عرض مشاركة واحدة
  #15  
قديم 11-23-2015, 09:14 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بوساطة التفاعل جوهري البروتين البروتين وChaperonin بمساعدة الجمعية متسلسل من مستقر بارديه-بيدل متلازمة مجمع البروتين، وBBSome *

 

http://www.jbc.org/content/287/24/20625.full



الميزات عديد المظاهر من السمنة، وتنكس الشبكية، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الإدراك، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري وجدت في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) تجعل هذا الاضطراب اضطراب نموذجا هاما لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في الأمراض الإنسانية المشتركة. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 16 جينات BBS، سبعة منها (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) رمز للبروتينات التي تشكل مجمع المعروفة باسم BBSome. وظيفة BBSome ينطوي على نشوء حيوي الغشاء الهدبي. ثلاثة جينات BBS إضافية (BBS6، BBS10، وBBS12) لديها تناظر لكتابة II chaperonins والتفاعل مع CCT / البروتينات TRIC وBBS7 لتشكيل مجمع يطلق عليه مجمع BBS-chaperonin. مطلوب هذا المجمع لBBSome التجمع. ولا يعرف الكثير عن هذه العملية وتنظيم تشكيل BBSome. استخدمنا الطفرات نقطة والأليلات فارغة من البروتينات BBS لتعطيل تجميع BBSome مما يؤدي إلى تراكم BBSome سيطة التجمع. التي تميز BBSome سيطة التجمع، وتبين لنا أن المجمع BBS-chaperonin يلعب دورا في الاستقرار BBS7. يتفاعل مع BBS7 BBS2 ويصبح جزءا من التجمع BBS7-BBS2-BBS9 المتوسطة ويشار إلى أن مجمع الأساسية BBSome لأنها تشكل جوهر BBSome. وأضاف BBS1، BBS5، BBS8، وأخيرا BBS4 حتى النخاع BBSome لتشكيل BBSome كاملة.
مقدمة

المجمعات الجزيئات، بما في ذلك الريبوسوم، و26 S proteasome و، مجمع المسام النووي، ومجمعات النقل intraflagellar، هي المسؤولة عن وظائف أساسية، مما أدى إلى اهتمام واسع في توصيف والعملية التي يتم تجميعها (1، 6 ). تنص على تجميع البروتين المعقد والمهم، إذا تقدير كما ينبغي وفي الوسائل التي يمكن أن خلايا تنظيم وظيفة. وعلاوة على ذلك، يمكن فهم أفضل التجمع بروتين معقد توفير نظرة ثاقبة الأمراض غير المتجانسة وراثيا وmultigenic ويحتمل أن توفر وسيلة جديدة للتعديل الدوائي من وظيفة، مما يؤدي إلى تصاميم دواء جديد.
الميزات عديد المظاهر من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) 4 بما في ذلك السمنة، تنكس الشبكية، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الإدراك، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري جعل BBS باعتبارها نموذجا جذابا لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في الأمراض المشتركة (7، 8). حتى الآن، وقد تم تحديد 16 جينات BBS المسببة لل(9). سبعة من البروتينات BBS (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) وقد ثبت أن تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome (10). وظيفة BBSome ينطوي على نشوء حيوي الغشاء الهدبي من خلال Rab8 GTPase الصغيرة والبروتين التفاعل لها، Rabin8. وBBSome أيضا يتفاعل وراثيا مع مسار النقل intraflagellar لتنظيم نقل الإشارة الصوتية القنفذ (11). BBSome مفارز تحتوي على مجالات معروفة للتوسط تفاعلات البروتين البروتين. على وجه التحديد، BBS1، BBS2، BBS7، وBBS9 احتواء المجالات المروحة بيتا. BBS4 وBBS8 يحتوي على عدة tetratricopeptide تكرار المجالات. وBBS5 يحتوي على اثنين من المجالات تناظر pleckstrin. BBS3 / ARL6 (ADP-ribosylation مثل عامل 6) هو عضو في الفصيلة رأس من البروتينات ملزم GTP صغيرة ومطلوب من أجل توطين الهدبية من BBSome (12، 15). BBS6، BBS10، وBBS12 دينا نوع II تناظر chaperonin (16، 19). وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS6، BBS12، وBBS7 التفاعل مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل المجمع الذي سنشير فيما بعد باسم مجمع BBS-chaperonin. مجمع BBS-chaperonin يسهل BBSome التجمع (20). ولا يعرف سوى القليل عن عملية متسلسلة من تشكيل BBSome، وتنظيم هذه العملية، أو الانتقال من BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى BBSome. في الجسم الحي، وتوجد البروتينات BBSome بوفرة في مجمع BBSome بدلا من كونها في شكل فردي أو ضمن المجمعات الحرة أصغر (10)، مما يوحي بأن BBSome سيطة التجمع عابرة وقصيرة الأجل.
فهم عملية BBSome التجمع قد تساعد في تحديد المكونات الجزيئية الجديدة، والطفرات التي تسبب إما أو تعديل الظواهر BBS. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فهم عملية تشكيل BBSome قد توفر معلومات عن وظيفة فرعية فردية، وبالتالي توفير رؤى جديدة بشأن BBSome وظيفة. وعلاوة على ذلك، فإن توصيف BBSome التجمع توفر المقايسات خلية مقرها فعالة لتقييم الطفرات نقطة المحددة في المرضى. وأخيرا، فإن فهم عملية BBSome التجمع قد يؤدي إلى علاجات جديدة للالظواهر ذات الصلة BBS BBS و.
كنا مناهج متعددة لتحديد BBSome سيطة التجمع بما في ذلك إدخال طفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS إلى الفردية البروتينات BBS، والاستفادة من الفئران خروج المغلوب، واستخدام رني ضد الجينات BBS لعرقلة تشكيل BBSome. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن overexpressed مفارز BBSome المحددة التي أسفرت عن تجميع وتراكم سيطة BBSome متميزة. التي تميز هذه الوسيطة، علينا أن نبرهن على BBSome التجمع هو عملية أمر ينطوي على البروتينات مثل chaperonin BBS (BBS6، BBS10، وBBS12) والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين.

إجراءات تجريبية

للحصول على وصف مفصل لمواد وأساليب، انظر "المواد والأساليب". التكميلية
السكروز التدرج تجزئة

تعطلت الأنسجة التي كتبها TISSUEMISER (فيشر) في المخزن تحلل (1- PBS، 0.5٪ تريتون X-100 مع مثبطات الأنزيم البروتيني). تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 20 دقيقة. تم تحميل supernatants على التدرج السكروز 20-60٪. تم طرد التدرج في 100،000 × ز لمدة 14 ساعة باستخدام الدوار TH-660 الحرارية العلمية (أشفيل، NC). أخذت اثنين من كسور مائة ميكروليتر من أعلى وعجلت عن طريق الأسيتون البارد. وقد نسج عينات المترسبة في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة. حلت الكريات في SDS-PAGE عينة العازلة.

البروتيني حساسية الفحص

وهي lysed الخلايا العازلة في الفحص (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 م م بوكل، 10 م م CaCl 2، 10٪ الجلسرين). كمية متساوية من البروتينات كانت مختلطة مع 200 ميكروغرام / مل thermolysin في 4 درجة مئوية لمدة الأوقات المحددة، وردود الفعل أوقفهم إضافة EDTA لتحقيق تركيز النهائي من 10 م م.

النتائج

BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج ترناري الجمعية المتوسطة

وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS7، التي هي جزء لا يتجزأ من BBSome، يتفاعل مع مجمع BBS-chaperonin (20). حقيقة أن جميع مكونات المجمع BBS-chaperonin هي بروتينات نوع chaperonin باستثناء BBS7 تشير إلى أن BBS7 قد تكون بمثابة ركيزة للمجمع BBS-chaperonin وأن يستقر من قبل المجمع. كيف يجعل BBS7 الانتقال من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع BBSome غير معروف حاليا. لمعالجة هذه المسألة، ونحن استخدام العديد من الطرق التي تؤدي إلى تراكم متميزة BBSome سيطة التجمع. وتتلخص الطفرات نقطة المستخدمة في هذه الدراسة في تكميلية الشكل. S1. عندما كنا بإفراط BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة T211I في الخلايا 293T، متحولة BBS7 T211I لديه قدرة انخفضت إلى التفاعل مع مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع WT BBS7 على النحو الذي يحدده المشترك مناعي باستخدام FLAG الأجسام المضادة. ومع ذلك، مناعي من BBS7 T211I يسحب إلى أسفل أكثر نسبيا BBS2 من البروتينات الأخرى BBSome (على سبيل المثال، BBS1 أو BBS4) (الشكل 1 أ)، مشيرا إلى أن هناك تفاعل ثنائي بين BBS7 T211I وBBS2 التي المحاصرين (لا تشرع في الخطوة التالية في التجمع).

الشكل 1.
BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية BBSome. و transfected BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة (T211I) وWT BBS7 إلى خلايا 293T. وتم سحب كلا WT وBBS7 متحولة بنسبة الخرز FLAG. تم الكشف عن وجود غيرها من مفارز BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. غياب BBS2 يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS1، في حين أن فقدان BBS1 لا يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS2. الموسومة FLAG BBS5، BBS8 ، و transfected BBS9، وBBIP10 إلى خلايا 293T. تم immunoprecipitated البروتينات الموسومة (IP) من خلال حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز أخرى BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. كان يستخدم BBS9 رني لاسقاط الذاتية التعبير BBS9 في خط الخلية مستقرة التعبير عن FLAG-BBS2. وimmunoprecipitated وBBSome التي كتبها حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية.

لقد أوقفنا بجوار أسفل BBS2 لتحديد تأثير ذلك على BBSome التجمع. ضربة قاضية من BBS2 يقلل من جمعية BBS7 مع BBS1، في حين أن ضربة قاضية من BBS1 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2 (الشكل 1 B). هذا يدل على أن BBS2 وBBS7 قادرين على التواصل مع كل أخرى مستقلة من BBS1. ويتم الحصول على نتائج مماثلة تظهر التفاعل مستقر من BBS2 مع BBS7 مع الأنسجة من الفئران الطافرة التي تعبر عن شكل متحولة من BBS1 مع أرجينين لطفرة في الحمض الأميني ميثيونين 390 (Bbs1 M390) (الشكل 2 C). هذه النتيجة مزيد من يدعم فكرة أن BBS7 بربط BBS2 مستقل ملزمة لBBS1 والبروتينات BBSome أخرى. وانسجاما مع هذه النتيجة، BBS7 يتفاعل بقوة مع BBS2 وضعيفة مع BBS1 في المقايسات التفاعل البشرى (التكميلي الشكل S2 A).

الشكل 2.
أدرج BBS1 في BBSome قبل BBS4. البقع الغربية من لست] البروتين من WT وBbs1 M390R / M390R الفئران تبين أن غياب BBS1 لا يؤثر على الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين، في حين أن انخفاض مستويات البروتين BBS1 إلى حد كبير في عينات من Bbs1 الفئران M390R / M390R كما هو مبين بالسهم. ويعترف هذا الضد أيضا عدة فرق إضافية لا تغيير في كثافة بالمقارنة بين WT وBbs1 M390R / M390R الفئران، مشيرا إلى أن هذه العصابات هي غير محددة. تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs1 M390R الخصيتين يوضح أن معظم BBS4 يتم فصلها عن وsubcomplex تتكون من BBS2، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9. مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2 من البروتين لست] الخصيتين يدل على أن BBS4 يتم فصلها من subcomplex في غياب BBS1. هذه النتائج مشابهة لتلك التي تظهر من خلال تحليل الانحدار السكروز. مناعي المتبادل من الخلايا 293T transfected يوضح أن BBS4 التفكك من BBS1 M390R يرجع إلى انخفاض التفاعل بين BBS1 M390R وBBS4 مقارنة مع WT BBS1. رسم بياني للترتيب تسلسلي لل BBS1 وBBS4 إدماجها في BBSome.

المقبل، ونحن overexpressed BBS9 الموسومة FLAG في الخلايا 293T وتستخدم BBS9 لهدم مفارز BBSome الذاتية. مناعي من خارجيا أعرب النتائج BBS9 في مناعي كميات كبيرة من BBS2 وBBS7، في حين يتم سحب كميات صغيرة فقط من BBS1 وBBS4 أسفل في ظل هذه الظروف (الشكل 1 C). هذه النتيجة تشير إلى أن BBS9 يشكل مجمع الثلاثي مع BBS2 وBBS7. لمزيد من الدعم وجود مجمع الثلاثي BBS2-BBS7-BBS9، فإننا نهدم BBS9 التعبير باستخدام رني. ضربة قاضية من BBS9 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2، مشيرا إلى أن التفاعل BBS7 / BBS2 لا يتوقف على BBS9. ومع ذلك، ضربة قاضية لBBS9 يقلل إلى حد كبير من جمعية BBS1، BBS4، وBBS8 مع BBS2 (الشكل 1 D).
وانسجاما مع هذه النتيجة، تشير الدراسات إلى التفاعل البشرى أن BBS2 يتفاعل مباشرة مع BBS7 وBBS9، في حين BBS7 وBBS9 لا تتفاعل مباشرة، بل تتفاعل إلا في وجود من BBS2 (التكميلي الشكل S2 B). نشير إلى مجمع الثلاثي يتكون من BBS2-BBS7-BBS9 كما المجمع الأساسية BBSome لأن هذا المجمع يبدو أن العنصر المركزي اللازمة لتشكيل BBSome كاملة.

BBS1 وBBS4 هل الوحدات الصغرى الطرفية من BBSome

وأظهرت دراساتنا التفاعل البشرى أن BBS9 يتفاعل مباشرة مع عدة وحدات فرعية BBSome بما في ذلك BBS2، BBS1، BBS5، وBBS8، وإنشاء BBS9 كما سقالة المركزية للBBSome (10). لتحديد الترابط الذي يتم إدراج مفارز BBSome أخرى في BBSome، ونحن استخدام الأنسجة من BBS فئرانا معدلة وراثيا ولدت في المختبر لدينا (21، 24). أظهر النشاف الغربي من أنسجة الخصية (الذي يعبر عن كميات كبيرة من البروتينات BBS) أن الفئران Bbs1 M390R / M390R انخفضت مستويات البروتين BBS1، ولكن الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين مماثلة لمستويات WT (الشكل 2 A). ويكشف تحليل الانحدار السكروز أن BBS1 M390R طفرة الزميلة عادة مع جميع البروتينات BBSome، باستثناء BBS4 (الشكل 2 B). ونأت معظم BBS4 من BBSome في Bbs1 M390R / M390R الأنسجة الماوس متحولة. لتأكيد هذه النتيجة، ونحن immunoprecipitated وBBSome الذاتية من Bbs1 M390R / M390R فئرانا معدلة وراثيا باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2. كما هو متوقع، BBS1 مفقود من مجمع جنبا إلى جنب مع BBS4 (الشكل 2 C).
للتأكد من أن BBS1 M390R البروتين الطافر يؤثر BBS4 إدماجها في BBSome، شاركنا transfected. Myc على الموسومة BBS1 مع الموسومة FLAG مفارز BBSome إلى خلايا 293T. BBS1 M390R البروتين الطافر قد تقلص إلى حد كبير التفاعل مع BBS4 (الشكل 2 D)، ولكن التفاعلات الطبيعية مع BBS9 وBBS2. معا، وهذه البيانات تشير إلى أن يتم تضمينها BBS1 في BBSome قبل BBS4 (الشكل 2 E). باستخدام نهج مماثل، علينا أن نظهر أن فقدان BBS4 لا يؤثر على إدماج مفارز BBSome الأخرى (بما في ذلك BBS1) في BBSome (الشكل A و B)، مشيرا إلى أن BBS4 هو الوحيدات الماضية لتضاف إلى BBSome (الشكل 3 C).

الشكل 3.
ومن المرجح BBS4 الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs4 - / - الخصيتين لست] يدل على أن جميع مفارز BBSome أخرى لا تزال تشكل تعقيدا في غياب BBS4 مناعي باستخدام المضادة. BBS2 الضد من البروتين لست] الخصيتين إلى أن BBS4 هو الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome. رسم بياني يبين ترتيب تسلسلي للBBS مكونات إدماجها في BBSome.

لتحديد ما إذا كان غياب البروتينات BBS أخرى يسمح جزئي BBSome التجمع، ونحن ترسيتها التعبير عن BBS5 وBBS8 باستخدام رني في الخلايا RPE1. بينت النتائج أن مفارز BBSome أخرى لا تزال تتضمن في BBSome في غياب BBS5، وكذلك في غياب BBS8 (25)، مشيرا إلى أن مثل BBS1، BBS5 وBBS8 تدرج بشكل مستقل في BBSome. وتتفق هذه النتائج مع البيانات التفاعل البشرى تبين أن BBS1، BBS5، BBS8، وBBS2 التفاعل مباشرة مع BBS9 (10).

BBS4 بربط PCM1 ويموضع لالجسيم المركزي / محيط بالمريكز الأقمار الصناعية المستقلة للBBSome الوحدات الصغرى أخرى

حقيقة أن BBS4 من بين مفارز الأخيرة لإدراجها في BBSome يضعه في موقف طيب للتفاعل مع البروتينات غير BBSome بما في ذلك الشحنات BBSome. وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBSome تنتقل من السيتوبلازم إلى محيط بالمريكز الأقمار الصناعية ثم إلى أهداب. BBS4 يموضع لالجسيم المركزي / الأقمار الصناعية محيط بالمريكز ويتفاعل مع محطة C من PCM1 (10، 26). أهمية وظيفية لهذا التفاعل ليست واضحة. لتحديد ما إذا كان يتعين على التفاعل BBS4-PCM1 لتوطين الجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز من BBS4، تم WT-الموسومة GFP وشكلين متحولة من BBS4 (BBS4 G277E وBBS4 R295P) بشكل مستقل شارك transfected مع جزء C-محطة HA الموسومة من PCM1. كل من الطفرات نقطتين تعطلت تفاعل BBS4 مع PCM1 (الشكل 4 A). عندما transfected في الخلايا RPE1 الإنسان، سواء BBS4 G277E وBBS4 R295P تفقد القدرة على توطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز (الشكل 4 B). وتشير هذه البيانات إلى أن التفاعل BBS4 PCM1 مطلوب للBBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية.

الشكل (4).
مطلوب تدخل BBS4-PCM1 لBBSome لتوطين لالجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز. BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل التفاعل بين BBS4 ومحطة C من PCM1. BBS4 (WT أو المسوخ) وHA الموسومة PCM1 C محطة و transfected المشارك في الخلايا 293T، وأجريت شارك في مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد HA وGFP الموسومة GFP. BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل جسيم مركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية BBS4. أظهرت هو تلطيخ مناعي من GFP-BBS4 (WT والمسوخ) في الخلايا RPE1 transfected. γ-تويولين يستخدم (الأحمر) كعلامة centrosomal. و transfected الخلايا الأولية الكلى مع GFP-BBS4، وكانت الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل شارك في ملطخة γ تويولين. يمثل شريط 10 ميكرون.

لتحديد ما إذا كان يلزم BBSome سليمة لBBS4 لتوطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز، ونحن transfected خلايا الكلى مثقف من BBS خروج المغلوب الفئران مع GFP-BBS4. غياب BBS2، BBS6، أو BBS7 لا يؤثر BBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية (الشكل 4 C)، مشيرا إلى أن هذا التعريب هو سمة أصيلة من BBS4 مجانا (يحدث مستقلة عن BBSome). لمزيد من تميز التفاعلات BBS4، رسمناها المجال BBS4 التي تتفاعل مع PCM1 إلى N-380 محطة الأحماض الأمينية (التكميلي الشكل S3 A). الأحماض الأمينية N-المحطة 380 من BBS4 لا تحتوي على المجال الذي يربط مع BBIP10، وهو بروتين BBSome لا يتجزأ يربط المجمع من خلال BBS4 (27). وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن PCM1 يمكن أن تتفاعل مع BBIP10 فقط عندما BBS4 موجود (التكميلي الشكل S3 B).

BBS10 ينظم تفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / TRIC البروتينات لتشكيل مجمع BBS-Chaperonin

كما ذكر سابقا، وأظهرت الدراسات أن BBS7 تشكيل مجمع مع BBS6، BBS12، وCCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin (20). حقيقة أن BBS7 هو العنصر غير chaperonin الوحيد في مجمع BBS-chaperoinin تشير إلى أن BBS7 قد يكون الركيزة لBBS-chaperonin. وظيفة واحدة ممكنة من مجمع BBS-chaperonin هو استقرار BBS7. ويرتبط BBS10 مع هذا المجمع عند مستويات substoichiometric (أقل من نسبة 1: 1). وتشير هذه النتيجة إلى أن BBS10 ليس العنصر الهيكلي للمجمع BBS-chaperonin بل يلعب دورا في تنظيم تشكيل تعقيدا. للتحقيق في دور BBS10 في تشكيل معقد BBS-chaperonin، ونحن استخدام رني لاسقاط BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والتي هي بمثابة أداة ملائمة لمناعي للمجمع BBS-chaperonin. غياب BBS10 يقلل من تفاعل BBS6 مع TCPα وTCPβ، وهما CCT / البروتينات TRIC (الشكل 5 A). وعلاوة على ذلك، overexpression من BBS10 يعزز التفاعل بين BBS6 مع TCPα وTCPβ (الشكل 5 B). وتبين هذه النتائج أن BBS10 ينظم تشكيل مجمع BBS-chaperonin.

الشكل 5.
مطلوب BBS10 للتفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin. يستخدم BBS10 رني لاسقاط التعبير عن BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والذي تم استخدامه لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7 وCCT / البروتينات TRIC للكشف عن وجود هذه البروتينات في المجمع. overexpression من BBS10 يسهل جمعية BBS6 مع CCT / البروتينات TRIC. وقد شارك في transfected-FLAG-BBS10 مع ناقلات فارغة أو Myc على-BBS6، وكان يستخدم Myc على الأجسام المضادة لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7، TCPα، وTCPβ (وحدتين فرعيتين من البروتينات CCT / TRIC) للكشف عن هذه البروتينات في المجمع. IP، مناعي.

الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-Chaperonin يتم التنسيق مع BBSome كور تشكيل مجمع

لا يحتوي على شكل ناضج من BBSome BBS6، BBS12، أو CCT / البروتينات TRIC، مما يوحي يجب فصل هذه المكونات chaperonin من سيطة التجمع عند نقطة معينة. لتحديد متى يتم الافراج عن هذه المكونات من وسيطة التجمع، ونحن overexpressed FLAG الموسومة BBS6 في الخلايا 293T وimmunoprecipitated مع FLAG الأجسام المضادة. كما هو متوقع، مكونات معقدة BBS-chaperonin أخرى، فضلا عن BBS7 الذاتية وشارك immunoprecipitated جنبا إلى جنب مع BBS6 (الشكل 6 A). بالإضافة إلى ذلك، سحبت BBS6 أسفل بعض BBS2. ومع ذلك، فإن كمية BBS2 انزلوا كانت بالنسبة إلى BBS7 أقل من مبالغ BBS2 وجدت في BBSome (كما هو موضح من قبل إنزال BBSome مع BBS5). هذا يدل على أن التفاعل بين BBS2 مع BBS7 يقترن مع الافراج عن BBS6 وBBS12 من مجمع BBS-chaperonin (التكميلي الشكل. S4).

الشكل 6.
ويتم تنسيق الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-chaperonin مع تشكيل معقد BBSome الأساسية. وقد overexpressed FLAG-BBS6 في الخلايا 239T إلى سيطة فخ BBSome. نحن انزلوا BBS6 باستخدام الخرز FLAG والكشف عن مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية. وقد استخدم FLAG-BBS5 كعنصر تحكم إيجابية، وكان يستخدم FLAG-GFP كما سلبي السيطرة. وoverexpressed مفارز BBSome الفردية في الخلايا 293T، وكانت تستخدم لتحديد جمعيات معينة مع CCT / البروتينات TRIC. BBS7 وBBS2 فقط قادرين على التواصل مع CCT البروتينات / TRIC. وقد استخدم FLAG-VHL كعنصر تحكم إيجابية. استخدمت FLAG-GFP وFLAG-BBS3 والضوابط السلبية. IP، مناعي.

التالي درسنا الافراج عن البروتينات CCT / TRIC من وسيطة التجمع. نحن overexpressed كل الوحيدات BBSome في الخلايا 293T وتحديد ما إذا كان أي الوحيدات BBSome يمكن immunoprecipitate أن التحويلات النقدية المشروطة / البروتينات TRIC. أظهر BBS2 وBBS7 المنسدلة قوية من CCT / البروتينات TRIC. أظهر BBS9 المنسدلة أقل نسبيا من البروتينات TRIC CCT / مقارنة مع BBS2 وBBS7 (الشكل 6 B). هذه النتيجة تشير إلى أن إدماج BBS9 لتشكيل يقترن مجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن BBS2 / BBS7 من CCT البروتينات / TRIC.

استقرار BBS2 يعتمد على تفاعله مع البروتينات الأخرى

لقد أثبتنا أن BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية (الشكل 1). لتحديد أهمية هذا المجمع، درسنا مستوى البروتين من BBS2 في غياب BBS7 وBBS9، وكذلك في حالة عدم وجود مجمع BBS-chaperonin. غياب BBS7 يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين في أنسجة الخصيتين BBS2 من Bbs7 - / - الفئران. وعلاوة على ذلك، فإن غياب BBS6 (أحد مكونات المجمع BBS-chaperonin) في Bbs6 - / - نتائج الفئران أيضا إلى انخفاض كميات BBS2 (الشكل 7. A). لأننا لم يكن لديك Bbs10 الفئران خروج المغلوب، نحن نستخدم الخلايا الليفية الجلد من مريض البشري الذي هو متماثل لطفرة BBS10 المشتركة، c91fs95. ومن المتوقع أن تؤدي هذه الطفرة في الغياب التام للبروتين BBS10. في دراستنا، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الإنسان، وغياب BBS10 لا يؤثر على تشكيل أهداب (التكميلي الشكل S5)، على النقيض من التقرير السابق (28). ومع ذلك، فإن غياب BBS10 يخفض مستويات بروتين BBS2 (الشكل 7 أ) ويمنع تشكيل BBSome (التكميلي الشكل. S6).

الشكل 7.
وubiquitinated BBS2 والمتدهورة التي proteasome و. استقرار BBS2 يعتمد على مجمع الأساسية BBSome، فضلا عن مجمع BBS-chaperonin. البروتينات من BBS خروج المغلوب الأنسجة الماوس (الخصية) أو من تم فصل لست] الخلية SDS-PAGE رني المعالجة. كان يستخدم لمكافحة BBS2 الأجسام المضادة للكشف عن مستويات البروتين BBS2. BBS2 حساس لالبروتيني العلاج. أصيب الكلى مع اتش معربا عن FLAG-BBS2 - الخلايا الأولية من WT وBbs6 - /. كانت مختلطة كميات متساوية من البروتين الكلي مع البروتيني thermolysin في 4 درجات مئوية للمرة المشار إليه. مقارنة مع خلايا WT، BBS2 يحط أسرع في Bbs6 - / - الخلايا، مما يشير إلى أن BBS2 غير مستقر في ظل غياب BBS6 خلايا 293T وعولج FLAG-BBS2 الخلايا معربا عن مستقرة، مع MG132 proteasome والمانع. وimmunoprecipitated BBS2 (IP) من خلال حبات FLAG أو مكافحة BBS2 الأجسام المضادة، وتم الكشف عن BBS2 ubiquitinated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. HA-بتحول وكان transfected في الخلايا 293T، وimmunoprecipitated BBS2 الذاتية من قبل مكافحة BBS2 الأجسام المضادة. تم الكشف عن BBS2 Ubiquitinated من قبل مكافحة HA الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. تم علاج الخلايا 293T مع 50 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد (فروج) مع أو بدون 20 μ م proteasome والمانع MG132 أو MG115 لمدة 8 ساعات. تم الكشف عن BBS2 الذاتية في الخلية لست] بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS2.

وبعد ذلك، كنا رني في الخلايا RPE1 للحد بشكل فردي التعبير عن BBS9 (BBSome عنصر معقد الأساسية)، BBS12 وTCPβ (مكونات معقدة BBS-chaperonin). تخفيض كل من هذه البروتينات يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين BBS2. في المقابل، فإن عدم وجود البروتينات BBSome العادي BBS4 أو BBS1 (باستخدام أنسجة من Bbs4 - / - وBbs1 M390R فئرانا معدلة وراثيا، على التوالي) لا تؤثر على مستويات البروتين BBS2 (الشكل 7. A). وتشير هذه البيانات إلى أن استقرار BBS2، وهو مكون من مجمع الأساسية BBSome، يتطلب مجمع BBS-chaperonin، فضلا عن العنصرين الآخرين من مجمع الأساسية BBSome (BBS7 وBBS9). وبالمثل، فإن استقرار BBS7 يتطلب مجمع BBS-chaperonin، وكذلك المكونات الأخرى اثنين من مجمع الأساسية BBSome (BBS2 وBBS9) (التكميلي الشكل S7).
لتحديد كيفية BBS-chaperonin الاستقرار التأثيرات المعقدة البروتين BBS2، ونحن المصابة Bbs6 - / - خلايا الكلى وخلايا الكلى WT مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. تم استخدام نفس تعدد العدوى لتصيب WT وBbs6 - / - خلايا الكلى، وكميات متساوية من البروتينات استخدمت في التحليل. مستوى البروتين BBS2 أقل في Bbs6 - / - الخلايا من الخلايا في WT (الشكل 7. B، 0 ')، بما يتفق مع الاستنتاج أن المجمع BBS-chaperonin مطلوب للBBS2 الاستقرار البروتين. البروتين BBS2 المتبقية في Bbs6 - / - الخلايا أكثر حساسية لالبروتيني thermolysin العلاج. عمر النصف من BBS2 في Bbs6 - / - الخلايا يتم تقليل ~3 أضعاف (4 دقيقة في خلايا WT مقابل 12 دقيقة في Bbs6 - / - الخلايا) (الشكل 7. B). ويتم الحصول على نتائج مشابهة عندما وإعادة تقديم FLAG-BBS2 إلى Bbs7 - / - خلايا الكلى (التكميلي الشكل S7.). وتشير هذه البيانات إلى أن مجمع BBS-chaperonin وBBS7 تلعب دورا في استقرار BBS2.

واليوبيكويتين-proteasome والمسار تشارك في BBS2 تدهور

للتحقيق في الآلية التي تتحلل BBS2 في الخلايا، درسنا ما إذا كان ينطوي على مسار بتحول-proteasome وفي هذه العملية. وubiquitinated كلا BBS2 أعرب خارجيا وأعرب عن التطور الطبيعي عند تحول دون proteasome والتي MG132 (الشكل 7 C). علينا أن نبرهن أيضا أن BBS2 الذاتية وubiquitinated حتى من دون تثبيط proteasome وعندما كنا overexpressed HA-بتحول في الخلايا 293T (الشكل 7 D). أسفرت علاج الخلايا 293T مع تخليق البروتين المانع سيكلوهيكسيميد في انخفاض مستويات البروتين BBS2. وزاد انخفاض مستويات البروتين BBS2 في الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد عندما يتم التعامل مع الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد أيضا مع مثبطات proteasome وMG132 أو MG115 (الشكل 7 E). وتبين هذه النتائج أن BBS2 الحرة وubiquitinated وتدهورت قبل proteasome و.

BBSome الجمعية نموذج

واستنادا إلى البيانات الواردة أعلاه، نقترح نموذجا فيه أشكال BBSome في عملية متسلسلة أمر يساعده على حد سواء الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات BBSome، فضلا عن عدم BBSome-تشبه chaperonin البروتينات BBS (BBS6، BBS10 وBBS12) (الشكل 8). يتفاعل مجمع BBS-chaperonin مع BBS7 لتحقيق الاستقرار فيه. التحولات BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع الأساسية BBSome، وهو مجمع يتألف من BBS7-BBS2-BBS9. ويرافق تشكيل مجمع الأساسية BBSome عن طريق إزالة مجمع BBS-chaperonin. الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين تعزيز إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يضاف BBS4 لاستكمال BBSome، وهي خطوة تتطلب وجود BBS1. مطلوب مجمع BBS-chaperonin لاستقرار الفرد من BBS2 وBBS7 البروتينات قبل هذه البروتينات المشاركة مع BBS9 لتشكيل مجمع الأساسية BBSome.

الشكل 8.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وchaperonin بوساطة التجمع متتابعة من BBSome. المعروضة هي المخططات من النموذج الحالي من أجل BBSome التجمع. واستقرت BBS7 من قبل BBS-chaperonin معقدة (BBS6-BBS12-BBS7-CCT) ويجعل الانتقال إلى مجمع الأساسية BBSome (BBS7-BBS2-BBS9). يتطلب هذا التحول BBS10. والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين توجه إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يتطلب BBS4 BBS1 على أن تدرج في المجمع وغير الوحيدات مشاركة تضاف إلى المجمع.

نقاش

ارتفاع معدل انتشار السمنة، ومرض السكري، وتنكس الشبكية في عموم السكان يجعل دراسة BBS ذات الصلة سريريا تتجاوز تلك مع هذه المتلازمة نادرة نسبيا. في الواقع، وقد ارتبطت متغيرات جينية BBS مع كل من الطفولة وتعليم الكبار السمنة مشتركة في عدد السكان واحد على الأقل (29). وعلاوة على ذلك فهم الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية من BBS سوف توفر معلومات مفيدة تتعلق هذه الاضطرابات شيوعا. على الأقل مجموعة فرعية من وظائف فردية البروتينات BBS تعتمد على تشكيل BBSome، وهو مجمع متعدد فرعية مستقرة تتكون من BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، BBS9، وBBIP10، وهو بروتين الذي الطفرات لم يتم بعد المتورطين في المرض. وقد تركزت الدراسات السابقة وظيفة BBSome على تحديد البروتينات أو الشحنات التي تتفاعل مع BBSome (14، 15، 26، 30، 32). هنا، نحن نقترب من الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية من BBS من وجهة نظر الجمعية BBSome. دراستنا يربط مباشرة مجمع BBS-chaperonin (تتألف من BBS6، BBS12، BBS7، وCCT / البروتينات TRIC) إلى BBSome، مجمعين تم تحديدها من خلال تحليل الكيمياء الحيوية.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وChaperonin مثل دليل BBS البروتينات أمر الجمعية BBSome

بشكل عام، والتجمع بروتين كبير المعقد هو عملية أمرت، عادة ما تتطلب خطوات وسيطة متعددة (1، 5).غالبا ما يكون من الصعب تحديد طبيعة وسيطة التجمع بسبب طبيعتها العابرة ونصف الحياة قصيرة. يمكن ترتيب تجميع محدد من مجمعات البروتين يحتمل أن تلعب دورا هاما في تحديد طبيعة الظواهر الناتجة عن الطفرات في مكونات المجمع. في بعض الحالات، يمكن أن تحور في بروتين واحد من مجمع يؤدي إلى تراكم من تجميع وسيطة أن يحافظ على وظيفة متبقية أو مكسب من وظيفة، في حين أن النظام المختلفة التكوين يمكن أن يؤدي إلى انعدام تام التجمع وخسارة كاملة وظيفة.
في هذه الدراسة، طبقنا النهج وموارد متعددة لتوصيف BBSome سيطة التجمع. الطفرات نقطة في بروتينات معينة BBS، والطفرات فارغة تفتقر تماما بعض البروتينات BBS، والتدخل RNA للحد من مستويات البروتين BBS، وكذلك overexpression من مفارز BBSome محددة تؤدي إلى تراكم الخلايا من التجمع سيطة متميزة. وأملت الجمعية من BBSome من قبل الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات وBBSome ويسترشد أيضا من البروتينات BBS مثل chaperonin-BBS6، BBS10، وBBS12. التحليل البنيوي يكشف أن BBS1، BBS2، BBS7، وBBS9 احتواء المجالات المروحة بيتا، BBS4 وBBS8 يحتوي على عدة tetratricopeptide تكرار المجالات، وBBS5 اثنين من المجالات تناظر pleckstrin. هذه المجالات التوسط عادة تفاعلات البروتين البروتين. وأظهرت البشرى المقايسات المشترك مناعي أن BBS7 يتفاعل مع BBS2 وأن BBS9 يتفاعل مع BBS1، BBS2، BBS5، وBBS8. وقد تبين BBS1 للتفاعل مع BBS2 وBBS4. عملية التجميع BBSome تعكس هذه التفاعلات البروتين البروتين. البروتينات BBS مثل chaperonin (BBS6، BBS10، وBBS12) ضرورية في بدء الخطوة الأولى لتشكيل BBSome من خلال تشكيل مجمع BBS-chaperonin لتحقيق الاستقرار BBS7.

BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج BBSome الأساسية مجمع

لدينا حددت الدراسة BBS2-BBS7-BBS9 بمثابة مجمع المتوسطة هاما في تجميع BBSome ناضجة. ويتم تنسيق تشكيل هذا المجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن مجمع BBS-chaperonin من BBS7. تظهر وظيفة واحدة من هذا المجمع BBS-chaperonin أن يكون لتحقيق الاستقرار BBS7 قبل ارتباطه BBS2 وBBS9. غياب BBS2، BBS7، BBS9، أو أي من مكونات معقدة BBS-chaperonin يقلل من مستويات BBS2 وBBS7، في حين أن غياب أو تحور BBS1 أو BBS4 له تأثير ضئيل على BBS2 وBBS7 الاستقرار البروتين. تتحلل BBS2 المجاني من مسار بتحول-proteasome و. يغاز بتحول لBBS2 غير معروف حاليا.
BBS11 / TRIM32 هو يغاز E3 لعدة بروتينات بما في ذلك الأكتين وdysbindin (33، 34). طفرة معينة من P130S في عائلة واحدة تسبب الظواهر BBS (35). ومن المثير للاهتمام أن يتكهن بأن يغاز E3 المفترض لBBS2 قد يكون BBS11 / TRIM32.

تنظيم BBSome وظيفة

هناك العديد من الآليات المحتملة التي يمكن أن تحدث في تنظيم وظيفة BBSome. أحد الاحتمالات هو أن يحدث التنظيم بعد تجميعها BBSome تماما، وحركة BBSome في المقصورة، وظيفية الخلوية (أي ينظم، أهداب). سواء كانت إيجابية (RAB8) والسلبية interactors (LZTFL1) BBSome وقد تم تحديد (10، 25). ومع ذلك، وتنظيم التجمع هو أيضا احتمال وارد. وبناء على دراستنا، فإن تنظيم التجمع الأرجح أن يحدث على مستوى تشكيل مجمع BBS-chaperonin، على مستوى تشكيل مجمع الأساسية BBSome، و / أو على مستوى الإفراج BBS6، BBS12، والبروتينات CCT / TRIC من BBS7. ومن المرجح BBS10 عنصر تنظيمي رئيسي للمجمع BBS-chaperonin.

أهمية الفسيولوجية والسريرية BBSome الوسطيات: دور للBBSome الوسطيات الجمعية في BBS النمط الظاهري التغير

في ظل ظروف طبيعية، يبدو أن هناك بركة مجانية محدودة من مفارز BBSome الفردية مع الغالبية العظمى من مفارز يجري في BBSome الأشكال المعقدة. ومع ذلك، BBSome سيطة التجمع مثل مجمع الأساسية BBSome قد تشكل في ظروف مثل تلك التي تحدث عند وجود خالية أو نقطة طفرات معينة في المرضى الذين يعانون BBS. الظواهر من BBS تتفاوت تفاوتا كبيرا بين العائلات المختلفة وحتى داخل أفراد من نفس العائلة (الأفراد بنفس طفرة معينة) (36، -، 38). وتشير هذه الملاحظات إمكانية المعدلات الوراثية. يمكن أن يحدث تعديل النمط الظاهري عندما متغير متخالف في جين واحد يؤثر على مظهر المظهري من الجين المسبب للمرض آخر. لأن بعض الطفرات قد يؤدي إلى تراكم التجمع مستقر وسيطة، وجود وسيطة قد يفسر بعض الاختلافات المظهرية لوحظ بين مختلف طفرات الجينات BBS. مثال واحد للاهتمام هو النمط الظاهري ارتفاع ضغط الدم الذي يتجلى في Bbs4 - / - الفئران، في حين Bbs2 - / - الفئران ليس لديها ارتفاع ضغط الدم (39، 40). وعلاوة على ذلك، كما تم الإبلاغ عن الاختلافات الفسيولوجية بين المرضى BBS البشرية التي تسببها طفرات في الجينات BBS متميزة (37). والآلية التي قد تحدث هذا يتطلب مزيدا من التحقيق.
توضيح من الطريقة التدريجية التي يتم تشكيل BBSome يوحي بإمكانية نوع معين أشكال خلية من BBSome. وبعبارة أخرى، فإن حقيقة أن بعض البروتينات BBSome (على سبيل المثال، BBS1، BBS5، وBBS8) تضاف بشكل مستقل لمجمع المتوسطة مستقر يسمح لاحتمال أن BBSome التجانس موجود وأن أشكال غير متجانسة من BBSome قد يكون الأدوار الوظيفية في أنسجة معينة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس