي إشارات Wnt من قبل luciferase الفحص سوبر TOP-فلاش بطريقة مماثلة لBBS4 قمع. overexpression من L327P مرنا في تركيز عال (300 خريج) النتائج في الأجنة dorsalized ومحاور مزدوجة (السهام) (D) وخارج الرحم التعبير chordin (E). (F) وفي سياق الميراث قليل الجينات، والابتدائي (المتنحية) موضع لديه احتمال زيادة كبيرة كونها hypomorphic (P <0.0001)، في حين من المرجح أن تكون شديدة، مع إثراء كبير من الآفات المهيمنة السلبية (موضع روكبي P = 0.0004).
إنقاذ الظواهر تكون المعيدة ينتج طائفة من الشدة.

إنقاذ BBS morphants مع مرنا البشري لجميع الجينات BBS أتاح لنا الفرصة لاختبار تأثير كل التغييرات الأحماض الأمينية nonsynonymous وجدت في المرضى الذين يعانون في سياق تسلسل البروتين البشري. أولا، نحن المهندسة بنيات متحولة عن طريق إدخال تغييرات النوكليوتيدات واحدة في كل الجينات البشرية = 109). نحن ثم يعاير كفاءة إنقاذ كل بناء عن طريق حقن الأجنة WT إما (ط) لمراقبة سلبية، (ب) MO وحدها، (ج) MO بالاضافة الى كمية المولي محدد سلفا من WT RNA البشري، (د) MO بالإضافة إلى نفسه مقدار المولي مرنا متحولة، (ت) WT من mRNAs وحده، أو (السادس) من mRNAs متحولة وحدها. وسجل كل coinjection وعلى سبيل المقارنة مع MO وحدها أو مع الانقاذ WT (قيم P في SI الملحق، الجدول S4).
وأظهرت أربعة عشر الأليلات عدم وجود فروق ملموسة في كفاءة الإنقاذ (SI الملحق، الشكل. S4 والجدول S5)، مما يدل على أنهم كانوا حميدة فيما يتعلق وظيفة (ق) يعاير. على سبيل المثال، BBS6 R518H مرنا إنقاذهم بالكامل النمط الظاهري morphant (SI الملحق، التين. S2-S4). على النقيض من ذلك، حققت 15 الأليلات الظواهر تحسن كبير من الأجنة MO حقن لكن أسوأ من الأجنة coinjected مع WT مرنا، مما يشير إلى أن هذه الأليلات هي hypomorphs وظيفي، كما يتضح من BBS4 N165H (الشكل 1). مجموعة ثالثة من 45 الأليلات لم تسفر عن أي الانقاذ، وأنها بالتالي وسجل كما بلا قيم (على سبيل المثال، BBS4 D102G، N274H، الشكل 1). الظواهر أخيرا، 35 الأليلات أنتجت أسوأ بكثير من MO وحده، ومرنا تنتج الظواهر متحولة مماثلة أو أسوأ من MO وحدها، مما يوحي بأن هذه قد تكون الأليلات السائدة سلبية (على سبيل المثال، BBS4 L327P؛ الشكل 1). الأهم من ذلك، نحن يعاير عشوائيا 26 الطفرات من خلال تتبع اكتفار القياسات الكمي والجسيدة طول الجذع وجدت التوافق الكامل في جميع المقايسات، مما يوحي بأن يحرز التحيز غير المرجح أن يعرض نتائج إيجابية كاذبة.
هذا التقييم المنهجي، بالإضافة إلى سابقا لدينا أفادت بيانات لBBS13-14، MKS3، وRPGRIP1L (17، 23)، مكنتنا من إنشاء سلسلة أليلية كاملة ل 125 المتغيرات الترميز nonsynonymous في جميع الجينات المرتبطة BBS (الشكل 1 و SI الملحق، الشكل. S4 والجدول S5).
حساسية وخصوصية: إثبات وراثية.

وقد وفرت الفصل والتحليل القائم على السكان أو في البيانات الوظيفية المختبر لمجموعة فرعية من الطفرات وجدت في المرضى الذين لديهم BBS أدلة قوية على الإمراضية، وتكفل لنا الفرصة لاختبار حساسية في الجسم الحي لدينا التهديف. لذا اخترنا 49 الأليلات المرضية المعروفة في البشر وسألت عن كيفية وسجل انهم في الجسم الحي (SI الملحق، الجدول S5). باستثناء أليل S329L في BBS10 (سجل حميدة)، وتوقع 48 من 49 الأليلات بشكل صحيح المسببة للأمراض كما، مما يدل على أن المقايسات في الجسم الحي لديها حساسية من 98٪.
يمكن تنفيذها نهج مماثل لاختبار خصوصية. اخترنا 12 التغييرات (BBS2 123 IV؛ BBS6 C517R؛ BBS9 A455T؛ BBS10 D142N؛ BBS12 I170V، R235M، Q386R، وS429T؛ MKS1 L491I؛ MKS3 D261N، وL437V وRPGRIP1L G1025S) شائع في البشر (تردد أليل طفيفة> 15 ٪)، وبالتالي وجدت في كثير من الأحيان الآباء تتأثر والأشقاء المرضى، وأحيانا في زيجوت متماثلة الألائل. نحن أيضا اختبار أليل ال13، BBS4 N165F، وهو التغيير الناجم عن ذلك لا يغير من خصائص البروتين (انظر أدناه)، وأربعة الأليلات BBS6 (G52D، I339V، S511A، وR518H) التي تصرف indistinguishably من WT في الخلايا المستزرعة ( 29)؛ وكانت 14 من 17 التغيرات حميدة في جميع المقايسات الثلاثة في الجسم الحي، مما يشير إلى خصوصية> 82٪.
في فحوصات المختبر.

وقد لوحظت الظواهر تتعلق ببعض البروتينات BBS في الخلايا المستزرعة (+8 - 10، +29 - 34). لذا، طلبنا ما إذا كانت بعض النشاط الشاذ في الأجنة الزرد يمكن تفسير السلوك خلل في خلايا الثدييات.
ركزنا في البداية على BBS4 لأنه، على النقيض من البروتينات BBS أخرى، التعريب لها بالقرب من centrioles اثنين يمكن أن يتحقق بتكاثر التي كتبها overexpression من البروتين الموسومة في مختلف خطوط الخلايا تحولت (31، 32). نحن المهندسة ستة الطفرات BBS4 مغلطة إلى MYC N-محطة -tagged متجه التعبير الثدييات. وتوقع ثلاثة لاغيا (D102G، N274H، وM472V)، وكان واحد ناقص المفعول (N165H)، كان واحدا المهيمنة سلبية (L327P)، وكان واحدا حميدة البديل N165F. وبعد ترنسفكأيشن في الخلايا IMCD3، وجدنا ملاحظاتنا أن تكون متطابقة مع التقييمات في الجسم الحي. على الرغم من أن بناء N165F حميدة أظهرت نمطا من التوطين لا يمكن تمييزها عن تلك التي WT (الشكل 2 A - F)، كل من سبع طفرات nonneutral أظهر الظواهر استنساخه الحالية في> 70٪ من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. كانت D102G وN274H الطفرات فارغة لا يمكن الكشف عنها 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الشكل 2 G - I وS.)، في حين كان تدهور أليل N165H hypomorphic أيضا، وإن كان بوتيرة أبطأ (96 ساعة بعد ترنسفكأيشن، الشكل 2 J - L وS.) . أخيرا، أظهرت أليل المهيمنة سلبية على L327P الاستقرار لا يمكن تمييزها عن تلك التي WT (الشكل 2 S.) لكنه فشل في colocalize مع γ تويولين في الخلايا تالية للتفتل (الشكل 2 M - O). ومن المثير للاهتمام، لاحظنا توطين مريكزي من L327P في المغزل الإنقسامية من الخلايا المنقسمة، مما يشير إلى أن هذه الطفرة تمارس تأثيرا تالية للتفتل معين (الشكل 2 P - R). تم التحقق من التعبير عن كل بناء من قبل RT-PCR ومع علامة GFP cotransfection (SI الملحق، التين. S2 و S6).
وكانت هذه الملاحظات لا تقتصر على BBS4. نحن المهندسة بنيات التعبير الثدييات لمجموعة عشوائية من 17 الطفرات BBS (14٪). على الرغم من أن معظم البروتينات WT overexpressed تظهر نزع فتيل باستمرار توزيع حشوية، على غرار التقارير السابقة (34)، كنا لا نزال قادرين على تقييم الاختلافات بين WT ويبني متحولة. أظهرت عدة الأليلات يتوقع أن تكون ضارة وظيفة البروتين نمط توطين متميز من WT (SI الملحق، الشكل. S6). والجدير بالذكر أن لاحظنا العديد من الأمثلة التي تحور قاد توطين البروتين إلى المناطق التحت خلوية لم يسبق له مثيل مع بنيات وزن. على سبيل المثال، تم الكشف عن WT BBS7 في جميع أنحاء السيتوبلازم ولكن تم استبعاد حد كبير من النواة (SI الملحق، الشكل. S6 L). على النقيض من ذلك، وجدنا المسوخ T211I وH323R في نواة لنسبة كبيرة من الخلايا (SI الملحق، الشكل. S6 M و N).
نحن لم تجد نتيجة واحدة متفاوتة: كان أليل BBS6 T112A حميدة في الزرد، بعد أن أظهر بناء 112A، معربا عن التعريب الشاذة في النواة في خلايا الثدييات (SI الملحق، الشكل S6.). على الرغم من أنه ليس من الواضح أي من فحوصات اثنين من أكثر بالمعلومات، فإننا نخلص إلى أنه متحفظ، لدينا استراتيجية في الجسم الحي لديها معدل دقة بالمقارنة مع في المختبر بيانات الخلية الثديية من 94٪ (مقارنة مع مستوى حساسية لوحظ عبر ثلاثة في المقايسات فيفو). الأهم من ذلك، ملاحظاتنا من خلايا IMCD3 تم إثباتها بشكل كامل من قبل دراسات الترجمة في ARP19 وhTERT الخلايا المهدبة الإنسان (قاعدة بيانات على الإنترنت).
الطفرات المهيمنة سلبية.

وكشفت دينا في الدراسات المجراة 35 مرشح الأليلات السائدة سلبية (28٪). لدراسة هذا الاحتمال، أجرينا دراستين مستقلة. نحن إعادة النظر أولا في الجسم الحي الزرد فحص ومعللا أنه إذا كانت هذه الأليلات السائدة سلبية، يجب أن تكون البيانات التاليين صحيحا: حقن مرنا ترميز الأليلات السائدة سلبية وحدها أن نسخة مظهرية النمط الظاهري morphant، وحقن متساوي المولية من المهيمنة سلبية و WT مرنا يجب تخفيف من تأثير إنقاذ الرسالة WT.
وجدنا البيان الأول أن يكون صحيحا لجميع الأليلات السائدة سلبية. حقن مرنا المهيمن سلبية تنتج وحدها الظواهر مماثلة لMO حدها لكل من 35 الطفرات (الشكل 3 SI الملحق، الشكل. S7 A-E، وقاعدة بيانات على الإنترنت). وهذا صحيح حتى بتركيزات دون المستوى الأمثل، الذي WT مرنا تنتج الحد الأدنى من العيوب (الشكل 3 B و SI الملحق، الشكل. S7 F و G). وعلاوة على ذلك، اقترح إجراء مزيد من التجارب البيان الثاني أيضا ليكون صحيحا. على سبيل المثال، لbbs4، coinjection من MO و 100 خريج من WT مرنا أنقذت بكفاءة النمط الظاهري morphant. Coinjection من 100 خريج من 327P مرنا مع MO، ومع ذلك، أدت إلى النمط الظاهري الجنين أسوأ بكثير مما كانت عليه عندما MO حدها تم حقن، كما فعل حقن 100 خريج من مرنا متحولة وحدها. وعلاوة على ذلك، في حين coinjection من bbs4 MO و 50 خريج من WT مرنا انقاذ جزئيا النمط الظاهري morphant، إضافة 50 خريج من 327P الترميز مرنا (أي ما مجموعه 100 خريج من مرنا) قلصت قدرة WT مرنا لانقاذ النمط الظاهري (الشكل 3. A). لاحظنا سيناريوهات مماثلة لجميع الأليلات اختبار (SI الملحق، الشكل. S7 A-E).
البحث عن أدلة إضافية، لجأنا إلى الثدييات خلية القاعدة مقايسة البيوكيميائية. لقد أظهرنا سابقا أن قمع BBS4 يؤدي إلى ارتفاع الكنسي النشاط الإشارات WNT، كما رصدتها luciferase الفحص سوبر TOP-فلاش، في حين overexpression من WT BBS4 ليس له أي تأثير (21). وإذا كنا قد تفسر البيانات الزرد بشكل صحيح، توقع BBS4 الأليل الوحيد لتكون مهيمنة سلبية، L327P، يجب transactivate مراسل β-catenin بطريقة مماثلة لBBS4 shRNA. ولذلك عبرنا عن L327P وكذلك WT، أربعة الخسارة من وظيفة الطفرات BBS4 (D102G، N165H، N274H، وM472V)، والبديل محايد الاصطناعي N165F. وتوقع تحليل أعمى من البيانات بشكل صحيح L327P أن تكون مهيمنة سلبية في ثلاثة تجارب منفصلة (الشكل 3 C). لتحديد ما إذا كان هذا التأثير يمكن تكرارها في الجسم الحي، ونحن overexpressed L327P مرنا في تركيز عال (300 خريج) وdorsalization احظ، بما في ذلك تشكيل محور مزدوج في نسبة صغيرة من الأجنة (الشكل 3 D)، وهي السمة المميزة ليصل التنظيم من الكنسي إشارات Wnt. باستمرار، هذه الأجنة يحمل التعبير خارج الرحم من الكنسي WNT الجين المستهدف، chordin (21)، في مراحل midepiboly (3 الشكل E).
اكتشاف عدد كبير من الطفرات السائدة سلبية لا يتفق مع فكرة المفاهيمية من الخسارة من وظيفة الآثار في مرض المتنحية. أن الملاحظات الفنية من غير المحتمل بسبب استنساخ بهم عبر التكرار متعددة وفحوصات مستقلة. لذا سألنا عما إذا رؤى الوراثية يمكن أن تستشف من خلال دراسة توزيع مرشح الأليلات المهيمنة سلبية في 218 المرضى وعائلاتهم في فوج لدينا. وجدنا أن الأليلات السائدة سلبية تشكل أقلية (18٪) من كل الأليلات BBS. ومع ذلك، نحن وغيرنا وأفادت العديد من الأسر التي طفرة غير المشبعة الثالثة تتفاعل وراثيا مع الأليلات المتنحية في موضع الأساسي لتعديل انتفاذ المرض والتعبيرية (+34 - +37). عند تعيين موقف الأليلات السائدة سلبية (موضع الابتدائي مقابل موضع روكبي)، وجدنا زيادة كبيرة من الطفرات السلبية المهيمنة في مواضع روكبي (33٪ في معدلات مقابل 18٪ مساهمة في إجمالي الطفرات؛ P = 0.0004؛ الشكل 3 F)، مما يدل على أن غالبية الظواهر معدل ويورث.
المتغيرات المشتركة في BBS.

لم تقتصر دينا المقايسات الفنية إلى حدوث طفرات نادرة أو خاصة ولكن متكاملا يعرف كل الألائل في الجينات BBS. وأشارت سواء في الجسم الحي الاختبارات والدراسات توطين الخلية أن 7 من 14 الأليلات المصنفة رسميا باسم الأشكال (> 1٪ تردد السكان) هي أيضا ضارة وظيفة البروتين، وبالتالي قد تشارك في عملية المرض (SI الملحق، الشكل S5 والجدول S6 ). وبالنظر إلى أن معظم هذه المتغيرات يمكن العثور عليها في زيجوت متماثلة الألائل في الأفراد تحكم يوحي بأنها غير كافية لتسبب المرض. ومع ذلك، تساءلنا عما إذا كانوا قد تتفاعل مع طفرات قوية لتحفيز BBS، كما هو مبين في الآونة الأخيرة عن واحد منهم، وأليل A229T في RPGRIP1L (23).
وأشارت هذه البيانات إلى أن تردد سكان الأليلات ليس بالضرورة مؤشرا على وظيفة، مما دفعنا للاستعلام عن الفصل بين كل الأشكال nonsynonymous = 18) في عائلاتنا. ليس من المستغرب، فصلت ما بين سبعة تعدد الأشكال الحميدة في أنماط لا علاقة لهذا المرض (SI الملحق، الشكل S5 والجدول S6). لالأليلات أخرى، ومع ذلك، كان الجمع بين في الجسم الحي البيانات والفصل يحتمل أن تكون قادرا على حساب لنقل الفوضى في الأسر. نحن وغيرنا وذكرت العديد من الأنساب التي تم العثور احدة فقط الطفرة المسببة للأمراض متخالف في أي BBS جين معين (4، 14، 16، 17، 38). وقد تم افتراض أن الطفرة الثانية قد تكمن في عنصر تنظيمي. ومع ذلك، بياناتنا تقدم الفرضية البديلة، الذي، بالنسبة لبعض الأسر، وهذا المرض يمكن تفسير noncomplementation nonallelic بين الأليلات النادرة والمشتركة. على الرغم من أن معظم هذه الأليلات كانت نادرة جدا في فوج لدينا لأداء الاختبارات الجينية رسمية لهذه الفرضية، لم يكن هذا هو الحال بالنسبة ل123 IV في BBS2 [13.3٪ في الضوابط لدينا = 240)، و 13٪ في سكان يوتا مع أصل من أوروبا الشمالية والغربية (CEU) هاب ماب]. في شمال AR186 الأسرة الأوروبية، وكان المريض haploinsufficient لBBS1 (مع وجود الحسنة الخسارة من وظيفة طفرة Q128X النية، على النحو الذي يحدده الفحص في الجسم الحي (الشكل 4 B و C)، لم يكن لديها الحذف واضح في الآخر ومع ذلك، كان أليل (كما تقرره SNP تغاير على مستوى ~ 1 كيلو بايت من القرار عبر مكان)، وليس لديها أي الأليلات المسببة للأمراض أخرى مرشحة في BBS1. هذا المريض أيضا متماثل ل123 IV SNP في BBS2، وظيفية ناقص المفعول (الشكل 4 A - C). الأهم من ذلك، على الرغم من أن أليل 123V قد تبدو كافية لالمرضية في هذه العائلة، وجود أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل 123V في عموم السكان (3٪ في الضوابط لدينا، 3.3٪ في CEU هاب ماب) ويقول أن الجمع بينها وبين هراء أليل BBS1 قد تحفيز الدولة المرض.

تين. 4.
إعادة تقييم البيانات الوراثية باستخدام المجراة التهديف. وتشير آثار الطفرات استنادا في الجسم الحي التحليلات أن شدة الطفرات BBS تتفق مع العزل من المرض في العائلات مع BBS. (A) على الرغم من أن هراء متخالف BBS1 طفرة Q128X موجودة في شخص لديه BBS في AR186 الأسرة باطل وظيفيا (B و C)، وجودها لا يأخذ في الحسبان تماما لهذا المرض. (B و C) تتأثر فرد، ومع ذلك، هو أيضا متماثل لتعدد الأشكال BBS2، I123V، وتوقع أن يكون ناقص المفعول معتدل. (D) حقن إما bbs1 أو bbs2 MO حده في النتائج تركيزات دون المستوى الأمثل في الأجنة تتأثر بشكل معتدل. Coinjection كل من المنظمات الأعضاء تنتج معا الأجنة المصابة بشدة مع الظواهر لم أر عن طريق الحقن إما MO وحده، بما في ذلك شبه كاملة فقدان تعريف أجسودي (المسمى من قبل myoD) وفقدان الحقل العين (المسمى من قبل pax2).

لأن التغيير 123 IV هو متكررة بشكل كاف في أوروبا، كنا قادرين على اختبار ما إذا كان التنبؤ في الجسم الحي من nonneutrality صحيح بالسؤال عما إذا كان إثراء أليل 123V من BBS2 وovertransmitted في المرضى الذين لديهم BBS. لاحظنا على حد سواء ليكون صحيحا: لقد وجدنا 123V في 55 (19.3٪) من 284 الكروموسومات من المرضى شمال أوروبا الذين BBS مقارنة مع 32 (13.3٪) من 240 الكروموسومات من الضوابط عرقيا المتطابقة، وهو فارق كبير (χ 2 = 8.78، P = 0.003)، على الرغم من أن اختبار اختلال التوازن انتقال أظهر أن 25 ثلاثيات بالمعلومات تحليلها (أي متماثل الأم لأليل طفيفة وباستثناء "اكتشاف" AR186 الأسرة)، وأحيلت 123V للفرد المصاب في 22 من الحالات (88٪؛ P = 0.02).
هذه البيانات، على الرغم من الأرقام متواضعة، وكلاهما يتفق مع المجراة التحليلات وموحية للتفاعل بين BBS1 وBBS2. لذا نحن اختبار ما إذا كان فقدان subeffective من BBS2 يمكن أن تعدل النمط الظاهري من فقدان BBS1 وظيفة. وجدنا دليلا قويا على أن هذا صحيح: حقن كل من bbs1 وbbs2 المنظمات الأعضاء تنتج الظواهر بشكل ملحوظ أكثر حدة من حقن إما MO وحدها، وبعضها، مثل فقدان شبه كامل للتعريف الجسيدة وفقدان مجال العين، كانت لم يلاحظ في أي حقن MO واحد، حتى في تركيزات أعلى (الشكل 4 D).

نقاش

استخدمنا واسع وشامل في استراتيجية التحليلية الجسم الحي التصديق عليها من قبل عدة مستقلة في المختبر والأدوات الوراثية لتقييم العواقب الوظيفية من المتغيرات nonsynonymous في الجينات BBS. تطبيق مثل شاملة في الجسم الحي المقايسات ليست فريدة من نوعها. على سبيل المثال، تم استخدام misexpression من جينات الإنسان في ذبابة الفاكهة لتقييم إمكانات المسببة للأمراض من الجينات / الأليلات المرتبطة اعتلال عضلة القلب (+39 - 41). وتشمل مزايا نظامنا استخدام الفقاريات التي يشترك في العديد من العمليات التنموية والميزات التشريحية مع البشر ويعاير من النمط الظاهري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ذات الأهمية المعروفة للمرض بين البشر. نلاحظ أننا يعاير فقط هذا الجانب من النمط الظاهري BBS وغيرها من عناصر الفوضى التي هي من PCP مستقلة قد لا يتم التقاطها. والجدير بالذكر، ومع ذلك، كانت البيانات المتوفرة لدينا أيضا متسقة مع جميع الملاحظات التي نشرت من أليل المرضية، مما يوحي بأن هذه المقايسات هي بدائل معقولة. لقد وجدنا 48 من 49 الطفرات يتوقع أن تكون ممرضة من التحليل الجيني البشري ليكون مثل، في حين أن تفسيرنا للأليل BBS1 M390R باعتباره ناقص المفعول يتسق مع M390R الضربة القاضية في نموذج الفأر (42) وتوقعاتنا BBS11 P130S أن تكون الممرضة يتسق مع تقرير سابق من فشل هذه أليل لإنقاذ النقل جسيم ميلانيني (15). وعلاوة على ذلك، في الجسم الحي لدينا بيانات عن BBS3 وBBS6 متفقة مع اثنين من الدراسات البيوكيميائية الأخيرة (29، 30).
لقد فوجئنا في البداية لإيجاد رجحان عال من الأليلات المهيمنة سلبية. رأيناها لأول مرة إمكانية أن هذا قد يكون قطعة أثرية للنظام في الجسم الحي، ربما بدافع من مستويات عالية من التعبير عن متحولة مرنا / البروتين. ومع ذلك، والحقن متساوي المولية من WT / مرنا متحولة قلصت ولكنها لم تطفئ تأثير مهيمن سلبية، والتعبير حتى بتركيزات دون المستوى الأمثل تنتج عيوب شديدة. هناك ثلاث آليات المرجح أن تفسر هذه الملاحظات. أولا، تم العثور على وجود فائض من الطفرات السلبية المهيمنة في العلاقات معدل الموقع الثاني، مما يشير إلى أن التعديل روكبي هو مرض وراثي جسمي، في حين أن المرض في حد ذاته لا يزال المتنحية. ثانيا، نتوقع أن الناقلين من الأليلات السائدة سلبية سوف تظهر تحت الإكلينيكي الظواهر BBS المصاحب. وتمشيا مع هذه الفكرة، تم الإبلاغ عن آباء المرضى الذين لديهم BBS أن تكون أكثر عرضة للبدانة وخلل في شبكية العين (43، 44). يثير الاهتمام والفضول، وجدنا طفرة BBS6 A242S أن يكون الاستنتاج السائد سلبية. وقد ارتبط هذا التحول مع السمنة في ولاية متخالف في دراسة على أساس السكان (45). وأخيرا، نعتقد أن الأليلات السائدة سلبية قد يؤدي الى تأثيرات على المستوى الكيمياء الحيوية، وربما عن طريق تعطيل BBSome (31) أو عن طريق التأثير في الكنسي / noncanonical توازن الإشارات WNT، كما كان الحال بالنسبة لBBS4 L327P. فمن الممكن أن مثل هذه التفاعلات من البروتينات متحولة إلى تفاقم النمط الظاهري المرض ولكن هذا التفاعل من متحولة والبروتين WT، على الرغم من أن تضر WT ظيفة البروتين، لا في حد ذاته يؤدي إلى المرض. هذه الصيغة هي متسقة مع التقرير الأخير للطفرة المهيمنة سلبية في β اميلويد البروتينات السلائف في رثت مقهور مرض الزهايمر (46).
تشير البيانات المتوفرة لدينا أيضا أن الأليلات المشتركة يمكن أن يكون ضارا وظيفة البروتين، وأنه في العديد من الحالات، والتفاعل تعتمد على سياق الأليلات النادرة ومشتركة يمكن تحديد النمط الظاهري. نحن التكهن بأن هذه التفاعلات هي على الارجح وفيرة في اضطرابات وراثية، وأنه ينبغي تقييم وجود والنسبية مساهمة الأليلات مع ارتفاع وتيرة أليل طفيفة بعناية في سياق المتغيرات النادرة إضافية.
وأخيرا، استفادت الدراسة من الطفرات BBS من مزيج من الحفظ التطوري قوي وفهم مسبق لبعض الممرات المشتركة في إمراض المرض. ومع ذلك، فمن المرجح أن هذا النهج هو ممكن من الناحية النظرية لمجموعة واسعة من الظواهر السريرية الأخرى. وسيكون من المهم لتطوير الأدوات التجريبية التي يمكن تقييم أثر الاختلاف على إخراج آليات المرض واضحة، أو على نطاق أوسع، على عواقب المظهرية لأنظمة بأكملها. سوف توفر على نطاق واسع resequencing يستلزم تطوير وتطبيق اختبارات بيولوجية مثل تلك المذكورة هنا لتقييم أهمية وظيفية من المتغيرات المحددة في الأفراد مع الظواهر المثيرة للاهتمام.

المواد والأساليب

المنظمات الأعضاء والتلاعب الأجنة.

المنظمات الأعضاء ضد الزرد bbs1 - 12 (SI الملحق، الجدول S1 تم الحصول عليها) والسيطرة MO من أدوات الجينات. تم حقن واحدة نانولتر كل الحل في الأجنة الزرد WT في واحد- إلى مرحلة الخلية يومين. مرنا WT ومتحولة البشري لBBS1 - 12 تم نسخه في المختبر مع عدة آلة SP6 رسالة (AMBION). MO ومرنا تركيزات (SIالملحق، الجدول S3 تم تحديد) على أساس الجمع التي WT مرنا انقاذ بكفاءة النمط الظاهري morphant. استخدمت تركيزات نفسها للانقاذ مع مرنا متحولة أو حقن مرنا وحدها. متوفرة عند الطلب البيانات منحنى الجرعة والاستجابة الكاملة لكل MO.

تصنيف وتسجيل النقاط من الأجنة.

تم تصنيف الأجنة تتأثر إلى قسمين الظواهر متدرج على أساس شدة النسبية مقارنة مع العمر المتطابقة الضوابط uninjected من نفس القابض، كما هو موضح في SI الملحق. وأجريت مقارنات بين حقن MO حدها، مرنا وحده، والإنقاذ متحولة، وWT الإنقاذ عن طريق χ 2 الاختبار.

كامل جبل RNA في الموقع التهجين.

جبل بأكمله في الموقع التهجين أجريت، تليها تركيب مسطحة، وتطهير في الساليسيلات الميثيل، والتصوير الفوتوغرافي في التكبير من × 10، والقياس، كما هو موضح في SI الملحق.

رصد حركات تكون المعيدة.

تم رصد تحركات تكون المعيدة عن طريق الحقن قسيم أرومي واحدة من 10000-M R-ديكستران مترافق الأخضر النسب الفلورسنت التتبع (إينفيتروجن) في المرحلة 16 خلية ورصد المواقع من الخلايا الفلورسنت من خلال مراحل اكتفار.

زراعة الخلايا الثديية.

وقد نمت الخلايا على coverslips الزجاج في DMEM وسائل الإعلام / F12 (10٪ المجلد / المجلد FBS). بعد ترنسفكأيشن عابرة مع Fugene 6 (روش)، تم إصلاح الخلايا في الميثانول بعد 48 ساعة وimmunostained مع مكافحة Myc على ومكافحة γ تويولين الأضداد الأرنب بولكلونل (سيغما).

شكر وتقدير

نشكر اندي McCallion، جيم Lupski، والمختبر Katsanis لمراجعة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل عن طريق منح R01HD04260 من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية. منح R01DK072301، R01DK075972 (لNK)، وR01DK52431 (لRLL) من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. مؤسسة البقعي الرؤية البحوث (NK)؛ والبصرية زمالة برنامج تدريب العلوم العصبية (NAZ)؛ ومؤسسة Berrie راسل (RLL). NK هو جان وجورج BRUMLEY أستاذ.

الحواشي

  • 1 لمن ينبغي أن تعالج المراسلات. البريد الإلكتروني: katsanis@cellbio.duke.edu.
  • الكاتب المساهمات: NAZ، ECO، JLB، وNK مصممة البحوث؛ NAZ، YL، JMG، CG، ECO، CCL، YB، JB، يقوم AS، وJLB البحوث؛ NAZ، YL، JMG، CG، ECO، CCL، YB، JB، RLL، AS، JLB، وNK تحليل البيانات؛ وNAZ، YL، ECO، RLL، كتب JLB، وNK ورقة.
  • الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
  • * كان تقديم هذه المادة المباشرة محرر مسبقا.
  • تحتوي هذه المقالة على معلومات داعمة على الانترنت في http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi...DCSupplemental.

المراجع

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس