عرض مشاركة واحدة
  #12  
قديم 10-20-2015, 12:42 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي العكس الجينوم البشري من كروموسوم 15q11-Q13 في أمهات مرضى متلازمة أنجلمان مع الدرجة الثانية (BP2 / 3) الحذف

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/12/8/849.full

https://translate.googleusercontent....LiWWQSf3fqt94w




وقد تم مؤخرا أظهرت الوالدين العكس الجينومية دون المجهرية أن يكون حاضرا في العديد من الاضطرابات الجينوم. هذه ظاهرة الانقلاب هي الأشكال الجينومية التي تسهل اختلال وإعادة التركيب غير طبيعي بين الازدواجية قطعي المرافقة. ويرتبط؛ (MIM 105830 AS) مع تشوهات معينة من كروموسوم 15q11-Q13، مع حوالي 70٪ من الحالات يجري الأم من أصل 4 ميجا بايت الحذف متلازمة أنجلمان. نقدم هنا دليل على أن بعض أمهات AS المرضى الذين يعانون من الحذف في المنطقة 15q11-Q13 لها انعكاس متخالف التي تنطوي على المنطقة التي يتم حذفها في النسل المتضررين. تم الكشف عن انعكاس في أمهات أربعة من ستة AS الحالات مع نقطة توقف 2-3 (BP2 / 3) 15q11-Q13 الحذف، ولكن ليس في سبع أمهات AS بسبب disomy أحد الأبوين الأب (UPD) 15. لقد حددنا متغير نقاط التوقف انقلاب داخل BP الازدواجية قطعي في مقلوب AS الأمهات، وكذلك في المرضى كما حذف. ومن المثير للاهتمام، هو مقلوب المنطقة BP2-BP3 في مشروع الماوس تسلسل الجينوم فيما يتعلق بمشروع التسلسل البشري. تم اكتشاف BP2-BP3 كروموسوم 15q11-Q13 انقلاب في أربعة من 44 شخصا (9٪) من السكان عام (P <0.004). يجب أن يكون انعكاس BP2 / 3 عقار المتوسطة التي تسهل وقوع 15q11-Q13 BP2 / 3 الحذف في النسل.
مقدمة

وقد ركزت الازدواجية قطعي الاهتمام البحوث المكثفة حول آليات تحور الجينوم البشري ودور الازدواجية في تطور الرئيسيات (1). أكثر من 30 الأمراض التي تصيب الإنسان، التي أطلق عليها أسم اضطرابات الجينوم (2)، هي نتيجة لإعادة ترتيب الجينوم داخل الازدواجية قطعي (2، 3). وقد أثبتت العديد من الدراسات أن الازدواجية قطعي يقع عن كثب هي واحدة من العوامل المؤهبة لحدوث اضطرابات الجينوم. نحن نفترض أنه، على الأقل بالنسبة لبعض الأنواع من إعادة ترتيب، والعامل الثاني المهيئة لإعادة ترتيب هو وجود ظاهرة الانقلاب متخالف في منطقة محددة من الازدواجية قطعي. وهذه ظاهرة الانقلاب، والتي هي غير مرئي بالمجهر نظرا لقربه من الازدواجية المجزأ، تتداخل مع نقاط الاشتباك العصبي مثلي العادية، وسوف تجعل اختلال وإعادة التركيب غير طبيعي على الأرجح، تماما كما هو الحال بالنسبة العكس تعريفية cytogenetically. وصفناها في الآونة الأخيرة أن بعض من جديد إعادة ترتيب الكروموسومات المتكررة، التي تنطوي على كروموسوم 8 أو كليهما الكروموسومات 4 و 8، هي المنتجات المؤتلف من العكس متخالف دون المجهرية موجودة في الأصل تحيل كروموسوم المتعلقة المرض (4، 5). على العكس لها نفس نقاط التوقف لإعادة ترتيب المتكررة ويحيط بها الازدواجية قطعي paralogous. وعلاوة على ذلك، كانت موجودة في نسبة كبيرة من موضوعات عامة السكان، وبالتالي يمكن اعتبار الأشكال الجينومية، التي تشارك في حدوث إعادة ترتيب الأمراض المرتبطة. آخر انقلاب خفي من 1.5 ميجا بايت على الصبغي 7q11.23 تم العثور في أربع من 12 آباء المرضى الذين يعانون من متلازمة وليامز-بيرون (WBS) (6). وتشير هذه النتائج إلى أن الأشكال الجينومية قد يكون سمة مشتركة في بعض المناطق غير المستقرة المرتبطة اضطرابات الجينوم. لاختبار هذه الفرضية درسنا كروموسوم المنطقة 15q11-Q13 في أمهات Angelman متلازمة 15q11-Q13 المرضى حذفها.
يبدو البشري كروموسوم 15q11-Q13 ترتيبها في العديد من الاضطرابات. متلازمة برادر ويلي (PWS؛ MIM 176270) ومتلازمة أنجلمان (AS؛ MIM 105830) هي الاضطرابات العصبية السلوكية التي تحدث على تردد 000 1/10 إلى 1/20 000 ولادة حية (7). حوالي 70٪ من PWS وAS المرضى الذين لديهم الحذف كروموسوم 15q11-Q13 من أصل الأب والأم، على التوالي (8). الأكثر PWS / AS تتجمع الحذف على اثنين من نقاط التوقف القريبة (BP1 وBP2، الدرجة الأولى والدرجة الثانية المرضى، على التوالي)، وتوقف البعيدة المشتركة (BP3) (9). وتقع الكبيرة (~400 كيلوبايت) الازدواجية قطعي الهوية تسلسل عالية (> 90٪) في هذه نقاط التوقف (10، 11). وقد كشفت الدراسات التطورية أن هذه الازدواجية قطعي ظهرت منذ ~20 مليون سنة (10)، لذلك من ظهور عائلة قردة عليا (12). الازدواجية قطعي إضافية ومشتركة جزئيا موجودة في نسخ متعددة على 15q11-Q14 (13). على الرغم من التقدم في توصيف هذه الازدواجية المجزأ، الآلية الجزيئية وعوامل القابلية المحتملة التي يمكن أن تكمن وراء PWS / AS الحذف لا تزال مجهولة. على سبيل المثال، BP1 / BP2 وBP3 15q11-Q13 المرافقة الازدواجية قطعي يبدو أن تقع في التوجه المقلوب، الذي من شأنه أن يؤدي من خلال الصبغي معبر المبالغ إلى paracentric العكس ولكن ليس الحذف. مع هذا التوجه المقلوب، وآليات أخرى مثل الصبغي سيطة الجذعية حلقة وقد اقترحت (10). هنا، علينا أن نظهر أن نسبة كبيرة من الأمهات من AS المرضى الذين يعانون من الحذف BP2 / 3 تحمل انعكاس لهذه المنطقة. وينبغي أن يكون وجود انعكاس عقار المتوسطة التي تسهل وقوع BP2 / 3 الحذف في النسل.

