عرض مشاركة واحدة
  #17  
قديم 11-22-2015, 11:31 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Nipa1 (spg6)، وأساس وراثي جسمي شكل وراثي مشلول الشلل النصفي، يشفر الناقل وظيفية المغنيسيوم 2+ *

 

http://www.jbc.org/content/282/11/8060.full


ملخص

الطفرات في NIPA1 (SPG6) الجين الذي يحمل اسم "ن على ط mprinted في P ريدر-ويلي / A ngelman" لقد تورطت في شكل واحد من مرض وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP)، وهو اضطراب الاعصاب تتميز التدريجي أقل التشنج أطرافهم والضعف. ومع ذلك، فإن وظيفة NIPA1 غير معروف. هنا، وتبين لنا أن انخفاض تركيز المغنيسيوم يعزز التعبير عن NIPA1 مما يشير إلى دور في استقلاب المغنيسيوم الخلوية. في الواقع NIPA1 يتوسط المغنيسيوم 2+ امتصاص هذا هو كهربي، التي تعتمد على التيار الكهربائي، ويمكن إشباعه مع ثابت ميخائيل 0.69 ± 0.21 م م عندما أعرب في البويضات القيطم. أظهر توطين التحت خلوية مع المناعي أن الذاتية الزميلة البروتين NIPA1 مع الإندوسومات المبكرة وسطح الخلية في مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية والظهارية. كما هو متوقع من الجين المغنيسيوم استجابة، نجد أن تركيز المغنيسيوم تغير يؤدي إلى إعادة توزيع بين مقصورة endosomal وغشاء البلازما. النتائج المغنيسيوم عالية في تضاءلت NIPA1 سطح الخلية في حين المغنيسيوم المنخفض يؤدي إلى تراكم في الإندوسومات المبكر والتجنيد لغشاء البلازما. وأظهرت المسوخ NIPA1 الماوس، T39R وG100R الموافق المسوخ البشرية منها خسارة-وظيفة عندما أعرب في البويضات وغيرت الاتجار في الخلايا COS7 transfected. نستنتج أن NIPA1 يشفر عادة المغنيسيوم 2+ نقل وفقدان للوظيفة NIPA1 (SPG6) بسبب الاتجار غير طبيعية من البروتين تحور يوفر أساس النمط الظاهري HSP.
القسم السابق القسم التالي
يدعى NIPA1 [NT_078094] الجيني ل "ن ط على mprinted في P-ريدر ويلي / A ngelman" لأنه كان يعتقد أن يكون موجودا بين حوالي 30 جينات مطبوع مرتبطة كروموسوم 15q11-Q13 (SPG6 مكان) تشارك في Prader- متلازمة ويلي (1 - +5). ومع ذلك، NIPA1 كما تورطت في آخر اضطراب واضح راثي يسمى المهيمن الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP) 4 (OMIM 608145 و600363). تضم HSP أكثر من 30 الاضطرابات الوراثية التي هي مشية تشنجي (ميزة السائد 6). وقد ارتبطت طفرات في الجينات لا يقل عن ستة مع راثي HSP المهيمن بما في ذلك NIPA1 (SPG6). تقدم هذه المجموعة غير متجانسة مع التدريجي أقل التشنج أطرافهم والضعف. في غياب المظاهر السريرية الأخرى ويشار إلى هذه الاضطرابات إلى نقية كما أو غير معقدة HSP (6). فينك وآخرون. (7، 8) أن غير معقدة HSP ارتبط كروموسوم 15q، منطقة NIPA1. حددت دراسات إضافية قبل هذه المجموعة إجراء تبديل النوكليوتيدات في موقف 134 من NIPA1 [كدنا أن أدى إلى استبدال الحمض الأميني في موقف 45 من البروتين NIPA1 (T45R) في ربط SPG6 HSP المشابهة وفي علاقة المشابهة التي كانت صغيرة جدا للربط تحليل (9). وفي الآونة الأخيرة، حددت ثلاث مجموعات بحثية مختلفة إجراء تبديل مغلطة في NIPA1، G106R، في عدد من أسر لا علاقة كبيرة (+10 - 12). لم يتم تحديد الدور الوظيفي للNIPA1 في برادر ويلي أو HSP المتلازمات.
المغنيسيوم هو ثاني الموجبة الأكثر وفرة داخل الخلايا ويلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الكيميائية الحيوية داخل الخلايا (13). على الرغم من وفرة وأهمية المغنيسيوم، لا يعرف إلا القليل حول كيفية الخلايا حقيقية النواة تنظيم محتوى المغنيسيوم بهم. الخلايا الحرة المغنيسيوم 2+ التركيز هو في حدود 0.5 م م، وهو 1-2٪ من مجموع المغنيسيوم الخلوية (13). وفقا لذلك، يتم الحفاظ على الخلايا المغنيسيوم 2+ دون تركيز توقع من إمكانات الكهروكيميائية عبر الغشاء. وينظم الخلايا المغنيسيوم 2+ تركيز ناعما المحتمل عن طريق فرض ضوابط دقيقة من المغنيسيوم 2+ دخول، والمغنيسيوم 2+ هروب رأس المال، وحجرات تخزين الخلايا (14). لقد أثبتنا أن المغنيسيوم 2+ المدخلة من خلال مسارات محددة وتنظيم المغنيسيوم التي تنظمها آليات الجوهرية بحيث ثقافة الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على المغنيسيوم نتائج منخفضة في ما يصل التنظيم من المغنيسيوم 2+ امتصاص داخل الخلايا. وقد أظهرت هذه الزيادة على التكيف في المغنيسيوم 2+ دخول أن تعتمد على دي نوفو النسخ منذ المعالجة المسبقة للخلايا الظهارية مع أكتينوميسين D منعت التكيف مع انخفاض المغنيسيوم خارج الخلية (15). وتشير البيانات إلى أن الخلايا الظهارية يمكن الشعور المغنيسيوم البيئي وخلال عمليات transcription- والتي تعتمد على ترجمة يغير النقل المغنيسيوم 2+ والحفاظ على توازن المغنيسيوم.
في محاولة لتحديد الجينات الكامنة وراء التغيرات الخلوية الناتجة عن التكيف مع المغنيسيوم خارج الخلية المنخفض، استخدمنا تحليل النوكليوتيد ميكروأري للكشف عن النصوص التنظيم المغنيسيوم في الخلايا الظهارية (16). نص واحد، NIPA2، كان إلى حد كبير من قبل المغنيسيوم خارج الخلية مما يدل على أن التوليف ينظمها التغييرات في المغنيسيوم خلية التنظيم الأعلى. 5 أظهرنا أن NIPA2 بوساطة المغنيسيوم 2+ النقل عند المعبر عنها في القيطم المورق البويضات. وبحثا سيليكون وأظهرت العضو الثاني من هذه العائلة من البروتينات، NIPA1. وكان الهدف من هذه الدراسة لمعرفة ما إذا NIPA1 يتوسط النقل المغنيسيوم 2+ باستخدام دراسات الكهربية ومضان. وعلاوة على ذلك، تقرر توزيع الخلوية وتوطين التحت خلوية من خلال تحليل لطخة غربية والمناعي المجهري. تم تقييم إعادة توزيع البروتين NIPA1 في استجابة للتغيرات في المغنيسيوم الخلوية. وأخيرا، فإن NIPA1-T39R وG100R المسوخ، ويرتبط مع HSP، تم إنشاؤها واختبارها. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن بروتين NIPA1 يتوسط النقل المغنيسيوم 2+ وينظمه المغنيسيوم مشيرا إلى أنه قد تلعب دورا في السيطرة على الخلوي توازن المغنيسيوم. أدت الطفرات T39R وG100R في الاتجار داخل الخلايا تغير من البروتين NIPA1 وتضاءلت المغنيسيوم 2+ النقل مما يشير إلى دور في النمط الظاهري HSP.

المواد والأساليب

تم شراؤها بناء التعبير ناقلات ترميز NIPA1 -A الماوس NIPA1 كدنا] استنساخ من بتبريد، رقم الكتالوج B430207K20. والإنسان NIPA1 كدنا] هو أطول من تسلسل الماوس بسبب امتدادا AAAAAA N-المحطة. والتسلسل Subclones لتأكيد سلامة التسلسل. التركيبة الناتجة، pFLCI-mNIPA1، تضمن الترميز المنطقة بأسرها من mNIPA1 كدنا] يحيط بها 20 سنة مضت من غير مترجم تسلسل 5'-النوكليوتيدات و 929 سنة مضت من غير مترجم 3'-التسلسل. اثنين من الماوس بنيات متحولة، pFLCI-mNIPA1-T39R وpFLCI-mNIPA1-G100R، حيث تم استبدال منتدى المجالس الرومانسية 39 (ACG) مع الارجنتين 39 (AGG) والغليسين تم استبدال 100 (GGG) مع الارجنتين 100 (AGG)، على التوالي، كانت تنتج من pFLCI-mNIPA1 باستخدام QuikChange II XL موقع الموجه عدة الطفرات (Stratagene). تم إضافة بصمة HA-C محطة لNIPA1 كدنا] بواسطة PCR مع قليل النوكليوتيد (5N1Sac1: 5'-GGCGGCGAGCTCGGCATGGGGACTG-3 "، 3N1HA: 5'-TTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGTCTGTTTTCATATTGG-3 ') التي تحتوي على HA الكامل. وNIPA1-HA ثم subcloned في ناقلات pEGFP-N1 استبدال العلامة EGFP مع HA مما أدى إلى البلازميد HA-N1-NIPA1. كانت خلايا COS7 مثقف على النحو المبين أدناه وعابر. مع HA-N1-NIPA1 باستخدام Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن).
التعبير عن ماوس NIPA1 التركيبات في القيطم البويضات وتوصيف المغنيسيوم 2 + النقل، للحصول على القيطم البويضة التعبير، تم تصنيعه كرنا من mNIPA1، mNIPA1-T39R، وmNIPA1-G100R كدنا] يبني، خطي، ومن ثم نسخها مع T7 البلمرة في وجود M7 سقف GpppG باستخدام mMESSAGE ماكينة ™ T7 KIT (AMBION) نظام النسخ. كان إعداد البويضات، وحقن مع كرنا، واثنين من الجهد الكهربائي المشبك كما هو موضح سابقا، وأجرى في 21 ° C (16). تمت دراسة البويضات 3-5 أيام بعد الحقن. تم حساب نسب نفاذية باستخدام العلاقة Nernstian وK م وV ماكس القيم واضحة مع تحليل الانحدار غير الخطية (16).
تم استخدام المجهر epifluorescence لقياس المغنيسيوم 2+ تدفق إلى البويضات واحدة باستخدام المغنيسيوم 2+ -responsive-ماج FURA-2 صبغ مضان (16). تم حقن البويضات مع 50 μ M-ماج FURA-2 حامض (المسابر الجزيئية)، 20 دقيقة قبل التجريب. وقد شنت الغرفة (0.5 مل) على مجهر نيكون Diaphot-TMD مقلوب، مع فلور × 10 هدف، وتحديد جمعية I-V. وفي وقت لاحق، كانت فرضت في -70 بالسيارات لقياسات مضان لالأوقات المحددة. مضان تم تسجيلها بشكل مستمر باستخدام ثنائي الطول الموجي الإثارة الطيفي (دلتا المسح، فوتون تكنولوجيز) مع الإثارة لل-ماج FURA-2 في 340 و 385 نانومتر (سرعة المروحية التي حددت في 100 هرتز) والانبعاثات في 505 نانومتر. يتم عرض النتائج على هيئة نسبة 340/385، الأمر الذي يعكس الخلايا المغنيسيوم 2+ التركيز.
وقد حافظت الفئران إعداد الحيوانية والخلية الثقافة -Male لمدة 5 أيام على اتباع نظام غذائي منخفض المغنيسيوم (ICN النظام الغذائي رقم 902205، الكيميائية الحيوية الغذائية) تستكمل مع 0.05٪ MgSO 4 يمكن مقارنتها مع طعام الماوس التجاري (17).
كانت COS7، والماوس البعيدة نبيب الملتوية (MDCT)، HEK293، والخلايا العصبية الحصين الابتدائية المثقف في الحد الأدنى من المتوسط ​​الضروري أن تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، البيروفات الصوديوم (110 ملغ / لتر)، 5 م مل -glutamine و 50 وحدة / مل البنسلين، و 50 ميكروغرام / الستربتومايسين مل في بيئة ترطيب 5٪ CO 2 -95٪ الهواء في 37 ° C. تم عزل الخلايا العصبية الأولية من أدمغة الفئران ومثقف باستخدام أساليب مماثلة لتلك التي سبق وصفها (18). حيث المشار إليها، كانت خلايا subconfluent مثقف في أبعاده المغنيسيوم 2+ خالية، العادي المغنيسيوم 2+، 0،08 م م، أو ارتفاع المغنيسيوم 2+ و 5.0 م م ومتوسطة (تقنيات الخلايا الجذعية) ل3 أو 16 ساعة قبل الحصاد أو تجهيز كيمياء المناعة كما ذكرت سابقا (16). وكانت عناصر أخرى من المغنيسيوم 2+ ثقافة خالية المتوسطة على غرار المتوسطة كاملة.
وتم قياس كمية التحليل الكمي للNIPA1 النصوص التي في الوقت الحقيقي المنتجات عكس النسخ، PCR -PCR مستمر مع AB7000 ™ (النظم البيولوجية التطبيقية) باستخدام SYBR الخضراء ™ مضان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. التمهيدي مجموعة من الماوس NIPA1 كان: 5'-CTGGTGGACTTCTTGGGCAT-3 "(إلى الأمام) و5'-TCCAATGCCTGTTCCTCAA-3" (عكس). وتم تطبيع المبالغ النسبية للNIPA1 RNA إلى النصوص الماوس β-أكتين.
تم تحديد تسلسل الجينوم تحليل تسلسل -THE NIPA1 كدنا] بالطرق العادية. وNIPA1 تسلسل الأحماض الأمينية طول الكامل في قاعدة بيانات بنك الجينات ™ (أرقام الانضمام: NP_653200 (الإنسان) وNP_705806 (الماوس)). وقد تم تحديد الدوافع البروتين باستخدام BLASTP وقاعدة البيانات السويسري بروت. وكان من المتوقع الغشاء طوبولوجيا بواسطة برنامج SOSUI على أساس تحليل للا مائية كايت-دوليتل (23).
البقعة الغربية تحليل -A الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة، ومكافحة NIPA1، أثيرت ضد حلقة الخلية الثالثة من نهائي المشقوق البروتين NIPA1 البشري باستخدام الببتيد الاصطناعية، NH 2 -AQDILHNNPSSQRALC-COOH (الأمينية بقايا حمض 207-222). وقد تضعف-تنقية تقارب أرنب الأجسام المضادة NIPA1 مكافحة الإنسان في برنامج تلفزيوني (المالحة تريس مخزنة، 20 م م تريس، 200 م م كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.6) تحتوي على 0.5٪ BSA بتركيز نهائي حوالي 0.7 ميكرولتر / مل. تم إجراء التحليل الغربي التي يحتضنها البقع مع anti-NIPA1 الأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تليها ثلاث يغسل مع PBS، 0.1٪ توين 20، 10 دقيقة لكل منهما. ثم تم تحضين البقع مع 1/10000 الفجل-البيروكسيديز مترافق حمار المضادة للأرنب الثانوي (سيغما) الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة. بعد غسل ثلاث مرات مع PBS / توين 20، 10 دقيقة لكل منهما، وتصور البقع مع ECL (أمرشام العلوم البيولوجية) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
تم إصلاحها المناعي متحد البؤر المجهري -Coverslips من الخلايا المستزرعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 2٪ امتصاص العرق. تم غسلها الخلايا ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 (PBST) قبل كل حضانة الأجسام المضادة. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: NIPA1، GM130 (أ رابطة الدول المستقلة جولجي البروتين مصفوفة)، EEA1 (في وقت مبكر الاندوسوم مستضد 1)، Rab5 وRab8 (البروتينات ملزم GTP) التي أثيرت في الماوس (مختبرات BD تنبيغ). تم الحصول على اليكسا 350-، اليكسا 488- واليكسا الأجسام المضادة الثانوية 568-مترافق من المسابر الجزيئية. تم تنفيذ جميع ردود الفعل الأجسام المضادة في عرقلة الحل يتكون من 2٪ مصل الماعز العادي في PBST لمدة 1 ساعة درجة حرارة الغرفة. اليكسا 350- وphalloidin 568-مترافق (المسابر الجزيئية واستخدمت) وصمة عار لالأكتين في التجارب المشار إليها للمساعدة في ترسيم الطرفية الكشكشة الغشاء. بعد التلوين، coverslips ثم تم تركيبه على الشرائح مع المتوسطة المتزايدة على أساس الجلسرين-Fluoromount-G (التكنولوجيا الحيوية الجنوبية).
وقد شنت البويضات في أكتوبر ناظم البرد المتوسطة وفلاش المجمدة في isopentane تبريده في النيتروجين السائل. قطعت أقسام عشرة ميكرون سميكة من خلال البويضات المجمدة والتي شنت مباشرة على superfrost بالإضافة إلى الشرائح (فيشر). كانت ثابتة قسم -20 ° C الميثانول ومعالجتها لالمناعية باستخدام NIPA1 الأجسام المضادة الأولية والمضادة للأرنب اليكسا 488 الضد الثانوية.
وقد تم نقل كل الصور باستخدام عدسة 63 × المياه الملصقة على زايس LSM 510 المجهر ميتا وAxioVision (epifluorescent) أو LSM 510 ميتا (متحد البؤر) والبرمجيات. وقد تم اختيار الخلايا 10-12 الحقول النظر وتستخدم لتقييم التعاون توطين تلوين الأجسام المضادة.

النتائج

NIPA1 كدنا] هل لجين-المغنيسيوم استجابة، مع العلم أن الفرق التعبير الجيني تشارك مع مراقبة انتقائية من الظهارية الحفاظ على المغنيسيوم خلية، كانت استراتيجيتنا الرامية إلى استخدام التحليل ميكروأري لتحديد cDNAs التي كانت تصل التنظيم مع المغنيسيوم منخفضة (15). كما كان هدفنا لتحديد البروتينات الناقلة الجديدة، ونحن أولويات هؤلاء المرشحين وفقا لخصائص الهيكلية ذكرت لنقل افتراضية. كان واحدا من شظايا [كدنا المختارة التي حددها زيادة في نص NIPA2 (المصحف العضلة البروتين افتراضية MNCb-2146، والتي سميت Nipa2). أجري بحث BLAST قاعدة بيانات بنك الجينات ™ وعضو آخر من هذه العائلة، NIPA1، تم تحديد. كما كان NIPA1 ليس على الماوس Affymetrix MG U74 Bv2 والمصفوفات MG U74 Cv2 (Affymetrix) المستخدمة في ذلك الوقت من تحليلنا ميكروأري الأولي، ونحن أول أظهرت أن نص NIPA1، مثل NIPA2 مرنا، وينظم من قبل المغنيسيوم في الوقت الحقيقي باستخدام RT -PCR. زيادة NIPA1 مرنا 3.2 أضعاف في خلد أنبوبية الملتوية البعيدة، MDCT، الخلايا الظهارية، ن = 3 الاستعدادات مستقلة، مثقف في المغنيسيوم منخفضة مقارنة مع الخلايا الطبيعية مؤكدا أن NIPA1 ينظم بشكل مختلف من قبل المغنيسيوم.
الأحماض الأمينية تسلسل NIPA1 -THE الجينية للإنسان والفأر كل تحتوي على أربعة أفراد من عائلة حول و، المعين NIPA1-NIPA4. NIPA1 هو أقل أعضاء مماثل من الأسرة على الرغم من أنها تقع جنبا إلى جنب مع NIPA2 على الصبغي 15q. تم العثور على البروتينات NIPA1 الإنسان والفأر أن 98٪ متطابقة في تسلسل الأحماض الأمينية. وهي تختلف من المدى القصير من alanines على الطرف N-المحطة. وNIPA1 الإنسان والفأر NIPA1 عرضها بين 36 و هوية 43٪ إلى أخرى ثلاثة أشكال الإنسان والفأر حول و منها. الجينات التي تكود المتماثلات وثيقة (83-91٪ الهوية تسلسل الأحماض الأمينية) موجودة في الدجاج وانسان الغاب، وجينومات الشمبانزي، مشيرا إلى أن الاختلاف في NIPA1 من NIPA2، NIPA3، وكانت أشكال NIPA4 حدث في وقت مبكر من تطور الفقاريات (الشكل. 1 A).
لمحات للا مائية باستخدام برنامج SOSUI توقع هيكل الثانوية مع تسعة مجالات توقع الغشاء، TMDS (الشكل 1 B). يتضح أيضا هي T39R الماوس والمواقع طفرة G100R التي تتوافق مع T45R البشرية منها ومواقع طفرة G106R تقع في TMD1 توقع وTMD3، على التوالي (الشكل 1 B).
NIPA1 يتوسط المغنيسيوم 2 + النقل في التعبير عن القيطم البويضات -إلى تحديد ما إذا كان NIPA1 يشفر وظيفية المغنيسيوم 2+ نقل نحن كما يفعل NIPA2، 5 إعداد الماوس NIPA1 كرنا، حقنه في البويضات القيطم وقياس المغنيسيوم 2+ التيارات -evoked باستخدام اثنين من مسرى مكروي تحليل المشبك الجهد والمغنيسيوم 2+ تدفق باستخدام-2-ماج FURA منهجيات مضان. أعطى بيانات الكهربية دليل على وجود عملية rheogenic مع التيارات الداخل في البويضات NIPA1 كرنا حقن، في حين لم تكن هناك تيارات ملموسة في السيطرة H 2 O- أو بولي الكلي (A) + الخلايا حقن الحمض النووي الريبي من نفس دفعة من البويضات. الشكل . 1 C يظهر متوسط ​​الجهد الحالي (I-V) المؤامرات. كان هناك وسيلة + 28 بالسيارات التحول في إمكانية انعكاس مع زيادة العقد في تركيز المغنيسيوم، والذي يقترب من القيمة النظرية التي تنبأ بها العلاقة Nernstian. ومن بين الخصائص المتأصلة في جميع الناقلين هو ملك الركيزة التشبع. المغنيسيوم 2+ -evoked التيارات، ويقاس عند نقطة زمنية محددة، كانت القابل للإشباع (الشكل 1 D) مما يدل ثابت ميخائيل (K م) من 0.69 ± 0.21 م م (الشكل 1 D أقحم) التي كانت مستقلة عن أكبر الفولتية لقط السلبية (لا تظهر البيانات). وأكدت-2-ماج FURA قرارات مضان أن التيارات شاهدوها بسبب المغنيسيوم 2+ تدفق (الشكل 1 E). زيادة المغنيسيوم الخارجي نسبة انبعاث 340/385 الإثارة التالية المشبك الجهد في -70 بالسيارات. كاليفورنيا 2+ لم نقل بمعدلات اللازمة لتغيير كثافة مضان من صبغ وليس على المعدلات المطلوبة لحساب التيارات المقاسة بشكل متزامن.
المناعي باستخدام الأجسام المضادة المحددة لمكافحة NIPA1 يظهر في الغالب توطين سطح البروتين NIPA1 في البويضات NIPA1، معربا، في حين لم يكن هناك أي تلطيخ في السيطرة، البويضات حقن الماء (الشكل 1 F).
الخاصية الثانية من معظم شركات النقل هي الركيزة الانتقائية. وبناء على ذلك، تم استخدام مجموعة متنوعة من الكاتيونات ثنائي التكافؤ خارج الخلية لتحديد الانتقائية للقناة NIPA1 التعبير عنها. كان NIPA1 انتقائية نسبيا المغنيسيوم 2+ (تكميلية الشكل S1). وكانت نسبة الانعكاس المحتمل التيارات استرنشيوم 2+ -evoked اسيما أقل من المغنيسيوم 2+ ونسبة الكاتيونات ثنائي التكافؤ الأخرى اختبارها، كا 2+، ني 2+، الزنك 2+ الحديد 2+، النحاس 2+، شركة 2+، كان با 2+، والمنغنيز 2+، صغيرة بالمقارنة مع تلك التي حركها المغنيسيوم 2+ .Inthe التجارب أظهرت، تم تصحيح التيارات لإجراء تغييرات في مقاومة الغشاء الناجمة عن الموجبة ثنائي التكافؤ منها باستخدام القيم من H 2 البويضات حقن O (التكميلي الشكل . S1 A). وفقا لذلك، وكان النقل الموجبة NIPA1 بوساطة انتقائية نسبيا المغنيسيوم 2+.

الشكل 1.
التوصيف الجزيئي لNIPA1. شجرة النشوء والتطور التي شيدت من تشكيلة متعددة من الإنسان العاقل التالية (ح)، المصحف العضلة (م)، الجرذ النرويجي (ص)، جالوس جالوس (ز)، وعموم troglodytus (حزب العمال)، بونجو pygmaeus ( ع)، بوس توريس (ب)، وكلب familiaris (ج) تسلسل باستخدام ClustalX الإصدار 1.88 (21) وطريقة الانضمام جارة سيتو ونيي (22) باستخدام Phylo القرعة، الإصدار 0.8 (مختبر تطبيقات الرسومات، جامعة بوسان الوطنية ). توقع هيكل الثانوية من الماوس NIPA1. ويتضح موقعين طفرة الماوس، T39R وG100R، المقابلة لT45R وG106R الطفرات البشرية منها. الجهد الحالي (I-V) العلاقات التي تم الحصول عليها من الخطوات الجهد خطية من -150 بالسيارات إلى +25 بالسيارات في وجود ملغ 2+ حلول خالية أو تلك التي تحتوي على تركيزات المشار إليها من MgCl 2. وقد فرضت البويضات في إمكانية عقد -15 بالسيارات وكثف من -150 بالسيارات إلى +25 بالسيارات في 25 بالسيارات الزيادات لمدة 2 ق في كل من تركيزات المشار إليها. المعروضة هي متوسط ​​I -V المنحنيات التي تم الحصول عليها من سيطرة H 2 O-حقن = 3) أو => 3) البويضات، معربا عن NIPA1. لاحظ تحولا إيجابيا في إمكانية انعكاس مع زيادات في المغنيسيوم 2+ التركيز. القيم يعني ± SE من الملاحظات تقاس في نهاية كل الاجتياح الجهد لالمغنيسيوم 2+ تركيز كل منها. ملخص تعتمد على التركيز المغنيسيوم 2+ -evoked التيارات في البويضات NIPA1، معربا عن استخدام المحتمل عقد -125 بالسيارات. يعني القيم ± SE هي تلك الواردة في الشكل. 1 C. كان ثابت ميخائيل تحديدها مع غير الخطية anaylsis الانحدار 0.69 م م. كان ثابت ميخائيل مستقلة عن منهما عقد المحتملة. والمغنيسيوم 2+ تدفق إلى البويضات، معربا عن NIPA1. تم قياس-2-ماج FURA نسب مضان في السيطرة والبويضات NIPA1، معربا، في إمكانات يستريح، في الحلول التي تتكون من الحلول اسميا خالية من المغنيسيوم وثم مع 2.0 م م MgCl 2 مع انقطاع كما هو مبين. البويضات وبعد ذلك الجهد فرضت-في إمكانية عقد -70 بالسيارات، حيث المشار إليها. تم تحديد ملغ 2+ تدفقات مع مضان باستخدام ملغ 2+ صبغ -sensitive،-ماج FURA-2. CaCl 2، 2.0 م م، تم إضافة وإزالة الأماكن المحددة. يتم عرض النتائج على هيئة نسبة 340/385 الإثارة التي تعكس التغيرات في تركيز ثنائي التكافؤ الموجبة. النتائج الوسطية لاقتفاء أثر يؤديها مع ثلاثة الاستعدادات بويضة مختلفة. F والتعبير سطح البروتين NIPA1 في X. المورق البويضات مع تحديد المناعي. اللوحة اليمنى، ومراقبة البويضات حقن المياه اختبار مع NIPA1 محددة الأجسام المضادة تنقية تقارب. الأسهم تشير إلى سطح الغشاء (× 200 التكبير). اللوحة اليمنى البويضة NIPA1 حقن تعامل مع NIPA1 الضد يظهر تلوين سطح المكثف. وكان التيار قياس لهذه البويضة 0.12 أمبير مع 2.0 م م فرضت الخارجي تركيز MgCl 2 في -70 بالسيارات.


الشكل 2.
توزيع الأنسجة من الماوس الذاتية البروتين NIPA1 التعبير. اليسار، النشاف الغربي من البروتين NIPA1 الذاتية في الأنسجة الماوس المختلفة. تم تطبيق قسامة من البروتين (50 ميكروغرام) من الأنسجة الماوس اشارت الى كل حارة وlabbeled مع الأجسام المضادة بولكلونل محددة لNIPA1. هلام هو ممثل من ثلاثة الاستعدادات الأنسجة منفصلة. الحق، ويزيد من البروتين NIPA1 في الخلايا الظهارية مثقف في البلدان المنخفضة وسائل الإعلام المغنيسيوم. يظهر هو وصمة عار التمثيلية، واحدة من سبع أجريت على الاستعدادات مختلفة من الخلايا. زادت كثافة الفرقة متوسط ​​163 ± 7٪ مع المغنيسيوم منخفضة بالنسبة إلى تلك مثقف مع تركيزات عادية من المغنيسيوم.

وأخيرا، خاصية العامة للنقل هي القدرة على أن تحول دون ركائز ذات الصلة ولكن ليس نقلها. نحن اختبار إذا الكاتيونات التي لم نقلها بواسطة NIPA1 أن تمنع المغنيسيوم 2+ -evoked التيارات. تم اختبار تركيزات كبيرة نسبيا من 0.1 م م المنغنيز 2+ و 5.0 م م كا 2+ في وجود 2.0 م م MgCl 2 (الشكل S1 B). مليون 2+ تحول دون تماما المغنيسيوم 2+ التيارات، في حين كا 2+ لم تمنع النقل كما يتضح من التغيير في إمكانية انعكاس لالمغنيسيوم 2+. على التوازن، وهذه البيانات تشير إلى أن النقل NIPA1 بوساطة يوضح التشبع، والانتقائية، والقدرة على أن تحول دون تفاضلي قبل الكاتيونات ثنائي التكافؤ الأخرى.
توزيع أنسجة الذاتية NIPA1 البروتين التعبير التي تستخدم والوقت الحقيقي RT-PCR، وتبين لنا أن النصوص NIPA1 يتم التعبير على نطاق واسع بين الأنسجة الماوس اختبارها. وبعد ذلك قام تحليل لطخة غربية إلى تحديد الذاتية تعبير البروتين NIPA1 في مختلف الأنسجة الماوس (الشكل 2، يسار). للكشف عن البروتين NIPA1، تم إنشاؤها على الأجسام المضادة المحددة من قبل تحصين الأرانب. كان هناك فرقة واضحة في الكتلة الجزيئية المتوقع من 34 كيلو دالتون في القلب والكلى والكبد، والقولون، والفرقة خافت من 34 كيلو دالتون في الدماغ، وعدم وجود إشارة في الأمعاء الدقيقة. وكان من صدرة واضح في القلب والكلى الأنسجة التي قد توحي تعديل posttranslational في هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، كانت هناك عصابات باهتة في أنسجة القلب والكلى بنحو 68 كيلو دالتون وفرقة قوية جدا في الدماغ التي قد تمثل ديمر من البروتين. وكان هذا الأخير ثابت لمدة ثلاثة الاستعدادات الأنسجة منفصلة.
كما NIPA1 مرنا يستجيب لالمغنيسيوم، ونحن بعد ذلك تحديد NIPA1 تعبير البروتين في الخلايا المستزرعة في وسائل الإعلام المغنيسيوم منخفضة نسبة إلى المغنيسيوم العادي. باستخدام خط الخلية الكلى الماوس، MDCT، باعتبارها الخلايا الظهارية prototypic، كشف تحليل لطخة غربية عن زيادة بنسبة 2 أضعاف في كثافة البروتين في الخلايا المزروعة في المغنيسيوم منخفضة (الشكل يمين). ومن المثير للاهتمام، أن الزيادة السائدة في الفرقة 68 كيلو دالتون مع زيادات طفيفة في إشارة 34 كيلو دالتون. الفرقة أكبر، وربما متعدد القسيمات من البروتين NIPA1، قد يكون نقل نشط.
التعريب التحت خلوية من الذاتية NIPA1 البروتين -إلى تحقيق توطين التحت خلوية من البروتين NIPA1، أجرينا المناعي باستخدام محدد من الأجسام المضادة لمكافحة NIPA1 في الخلايا COS7 الكلى. NIPA1 على نطاق واسع شارك المترجمة مع EEA1 وRab5 التي هي بروتينات الاندوسوم في وقت مبكر (الشكل A و B). علاوة على ذلك، منقط نمط تلطيخ الطرفية من NIPA1 يتسق مع وجود NIPA1 في الإندوسومات مبكرة. لتثبت بشكل قاطع توطين NIPA1 إلى الإندوسومات في وقت مبكر، وهو شكل نشط بشكل جوهري من Rab5، Rab5Q79L، تم استخدامها. مترجمة شارك NIPA1 مع Rab5Q79L أعرب في الإندوسومات الموسعة (الشكل 3 B). بالإضافة إلى توطين endosomal، تم تفريق NIPA1 تلطيخ على نطاق واسع في جميع أنحاء سطح الخلية في الكشكشة الغشاء كما يتضح من phaloidin تلطيخ الأكتين (الشكل 3 C). إغفال من الأجسام المضادة الأولية أسفرت عن الغياب الكامل للالمناعية (لا تظهر البيانات). كما تم الكشف عن NIPA1 الذاتية مع الأجسام المضادة، وكان هذا النمط من التوزيع ليس الاستهداف غير الفعال للبروتين overexpressed الناتجة عن تعبير مغايرة. هذا النمط من التوزيع يتسق مع فكرة أن NIPA1 translocates من خلال الإندوسومات في وقت مبكر (وعلى الأرجح إعادة تدوير أيضا) وغشاء البلازما. يتم عرض النتائج من الخلايا COS7 هنا لأن عضية التقسيم داخل الخلايا كان من الأسهل تمييز مع المجهر متحد البؤر. ومع ذلك، لوحظت أنماط مماثلة من التوزيع مع HEK293 الكلى والخلايا MDCT (لا تظهر البيانات) والخلايا العصبية الحصين الابتدائية (التكميلي الشكل S2). كان NIPA1 واضح في نمط منقط في سوما والتشعبات من الخلايا العصبية مثقف وكان غائبا من مواقع متشابك (التكميلي الشكل S2). الاقتراح الذي NIPA1 الذاتية هي موجودة في غشاء سطح يتماشى مع الدراسات الفنية يؤديها مع البويضات معربا عن مغاير.

الشكل 3.
ويرد توطين التحت خلوية من NIPA1 الذاتية. المناعي تلطيخ الخلايا COS7. تم إصلاح الخلايا وحضنت مع الأجسام المضادة NIPA1 وعلامات الاندوسوم في وقت مبكر، EEA1 (A، اللوحة العلوية)، أو علامة جولجي، GM130 (A، لوحة الوسط) أو علامة TGN إعادة تدوير الاندوسوم، Rab8 (A، اللوحة السفلية). B، Rab5 (B، اللوحة العلوية) أو Rab5Q79L (B، اللوحة السفلية) استخدمت لتأكيد endosomal الترجمة. كانت ملطخة الخلايا COS7 مع phaloidin ل رسم سطح الخلية. يتم عرض تراكب في العمود الثالث من كل شخصية مع تضخم مقربة في العمود اليمين المتطرف. السهام تشير شارك توطين البروتين NIPA1 مع علامة منها. تم العثور على توزيعات التحت خلوية مماثلة في MDCT، HEK293، وخلايا الدماغ الحصين الابتدائية.

التغييرات في خارج الخلية المغنيسيوم يؤدي إلى تشارك إعادة التوزيع التحت خلوية من NIPA1 البروتين، إذا NIPA1 مع توازن المغنيسيوم الخلوي، فإننا نتوقع أنه قد يكون هناك إعادة توزيع التحت خلوية من البروتين في استجابة للتغيرات في تركيز المغنيسيوم الخارجي. كانت خلايا COS7 مثقف في المغنيسيوم عالية نسبيا، 5،0 م م MgCl 2، لمدة 3 أو 12 ساعة أو في أبعاده خالية من المغنيسيوم متوسطة لمدة 3 أو 12 ساعة، وتحدد توطين التحت خلوية مع المناعي على النحو الوارد أعلاه. حدثت تغييرات أكثر وضوحا في NIPA1 توزيع التحت خلوية داخل غشاء السطحية والإندوسومات في وقت مبكر (الشكل 4 أ). NIPA1was انخفاض طفيف في الغشاء الطرفية الثقافة التالية في ارتفاع المغنيسيوم 2+. بالنسبة لتلك الخلايا المزروعة في وسائل الإعلام الثقافة العادية التي تحتوي على 0.5 م م المغنيسيوم، وخفض البروتين NIPA1 في الغشاء السطحي وزيادة في الإندوسومات في وقت مبكر (الشكل 4 B). كان هذا الاتجار واضح من السطح إلى الاندوسوم مقصورة مبكرة ملحوظ في 3 ساعة وضعت في 12 ساعة بعد التغيير إلى ارتفاع متوسط ​​المغنيسيوم. كان تراكم البروتين NIPA1 كبيرة بما يكفي لتبدو وكأنها "تجميع" من البروتين في الإندوسومات في وقت مبكر (التكميلي الشكل S3 A).
وضع الخلايا في المغنيسيوم منخفضة لمدة 3 و 12 ساعة أدت إلى زيادة في البروتين NIPA1 في التجمع الاندوسوم في وقت مبكر ولكن ليس التجميع بل كان أكثر منقط داخل الإندوسومات مكبرة مقارنة مع تلك التي لوحظت مع المغنيسيوم العادي (التكميلي الشكل S3 A). وعلاوة على ذلك، كان هناك توظيف ملحوظ من البروتين NIPA1 إلى غشاء سطح الذي كان واضحا في 3 ساعات وتميز في 12 ساعة بعد إزالة المغنيسيوم. في الواقع، كان وضع العلامات السطح مع NIPA1 واسعة حتى أن مخطط الخلية كان واضحا مما يشير إلى أنه تم توطين في غشاء البلازما (المشار إليها في الشكل 4 B).
الخسارة من وظيفة الطفرات من NIPA1 البروتين -Rainer وآخرون. (9) التعرف على استبدال النوكليوتيدات في موقف 134 من NIPA1 [كدنا أن أدى إلى استبدال الحمض الأميني في موقف 45 من البروتين NIPA1 (T45R) في HSP المشابهة. هذا الموقع يتوافق مع وضع الثريونين 39 من NIPA1 الماوس. تحدث الطفرة T39R في بقايا المحفوظة في واجهة أول نطاق الغشاء (TMD1) وأول حلقة المفترضة (الشكل 1 B). ومن المتوقع أن يمدد هذه أول TMD من قبل ثلاثة أحماض أمينية يمكن أن يغير الاتجار البروتين أو وظيفة النقل. لاختبار هذا، فإننا استبدال منتدى المجالس الرومانسية 39 (ACG) مع الارجنتين 39 (AGG) وحقن كرنا المرتبطة إلى البويضات وأداء المشبك الجهد والتحليل مضان. طفرة T39R أدى إلى تقلص المغنيسيوم 2+ النقل بنحو 30٪ مقارنة مع NIPA1 من النوع البري على النحو الذي يحدده على حد سواء الكهربية (الشكل 5 A) وماج FURA-2 مضان (الشكل 5 B). يمكن أن يكون سبب هذه النتيجة عن طريق إما فشل نقل حركة المرور بشكل صحيح إلى غشاء البلازما أو عن طريق نقل أن حركة المرور بشكل طبيعي ولكنها غير وظيفية. للتمييز بين هذه الاحتمالات، وتنصهر من النوع البري NIPA1 وNIPA1T39R متحولة مع HA بحيث يمكن تقييم التعبير سطح الخلية في الخلايا COS7 عابر. من خلال تقنيات المناعي. وأعرب البرية من نوع NIPA1-HA في الإندوسومات المبكر، وكذلك سطح الخلية بطريقة مماثلة كما رأينا مع المناعي مع الأجسام المضادة NIPA1 (الشكل 5 C). كان غشاء البلازما NIPA1T39R-HA أقل بشكل ملحوظ من النوع البري الخلايا NIPA1-HA transfected، وكان هناك الاحتفاظ كبيرا من بناء متحولة في بنية تشبه شبكة محيط بالنواة تضم الشبكة الإندوبلازمية (الشكل 5 D). يتم تحديد البروتينات الخاطئة وتتجمع بواسطة الباطنة مراقبة الجودة شبكية. كان هناك أيضا زيادة واضحة في حجم endosomal قد توحي معالجة بروتين غير طبيعي داخل الإندوسومات (الشكل 5 E).

الشكل (4).
إعادة توزيع التحت خلوية من NIPA1 ردا على المغنيسيوم. كانت خلايا COS7 مثقف في المغنيسيوم عالية، 5.0 م م، المغنيسيوم العادي، 0.8 م م، أو المغنيسيوم المنخفض، أبعاده خالية من المغنيسيوم، لمدة 12 ساعة. تم تنفيذ المناعي مع NIPA1 الأجسام المضادة وعلامة السطح، phalloidin. وتظهر الصور المدمجة من الخلايا المسمى أيضا في لوحة اليمين المتطرف. ملخص تراكم NIPA1 في الغشاء الطرفية في استجابة للتغيرات في المغنيسيوم.


الشكل 5.
الخسارة من وظيفة الطفرات في NIPA1. ملخص المغنيسيوم 2+ -evoked التيارات في NIPA1T39R- والبويضات NIPA1G100R، معربا مقارنة مع من النوع البري البويضات، معربا عن NIPA1. تم قياس التيارات مع 2.0 م م MgCl 2 في الجهد إجراء 100 بالسيارات وفقا لأساليب معينة في وسيلة الإيضاح إلى الشكل. غادر. النتائج يعني ± SE ل n = 7، 10، و 7 البويضات، على التوالي. المغنيسيوم 2+ تدفق، والتي تحددها-ماج FURA-2 مضان، إلى البويضات NIPA1T39R- وNIPA1G100R، معربا عن. وقد تم قياس تركيز ملغ 2+ مع 2.0 م م MgCl 2 وفقا لأساليب معينة في وسيلة الإيضاح إلى الشكل. والحق. النتائج سيلة لأربعة البويضات. صور المناعي من NIPA1-HA-، NIPA1T39R-HA-، أو NIPA1G100R-HA-معربا عن الخلايا COS7. ملخص NIPA1T39R-HA وNIPA1T100R-HA الاحتفاظ في الشبكة الإندوبلازمية (ER) نسبة إلى البرية من نوع NIPA1 البروتين. وزيادة في حجم endosomal من NIPA1T39R-HA وNIPA1T100R-HA transfected نسبة إلى البرية من نوع الخلايا COS7 NIPA1-HA transfected. WT، النوع البري.

القصب (10)، تشن (11)، مونهوز (12)، وزملائهم المعنية حددت إجراء تبديل مغلطة، G106R، في أربع أسر لا علاقة كبيرة مع HSP. طفرة G106R الإنسان يتوافق مع الماوس G100R (الشكل 1 B). يقع هذا التحول في المنطقة الأحماض الأمينية الحفظ جدا في الجزء المركزي من TMD الثالث بحيث يتوقع أن يغير كثيرا من بنية البروتين (10). لقد استبدلنا الغليسين 100 (GGG) مع الارجنتين 100 (AGG)، وحقن كرنا المرتبطة في البويضات. طفرة G100R تلغى تماما المغنيسيوم 2+ النقل على النحو الذي يحدده الكهربية أو ماج FURA-2 مضان (الشكل A و B). بالتنسيق مع هذه النتائج، تم الابقاء على NIPA1G100R-HA في الشبكة الإندوبلازمية وكان هناك الاتجار القليل من البروتين النقل إلى سطح الخلية (الشكل C و D). كما هو الحال مع متحولة T39R، كانت هناك زيادة في البروتين endosomal (الشكل 5 E). نخلص إلى أن التعبير سطح تقلص من NIPA1T39R وغياب النتائج البروتين NIPA1G100R في فقدان جزئي وكاملة من المغنيسيوم 2+ امتصاص، على التوالي، من هذه الأشكال متحولة اثنين.

نقاش

نعرض هنا أن NIPA1، أساس بعض أشكال HSP، يتوسط المغنيسيوم 2+ النقل. والدليل على أن NIPA1 هو نقل المغنيسيوم مقنعة. أولا، تعبيرا عن NIPA1 في البويضات القيطم تنتج المغنيسيوم 2+ التيارات -evoked مع خصائص القناة مثل قياس مع الظروف الجهد المشبك. عكس التحولات المحتملة للحق قوته 28 فولت كما تنبأ به علاقة نرنست مع زيادة العقد في تركيز المغنيسيوم. ملغ 2+ التيارات هي التي تعتمد على التركيز، وتشبع، عكسها، وinhibitable كما هو متوقع لنقل القناة مثل. ثانيا، NIPA1 يتوسط المغنيسيوم 2+ تدفق على النحو الذي يحدده مضان مع المغنيسيوم 2+ -sensitive ماج-FURA-2 الصبغة. ثالثا، NIPA1 نص والبروتين وتغييرها كميا مع التغيرات في المغنيسيوم 2+ التركيز، وتتفق مع النموذج الأولي لدينا (16). رابعا، علينا أن نبرهن على الاتجار NIPA1 إلى الإندوسومات المبكرة والبلازما الغشاء تزداد مع تقلص خارج الخلية المغنيسيوم 2+، كما هو متوقع من نقل التنظيم المغنيسيوم. وأخيرا، وتبين لنا أن NIPA1T38R وNIPA1G100R طفرات تؤدي إلى فقدان المغنيسيوم النقل 2+ في البويضات معربا عن NIPA1 تغييرها. نستنتج أن NIPA1 يشفر المغنيسيوم 2+ نقل. ما هو غير واضح هو كيف يمكن لNIPA1 الخسارة من وظيفة يمكن أن تؤدي إلى فرط الاستثارية شبكة غير قادرة على يسبب الشلل النصفي التشنجي.
راينر وآخرون. (9) وتشاي وآخرون. (5) وأفادت وجود اثنين من النصوص NIPA1، 1،9-2،2 و 7.5 كيلوبايت، في الإنسان والفأر (5، 9). دعت إيسفورمس مرنا بديلة من مواقع تذييل بعديد الأدينيلات بديلة له داخل اكسون 5 (5). وأعرب الرنا اثنين جوهري في جميع أنسجة اختبار ولكنها أثرت خصوصا في أنسجة المخ (5، 9). نتائجنا باستخدام التحليل الغربي تتفق مع هذه الملاحظات السابقة. باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل المحددة التي ولدت لنا في الأرانب، وتبين لنا هنا أن البروتين NIPA1 الذاتية موجود في العديد من الأنسجة ولكن وفرة خاصة في الدماغ. ومن المثير للاهتمام، وشكل كبير في خلايا المخ ويبدو أن حوالي ضعف حجم الجزيئي وتوقع من تسلسل الأحماض الأمينية يمكن أن يوحي أنه قد يكون ديمر. العديد من مستقبلات غشاء، النقل، وبروتينات الغشاء لا يتجزأ تتطلب dimerization أو أعلى oligomerization لنشاطهم.
ردا على المغنيسيوم منخفض، كانت هناك زيادة 65٪ في البروتين NIPA1 في خلايا الكلى الماوس. وعلاوة على ذلك، كانت الزيادة أساسا في شكل 68 كيلو دالتون مع زيادات أصغر بكثير في الحجم 34 كيلو دالتون. نحن التكهن بأن النموذج النشط لنقل NIPA1 هو أكبر الأنواع بروتين dimerized. وأعرب عن بوفرة في الخلايا الظهارية المستزرعة في المغنيسيوم منخفضة مقترن النقل مرتفعة المغنيسيوم 2+. وبناء على ملاحظة أن النموذج في خلايا الدماغ الطبيعية هو في المقام الأول أكبر حجم 68 كيلو دالتون، ونحن التكهن أيضا أن نقل NIPA1 نشط بشكل جوهري في الأنسجة العصبية.
داخل الخلية، والمترجمة البروتين NIPA1 أساسا في المقصورة endosomal المبكرة والسطح المحيطي. كان هناك القليل جدا من البروتين الموجود في النواة، الشبكة الإندوبلازمية، جولجي، أو الإندوسومات المتأخرة وlysozomes. وتشير هذه الترجمة أن البروتين NIPA1 يلعب دورا في الغشاء السطحي. ودعما لهذه الفكرة هو إعادة توزيع NIPA1 ردا على المغنيسيوم. كان هناك تهريب واضح من على سطح الأرض والتجميع في الإندوسومات في الخلايا المستزرعة في المغنيسيوم عالية، في حين كانت هناك حركة ملحوظة من NIPA1 إلى المحيط مع المغنيسيوم منخفضة. تتفق مع التحليل الغربي، كانت هناك زيادة ملحوظة في إجمالي البروتين في الخلايا الظهارية التي تزرع في المغنيسيوم منخفضة وتجميع واضح من البروتين NIPA1 في الإندوسومات مبكرة إعطاء مظهر منقط. نستنتج أن المغنيسيوم عالية يؤدي إلى التعبير سطح تقلص من البروتين NIPA1 وعزله في حين الإندوسومات النتائج المغنيسيوم المنخفضة في زيادة endosomal أوائل البروتين NIPA1 وتعزيز استهداف لغشاء السطح. هذه التغييرات في حساب المرجح البروتين التعبير، في جزء منه، ليرتبط بها من تغيرات في النقل المغنيسيوم 2+.
وأخيرا، وتبين لنا أن NIPA1T38R وNIPA1G100R طفرات تؤدي إلى فقدان المغنيسيوم النقل 2+ في البويضات معربا عن NIPA1 تغييرها. الطفرات مغلطة G100R وT45R تؤدي إلى وظيفة الخسارة من ويوحي بأن G100 والمواقع T45 مهمة، إن لم يكن من الضروري، في تجهيز NIPA1 المغنيسيوم 2+ البروتين النقل. وعلاوة على ذلك، الغليسين يتم حفظها 106 والثريونين 45 بين القنوات NIPA1 ortholog يدعم فكرة أن الطفرة إمراضي بقوة. وفي الآونة الأخيرة، كانت هناك طفرة أخرى، A100T، وذكرت في عائلة عرض مع النمط الظاهري HSP (19). تبقى التغييرات في النقل يحدد لاحقا. لا توجد مواقع الإجماع مماثلة في سائر أعضاء الأسرة حول و، إما NIPA2 paralog أو NIPA3 ذات الصلة وNIPA4، بحيث البروتين للطي يختلف المحتمل بين هذه الناقلين. تبقى أهمية هذه الاختلافات في أداء الفيزيائية الحيوية للنقل حول و لفحصها. ومن المثير للاهتمام أيضا أن G106R يؤدي إلى استكمال الخسارة من وظيفة في حين T45R يتوسط بعض المغنيسيوم 2+ النقل. سيكون من المثير للاهتمام أن نرى ما اذا كان هناك اختلافات في الأعراض السريرية بين هاتين المجموعتين من المرضى HSP.
وتشير النتائج الحالية التي NIPA1 يشكل المغنيسيوم 2+ نقل. كيف يمكن ان يكون عيب المغنيسيوم 2+ نقل يؤدي إلى النمط الظاهري للHSP غير واضح. بالإضافة إلى انخفاض تدريجي التشنج أطرافهم، وبعض الموضوعات مع غير معقدة HSP لها الإلحاح البولي ومعتدل انخفاض اهتزازي الإحساس في أصابع القدم (9). على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن اضطرابات في عملية الأيض المغنيسيوم في هؤلاء الأفراد ولا له تأثير مكملات المغنيسيوم تم تقييمها. أيضا من الفائدة هو السبب المرتبطة NIPA1 HSP المرضى الحالي مع الأعراض في سن المراهقة أو الكبار سنواتهم بدلا من الرضاعة أو الطفولة (6). قد تشير إلى سيطرة المرتبطة بالعمر أو الزمانية لNIPA1 التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، لأن HSP هو مجموعة سريريا وغير متجانسة وراثيا من الاضطرابات العصبية، فمن المرجح أن العديد من العوامل وجينات أخرى يمكن أن تسهم في توليد الظواهر الاستيلاء وحظ في الطيف HSP (20). باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، والخضيرة وآخرون. (20) في الآونة الأخيرة أنه ضمور النخاع الشوكي في وقت مبكر وشديد يحدث في المرضى الذين يعانون NIPA1-HSP بسبب فقدان محور عصبي مما يشير إلى انحطاط تنازلي مساحات الحبل الشوكي التعصيب السفلية. ومن المثير للاهتمام، لم تحليل الدماغ لم تكشف عن أي تشوهات دائمة من شأنها أن تميز المرضى NIPA1 طفرة HSP من السيطرة على المجموعة. وبناء على ذلك، فإنه من الصعب التكهن على وظيفة NIPA1 في الدماغ والحبل الشوكي أو خلايا nonneural أخرى حيث وجدت.
نستنتج من الدراسات الحالية أن NIPA1 يشفر عادة المغنيسيوم 2+ نقل وفقدان للوظيفة NIPA1 (SPG6) بسبب mistrafficking من البروتين تحور يوفر الأساس لالنمط الظاهري HSP.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس