BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج ترناري الجمعية المتوسطة
وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS7، التي هي جزء لا يتجزأ من BBSome، يتفاعل مع مجمع BBS-chaperonin
(20). حقيقة أن جميع مكونات المجمع BBS-chaperonin هي بروتينات نوع chaperonin باستثناء BBS7 تشير إلى أن BBS7 قد تكون بمثابة ركيزة للمجمع BBS-chaperonin وأن يستقر من قبل المجمع. كيف يجعل BBS7 الانتقال من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع BBSome غير معروف حاليا. لمعالجة هذه المسألة، ونحن استخدام العديد من الطرق التي تؤدي إلى تراكم متميزة BBSome سيطة التجمع. وتتلخص الطفرات نقطة المستخدمة في هذه الدراسة في
تكميلية الشكل. S1. عندما كنا بإفراط BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة T211I في الخلايا 293T، متحولة BBS7 T211I لديه قدرة انخفضت إلى التفاعل مع مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع WT BBS7 على النحو الذي يحدده المشترك مناعي باستخدام FLAG الأجسام المضادة. ومع ذلك، مناعي من BBS7 T211I يسحب إلى أسفل أكثر نسبيا BBS2 من البروتينات الأخرى BBSome
(على سبيل المثال، BBS1 أو BBS4)
(الشكل 1 أ)، مشيرا إلى أن هناك تفاعل ثنائي بين BBS7 T211I وBBS2 التي المحاصرين (لا تشرع في الخطوة التالية في التجمع).
الشكل 1.
BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية BBSome. A، و transfected BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة (T211I) وWT BBS7 إلى خلايا 293T. وتم سحب كلا WT وBBS7 متحولة بنسبة الخرز FLAG. تم الكشف عن وجود غيرها من مفارز BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. B، غياب BBS2 يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS1، في حين أن فقدان BBS1 لا يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS2. C، الموسومة FLAG BBS5، BBS8 ، و transfected BBS9، وBBIP10 إلى خلايا 293T. تم immunoprecipitated البروتينات الموسومة (IP) من خلال حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز أخرى BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. D، كان يستخدم BBS9 رني لاسقاط الذاتية التعبير BBS9 في خط الخلية مستقرة التعبير عن FLAG-BBS2. وimmunoprecipitated وBBSome التي كتبها حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية.
لقد أوقفنا بجوار أسفل BBS2 لتحديد تأثير ذلك على BBSome التجمع. ضربة قاضية من BBS2 يقلل من جمعية BBS7 مع BBS1، في حين أن ضربة قاضية من BBS1 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2
(الشكل 1 B). هذا يدل على أن BBS2 وBBS7 قادرين على التواصل مع كل أخرى مستقلة من BBS1. ويتم الحصول على نتائج مماثلة تظهر التفاعل مستقر من BBS2 مع BBS7 مع الأنسجة من الفئران الطافرة التي تعبر عن شكل متحولة من BBS1 مع أرجينين لطفرة في الحمض الأميني ميثيونين 390
(Bbs1 M390) (الشكل 2 C). هذه النتيجة مزيد من يدعم فكرة أن BBS7 بربط BBS2 مستقل ملزمة لBBS1 والبروتينات BBSome أخرى. وانسجاما مع هذه النتيجة، BBS7 يتفاعل بقوة مع BBS2 وضعيفة مع BBS1 في المقايسات التفاعل البشرى
(التكميلي الشكل S2 A).
الشكل 2.
أدرج BBS1 في BBSome قبل BBS4. A، البقع الغربية من لست] البروتين من WT وBbs1 M390R / M390R الفئران تبين أن غياب BBS1 لا يؤثر على الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين، في حين أن انخفاض مستويات البروتين BBS1 إلى حد كبير في عينات من Bbs1 الفئران M390R / M390R كما هو مبين بالسهم. ويعترف هذا الضد أيضا عدة فرق إضافية لا تغيير في كثافة بالمقارنة بين WT وBbs1 M390R / M390R الفئران، مشيرا إلى أن هذه العصابات هي غير محددة. B، تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs1 M390R الخصيتين يوضح أن معظم BBS4 يتم فصلها عن وsubcomplex تتكون من BBS2، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9. C، مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2 من البروتين لست] الخصيتين يدل على أن BBS4 يتم فصلها من subcomplex في غياب BBS1. هذه النتائج مشابهة لتلك التي تظهر من خلال تحليل الانحدار السكروز. D، مناعي المتبادل من الخلايا 293T transfected يوضح أن BBS4 التفكك من BBS1 M390R يرجع إلى انخفاض التفاعل بين BBS1 M390R وBBS4 مقارنة مع WT BBS1. E، رسم بياني للترتيب تسلسلي لل BBS1 وBBS4 إدماجها في BBSome.
المقبل، ونحن overexpressed BBS9 الموسومة FLAG في الخلايا 293T وتستخدم BBS9 لهدم مفارز BBSome الذاتية. مناعي من خارجيا أعرب النتائج BBS9 في مناعي كميات كبيرة من BBS2 وBBS7، في حين يتم سحب كميات صغيرة فقط من BBS1 وBBS4 أسفل في ظل هذه الظروف
(الشكل 1 C). هذه النتيجة تشير إلى أن BBS9 يشكل مجمع الثلاثي مع BBS2 وBBS7. لمزيد من الدعم وجود مجمع الثلاثي BBS2-BBS7-BBS9، فإننا نهدم BBS9 التعبير باستخدام رني. ضربة قاضية من BBS9 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2، مشيرا إلى أن التفاعل BBS7 / BBS2 لا يتوقف على BBS9. ومع ذلك، ضربة قاضية لBBS9 يقلل إلى حد كبير من جمعية BBS1، BBS4، وBBS8 مع BBS2
(الشكل 1 D).
وانسجاما مع هذه النتيجة، تشير الدراسات إلى التفاعل البشرى أن BBS2 يتفاعل مباشرة مع BBS7 وBBS9، في حين BBS7 وBBS9 لا تتفاعل مباشرة، بل تتفاعل إلا في وجود من BBS2
(التكميلي الشكل S2 B). نشير إلى مجمع الثلاثي يتكون من BBS2-BBS7-BBS9 كما المجمع الأساسية BBSome لأن هذا المجمع يبدو أن العنصر المركزي اللازمة لتشكيل BBSome كاملة.
BBS1 وBBS4 هل الوحدات الصغرى الطرفية من BBSome
وأظهرت دراساتنا التفاعل البشرى أن BBS9 يتفاعل مباشرة مع عدة وحدات فرعية BBSome بما في ذلك BBS2، BBS1، BBS5، وBBS8، وإنشاء BBS9 كما سقالة المركزية للBBSome
(10). لتحديد الترابط الذي يتم إدراج مفارز BBSome أخرى في BBSome، ونحن استخدام الأنسجة من BBS فئرانا معدلة وراثيا ولدت في المختبر لدينا
(21، -، 24). أظهر النشاف الغربي من أنسجة الخصية (الذي يعبر عن كميات كبيرة من البروتينات BBS) أن الفئران
Bbs1 M390R / M390R انخفضت مستويات البروتين BBS1، ولكن الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين مماثلة لمستويات WT
(الشكل 2 A). ويكشف تحليل الانحدار السكروز أن BBS1 M390R طفرة الزميلة عادة مع جميع البروتينات BBSome، باستثناء BBS4
(الشكل 2 B). ونأت معظم BBS4 من BBSome في
Bbs1 M390R / M390R الأنسجة الماوس متحولة. لتأكيد هذه النتيجة، ونحن immunoprecipitated وBBSome الذاتية من
Bbs1 M390R / M390R فئرانا معدلة وراثيا باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2. كما هو متوقع، BBS1 مفقود من مجمع جنبا إلى جنب مع BBS4
(الشكل 2 C).
للتأكد من أن BBS1 M390R البروتين الطافر يؤثر BBS4 إدماجها في BBSome، شاركنا transfected. Myc على الموسومة BBS1 مع الموسومة FLAG مفارز BBSome إلى خلايا 293T. BBS1 M390R البروتين الطافر قد تقلص إلى حد كبير التفاعل مع BBS4
(الشكل 2 D)، ولكن التفاعلات الطبيعية مع BBS9 وBBS2. معا، وهذه البيانات تشير إلى أن يتم تضمينها BBS1 في BBSome قبل BBS4
(الشكل 2 E). باستخدام نهج مماثل، علينا أن نظهر أن فقدان BBS4 لا يؤثر على إدماج مفارز BBSome الأخرى (بما في ذلك BBS1) في BBSome
(الشكل 3، A
و B)، مشيرا إلى أن BBS4 هو الوحيدات الماضية لتضاف إلى BBSome
(الشكل 3 C).
الشكل 3.
ومن المرجح BBS4 الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome A، تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs4 - / - الخصيتين لست] يدل على أن جميع مفارز BBSome أخرى لا تزال تشكل تعقيدا في غياب BBS4 B، مناعي باستخدام المضادة. BBS2 الضد من البروتين لست] الخصيتين إلى أن BBS4 هو الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome. C، رسم بياني يبين ترتيب تسلسلي للBBS مكونات إدماجها في BBSome.
لتحديد ما إذا كان غياب البروتينات BBS أخرى يسمح جزئي BBSome التجمع، ونحن ترسيتها التعبير عن BBS5 وBBS8 باستخدام رني في الخلايا RPE1. بينت النتائج أن مفارز BBSome أخرى لا تزال تتضمن في BBSome في غياب BBS5، وكذلك في غياب BBS8
(25)، مشيرا إلى أن مثل BBS1، BBS5 وBBS8 تدرج بشكل مستقل في BBSome. وتتفق هذه النتائج مع البيانات التفاعل البشرى تبين أن BBS1، BBS5، BBS8، وBBS2 التفاعل مباشرة مع BBS9
(10).
BBS4 بربط PCM1 ويموضع لالجسيم المركزي / محيط بالمريكز الأقمار الصناعية المستقلة للBBSome الوحدات الصغرى أخرى
حقيقة أن BBS4 من بين مفارز الأخيرة لإدراجها في BBSome يضعه في موقف طيب للتفاعل مع البروتينات غير BBSome بما في ذلك الشحنات BBSome. وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBSome تنتقل من السيتوبلازم إلى محيط بالمريكز الأقمار الصناعية ثم إلى أهداب. BBS4 يموضع لالجسيم المركزي / الأقمار الصناعية محيط بالمريكز ويتفاعل مع محطة C من PCM1
(10، 26). أهمية وظيفية لهذا التفاعل ليست واضحة. لتحديد ما إذا كان يتعين على التفاعل BBS4-PCM1 لتوطين الجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز من BBS4، تم WT-الموسومة GFP وشكلين متحولة من BBS4 (BBS4 G277E وBBS4 R295P) بشكل مستقل شارك transfected مع جزء C-محطة HA الموسومة من PCM1. كل من الطفرات نقطتين تعطلت تفاعل BBS4 مع PCM1
(الشكل 4 A). عندما transfected في الخلايا RPE1 الإنسان، سواء BBS4 G277E وBBS4 R295P تفقد القدرة على توطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز
(الشكل 4 B). وتشير هذه البيانات إلى أن التفاعل BBS4 PCM1 مطلوب للBBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية.
الشكل (4).
مطلوب تدخل BBS4-PCM1 لBBSome لتوطين لالجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز. A، BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل التفاعل بين BBS4 ومحطة C من PCM1. BBS4 (WT أو المسوخ) وHA الموسومة PCM1 C محطة و transfected المشارك في الخلايا 293T، وأجريت شارك في مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد HA وGFP الموسومة GFP. B، BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل جسيم مركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية BBS4. أظهرت هو تلطيخ مناعي من GFP-BBS4 (WT والمسوخ) في الخلايا RPE1 transfected. γ-تويولين يستخدم (الأحمر) كعلامة centrosomal. C، و transfected الخلايا الأولية الكلى مع GFP-BBS4، وكانت الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل شارك في ملطخة γ تويولين. يمثل شريط 10 ميكرون.
لتحديد ما إذا كان يلزم BBSome سليمة لBBS4 لتوطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز، ونحن transfected خلايا الكلى مثقف من BBS خروج المغلوب الفئران مع GFP-BBS4. غياب BBS2، BBS6، أو BBS7 لا يؤثر BBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية
(الشكل 4 C)، مشيرا إلى أن هذا التعريب هو سمة أصيلة من BBS4 مجانا (يحدث مستقلة عن BBSome). لمزيد من تميز التفاعلات BBS4، رسمناها المجال BBS4 التي تتفاعل مع PCM1 إلى N-380 محطة الأحماض الأمينية
(التكميلي الشكل S3 A). الأحماض الأمينية N-المحطة 380 من BBS4 لا تحتوي على المجال الذي يربط مع BBIP10، وهو بروتين BBSome لا يتجزأ يربط المجمع من خلال BBS4
(27). وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن PCM1 يمكن أن تتفاعل مع BBIP10 فقط عندما BBS4 موجود
(التكميلي الشكل S3 B).
BBS10 ينظم تفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / TRIC البروتينات لتشكيل مجمع BBS-Chaperonin
كما ذكر سابقا، وأظهرت الدراسات أن BBS7 تشكيل مجمع مع BBS6، BBS12، وCCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin
(20). حقيقة أن BBS7 هو العنصر غير chaperonin الوحيد في مجمع BBS-chaperoinin تشير إلى أن BBS7 قد يكون الركيزة لBBS-chaperonin. وظيفة واحدة ممكنة من مجمع BBS-chaperonin هو استقرار BBS7. ويرتبط BBS10 مع هذا المجمع عند مستويات substoichiometric (أقل من نسبة 1: 1). وتشير هذه النتيجة إلى أن BBS10 ليس العنصر الهيكلي للمجمع BBS-chaperonin بل يلعب دورا في تنظيم تشكيل تعقيدا. للتحقيق في دور BBS10 في تشكيل معقد BBS-chaperonin، ونحن استخدام رني لاسقاط BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والتي هي بمثابة أداة ملائمة لمناعي للمجمع BBS-chaperonin. غياب BBS10 يقلل من تفاعل BBS6 مع TCPα وTCPβ، وهما CCT / البروتينات TRIC
(الشكل 5 A). وعلاوة على ذلك، overexpression من BBS10 يعزز التفاعل بين BBS6 مع TCPα وTCPβ
(الشكل 5 B). وتبين هذه النتائج أن BBS10 ينظم تشكيل مجمع BBS-chaperonin.
الشكل 5.
مطلوب BBS10 للتفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin. A، يستخدم BBS10 رني لاسقاط التعبير عن BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والذي تم استخدامه لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7 وCCT / البروتينات TRIC للكشف عن وجود هذه البروتينات في المجمع. B، overexpression من BBS10 يسهل جمعية BBS6 مع CCT / البروتينات TRIC. وقد شارك في transfected-FLAG-BBS10 مع ناقلات فارغة أو Myc على-BBS6، وكان يستخدم Myc على الأجسام المضادة لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7، TCPα، وTCPβ (وحدتين فرعيتين من البروتينات CCT / TRIC) للكشف عن هذه البروتينات في المجمع. IP، مناعي.
الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-Chaperonin يتم التنسيق مع BBSome كور تشكيل مجمع
لا يحتوي على شكل ناضج من BBSome BBS6، BBS12، أو CCT / البروتينات TRIC، مما يوحي يجب فصل هذه المكونات chaperonin من سيطة التجمع عند نقطة معينة. لتحديد متى يتم الافراج عن هذه المكونات من وسيطة التجمع، ونحن overexpressed FLAG الموسومة BBS6 في الخلايا 293T وimmunoprecipitated مع FLAG الأجسام المضادة. كما هو متوقع، مكونات معقدة BBS-chaperonin أخرى، فضلا عن BBS7 الذاتية وشارك immunoprecipitated جنبا إلى جنب مع BBS6
(الشكل 6 A). بالإضافة إلى ذلك، سحبت BBS6 أسفل بعض BBS2. ومع ذلك، فإن كمية BBS2 انزلوا كانت بالنسبة إلى BBS7 أقل من مبالغ BBS2 وجدت في BBSome (كما هو موضح من قبل إنزال BBSome مع BBS5). هذا يدل على أن التفاعل بين BBS2 مع BBS7 يقترن مع الافراج عن BBS6 وBBS12 من مجمع BBS-chaperonin
(التكميلي الشكل. S4).
الشكل 6.
ويتم تنسيق الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-chaperonin مع تشكيل معقد BBSome الأساسية. وقد overexpressed A، FLAG-BBS6 في الخلايا 239T إلى سيطة فخ BBSome. نحن انزلوا BBS6 باستخدام الخرز FLAG والكشف عن مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية. وقد استخدم FLAG-BBS5 كعنصر تحكم إيجابية، وكان يستخدم FLAG-GFP كما سلبي السيطرة. B، وoverexpressed مفارز BBSome الفردية في الخلايا 293T، وكانت تستخدم لتحديد جمعيات معينة مع CCT / البروتينات TRIC. BBS7 وBBS2 فقط قادرين على التواصل مع CCT البروتينات / TRIC. وقد استخدم FLAG-VHL كعنصر تحكم إيجابية. استخدمت FLAG-GFP وFLAG-BBS3 والضوابط السلبية. IP، مناعي.
التالي درسنا الافراج عن البروتينات CCT / TRIC من وسيطة التجمع. نحن overexpressed كل الوحيدات BBSome في الخلايا 293T وتحديد ما إذا كان أي الوحيدات BBSome يمكن immunoprecipitate أن التحويلات النقدية المشروطة / البروتينات TRIC. أظهر BBS2 وBBS7 المنسدلة قوية من CCT / البروتينات TRIC. أظهر BBS9 المنسدلة أقل نسبيا من البروتينات TRIC CCT / مقارنة مع BBS2 وBBS7
(الشكل 6 B). هذه النتيجة تشير إلى أن إدماج BBS9 لتشكيل يقترن مجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن BBS2 / BBS7 من CCT البروتينات / TRIC.
استقرار BBS2 يعتمد على تفاعله مع البروتينات الأخرى
لقد أثبتنا أن BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية
(الشكل 1). لتحديد أهمية هذا المجمع، درسنا مستوى البروتين من BBS2 في غياب BBS7 وBBS9، وكذلك في حالة عدم وجود مجمع BBS-chaperonin. غياب BBS7 يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين في أنسجة الخصيتين BBS2 من
Bbs7 - / - الفئران. وعلاوة على ذلك، فإن غياب BBS6 (أحد مكونات المجمع BBS-chaperonin) في
Bbs6 - / - نتائج الفئران أيضا إلى انخفاض كميات BBS2
(الشكل 7. A). لأننا لم يكن لديك
Bbs10 الفئران خروج المغلوب، نحن نستخدم الخلايا الليفية الجلد من مريض البشري الذي هو متماثل لطفرة BBS10 المشتركة، c91fs95. ومن المتوقع أن تؤدي هذه الطفرة في الغياب التام للبروتين BBS10. في دراستنا، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الإنسان، وغياب BBS10 لا يؤثر على تشكيل أهداب
(التكميلي الشكل S5)، على النقيض من التقرير السابق
(28). ومع ذلك، فإن غياب BBS10 يخفض مستويات بروتين BBS2
(الشكل 7 أ) ويمنع تشكيل BBSome
(التكميلي الشكل. S6).
الشكل 7.
وubiquitinated BBS2 والمتدهورة التي proteasome و. A، استقرار BBS2 يعتمد على مجمع الأساسية BBSome، فضلا عن مجمع BBS-chaperonin. البروتينات من BBS خروج المغلوب الأنسجة الماوس (الخصية) أو من تم فصل لست] الخلية SDS-PAGE رني المعالجة. كان يستخدم لمكافحة BBS2 الأجسام المضادة للكشف عن مستويات البروتين BBS2. B، BBS2 حساس لالبروتيني العلاج. أصيب الكلى مع اتش معربا عن FLAG-BBS2 - الخلايا الأولية من WT وBbs6 - /. كانت مختلطة كميات متساوية من البروتين الكلي مع البروتيني thermolysin في 4 درجات مئوية للمرة المشار إليه. مقارنة مع خلايا WT، BBS2 يحط أسرع في Bbs6 - / - الخلايا، مما يشير إلى أن BBS2 غير مستقر في ظل غياب BBS6 C، خلايا 293T وعولج FLAG-BBS2 الخلايا معربا عن مستقرة، مع MG132 proteasome والمانع. وimmunoprecipitated BBS2 (IP) من خلال حبات FLAG أو مكافحة BBS2 الأجسام المضادة، وتم الكشف عن BBS2 ubiquitinated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. D، HA-بتحول وكان transfected في الخلايا 293T، وimmunoprecipitated BBS2 الذاتية من قبل مكافحة BBS2 الأجسام المضادة. تم الكشف عن BBS2 Ubiquitinated من قبل مكافحة HA الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. E، تم علاج الخلايا 293T مع 50 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد (فروج) مع أو بدون 20 μ م proteasome والمانع MG132 أو MG115 لمدة 8 ساعات. تم الكشف عن BBS2 الذاتية في الخلية لست] بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS2.
وبعد ذلك، كنا رني في الخلايا RPE1 للحد بشكل فردي التعبير عن BBS9 (BBSome عنصر معقد الأساسية)، BBS12 وTCPβ (مكونات معقدة BBS-chaperonin). تخفيض كل من هذه البروتينات يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين BBS2. في المقابل، فإن عدم وجود البروتينات BBSome العادي BBS4 أو BBS1 (باستخدام أنسجة من
Bbs4 - / -
وBbs1 M390R فئرانا معدلة وراثيا، على التوالي) لا تؤثر على مستويات البروتين BBS2
(الشكل 7. A). وتشير هذه البيانات إلى أن استقرار BBS2، وهو مكون من مجمع الأساسية BBSome، يتطلب مجمع BBS-chaperonin، فضلا عن العنصرين الآخرين من مجمع الأساسية BBSome (BBS7 وBBS9). وبالمثل، فإن استقرار BBS7 يتطلب مجمع BBS-chaperonin، وكذلك المكونات الأخرى اثنين من مجمع الأساسية BBSome (BBS2 وBBS9)
(التكميلي الشكل S7).
لتحديد كيفية BBS-chaperonin الاستقرار التأثيرات المعقدة البروتين BBS2، ونحن المصابة
Bbs6 - / - خلايا الكلى وخلايا الكلى WT مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. تم استخدام نفس تعدد العدوى لتصيب WT
وBbs6 - / - خلايا الكلى، وكميات متساوية من البروتينات استخدمت في التحليل. مستوى البروتين BBS2 أقل في
Bbs6 - / - الخلايا من الخلايا في WT
(الشكل 7. B، 0 ')، بما يتفق مع الاستنتاج أن المجمع BBS-chaperonin مطلوب للBBS2 الاستقرار البروتين. البروتين BBS2 المتبقية في
Bbs6 - / - الخلايا أكثر حساسية لالبروتيني thermolysin العلاج. عمر النصف من BBS2 في
Bbs6 - / - الخلايا يتم تقليل ~3 أضعاف (4 دقيقة في خلايا WT
مقابل 12 دقيقة في
Bbs6 - / - الخلايا)
(الشكل 7. B). ويتم الحصول على نتائج مشابهة عندما وإعادة تقديم FLAG-BBS2 إلى
Bbs7 - / - خلايا الكلى
(التكميلي الشكل S7.). وتشير هذه البيانات إلى أن مجمع BBS-chaperonin وBBS7 تلعب دورا في استقرار BBS2.
واليوبيكويتين-proteasome والمسار تشارك في BBS2 تدهور
للتحقيق في الآلية التي تتحلل BBS2 في الخلايا، درسنا ما إذا كان ينطوي على مسار بتحول-proteasome وفي هذه العملية. وubiquitinated كلا BBS2 أعرب خارجيا وأعرب عن التطور الطبيعي عند تحول دون proteasome والتي MG132
(الشكل 7 C). علينا أن نبرهن أيضا أن BBS2 الذاتية وubiquitinated حتى من دون تثبيط proteasome وعندما كنا overexpressed HA-بتحول في الخلايا 293T
(الشكل 7 D). أسفرت علاج الخلايا 293T مع تخليق البروتين المانع سيكلوهيكسيميد في انخفاض مستويات البروتين BBS2. وزاد انخفاض مستويات البروتين BBS2 في الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد عندما يتم التعامل مع الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد أيضا مع مثبطات proteasome وMG132 أو MG115
(الشكل 7 E). وتبين هذه النتائج أن BBS2 الحرة وubiquitinated وتدهورت قبل proteasome و.
BBSome الجمعية نموذج
واستنادا إلى البيانات الواردة أعلاه، نقترح نموذجا فيه أشكال BBSome في عملية متسلسلة أمر يساعده على حد سواء الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات BBSome، فضلا عن عدم BBSome-تشبه chaperonin البروتينات BBS (BBS6، BBS10 وBBS12)
(الشكل 8). يتفاعل مجمع BBS-chaperonin مع BBS7 لتحقيق الاستقرار فيه. التحولات BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع الأساسية BBSome، وهو مجمع يتألف من BBS7-BBS2-BBS9. ويرافق تشكيل مجمع الأساسية BBSome عن طريق إزالة مجمع BBS-chaperonin. الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين تعزيز إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يضاف BBS4 لاستكمال BBSome، وهي خطوة تتطلب وجود BBS1. مطلوب مجمع BBS-chaperonin لاستقرار الفرد من BBS2 وBBS7 البروتينات قبل هذه البروتينات المشاركة مع BBS9 لتشكيل مجمع الأساسية BBSome.
الشكل 8.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وchaperonin بوساطة التجمع متتابعة من BBSome. المعروضة هي المخططات من النموذج الحالي من أجل BBSome التجمع. واستقرت BBS7 من قبل BBS-chaperonin معقدة (BBS6-BBS12-BBS7-CCT) ويجعل الانتقال إلى مجمع الأساسية BBSome (BBS7-BBS2-BBS9). يتطلب هذا التحول BBS10. والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين توجه إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يتطلب BBS4 BBS1 على أن تدرج في المجمع وغير الوحيدات مشاركة تضاف إلى المجمع.