النتائج

انقلاب 15q11-Q13 في أمهات AS المرضى الذين يعانون من BP2 / 3 الحذف

من خلال تحقيقات مختلفة تقع في 15q11-Q13 وفقا لمحتواها من علامات والجينات من المنطقة (14) (الشكل 1 A)، وقد عرفت حذف 15q11-Q13 من الطبقة الأولى (BP1 / 3) في اثنين AS المرضى وكما الدرجة الثانية (BP2 / 3) في ستة AS المرضى. وأظهرت الطورية والطور البيني FISH التجارب أن أربعة من ست أمهات (عينات 1-4 في الجدول 1) من AS المرضى الذين يعانون من الحذف BP2 / 3 كان لها انعكاس متخالف المنطقة 15q11-Q13، الذي يتم حذف في ذريتهم (الشكل 2 ). ومع ذلك، كان أيا من أمهات سبع حالات AS تظهر isodisomy الأب (UPD) 15، ولا أمهات اثنين من المرضى الذين يعانون من BP1 / 3 الحذف انعكاس 15q11-Q13 (عينات 15/07 في الجدول 1). ومن المثير للاهتمام، وكانت أربع من 44 موضوعات لا علاقة لها من عموم السكان متخالف للقلب، مما تردد من 4.5٪ من الكروموسومات مقلوب في عموم السكان. وهذا يؤدي إلى اختلاف كبير في وتيرة انقلاب في AS أمهات المرضى BP2 / 3 الحذف، بالمقارنة مع موضوعات من عموم السكان (P <0.004؛ OR = 20.00، 95٪ CI 2،75-145،5).

الشكل 1. (A) خريطة الجينوم المنطقة 15q11-Q13، ترتيبها في PWS وAS المرضى واضطرابات البشرية الأخرى. I (BP1) والدرجة الثانية كما تظهر نقاط التوقف BP1-BP3 المشاركين في فئة (BP2) PWS / أنواع الحذف. وأشار أيضا نقاط التوقف الأخرى (BP4، BP5 وBP). موقع تحقيقات تستخدم لFISH (استنساخ RP11 BAC) وPFGE (تحقيقات 1-4، انظر المواد وطرق) وترد التحليل. المسافات بين الازدواجية قطعي، لا يتم تحجيم نقطة أساس و علامات. يتم وضع علامة على تسلسل LCR15 التي كتبها المستطيلات الصفراء (GLP، golgin مثل البروتين، X عدد ممكن من النسخ) وHERC2 الازدواجية قطعي ذات الصلة ب التي كتبها المستطيلات الخضراء. (B) GenomePixelizer عرض النتائج داخل الصبغي BLAST من منطقة كروموسوم 15q11-Q13 (الهوية تسلسل الأحمر = 100٪، الأرجواني 95-99٪، 90-94٪ الخضراء). المراسلات بين المواقع في لوحة تقريبية فقط. السهام الملونة تشير إلى مناطق هوية تسلسل والتوجيه بين الازدواجية قطعي في بناء 30. ونفس اللون من السهام يشير الازدواجية القطاعية التي ترتبط مع بعضها البعض. الازدواجية قطعي أخرى في المنطقة، التي لا علاقة لها PWS / AS لا تظهر الحذف.


الشكل 2. تحديد انعكاس 15q11-Q13 في أمهات AS المرضى الذين يعانون من الحذف BP2 / 3. النتائج FISH تهجين على الطورية (A) والطور البيني (B) الكروموسومات من أمهات AS المرضى الذين يعانون من BP2 / 3 الحذف مع (A1، B1) ودون (A2، B2) انعكاس 15q11-Q13. في (A) تحقيقات RP11-494F2 (الخضراء) وRP11-322N14 (الحمراء)، في طرفي المنطقة BP2-BP3، استخدمت. في (B) تحقيقات RP11-494F2 (الأخضر)، RP11-131I21 (الحمراء)، داخل المنطقة BP2-BP3 الداني، وRP11-25C1 (الصفراء)، بين BP1 وBP2، استخدمت. السهام البيضاء تدل على كروموسوم مقلوب.


الجدول 1.
نتائج التجارب FISH في الخلايا الطورية والطور البيني من أمهات مرضى متلازمة أنجلمان

مجموعة من الازدواجية قطعي في المنطقة 15q11-Q13

لقد قمنا على BLASTN (15 التحليل) في المنطقة 15q11-Q14 ضد نفسها لتحديد طول وتوجه الازدواجية قطعي. أكدنا وجود الازدواجية الرئيسية الثلاث قطعي (BP1، BP2 وBP3)، وكذلك الكشف عن مجموعتين إضافية (BP4 وBP5)، كما ذكرت سابقا (10، 11، 13) (الشكل 1 B). أحدث التجمع (بناء 30) من مشروع تسلسل الجينوم البشري المقابلة لهذه المنطقة يعطي حجم بين BP1 وBP3 من ~4.8 ميغابايت، ويظهر التوجه جنبا إلى جنب من BP2 فيما يتعلق BP3. أن هذا التوجه غير صحيحة استنادا إلى تحليل مفصل لاستنساخ المسيحية وآخرون. (10) وعاموس-Landgraf وآخرون (11)، على الرغم من تعدد الأشكال الازدواجية قطعي ويمكن أيضا موجودة تتغير توجهات هذه القطاعات. ويحيط المنطقة التي تحتوي على قطعي الازدواجية BP3 ثغرات في الجمعية بناء 30 وأنه أقصر بكثير مقارنة مع الخريطة الفعلية التي تم بناؤها باستخدام الحيوانات المستنسخة YAC (14).

تحديد 15q11-Q13 قلب وحذف نقاط التوقف

لمزيد من تميز المنطقة 15q11-Q13 تشارك في قلب والحذف، أجرينا الكهربائي النبضي (PFGE) تحليل عينات من AS الأمهات مع وبدون انقلاب BP2-BP3، AS المرضى BP2 / 3 و BP1 / 3 حذفها، والموضوعات من عموم السكان.
أولا، من خلال التحقيق 1، وتقع بالقرب من علامة D15S542 (على الطرف القريب من BP2)، ونحن الكشف عن المحتملة الداني توقف حذف اثنين من الدرجة الثانية المرضى (من ثلاثة تحليلها) باستخدام ثلاثة انزيمات تقييد مختلفة في حالة واحدة، مما أعطى إضافية شظايا من ~0.6 ميجا بايت ليس أنا، ~1.7 ميغابايت ناورو الأول و~0.7 ميغابايت ساجيتاريوس منظمة العفو الدولية، ومع إضافي ~1.5 ميغابايت MLU I تفتيت في الصف الثاني مريض آخر (الشكل 3). لذلك، إذا كشف هذا التحقيق الطبقة II نقاط، ومن ثم ينبغي أن تكشف أيضا عن انعكاس الجيني BP2-BP3 في أمهات AS الدرجة الثانية المرضى. وهكذا، التحقيق 1 أعطى العصابات إضافية في ثلاثة BP2-BP3 أمهات مختلفة مقلوب: ~1.8 ميغابايت MLU أنا في عينة LB327، ثلاثة ناورو مختلفة I خارج نطاقات (~1.0، 1.5 و 1.7 ميغابايت) في عينة LB325، و~1.6 ميجا بايت ناورو I الفرقة إضافية في عينة LB320. كما استبعدت إمكانية ناورو I الهضم الجزئي عن طريق التهجين نفس تصفية مع تحقيقات أخرى مصممة في هذه الدراسة.

الشكل 3. حقل النبض الكهربائي للهلام (PFGE) نتيجة لتحقيقات تقع في نهايات المنطقة مقلوب 15q11-13. تحقيقات 1 و 2 وتقع قريب وبشكل أقصى للازدواجية BP2 قطعي، على التوالي. تحقيقات 3 و 4 تقع قريب وبشكل أقصى للازدواجية BP3 قطعي، على التوالي (تكوين غير مقلوب كروموسوم). الجرد مو، أم مقلوب؛ LB، عدد العينة. غير الجرد مو، غير مقلوب الأم. الدرجة الثانية، AS BP2 / 3 عينات حذف؛ جنرال البوب، عينة السكان العامة. بات، المريض. يتم وضع علامة على نقاط التوقف قلب (نطاقات إضافية محددة من الأمهات مقلوب) من خلال الأسهم، ونقاط التوقف الحذف (نطاقات إضافية محددة من الدرجة الثانية مرضى) نجمية. نطاقات متعددة الأشكال الأخرى التي تظهر لدى الأمهات مقلوب وغير مقلوب، لم يتم وضع علامة الدرجة الثانية أو عينات من عموم السكان. من النوع البري أنماط تقييد تتوافق مع الممرات دون السهام، والعلامات النجمية أو عصابات متعددة الأشكال الإضافية المذكورة في النص.

تم الكشف عن شظايا نقطة توقف أيضا مع ثلاثة تحقيقات إضافية المرافقة المنطقة مقلوب، وتقع في النهاية البعيدة من BP2 وعند النهايات القريبة والبعيدة من BP3. التعرف على مختلف أجزاء إضافية باستخدام أنزيمات التقييد مختلفة في نفس العينات وينبغي أن تبين وجود إعادة ترتيب الجينوم بدلا من مجرد الأشكال موقع قيود. مسبار 2، وتقع على مقربة من علامة D15S543، بالكشف عن أجزاء إضافية مختلفة مع العديد من الانزيمات التقييد في اثنتين من الأمهات مقلوب: إضافي ~2 ميغابايت ناورو الأول و> 2 ميجا بايت ليس أنا شظايا تم تحديدها في عينة LB325، و~1.8 ميجا بايت ليس أنا جزء إضافي في عينة LB327. التحقيق 3، وتقع في الجانب القريب من BP3 الكشف عن إضافي ~1.5 ميغابايت ساجيتاريوس AI جزء في العينة LB327 مقلوب. ومن المثير للاهتمام، تحقيقات 3 و 4 الكشف عن شظايا متعددة الأشكال الأخرى في عينات من عموم السكان أو في أمهات اختبار (مقلوب وغير مقلوب)، مما يؤكد مدى تعقيد المنطقة 15q11-Q13. وهكذا، التحقيق 2 الكشف عن ~0.3 ميغابايت ناورو أنا جزء في العينة LB327 (ينظر أيضا في أمهات غير مقلوب، لا يظهر)، وتحقيقات 3 و 4 الكشف عن شظايا متعددة الأشكال من ~0.4 و~0.6 ميغابايت مع أنظمة دعم الأعمال التجارية HII في المواد من عموم السكان، على التوالي (الشكل 3).

هو مقلوب المنطقة كروموسوم BP2-BP3 15q11-Q13 أيضا في تسلسل جينوم الفأر

لقد محاذاة تسلسل العام البشري 15q11-Q13 مع المنطقة syntenic من كروموسوم الماوس 7. وكشفت هذه المواءمة أن المنطقة BP2-BP3 هو مقلوب أيضا في تسلسل الماوس فيما يتعلق التسلسل البشري (الشكل 4). تم الكشف عن هذا انعكاس أيضا باستخدام بيانات تسلسل الماوس من سيليرا (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن هذه المناطق لا تزال تحتاج إلى مزيد من تسلسل وتجميع، حدود انعكاس تنسجم تماما مع المواقع HERC2 جين كاذب، الموافق BP الازدواجية قطعي. كما هو متوقع، والجينات وتسلسل الموسومة المواقع (STS) النظام في الإشعاع الماوس خريطة الهجين دعم البيانات من تسلسل تجميعها ومن ثم التوجه المقلوب في هذه المنطقة فيما يتعلق التسلسل البشري. وهكذا، يبدو أن كتلة الجين P-Gabrg3-Gabra5-Ube3a-Snprn-NDN-Magel2 مقلوب عند مقارنتها الخريطة الإنسان، ولكن ليس فيما يتعلق المرافقة الجينات، مثل Chrna7 (البعيدة) وMGC35570 (القريبة)، والجينات الموجودة القاصي أو الداني لهؤلاء الصغار، على التوالي. على الرغم من أن تسلسل متاح في المنطقة القريبة لا يزال غير مكتمل، والمواءمة بين الفأر والإنسان تبين أن انعكاس لا يشمل المنطقة BP1-BP2. ومن المثير للاهتمام، وتغيير ترتيب الشرائح BP3-BP4 وBP4-BP5 في المنطقة syntenic الماوس. يقع التسلسل الماوس BP3-BP4 البعيدة في المنطقة BP4-BP5، التي هي على تماس إلى BP2-BP3 (الشكل 4). حدود هذه إعادة ترتيب ترتبط مع موقف نقطة أساس و مجموعات من انخفاض نسخة تكرار تسلسل 15 (LCR15s) المرتبطة جزئيا إلى الازدواجية BP قطعي (13).

الرقم 4. نقطة مؤامرة المواءمة بين الكروموسوم البشري 15 (HSA15)، والمنطقة 15q11-Q13 (18-28 ميجا بايت، وبناء 30)، ونظيره syntenic على الماوس كروموسوم 7 (MMA7؛ 45-55 ميجا بايت). الأسهم المنحدرة تشير إلى اتجاه التحالفات في المناطق مباشرة أو مقلوب. فجوات واسعة في محاذاة ومن المقرر أن مشروع وضع تسلسل الجينوم وتصفية التحالفات. HERC2 تظهر التشابه تسلسل الدوائر وتكشف BP2، BP3 وBP4 الازدواجية قطعي. وتظهر مواقف علامة المرافقة BP2 وBP3 الازدواجية قطعي كخطوط متقطع العمودية. الكتلة LCR15 الرابع (13 يظهر) التي تعين بين كتلتين الجينومية من ترتيب مختلف في الماوس / محاذاة الإنسان باعتبارها السهم العمودي. صناديق الأفقية الداكنة والفاتحة هي تمثيل الماوس / محاذاة تسلسل الإنسان.

مناقشة

وصفنا هنا انعكاس الجيني 15q11-Q13 في أمهات المرضى AS BP2 / 3 حذف وفي 9٪ من المرضى من عموم السكان. منذ BP2 وBP3 الازدواجية قطعي وعادة ما تكون في اتجاه ذيل إلى ذيل (10، 11)، ومن المحتمل أن تنشأ عن أحداث إعادة التركيب غير المتجانسة بين الهوية تسلسل عالية من هذه الازدواجية قطعي الكروموسومات مقلوب. ينبغي اقتراح لشرح الاستعداد لحذف في المواد التي تحمل BP2 / 3 انعكاس، توجه جنبا إلى جنب الجزئي داخل BP2 وBP3 مقلوب الكتل. وبالتالي، فإن انعكاس بين BP2 وBP3 تغيير التوجه النسبي للجزء الداخلي من الازدواجية قطعي أنه من خلال عرضية غير المتكافئ على الأحداث بينهما، من شأنه أن يؤدي إلى الحذف أو الازدواجية في النسل.
منذ انقلاب 15q11-Q13 موجود في 4.5٪ من الكروموسومات من الموضوعات من عامة السكان، ولأن هناك حالات قليلة جدا من تكرار للQ13 15q11 AS الحذف (خطر أقل من 1٪) (16)، وانتفاذ من انعكاس الجيني فيما يتعلق بمخاطر تعاني من حذف BP2 / BP3 في نسل الأمهات الناقل من المرجح أن تكون منخفضة (0.1-0.2٪). التباين الفردي يمكن أن توجد في عملية إعادة التركيب أو الآلات، والتي يمكن أن تزيد من القابلية للتعديل وإعادة ترتيب. وتجدر الإشارة إلى أن منظمة معقدة من duplicons قد يؤدي إلى إعادة ترتيب مختلفة، وأنه كما سبق ذكره من قبل جيليو وآخرون. (5)، وبعضها قد لا تكون متوافقة مع تطور الجنين طبيعية نسبيا. كروموسوم duplicons 15q11-Q13 قد توسط الحذف ليس فقط والحزب الاتحادي الديمقراطي الجرد (15) الكروموسومات ولكن أيضا الكروموسومات لامركزية الجزء 15q13-qter. وهكذا، فإن الأمهات انعكاس متخالف قد يكون في الواقع عدة أجنة غير متوازنة للكروموسوم 15 إعادة ترتيب، ولكن إما الجنين المجهض precociously أو كروموسوم غير طبيعي 15 وخسر بسبب عدم وجود السنترومير وظيفية. ومن الممكن أيضا أن الأجنة مع حذف 15q11-Q13 أقل قابلة للحياة من أجنة طبيعية، والتي ربما يفسر التردد المنخفض من تكرار الحذف في أمهات تحمل 15q11-Q13 BP2 / 3 انعكاس. ومن العوامل الأخرى التي يمكن أن تؤثر على القابلية للحذف أو ازدواجية في الأمشاج الإناث التي تحمل انعكاس BP2-BP3 يمكن أن يكون موقع محدد حيث وقع إعادة التركيب مما أدى إلى انقلاب. على الرغم من أن العينة المدروسة منخفضة نسبيا، ويبدو أن الأحداث انعكاس قعت في قضايا مختلفة، في مواقع مختلفة داخل BP2 وBP3، والكشف عنها بواسطة تقلب نقاط التوقف. وبالتالي، يجب على موقف مختلف من نقاط التوقف للانقلاب في BP2 قطعي الازدواجية يؤدي إلى طول مختلفة من مناطق هوية تسلسل الموجهة بالترادف بين BP2 وBP3 الازدواجية قطعي. وهذا يمكن أن يؤثر على وجود تسلسل المعرضة للإعادة التركيب في التوجه المباشر داخل كتل من الازدواجية قطعي مقلوب.
لقد وجدنا أن الأمهات BP2-BP3 مقلوب لديها نقاط التوقف المتغيرة. وهذا يدل على أنه لا يوجد بقعة ساخنة إعادة التركيب الكبرى، والتي ربما يرجع ذلك إلى الحجم الكبير (أكثر من 400 كيلو بايت) من BP2 وBP3 الازدواجية قطعي (10، 11). ويؤيد ذلك الملاحظات المستقلة للمحققين آخرين تحليل PWS وAS المرضى (17). دراسة Mewborn وآخرون (17 الكشف) سبع نقاط التوقف مختلفة (من 24 PWS / AS المرضى حذف) واقترحوا وجود الصبغيات مقلوب كعامل قابلية للحذف. لقد أظهرنا أيضا هنا أن هناك تفاوتا في نقاط التوقف حذف الدرجة الثانية داخل قطعي الازدواجية BP2. سوف المظاهرة من البقع المحتملة انعكاس أو حذف الساخنة داخل BP2 وBP3 الازدواجية قطعي في حاجة إلى تحليل عدد كبير من العينات وتوصيف مفصل للالازدواجية قطعي. وجود PFGE أخرى العصابات خارج في عينات من عموم السكان يدل على منظمة معقدة في المنطقة. تم العثور على مناطق متعددة الأشكال الكبيرة الأخرى الأقرب إلى BP1 (18) والبعيدة لBP3 (19).
لقد الكشف عن حالتين من BP2 / 3 AS المرضى وحالتين من BP1 / 3 AS المرضى فيها الأمهات لا تحمل العكس 15q11-Q13 كشفها بواسطة FISH مع تحقيقات المستخدمة في هذه الدراسة. وبما أن المنطقة تحتوي على هذه الازدواجية قطعي معقدة للغاية، مع غيرها من العديد من الازدواجية المشتركة جزئيا قطعي (LCR15s) (13)، فمن الممكن أن هذه الحالات لديهم اشكال معينة داخل كتل من الازدواجية قطعي. يجب اختبار هذه الفرضية بمجرد ان نعرف المنظمة مفصلة لهذه الازدواجية قطعي في عدد كبير من الموضوعات مع الحذف والضوابط العينات.
ومن المثير للاهتمام، وتبين الماوس / محاذاة تسلسل الإنسان التوجه المقلوب من تسلسل بين BP2 وBP3 الازدواجية قطعي. بالإضافة إلى ذلك، إعادة ترتيب الأخرى بين الماوس والمناطق syntenic الإنسان ترتبط مع BP وLCR15 المواقع. هذه النتائج من ظاهرة الانقلاب وإعادة ترتيب بين الماوس وتسلسل الإنسان يحيط بها الازدواجية قطعي مماثلة لتلك التي تم اكتشافها في المنطقة WBS (20، 21).
وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الشكل الأكثر شيوعا من حذف AS تشمل الدرجة الثانية المرضى يعتمد على اختلال بين قطعي الازدواجية BP2 وBP3 تطوق المنطقة 15q11-Q13، بسبب انعكاس المنطقة حذف المستهدفة. منذ نفس النوع من BP2 / 3 الحذف موجود في المرضى PWS (7 - 9)، ومن المتوقع أن بعض الحذف في هؤلاء المرضى بوساطة انقلاب 15q11-Q13 الموصوفة هنا، ولكن الناجمة عن الصبغيات الأبوية. وعلاوة على ذلك، نحن لا نعرف في هذه المرحلة في حالة حدوث إعادة ترتيب أخرى في النسل حاملي العكس 15q11-Q13، أو التي هي الجدوى من الأجنة التي تحمل إعادة ترتيب 15q11-Q13. ترتيب مختلف القطاعات في الماوس / البشري المنطقة syntenic البعيدة إلى BP3 يمكن أن توفر معلومات مفيدة لتحليل إعادة ترتيب الأخرى من كروموسوم 15q11-Q14، خاصة تلك التي تم وصفها في حالات التوحد (+22 - +24). وفي الختام، فإن البيانات المقدمة هنا تعزز فكرة أن الأشكال الجينومية يمكن أن توفر القابلية للدي نوفو إعادة ترتيب الكروموسومات البشرية (4 - 25)، وأدلة أخرى الحالي للدور الازدواجية قطعي في التباين الجيني.

المواد والأساليب

المرضى

تم تشخيص المرضى الذين يعانون من AS وفقا لمعايير السريرية للاضطراب وتحليل الحذف في المنطقة 15q11-Q13. تكونت عينة الدراسة من ستة BP2 / 3 AS المرضى والأمهات يناظرها، وهما BP1 / 3 AS المرضى والأمهات يناظرها، سبعة UPD 15 أمهات، ثلاث أمهات AS المرضى الذين يعانون من الطفرات UBE3A، و 44 الضابطة من خضوعه عامة السكان الاختبارات المعملية الدم الروتينية. تم الحصول على الموافقة المسبقة من المرضى وأهاليهم وعينات السيطرة.

تحليل FISH

تم تصنيف المرضى الذين يعانون من متلازمة AS كما حذف من خلال الطورية FISH مع تحقيقات تجارية محددة (Vysis). AS الصف الأول تم تعريف (BP1 / 3) المرضى الذين يستخدمون تحقيقات FISH BAC RP11-25C1 وRP11-289D12 (بنك الجينات غ الانضمام. AC016204 وAC090764، على التوالي؛ الشكل 1 A). كل من الحيوانات المستنسخة خريطة بين BP1 وBP2 وفقا لعلامات NIB1540 أو D15S18 وD15S542، على التوالي (9). AS الدرجة الثانية (BP2 / 3) وقد تم تحديد المرضى الذين يستخدمون تحقيقات FISH BAC RP11-494F2 وRP11-322N14 (بنك الجينات غ الانضمام. AC103750 وAC017046، على التوالي)، والتي تتوافق مع NDN ومواضع OCA2 داخل / المنطقة AS حذف PWS، على التوالي (14). خرائط تسلسل RP11-494F2 في نهاية الداني وتسلسل RP11-322N14 في النهاية البعيدة من المنطقة BP2-BP3. استنساخ RP11-322N14 أيضا يحتوي المعروف PWS / AS علامات كما D15S931 وD15S24. لتعريف الحذف كما BP1 / BP3 أو BP2 / BP3 أجرينا تجارب FISH في طور متوسط ​​جميع المرضى باستخدام كل RP11-289D12 وRP11-25C1 في تجارب منفصلة. تم تعريف توقف البعيدة BP3 في جميع الحالات عن طريق ثنائي اللون FISH مع تحقيقات RP11-494F2 وRP11-25D17. وقد تم تحليل جميع أمهات AS المرضى للانقلاب 15q11-Q13 من قبل كل من الطورية والطور البيني FISH. استخدمت تحقيقات RP11-494F2 وRP11-322N14 في الدراسات FISH الطورية المزدوجة (26). تحقيقات لهما المسافة المادية من حوالي 4 ميجا بايت. وهكذا، للحد من تداخل الإشارات استخدمنا عدة ترجمة Vysis نيك مصممة لوضع العلامات مضان المباشر من DNA وذلك لتجنب تضخيم إشارة. في حين فحص الشرائح رأيناها فقط تلك طور متوسط ​​مع إشارات خضراء وبرتقالية مميزة، ونبذ تلك مع تداخل منها. وقد تم تحليل ما لا يقل عن 30 طور متوسط ​​في كل حالة. كنا مجموعتين من ثلاثة تحقيقات كل لتحليل الخلايا في الطور البيني. من أجل تجنب سوء الفهم نتيجة لحلقات الإقليمية، تحقيقات من كل مجموعة غطت منطقة أصغر (حوالي 2 و 2.5 ميجا بايت، على التوالي) من أنه بحلول تحقيقات المستخدمة في التجارب الطورية (حوالي 4 ميجا بايت) مغطاة. وكانت مجموعتي RP11-494F2 وRP11-131I21 (بنك الجينات انضمام رقم AC009696)، بالإضافة إلى RP11-25C1 باعتباره التحقيق السيطرة، وRP11-20B10 (بنك الجينات انضمام رقم AC0022603) وRP1-322N14 بالإضافة إلى RP11-25D17 (بنك الجينات لم الانضمام . AC021360) باعتباره التحقيق السيطرة. واستخدمت تحقيقات من كلتا المجموعتين في FISH الثلاثي الألوان (26). درسنا ما لا يقل عن 40 نواة لكل مجموعة اختبار وسجلنا فقط تلك الكروموسومات حيث يمكن تصور كل ثلاثة تحقيقات في توافق وثيق مع بعضها البعض. هذه التجارب كان ينبغي أن يكون قادرا على كشف العكس من المناطق BP1-BP3 وBP2-BP3 ولكن ليس تلك التي تنطوي على مناطق BP1-BP2، التي يصعب الكشف مع البكالوريا المتاحة فعلا. أجريت التحقيق وإعداد الشرائح، تهجين الحمض النووي، وتحليل استخدام الأساليب التقليدية. وقد تم تحليل لا يقل عن 20 خلايا لكل حالة التي تصور المجهري المباشر وتحليل التصوير الرقمي. وصفت minipreparations BAC DNA مع SpectrumGreen-16dUTP أو SpectrumOrange-16dUTP (Vysis) من قبل ستاندرد رد فعل نيك الترجمة وFISH بروتوكول أجريت وفقا لتعليمات المورد. تم دراسة الشرائح تحت المجهر مضان مجهزة مجموعة التصفية المناسب.

تحليل تسلسل 15q11-Q14

يونيو 2002 (NCBI بناء 30) تم الحصول البشري تسلسل كروموسوم 15 من خلال UCSC (جامعة كاليفورنيا، سانتا كروز) الجينوم البشري متصفح الانترنت (ftp://genome.cse.ucsc.edu/goldenPath/05apr2002/). تحديد الازدواجية قطعي من قبل الانفجار كما وصفها (27). تسلسل كروموسوم 15 وملثمين تكرار-من العناصر المتكررة للغاية وتمت مقارنة تسلسل ملثمين ضد نفسها على نطاق كروموسوم BLAST للكشف عن الازدواجية قطعي الصبغي باستخدام BLAST2 الإعداد مع خيار MegaBlast على خادم يونكس المحلي. تم إنشاء جدول تقرير BLAST استخدام - خيار القيادة D. تم تحليل النتائج في وقت لاحق وفقا للمعايير التالية: نتائج BLAST ذات هوية تسلسل ≥90٪، ≥80 غليان في الطول، ومع القيمة المتوقعة ≤ ه -30. أزيلت جميع الزيارات متطابقة، بما في ذلك التحالفات BLAST دون المستوى الأمثل معترف بها من قبل التحالفات تداخل متعددة، وكذلك يضرب المرآة (الاتجاه المعاكس تنسيق التحالفات) من نتائج انفجار من داخل الصبغي مجموعة. محاذاة إحداثيات مفصولة مسافة الجار وانضم أقل من 5 كيلو بايت معا في وحدات لحساب تسلسل المتكررة ملثمين، وحدات فقط مع حجم بقيت أكثر من 10 كيلو بايت للتحليل في هذه الدراسة (28). تم تحويل النتائج المتولدة من الكشف عن الازدواجية قطعي في وقت لاحق إلى تنسيق ملفات كمدخل للعرض باستخدام GenomePixelizer (29)، التي تم الحصول عليها من www.atgc.org/GenomePixelizer/GenomePixelizer_Welcome.html.
وتم الحصول على تسلسل الخام من الماوس (يوليو 2002) والبشرية (سبتمبر 2002) من مستودع تسلسل Ensembl، ملثمين مع RepeatMasker (http://repeatmasker.genome.washington.edu/cgi-bin/RM2_req.pl) محليا والانحياز باستخدام MegaBlast . تم تحليل التحالفات الناتجة باستخدام مخطوطات برل على أساس وحدات bioperl. تم إنشاؤها يعرض رسومية من الاصطفافات من بيانات تحليل باستخدام عدة مخطوطات برل.

تحليل PFGE

تم الحصول على مسبار 1، وتقع بالقرب من علامة D15S542، عن طريق PCR مع الاشعال 5'-cctgtggtctccttgacag-3 "و5'-caaaacactctgaaagcagtg-3" مصممة على بنك الجينات انضمام رقم AC016446 (RP11-289D12)؛ تم الحصول على المسبار 2، وتقع بالقرب من علامة D15S543، عن طريق PCR مع الاشعال 5'-gaatccagcatggtgctcag-3 "و5'-ccaggagacaacttggtttcc-3" مصممة على بنك الجينات انضمام رقم AC073446 (RP11-757E13)؛ تم الحصول على التحقيق 3، وتقع بالقرب من علامة D15S931، عن طريق PCR مع الاشعال 5'-caataatgggagggaggtcac-3 "و5'-ctcattcaagcattcacctgt مصممة على بنك الجينات انضمام رقم AC017046 (RP11-322N14)؛ مسبار 4، وتقع بالقرب من علامة D15S1233، تم الحصول عليها عن طريق PCR مع الاشعال 5'-cccagcttccatgctgatg-3 "و5'-gggtggagtgagaagtgtc-3" مصممة على بنك الجينات انضمام رقم AC021360 (RP11-25D17). قبل التحقيق تنقية، وsubcloned المقابلة تحقيقات PCR في pGEM-T سهل ناقلات (PROMEGA). أجريت القيود PFGE DNA عالية الجزيئية باستخدام 80U للانزيم المقابلة خلال 24 ساعة وelectrophoresed عن طريق نظام CHEF مخطط XA (بيو راد). كانت الظروف التهجين القياسية في 7٪ SDS و 0.5 M العازلة الفوسفات، وبعد يغسل صرامة 0،5-0،2 × SSC في 55-65 درجة مئوية. تم تنفيذ اثنين على الأقل تحليلات مستقلة تماما عن كل انزيم التقييد والتحقيق.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس