عرض مشاركة واحدة
  #8  
قديم 11-22-2015, 08:48 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Oligomerization، وجمعية غشاء من راثي مشلول الشلل النصفي 3A (SPG3A) البروتين Atlastin

 

http://www.jbc.org/content/278/49/49063.full

ملخص

تضم paraplegias تشنجي وراثي مجموعة من المتلازمات غير متجانسة سريريا تتميز أقل التشنج أقصى والضعف، مع انحطاط المحاور البعيدة في تصاعدي طويلة ومساحات تنازلي من الحبل الشوكي. ويتسبب في وقت مبكر بداية راثي تشنجي الشلل النصفي SPG3A عن طفرات في atlastin / الإنسان ملزم guanylate البروتين 3 الجين (التي أعيدت تسميتها هنا atlastin-1)، الذي رموز لأحد أفراد 64 كيلو دالتون من dynamin / MX / ملزم guanylate البروتين الفصيلة GTPases من الكبيرة. يتم ترجمة البروتين atlastin-1 في الغالب في الدماغ، حيث يتم تخصيبه في الخلايا العصبية الهرمية في قشرة الدماغ والحصين. في العصبونات القشرية مثقف، atlastin-1 شارك المترجمة أبرزها مع علامات من جهاز جولجي، وكشف الفحص المجهري immunogold الإلكترون توطين السائد للatlastin-1 إلى رابطة الدول المستقلة -Golgi. وأظهرت التحليلات الخميرة يومين الهجينة والدراسات المشارك مناعي أن atlastin-1 يمكن الزميلة الذاتي، وهلام الاستبعاد اللوني والدراسات عبر ربط الكيميائية أشارت إلى أن atlastin-1 موجود باعتباره قليل وحدات في الجسم الحي، وعلى الأرجح tetramer. كشفت تجزئة الغشاء والمقايسات حماية البروتيني الذي atlastin-1 هو بروتين الغشاء لا يتجزأ مع توقع اثنين من المجالات عبر الغشاء. كل من يتعرض المجالات ملزم GTP وC-محطة N-الطرفية إلى السيتوبلازم. معا، وهذه النتائج تشير إلى أن بروتين SPG3A atlastin-1 هو multimeric لا يتجزأ GTPase الغشاء الذي يمكن أن تشارك في ديناميات غشاء جولجي أو الاتجار حويصلة.
القسم السابق القسم التالي
paraplegias تشنجي وراثي (شركائنا HSPs) 1 هي مجموعة من الاضطرابات العصبية تتميز بشكل رئيسي من قبل التشنج التدريجي وضعف في الأطراف السفلية (1 - 5). وعادة ما تظهر انحطاط محور عصبي في الأجزاء البعيدة من تصاعدي طويل الألياف العمود الظهري وتنازلي مساحات القشري من الحبل الشوكي، والتي تشكل أطول الحركية والحسية المحاور في النظام العصبي المركزي (6). تاريخيا تم تصنيفها شركائنا HSPs بأنها "نقية" أو "غير معقدة" في حالة حدوث الشلل النصفي التشنجي في عزلة و "معقدة" في حالة وجود تشوهات عصبية أخرى (7). وفي الآونة الأخيرة، يسمح بتحديد مواضع جينية جديدة لشركائنا HSPs تصنيف الجزيئي شركائنا HSPs (+2 - +5). من 20 مواضع معروفة (SPG1-20)، 11 هي مرض وراثي جسمي، ستة هي مقهورة، والثلاثة هم X-ربط. على الرغم من أن معظم المرضى HSP تجربة التدريجي تفاقم الأعراض، وبالنسبة للبعض، لا يظهر هذا الاضطراب أن تكون تقدمية (3، 4). وهكذا، على الرغم من أن بعض شركائنا HSPs بشكل واضح الاضطرابات العصبية (مثل SPG4)، والبعض الآخر مثل SPG1 (بسبب طفرات في L1 جزيء التصاق الخلية) وSPG3A (بسبب طفرات في GTPase atlastin) قد يكون من اضطرابات النمو العصبي (3، 4).
وقد تم تحديد ثمانية جينات المرض لشركائنا HSPs. واستنادا إلى البروتينات المعنية، وقد تقدمت عدة آليات المرضية. وتشمل هذه الإشارات الشاذة خلية أو الهجرة، تشوهات مرافقين الميتوكوندريا، شذوذ تكون الميالين، وعيوب في الاتجار داخل الخلايا والنقل (+2 - 5). البروتينات المتحورة في شركائنا HSPs التي تورطت في البروتين الخلوي أو الاتجار حويصلة تشمل KIF5A (SPG10)، spastin (SPG4)، spartin (SPG20؛ متلازمة تروير)، وatlastin (SPG3A) (استعراضها في المرجعان +2 - 5). KIF5A هو كينيسين العصبية السلسلة الثقيلة بروتين السيارات تشارك في نقل الجزيئات والعضيات غشائي على طول محور عصبي (8). Spastin، وهو عضو في AAA (لA TPases على ssociated مع مجموعة متنوعة من الأنشطة المحددة الخلوية) أسرة البروتين، الزميلة مع الأنابيب الدقيقة، وoverexpression spastin يسبب أنيبيب التفكيك (9). البروتين spartin يشبه VPS4، SNX15 (ق ن ه س ORTING IN-15)، وSKD1 البروتينات، التي تشارك في التشكل الاندوسوم والاتجار البروتين حجرات endosomal (10). شارك هذه البروتينات الأخيرة مع كل من spastin وspartin منطقة تسمى معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (الواردة في م icrotubule- ط nteracting ور rafficking الجزيئات) أو ESP (موجود في E nd13 / VPS4، S NX15، وP ALB) المجال (2، 11) . واستنادا إلى تشابهه مع أعضاء dynamin / MX / بروتين ملزمة guanylate (GBP) الفصيلة من GTPases كبيرة (12)، وatlastin البروتين SPG3A (التي أعيدت تسميتها هنا atlastin-1) وقد تورط في الاتجار داخل الخلايا، ولكن لا يعرف إلا القليل فيما يتعلق توطين الخلوية أو وظيفة (13).
بين شركائنا HSPs، SPG3A الجدير بالذكر بشكل خاص لبداية مبكرة جدا من الشلل النصفي التشنجي النقي. 1 atlastin تم الابلاغ عن خمسة الطفرات مغلطة واحد الإدراج قاعدة واحدة مع إنهاء السابق لأوانه توقع 558 الأحماض الأمينية المنطقة الترميز من (13 - 16). وكان قد تردد أن هذه الطفرات قد يغير هيكل، والتفاعلات، أو النشاط GTPase من atlastin-1 (+13 - +16). أعضاء من dynamin / MX / GBP الفصيلة، atlastin-1 هو الأكثر مشابهة لجيجابايت في الثانية. مثل جيجابايت في الثانية، atlastin-1 تمتلك حلقة RD بدلا من الكلاسيكي (N / T) تسلسل K X D داخل عزر الثالث من ثالوث الإجماع الملزم guanylate (13). ومع ذلك، atlastin-1 تفتقر إلى isoprenylation عزر-C محطة و-C محطة α12 / 13 الحلزون عزر، واثنين من السمات الهيكلية المميزة للعديد من جيجابايت في الثانية (12). هنا، علينا أن نبرهن على atlastin-1 هو GTPase بلازميدة قليلة القسيمات التي، على عكس جيجابايت في الثانية، وتتألف من وحدات فرعية التي هي بروتينات الغشاء لا يتجزأ، مع كل من N و C تيرميني تتعرض للمقصورة حشوية. Atlastin-1 يموضع بشكل بارز إلى جهاز جولجي وأثرت في الخلايا الهرمية القشرية الدماغية، جزء من السكان من الذي يحمل على "axonopathy طويلة" في المرضى الذين يعانون من SPG3A.

إجراءات تجريبية

وقد تم تحديد تسلسل Analysis- Atlastin-1 homologs مع انفجار (17). وقدمت تعيينات الكروموسومات باستخدام NCBI خريطة عارض. 2 الغشاء وتوقع المجالات حلزونية باستخدام نظام SOSUI (18). أجريت التحالفات البروتين مع ClustalW (19). حسبت التشابه تسلسل البروتين باستخدام تحليل BESTFIT (ولاية ويسكونسن الإصدار رزمة 10.3، Accelrys، سان دييغو، CA).
حقيقية النواة التركيبات التعبير الخلايا والحمض النووي Transfection- تسلسل الترميز الكامل للGTPase atlastin-1 (بنك الجينات ™ / بنك الإمارات الدولي رقم انضمام NM_015915 تم تضخيمه) من خلال PCR باستخدام PFU توربو (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا) من الدماغ البشري ماراثون (القشرة المخية ) مكتبة كدنا] (Clontech) وأكده تسلسل الحمض النووي. تم استنساخ [كدنا] بالطول atlastin-1 إلى موقع XmaI من حقيقية النواة pGW1 ناقلات التعبير مع Myc على أو هيماغلوتينين (HA) علامات حاتمة في محطة N كما هو موضح سابقا (20). تم استنساخ كامل طول atlastin-1 [كدنا أيضا في موقع XmaI من pRK5 (جينينتيك، جنوب سان فرانسيسكو، CA) للتعبير عن بروتين غير محدد. Torsin A (رقم القيد AF007871 تم استنساخ) مثل جزء HindIII-BglII إلى pGW1، الذي يسبق-C محطة Myc على العلامة في الإطار. تم تنفيذ موقع الموجه الطفرات باستخدام طريقة QuikChange (Stratagene). خلايا القرد الأخضر COS-7 الأفريقية (أمريكا نوع الثقافة مجموعة CRL-1651) تم الحفاظ عليها، transfected، وتحصد كما هو موضح سابقا (20).
Antibodies- الأجسام المضادة الانجذاب تنقية ضد بقايا 18/01 (رقم 5409؛ MAKNRRDRNSWGGFSEKTC-أميد) و544-558 (رقم 4735؛ أسيتيل CTPKSESTEQSEKKKM-OH) للأعدت atlastin-1 تجاريا (بيوسورس الدولية، هوبكينتون، MA) ، مع cysteines محطة تضاف إلى تسهيل اقتران. تم إعداد الأجسام المضادة أيضا ضد بقايا 947-960 (رقم 5174؛ أسيتيل CEKLDAFIEALHQEK-OH) من OPA1 البشرية / Mgm1 (بنك الجينات ™ / بنك الإمارات الدولي رقم انضمام NM_ 015560) (21، 22). وكانت الماوس وحيدة النسيلة المضادة للMyc على (9E10)، الأرنب بولكلونل مكافحة HA التحقيق (Y-11)، والماعز المضادة للcalregulin (T-19) الأجسام المضادة من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز، كاليفورنيا). الأرنب بولكلونل لمكافحة الصمم-خلل التوتر / وصفت البروتين 1 (DDP1) الأجسام المضادة TIMM8a سابقا (20). وكانت الماوس وحيدة النسيلة المضادة للcalnexin (مفتش 1)، ومكافحة GM130 (مفتش 1)، ومكافحة P115 (مفتش 1) الأجسام المضادة من Pharmingen. وكانت الماوس وحيدة النسيلة أضداد KDEL (استنساخ 10C3، مفتش 2A) من Stressgen في مجال التكنولوجيا الحيوية شركة (فكتوريا، كولومبيا البريطانية، كندا). تم الحصول على الماوس وحيدة النسيلة المرتبطة مكافحة أنيبيب البروتين-2 الأجسام المضادة (استنساخ HM-2، الماوس استسقاء) من سيجما.
وقد تم الحصول على الأنسجة إعداد والتحت خلوية Fractionation- الخليط الأنسجة البشرية من Clontech. أعدت الدماغ الكسور التحت خلوية من الفئران سبراغ داولي (150-175 غرام؛ مختبرات نهر تشارلز، ويلمنجتون، MA). والمتجانس العقول تشريح في 0.32 متر السكروز و 10 HEPES م م (7.4 درجة الحموضة) وطرد في 1330 × ز لمدة 3 دقائق، وتوليد بيليه (P1) وطاف (S1). تم طرد طاف S1 في 21200 × ز لمدة 10 دقيقة، مما ينتج عنه بيليه (P2) وطاف (S2). وبعد ذلك طرد طاف S2 في 200،000 × ز لمدة 1 ساعة، وتوليد بيليه P3 وطاف S3. تم تحديد تركيزات البروتين مقايسة BCA (بيرس) مع ألبومين المصل البقري كمعيار.
تم حل هلام الكهربائي وImmunoblotting- البروتينات بواسطة SDS-PAGE على 10 أو 14٪ والمواد الهلامية الأكريلاميد ونقل electrophoretically إلى النيتروسليلوز (Hybond ECL، أمرشام العلوم البيولوجية). بعد حجب مع الحليب الخالي 5٪، 0.1٪ توين 20، والمالحة تريس مخزنة (الرقم الهيدروجيني 7.4) بين عشية وضحاها، وأضيفت الأجسام المضادة (0،1-1،0 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة عند 25 ° C. بعد عدة غسلات مع 0.1٪ توين 20 و المالحة تريس مخزنة، الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية (1: 3000 تخفيف؛ أمرشام العلوم البيولوجية) وأضيفت لمدة 30 دقيقة. أخيرا، وبعد عدة يغسل مع العازلة حظر، تليها المالحة تريس مخزنة، تم الكشف عن البروتينات مناعيا باستخدام النهضة تعزيز كاشف التوهج (PERKINELMER علوم الحياة).
تم perfused Immunohistochemistry- ثلاثة الذكور البالغين سبراغ داولي الفئران (150-200 ز) transcardially تحت التخدير بنتوباربيتال العميق مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم في 0.1 م العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة)، تليها 4٪ لامتصاص العرق، وأخيرا 10٪ سكروز في 0.1 م الفوسفات العازلة. العقول وظيفة ثابتة لمدة 1 ساعة وحضنت بين عشية وضحاها في الفوسفات مخزنة 30٪ سكروز. وبعد ذلك وضعت العقول على مشراح تجميد ومقطعة إلى المادتين 50 ميكرون سميكة. وقد تم جمع هذه المقاطع في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) وتخزينها في -20 درجة مئوية في حل واق من البرد وتتألف من 30٪ سكروز و 30٪ جلايكول الإثيلين في 0.05 م العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.2) حتى استخدامها.
وقد أجريت رد الفعل المناعى من استخدام عدة ABC النخبة (ناقلات مختبرات، وشركة، بورلنجام، CA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم preincubated المقاطع في 1.0٪ مصل الماعز العادي (خ ع)، 10٪ ألبومين المصل البقري، وبرنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية ثم حضنت لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة لمكافحة atlastin-1 (رقم 5409؛ 0.7 ميكروغرام / مل) في 0.1٪ NGS، 1٪ ألبومين المصل البقري، وبرنامج تلفزيوني. في تجارب السيطرة، وpreincubated المضادة للatlastin-1 الأجسام المضادة (رقم 5409) مع الببتيد مناعة (0.25 μ م) قبل استخدامها. وثم تشطف الأقسام مع برنامج تلفزيوني وحضنت مع مفتش المعقدة البيروكسيديز المضادة للأرنب (ناقلات مختبرات، وشركة) في برنامج تلفزيوني مع 1.5٪ NGS لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. بعد الشطف مع PBS، حضنت المقاطع مع مجمع ABC (ناقلات مختبرات، وشركة) لمدة 45 دقيقة وتشطف مرة أخرى. تم الكشف عن الغلوثانيون تلطيخ باستخدام 3،3'-diaminobenzidine (مجموعة DAB سريعة، سيغما). وقد شنت المقاطع على Superfrost زائد الشرائح (فيشر)، المجففة، وcoverslipped مع Cytoseal 60 (ستيفنز العلمي، ريفرديل، NJ) المجفف في الهواء.
وأعدت العصبية الثقافة وImmunocytochemistry- الابتدائية ثقافات العصبونات القشرية الفئران الجنينية من الأجنة يوم 18 الفئران وصيانتها كما هو موضح سابقا (23). بعد 6 أيام في الثقافة، تم إصلاح الخلايا العصبية مع 4٪ الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية. غسلها عدة مرات مع برنامج تلفزيوني. ثم permeabilized ومنعت لمدة 30 دقيقة في 5٪ NGS، 0.2٪ سابونين، وبرنامج تلفزيوني. وحضنت الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة ضد atlastin-1 (رقم 5409 و 10 ميكروغرام / مل)، وأنيبيب المرتبطة بروتين-2 (1: 200 تمييع)، P115 (0.5 ميكروغرام / مل)، GM130 (0.5 ميكروغرام / مل)، أو KDEL (1.9 ميكروغرام / مل) في 3٪ NGS، 0.05٪ سابونين، وبرنامج تلفزيوني. بعد غسل ثلاث مرات مع PBS، حضنت الخلايا مع اليكسا فلور 488- واليكسا فلور الأجسام المضادة الثانوية 568-مترافق (1: 500 التخفيف؛ المسابر الجزيئية، وشركة، يوجين، OR) في 3٪ NGS، 0.05٪ سابونين، وPBS لمدة 30 دقيقة، تليها ثلاث يغسل مع برنامج تلفزيوني. وكانت Coverslips ثم شنت باستخدام هلام / جبل (Biomeda، فوستر سيتي، كاليفورنيا). تم الحصول على صور الفلورسنت مع المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر زايس Axiovert 100M ومعالجتها مع برنامج أدوبي فوتوشوب.
أعدت Immunogold الكترون Microscopy- الفئران الثقافات الخلايا العصبية القشرية كما هو موضح أعلاه. بعد 6 أيام في الثقافة، تم إصلاح الخلايا العصبية مع بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة) لمدة 30 دقيقة ثم يغسل مع العازلة 0.1 م الفوسفات. تم permeabilized الخلايا ومنعت في 5٪ NGS، 0.1٪ سابونين، وبرنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة وحضنت مع مكافحة atlastin-1 الأجسام المضادة (رقم 5409) أو بدون الأجسام المضادة الأولية كعنصر تحكم في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة. بعد غسل مع 1٪ NGS في برنامج تلفزيوني مع 2٪ الحليب الخالي في برنامج تلفزيوني، وحضنت الخلايا مع 1.4 نانومتر Nanogold الذهب مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية (1: 250 التخفيف؛ Nanoprobes، Yaphank، NY) في 2٪ الحليب الخالي في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. بعد غسل مع 2٪ الحليب الخالي في برنامج تلفزيوني، تم إصلاح الخلايا مع 2٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. وأخيرا، فإن خلايا غسلها جيدا مع PBS والماء المقطر، محسنة الفضة (HQ طقم فضة، Nanoprobes)، وغسلها مرة أخرى بالماء و 0.1 م العازلة الفوسفات. تم علاج الخلايا مع 0.2٪ أوسو 4 في 0.1 م العازلة الفوسفات لمدة 30 دقيقة، mordanted ككل مع 0.25٪ خلات اليورانيل في المخزن خلات (الرقم الهيدروجيني 5.0) بين عشية وضحاها، وغسلها والمجففة مع تركيزات المسلسل من الإيثانول، وأخيرا تسلل وجزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي. أقسام رقيقة من ~70 نانومتر كانت counterstained مع خلات اليورانيل وسترات الرصاص وفحصها تحت المجهر الإلكتروني JEOL 1200 نقل EXII. وقد تم جمع الصور الرقمية مع كاميرا XR-100 CCD (تقنيات متقدمة الميكروسكوب، دانفرس، MA).
جمعية غشاء Assays- COS-7 خلايا overexpressing تم غسلها atlastin-1 مرتين مع 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) ومن ثم تحصد في 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 10 م م كلوريد الصوديوم، و 1.5 م م MgCl 2. بعد مرور عدة من خلال إبرة عيار 25، وطرد جناسة في 1330 × ز. كان sonicated طاف ما بعد النووي ومن ثم recentrifuged في 200،000 × ز لمدة 60 دقيقة، مما أسفر عن بيليه (هي lysed جزء الغشاء) وجزء للذوبان. كان يعالج جزء الغشاء مع 1 م كلوريد الصوديوم و 25 م عازلة م الفوسفات (7.4 درجة الحموضة)، مع 100 متر عازلة م الجلايسين (درجة الحموضة 2.8)، مع 100 متر عازلة م كربونات (درجة الحموضة 11.0)، مع 0.1٪ تريتون X-100 و PBS، أو مع 1.0٪ deoxycholate الصوديوم وPBS كما هو مبين وطرد على 200،000 × ز لمدة 60 دقيقة لتوليد بيليه النهائي وطاف. في تجارب أخرى، أعدت كسور قابلة للذوبان وغشاء من COS-7 خلايا overexpressing Myc على الموسومة البرية من نوع atlastin-1 أو مختلف MYC الموسومة atlastin-1 بنيات الحذف. ثم تم immunoblotted بنسب متساوية من الكسور القابلة للذوبان والغشاء مع أضداد Myc على. تعرض الأغشية من الخلايا COS-7 overexpressing لازال الكسور atlastin-1 و غشاء P3 أعدت من دماغ الفئران للتخلص التقسيم مع تريتون X-114 كما وصفها برودييه (24)، وبنسب متساوية من مائي والمنظفات مراحل تم immunoblotted مع anti -atlastin-1 الأجسام المضادة (رقم 5409).
1 atlastin تم غسلها البروتيني الهضم وDeglycosylation Assays- COS-7 خلايا overexpressing غير محدد مرتين مع 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) ومن ثم جمعها في 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 10 م م كلوريد الصوديوم، 1.5 م م MgCl 2، و 10٪ سكروز. صدرت الخلايا من خلال إبرة عيار 25، وطرد جناسة في 3000 × ز لمدة 3 دقائق. تم تجاهل بيليه، وطرد طاف في 130،000 × ز لمدة 60 دقيقة. كان معلق هذا بيليه الأخير في المخزن نفسه مع أو بدون بروتين K (EC 3.4.21.64؛ سيغما) في أي من 50 μ م (30 دقيقة، 25 ° C) أو 200 μ م (15 دقيقة، 37 ° C). أنهيت ردود الفعل مع 2 م م phenylmethylsulfonyl الفلورايد، يليه مباشرة تحلل في SDS-PAGE عينة العازلة. ثم تم immunoblotted العينات مع الأجسام المضادة ضد محطة C (رقم 4735) أو N محطة (رقم 5409) من atlastin-1 أو مع أضداد calregulin. تم تنفيذ كما هو موضح سابقا (؛ deglycosylation بروتين الببتيد مع N -glycosidase F (نيو إنجلاند Biolabs شركة، بيفرلي، MA EC 3.5.1.52) 25).
أجريت الخميرة ثنائي هجين الخميرة Tests- الاختبارين الهجين باستخدام الخميرة سلالة L40 إيواء الجينات مراسل HIS3 وβ غالاكتوزيداز تحت سيطرة مواقع ملزم LexA المنبع كما هو موضح سابقا (20). أنتجت Atlastin-1 بنيات الحذف بواسطة PCR التضخيم باستخدام PFU توربو واستنسخ في الإطار إلى pGAD10 الفريسة وpBHA ناقلات الطعم (Clontech). وقد أكد كل بنيات من تسلسل الحمض النووي. كان يعاير قوة التفاعل من قبل بيتا غالاكتوزيداز وHIS3 الاستقراء كما هو موضح سابقا (20).
الخلايا COS-7 مناعي والكيميائية عبر linking- شارك transfected مع HA- وMyc على-atlastin-1 أو مع transfected Myc على-atlastin-1 تم غسلها وحدها مرتين مع برنامج تلفزيوني ثم تحصد في 0.5٪ تريتون X-100 و PBS و وأوضحت بواسطة الطرد المركزي في 130،000 × ز لمدة 30 دقيقة. وحضنت مقتطفات (100 ميكروغرام من البروتين) لمدة 1-2 ساعات في 4 درجة مئوية مع 5 ميكروغرام من أرنب بولكلونل مكافحة HA الأجسام المضادة التحقيق (Y-11) إلى جانب مسبقا إلى البروتين A-سيفاروز CL-4B (أمرشام العلوم البيولوجية). تم غسلها حبات ثلاث مرات مع 0.5٪ تريتون X-100 و PBS. تم حل البروتينات ملزمة SDS-PAGE وimmunoblotted مع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للأضداد Myc على. تم إجراء الكيميائية مع dithiobis (succinimidyl بروبيونات) ربط الصليب (بيرس) باستخدام الكريات سرعة عالية من طاف بعد النووي المستمدة من Myc على-atlastin-1-overexpressing الخلايا COS-7. تمت إضافة الكريات ومعلق في برنامج تلفزيوني، وdithiobis (succinimidyl بروبيونات) لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم حل المنتجات المرتبطة الشاملة التي SDS-PAGE تحت ظروف امختزل وimmunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على.
هلام استبعاد FPLC- Myc على الموسومة من النوع البري أو حذف المسوخ من atlastin-1 overexpressed في COS-7 خلايا كانت هي lysed في 0.1٪ تريتون X-100 و PBS وأوضحت بواسطة الطرد المركزي في 130،000 × ز لمدة 30 دقيقة. تم تطبيق استخراج القابلة للذوبان إلى Superdex 200 HR10 / 30 FPLC العمود (أمرشام العلوم البيولوجية) بمعدل تدفق 0،25 مل / دقيقة في 0.1٪ تريتون X-100 و PBS. تم جمع الكسور (0.25 مل)، وحلت البروتينات بواسطة SDS-PAGE ثم immunoblotted باستخدام أجسام مضادة لمكافحة Myc على. تم تطبيق معايير البروتين (سيغما وأمرشام العلوم البيولوجية) في 0.1٪ تريتون X-100 و PBS إلى العمود لتوليد منحنى القياسية، والتي تم حساب الجماهير الجزيئية الأم لمن النوع البري وطفرات حذف atlastin-1.
GTPase آخر Assays- وكدنا] atlastin-1 وsubcloned إلى pCAL-N-EK لإنتاج ملزم كالمودولين الببتيد (CBP) البروتينات الانصهار (Stratagene). وكان المستحث التعبير عن CBP-atlastin-1 في القولونية BL21 (DE3) من خلال 100 μ M-الآيزوبروبيل β- د -thiogalactopyranoside ل 4.5 ساعة عند 25 ° C. بعد التكوير، ومعلق الخلايا في 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 150 م م كلوريد الصوديوم، 5 م م MgCl 2، 2 م م CaCl 2، 10٪ الجلسرين، 10 م م β المركابتويثانول، 1.0٪ تريتون X وأوضح -100، و 0.5 م م phenylmethylsulfonyl الفلورايد وتمزق من قبل اثنين من الممرات من خلال خلية الضغوط الفرنسية على 10000 رطل استخراج بواسطة الطرد المركزي في 50000 × ز لمدة 30 دقيقة ومن ثم تطبيقها على الراتنج كالمودولين تقارب (Stratagene). بعد غسل مع 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 150 م م كلوريد الصوديوم، 5 م م MgCl 2، 2 م م CaCl 2، 10 م م β المركابتويثانول، و 0.1٪ تريتون X-100، وكانت البروتينات الانصهار ملزمة مزال مع 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 150 م م كلوريد الصوديوم، و 10 م م β المركابتويثانول، 2 م م EGTA، و 0.1٪ تريتون X-100. كان مدال-تنقية تقارب CBP-atlastin-1 انصهار بروتين ضد عازلة فحص (20 م م HEPES (درجة الحموضة 7.2)، 2 م م MgCl 2، و 1 م م dithiothreitol). وشمل خليط التفاعل لفحص GTPase مدال CBP-atlastin-1 مع 0.05٪ ألبومين المصل البقري و0.825 μ م [α- 32 P] GTP (3000 تسى / مليمول؛ ICN Biomedicals، إرفين، كاليفورنيا) في المخزن الفحص. وقد شوهدت عينات من خليط التفاعل عند نقاط زمنية مختلفة (0-60 دقيقة) على السليلوز polyethyleneimine على لوحات البوليستر TLC (سيغما). تم فصل النيوكليوتيدات جوانين التي كتبها تصاعدي اللوني في 1 م LiCl و 1.2 متر حمض الفورميك. و[32 P] الناتج المحلي الإجمالي، وحددت [32 P] البقع GTP، وكان كميا شدة باستخدام PhosphorImager والبرمجيات ImageQuant (أمرشام العلوم البيولوجية). وأعرب عن النشاط GTPase كنسبة من الناتج المحلي الإجمالي لمجموع النيوكليوتيدات جوانين (GTP + GDP) في كل نقطة زمنية.

النتائج

Atlastin عائلة GTP ملزم Proteins- بحثنا النوكليوتيدات والبروتين قواعد بيانات لبروتينات بشرية مماثلة لatlastin (التي أعيدت تسميتها atlastin-1) وجدت اثنين من البروتينات ذات الصلة للغاية (الشكل 1). واحد، والتي تم تحديدها سابقا ARL-6-التفاعل البروتين 2 (بنك الجينات ™ / بنك الإمارات الدولي رقم انضمام NM_022374)، أننا قمنا بتغيير اسم atlastin-2. الآخر قمنا اسمه atlastin-3 (انضمام عدد AK097588). في حين تم العثور على الجين atlastin-1 على 14q22.1 الصبغي (ID موضع 51062)، يموضع الجين atlastin-2 إلى 2p22.3 كروموسوم (ID موضع 64225)، وهذا الجين atlastin-3 إلى الكروموسوم 11q13.1 (ID مكان 25923). تظهر هذه البروتينات التماثل واسعة، مع نواة مركزية كبيرة من أعلى التشابه التي تضم منطقة ملزم GTP في الجزء N-المحطة. يحدث أكبر قدر من الاختلاف في C و N تيرميني (الشكل 1). هناك 69٪ الهوية الأحماض الأمينية و 79٪ تشابه بين atlastin-1 وatlastin-2 على 533 بقايا و 66٪ الهوية المركزية و 75٪ تشابه بين atlastin-1 وatlastin-3 على 476 المخلفات. Atlastin-2 والهوية atlastin-3 حصة 67٪ و 78٪ تشابه أكثر من 482 المخلفات. أيضا، توقع اثنين من اللوالب عبر الغشاء (SOSUI) (18 تم حفظها) في جميع البروتينات الثلاثة. باستخدام نفس البرنامج التنبؤ SOSUI، GBP1 البشري (عدد الانضمام NM_002053) والمتعلقة GTPase ماج 2 (عدد الانضمام M81128) عدم وجود أي توقع المجالات عبر الغشاء، بما يتفق مع التقارير السابقة (12). تسلسل توافق في الآراء بشأن N -linked بالغليكوزيل وMYB DNA ملزمة سابقا ذكرت لatlastin-1 (13) لا يتم حفظها في atlastin-2 وatlastin-3 (الشكل 1).

F IG. 1.
. عائلة Atlastin من البروتينات في البشر Atlastin (التي أعيدت تسميتها هنا atlastin-1 (ATL1)) هي مشابهة جدا لاثنين من البروتينات لدينا اسم atlastin 2 (ATL2، ويعرف أيضا باسم ARL-6-التفاعل البروتين 2) وatlastin-3 (ATL3 ). مظللة بقايا متطابقة في جميع البروتينات ثلاثة البرتقال، وتلك متطابقة في اثنين من البروتينات ثلاثة مظللة الأخضر. خطوط عريضة تشير إلى توقع المجالات عبر الغشاء. ومحاصر الزخارف ملزم GTP. النجمة للدلالة مواقع الطفرات مغلطة في المرضى الذين يعانون من SPG3A. يتم حفظها بشدة هذه المخلفات في atlastin-2 وatlastin-3. سهم يصادف موقع طفرة انزياح الإطار في عائلة واحدة مع SPG3A. مواقع توافق في الآراء بشأن N -linked بالغليكوزيل (#) والحمض النووي ملزم نطاق MYB (^) في atlastin-1 يشار؛ هي الحفاظ أيا من هذه في كل atlastin-2 وatlastin-3. A البديل من atlastin-3 مع الإدراج حمض 26-الأمينية التالية سر 74 (بنك الجينات ™ / بنك الإمارات الدولي رقم انضمام CAB56010) والبديل من atlastin-2 مع محطة رواية C (38 بقايا) التالية فال 545 (انضمام عدد AAM97342)، سواء الناتجة عن الربط البديلة، كما تم الإبلاغ عنها.

تحديد والتحت خلوية توطين Atlastin-1 بروتين ولدت أضداد الببتيد محددة ضد متباينة N (رقم 5409) وC (رقم 4705) تيرميني من atlastin-1. تم الكشف عن Atlastin-1 في ~64 كيلو دالتون على immunoblots من الخليط من COS-7 الخلايا، بما يتفق مع حجمها المتوقع، ولكن ليس في تلك الخلايا من untransfected (atlastin-1-overexpressing الشكل 2 A). وتم الحصول على نتائج مماثلة مع أضداد الببتيد التي أثيرت ضد كل من N (الشكل 2 A) وC (لا تظهر البيانات) تيرميني. تم الكشف عن Atlastin-1 أيضا في الخليط من أنسجة الفئران والدماغ البشري، مع عدم الرد عبر العصابات البروتين (الشكل 2 A). تم إلغاء إشارة مناعيا عندما preadsorbed الأجسام المضادة مع الببتيد مناعة (1 μ م) (لا تظهر البيانات). والأكثر ثراء Atlastin-1 في المخ، ولكن كان حاضرا أيضا في العديد من الأنسجة البشرية الأخرى في مستويات أقل من ذلك بكثير (الشكل 2 B). وعلى سبيل المقارنة، كان الميتوكوندريا البروتين الفضاء intermembrane DDP1 / TIMM8a توزيع الأنسجة أكثر تجانسا (الشكل 2 B). درسنا توطين التحت خلوية من atlastin-1 باستخدام الكسور الدماغ الفئران بواسطة الطرد المركزي التفاضلي (إعداد الشكل 2 C). وقد أثرى كلا atlastin-1 وهيولي باطني البروتين شبكية calregulin في جزء الميكروسومي P3. في المقابل، كان الميتوكوندريا البروتين OPA1 / Mgm1 الأكثر وفرة في بيليه P2، مع مستويات أقل من ذلك بكثير في جزء P3.

F IG. 2.
توطين التحت خلوية من atlastin-1. توصيف بولكلونل مكافحة atlastin-1 الأجسام المضادة. تم immunoblotted؛ لست] من همية transfected (10 ميكروغرام من البروتين / حارة) أو atlastin-1 (AT1) -transfected (5 ميكروغرام من البروتين) COS-7 الخلايا وكذلك الخليط الدماغ البشري والفئران (20 ميكروغرام من البروتين H) مع الأجسام المضادة ضد atlastin-1 (رقم 5409). وترد الهجرات المعايير الكتلة الجزيئية (في kilodaltons). توزيع الأنسجة من atlastin-1. جرى التحقيق مجموع الخليط (20 ميكروغرام / حارة) من الأنسجة البشرية المشار إليها مع الأجسام المضادة لمكافحة atlastin-1 (رقم 5409) أو معاداة DDP / TIMM8a (DDP1) ن خ الأجسام المضادة، على نحو سلس؛... كورونا، الهيكل العظمي C. تجزئة البيوكيميائية من atlastin-1. تم إعداد الكسور التحت خلوية من دماغ الفئران بواسطة الطرد المركزي التفاضلي (انظر "الإجراءات التجريبية" لمزيد من التفاصيل). تم immunoblotted الكسور (20 ميكروغرام من البروتين / لين) مع الأجسام المضادة لatlastin-1 (رقم 5409)، وهيولي باطني البروتين شبكية calregulin (Calreg)، والبروتين OPA1 الميتوكوندريا.

درسنا توطين الذاتية atlastin-1 في أقسام دماغ الفئران باستخدام الأجسام المضادة الناتجة ضد N محطة من atlastin-1 (رقم 5409) (الشكل 3). كانت خلايا immunopositive غاية الأكثر وفرة في الصفيحة V من القشرة الدماغية، بما في ذلك القشرة الحركية. على الرغم من أن سوما الخلايا العصبية وصفت بشدة، كانت ملطخة أيضا شجرة شجيري (الشكل 3، A-C). وكان القضاء المناعية عندما preadsorbed الأضداد المضادة للatlastin-1 لأول مرة مع الببتيد مناعة (الشكل 3 D). كان وضع العلامات أيضا بارز في قرن آمون، لا سيما في الخلايا العصبية الهرمية في CA1 CA3 و(الشكل E و F). من ناحية أخرى، لم يكن هناك أي تلطيخ للكشف في المخيخ. على الرغم من مناعية قليلة كان حاضرا في المخطط، مع المناعية المعتدل يقتصر على جزء من السكان من الخلايا العصبية كوليني كبيرة، وتلطيخ أكثر قوة واضحا في الخلايا العصبية داخل اللوزة والعديد من النوى المهادية. 3 A عدد الخلايا في عدة نوى mesopontine، بما في ذلك substantia الظهرية المادة الرمادية في الدماغ بارس المكتنزة ومنطقة retrorubal، ملطخة باعتدال. 3

F IG. 3.
توطين Immunocytochemical من atlastin-1 في دماغ الفئران. atlastin-1 هو وفرة في الخلايا الهرمية في الصفيحة V من القشرة الدماغية. B و C والصور التكبير أعلى من هذه الخلايا الهرمية القشرية تظهر مناعية شديدة في سوما وشجرة شجيري . preadsorption من الأجسام المضادة لمكافحة atlastin-1 (رقم 5409) مع الببتيد مناعة القضاء على المناعية محددة في قشرة الدماغ (قارن مع B). E و الخلايا الهرمية في المنطقة CA1 من الحصين تظهر أيضا immunolabeling القوي للمقصورة somatodendritic. أشرطة النطاق = 200 ميكرومتر (A)، 50 ميكرون (B، D و E)، و 25 ميكرون (C و F).

لإنشاء توطين atlastin-1 على مستوى التحت خلوية، تم فحص مثقف الخلايا العصبية القشرية الدماغية باستخدام مزدوج التسمية المناعي. تم العثور Atlastin-1 تلطيخ أبرزها في سوما الخلية، مع تلطيخ ضعف في العمليات العصبية، التي تضم كلا من المحاور والتشعبات (الشكل 4). وقد شارك في توطين محدودة للغاية مع علامات للالشبكة الإندوبلازمية (أضداد KDEL)، وكان ينظر أي تداخل من atlastin-1 وضع العلامات مع الميتوكوندريا ملطخة MitoTracker CMXRos (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، P115، وهي علامة للحصول على جهاز جولجي، بإحكام شارك المترجمة مع atlastin-1 (الشكل 4، A-C). واعتبر المشاركة في توطين مع atlastin-1 أيضا مع علامة GM130 جولجي، ولكن بدرجة أقل (لا تظهر البيانات). تم حجب إشارة مناعيا atlastin-1 من قبل preadsorption من الأجسام المضادة مع الببتيد مناعة (لا تظهر البيانات). في التعرض أطول، كان ينظر منقط تلطيخ في التشعبات والمحاور (الشكل 4، D-F). ومع ذلك، كان هذا تلطيخ أقل كثافة بكثير من تلك التي شوهدت المرتبطة جهاز جولجي في خلايا الجسم العصبية.

F IG. 4.
. توطين التحت خلوية من atlastin-1 إلى جهاز جولجي بالنقر المزدوج التسمية المناعي يظهر هو المشارك توطين atlastin-1 المناعية (أحمر، A) مع P115 جولجي علامة (الأخضر؛ B). وأظهرت الصورة المدمجة في C. في التعرض أطول، خافت atlastin-1 المناعية (الأحمر؛ D) غير مرئية داخل التشعبات (الأسهم الصغيرة)، والتي تم تحديدها من قبل costaining مع المرتبطة مكافحة أنيبيب الأجسام المضادة بروتين-2 (الأخضر؛ E)، والمحاور (النصال ). يظهر الصورة المدمجة في F. الحانات النطاق = 20 ميكرومتر.

لتأكيد هيمنة جولجي من الذاتية atlastin-1 بروتين، درسنا توطين atlastin-1 في الخلايا العصبية القشرية مثقف من قبل immunogold المجهر الإلكتروني (الشكل 5). وفرة من العلامات immunogold زينت جهاز جولجي، في الغالب رابطة الدول المستقلة -Golgi صهاريج (الشكل A و B). كان هذا وضع العلامات غير موجودة في أقسام التحكم التي تم حذف الأجسام المضادة الأولية (الشكل C و D). واعتبر أي تلطيخ محددة في الميتوكوندريا أو في النواة.

F IG. 5.
توطين التحت خلوية من atlastin-1 إلى جهاز جولجي من قبل immunogold المجهر الإلكتروني. A و B، توطين atlastin-1 داخل جهاز جولجي، وخاصة رابطة الدول المستقلة -Golgi صهاريج. C و D، أقسام التحكم فيها الانتخابات التمهيدية المناهضة للatlastin- 1 antibodies were omitted. Scale bars = 500 nm ( A and C ) and 100 nm ( B and D ).

Atlastin-1 هل يتجزأ غشاء بروتين استنادا إلى نتائج تجزيء التحت خلوية وimmunolabeling، درسنا ما إذا atlastin-1 هو الغشاء لا يتجزأ أو بإحكام غشاء المرتبطة البروتين جولجي، ومقارنتها مع البروتينات المعروفة تحت مختلف الظروف استخراج الغشاء. Atlastin-1 overexpressed في الخلايا COS-7 تقسيم حصرا لكسر الغشاء، الذي كان قد هي lysed صوتنة للافراج عن البروتينات اللمعية القابلة للذوبان وتعرض لتنبيذ فائق (الشكل 6 A). والجدير بالذكر، تم العثور على نسبة كبيرة من البروتين للذوبان اللمعية calregulin في طاف، مؤكدا تحلل كفاءة microsomes ل. تم العثور على بروتين الغشاء لا يتجزأ calnexin حصرا في جزء الغشاء (الشكل 6 A). وقد تعرض هذا جزء الغشاء لمختلف الظروف استخراج (أي ملح عالية، وانخفاض درجة الحموضة، ودرجة الحموضة العالية، والمنظفات الصناعية) لتحديد ما إذا atlastin-1 هو بروتين الغشاء لا يتجزأ. Atlastin-1 تقسيم لطاف بطريقة مشابهة للبروتين الغشاء لا يتجزأ calnexin. لا atlastin-1 أفرج عنه ولا calnexin من جزء الغشاء مخازن درجة الحموضة منخفضة أو عالية، ولكن كلا atlastin-1 وcalnexin تم solubilized بكفاءة عن طريق المنظفات (الشكل 6 A). في المقابل، تم الإفراج عن جزء المرتبطة غشاء calregulin من الأغشية ليس فقط عن طريق المنظفات، ولكن أيضا من جانب كل من مخازن درجة الحموضة العالية والمنخفضة (الشكل 6 A). مرحلة التقسيم مع تريتون X-114 تظاهر توزيع atlastin-1 في الغالب إلى مرحلة المنظفات، في حين تم العثور على غشاء المرتبطة قابل للذوبان البروتين calregulin في المرحلة المائية (الشكل 6 B).

F IG. 6.
Atlastin-1 هو بروتين الغشاء لا يتجزأ. A، جمعية غشاء atlastin-1. و transfected COS-7 الخلايا مع غير محدد atlastin-1. Atlastin-1 مجزأة في غشاء الكرية هي lysed (Memb)، ولكن ليس جزء عصاري خلوي للذوبان (سول) المستمدة من ارتفاع الطرد المركزي سرعة طاف ما بعد النووي (Homog)، والكشف عنها من قبل immunoblotting مع مكافحة atlastin-1 الأجسام المضادة. كان معلق هذا بيليه في وقت لاحق في أملاح المحددة أو المنظفات ثم refractionated عن ارتفاع الطرد المركزي بسرعة إلى طاف (S) وبيليه غشاء (P). وأطلق سراح Atlastin-1 من الأغشية بطريقة مشابهة لغشاء لا يتجزأ من البروتين calnexin، ولكن ليس للبروتين calregulin القابلة للذوبان وغشاء المرتبطة. DOC، 1.0٪ deoxycholate الصوديوم، TX-100، 0.1٪ تريتون X-100 B، تريتون X-114 مرحلة التقسيم. تم تقسيم الأغشية من atlastin-1 transfected-COS-7 الخلايا والفئران الدماغ الكسور P3 مع تريتون X-114 (TX-114)، وقسامات من المواد ابتداء من (المدخلات) وكذلك مائي والمنظفات (تريتون X-114) تم immunoblotted مراحل مع أضداد calregulin مكافحة atlastin-1 و. وقد أثرى Atlastin-1 في المرحلة المنظفات، في حين تم العثور على calregulin في المرحلة المائية. C، يطلب من المجالات مسعور من atlastin-1 للجمعية الغشاء. supernatants آخر النووية من COS-7 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع ومجزأة من النوع البري atlastin-1 أو حذف المسوخ كما هو موضح لMyc على الموسومة A وimmunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. حذف كل من توقع المجالات عبر الغشاء (H)، ولكن N- وC-محطة الحذف ليس أصغر، وانخفاض ملحوظ جمعية غشاء atlastin-1 (السهم). يشار إلى الأحماض الأمينية الحدود.

لتحديد ما إذا كان اثنين من المجالات مسعور في atlastin-1 تمثل المجالات عبر الغشاء، استخدمنا عدة Myc على الموسومة N- وC-محطة atlastin-1 الحذف لتقييم التوطين لطاف أو الكسور غشاء (الشكل 6 C). كان من النوع البري atlastin-1 موجودة في جزء الغشاء، ولم الحذف صغيرة في N وC تيرميني لا يغير من جمعية الغشاء بشكل ملحوظ (الشكل 6 C). ومع ذلك، توقع الحذف-C المحطة أن إزالة اثنين من المجالات عبر الغشاء، atlastin-1- (1-447)، تسبب في إعادة توزيع البروتين إلى جزء طاف (الشكل 6 C)، مشيرا إلى أن هذه المجالات المطلوبة للغشاء المرفق. كان A-C محطة 111 بقايا atlastin-1 جزء يحتوي على المجالات عبر الغشاء توقع (بقايا 448-558) كافية لجمعية غشاء (الشكل 6 C).
لتقييم طوبولوجيا عبر الغشاء من البروتين atlastin-1، استخدمنا الحويصلات الميكروسومي سليمة من COS-7 خلايا overexpressing atlastin-1 في مقايسة حماية البروتيني (الشكل 7 A). فقد مناعية لكلا N و C تيرميني على علاج microsomes ل مع بروتين K، على الرغم من أن تركيزات أعلى هناك حاجة لإزالة كاملة للنطاق N-محطة (الشكل 7 A). وتشير هذه النتائج التي يتعرض لها كل من N و C تيرميني لمواجهة حشوية من الغشاء. في تجارب السيطرة، كان calregulin البروتين اللمعية محمية تماما من التحلل البروتيني في نفس العينات (الشكل 7 A)، حتى بتركيزات أعلى من الأنزيم البروتيني (لا تظهر البيانات). وتمشيا مع هذا الاستنتاج هو أن تحور المواقع إجماع الثلاثة لN -linked بالغليكوزيل في atlastin-1 (N177Q، N236Q، وN436Q) لم يغير هجرة atlastin-1 على SDS-PAGE، ولم المعاملة مع الببتيد N - غليكوزيداز F (الشكل 7 B). في تجارب السيطرة، وبروتين سكري يعرف torsin ألف (26، 27) overexpressed في COS-7 خلايا وdeglycosylated بكفاءة عن طريق الببتيد N -glycosidase F (الشكل 7 B). وبالتالي، ليس لدينا أي دليل على أن هذه المواقع إجماع في atlastin-1 وN -glycosylated في الجسم الحي، بما يتفق مع دينا نموذج مقترح الغشاء طوبولوجيا (الشكل 7 C).

F IG. 7.
الغشاء طوبولوجيا atlastin-1. A، المقايسات حماية البروتيني. تركيزات المشار إليها (في ميكروغرام / مل) من بروتين K (بروت K أضيفت) لmicrosomes ل سليمة أعدت من COS-7 خلايا overexpressing غير محدد atlastin-1. تم immunoblotted العينات مع الأجسام المضادة ضد N (رقم 5409) أو C (رقم 4735) محطة من atlastin-1 أو مع أضداد calregulin. هاجر سليمة atlastin-1 في ~64 كيلو دالتون، وcalregulin سليمة (Calreg) في ~60 كيلو دالتون. سهام دلالة منتجات الهضم الجزئي. يشار إلى مناصب هجرة معايير الكتلة الجزيئية (في kilodaltons). B، لا atlastin-1 N -glycosylated. مقتطفات من COS-7 الخلايا معربا عن torsin A-Myc على أو Myc على الموسومة البرية من نوع atlastin-1 أو atlastin-1 مع الطفرات في المواقع إجماع الثلاثة لN -linked بالغليكوزيل (N177Q، N263Q، وN436Q؛ Glycos موت) وحضنت مع الببتيد N -glycosidase F (PNGase F) كما هو مبين وimmunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. لا الطفرات ولا الببتيد N -glycosidase F العلاج غيرت هجرة atlastin-1 من قبل SDS-PAGE. Torsin A-Myc على، وهو بروتين سكري معروف، وdeglycosylated التي كتبها الببتيد N -glycosidase F في ظل نفس الظروف. C، الهيكل التخطيطي المقترح atlastin-1 الغشاء طوبولوجيا.

Atlastin-1 هو بلازميدة قليلة القسيمات بروتين أعضاء dynamin / MX / GBP شكل الأسرة المجمعات البروتين وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الجسم الحي، وسعينا لتحديد ما إذا atlastin-1 أشكال oligomers كذلك. باستخدام الخميرة الاختبارين الهجين، اكتشفنا التفاعل القوي من كامل طول atlastin-1 مع نفسه (الشكل 8 A). كنا قادرين على تضييق المجالات المطلوبة للتفاعل الذاتي من قبل يحلل الحذف. وقد انخفض التفاعلات أو القضاء عليها مع كل من N- والحذف-C محطة (الشكل 8 A). أيضا، لم نجد رابطة بين المجالات بين عدة N- مختلفة وC-الطرفية يبني المجال (الشكل 8 A)، على الرغم من بين المجالات وضمجزيئي التفاعلات أثبتت للأعضاء الآخرين من dynamin / MX / GBP الفصيلة (12، 28 - 31). في التجارب المشتركة مناعي، تفاعلت Myc على-atlastin-1 مع HA-atlastin-1 (الشكل 8 B)، مما يدل على الارتباط الذاتي من atlastin-1 overexpressed في COS-7 الخلايا. وبناء على نتائج التجارب عبر ربط الكيميائية، ويبدو atlastin-1 الأكثر احتمالا أن يكون homotetramer، مع المنتجات في ~110، ~160، و~230 كيلو دالتون بالإضافة إلى الفرقة مونومر في 64 كيلو دالتون (الشكل 8 C) . باستخدام هلام استبعاد FPLC، وجدنا أن المنظفات solubilized atlastin-1 مزال في حجم الأصلي لل~280 كيلو دالتون، بما يتفق مع هيكل رباعي القسيمات المقترحة (الشكل 8 D). ومع ذلك، لأن عبر ربط atlastin-1 المنتج في ~230 كيلو دالتون كان مرئيا ضعيفة، وكان من الصعب تقدير مساهمة المنظفات لتقديرات لحجم قليل وحدات atlastin-1 من قبل هلام الاستبعاد اللوني، ونحن لا يمكن أن يستبعد هيكل رباعي مثلوثي للبروتين atlastin-1 في الجسم الحي. ومن المثير للاهتمام، هاجر atlastin-1- (1-516)، الذي يحتوي على المجالات عبر الغشاء المفترضة أيضا في حجم الأصلي مماثل على هلام الاستبعاد اللوني. ومع ذلك، مزال atlastin-1- (1-447)، الذي يفتقر إلى المجالات عبر الغشاء، كما قمم متعددة (الشكل 8 D)، مما يدل على أن اثنين توقع يطلب من المجالات عبر الغشاء لالتشكل السليم و / أو oligomerization من atlastin-1.

F IG. 8.
أشكال 1 Atlastin-وطي oligomers. مصفوفة من الخميرة المقايسات يومين الهجينة تظهر تفاعلات مختلف atlastin-1 (AT) N- وبنيات الحذف C-المحطة. يشار إلى حدود بقايا الأحماض الأمينية. وكان يعاير قوة التفاعل من قبل HIS3 وβ غالاكتوزيداز الاستقراء كما وصفها بلاكستون وآخرون. (20). في جميع الحالات، HIS3 وβ غالاكتوزيداز تحريض المترابطة. B، وشارك في مناعي من Myc- وHA الموسومة atlastin-1 البروتينات. و transfected الخلايا COS-7 مع أشارت atlastin-1 بنيات وimmunoprecipitated (IP) مع مكافحة HA الأجسام المضادة التحقيق. ثم تم immunoblotted رواسب مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. الإدخال يمثل 20٪ من المواد الاساسية. C والكيميائية عبر ربط. وعولج مقتطفات من الخلايا COS-7-overexpressing Myc على atlastin-1 مع تركيزات أشار من dithiobis (succinimidyl بروبيونات) (DSP)، تعرض لSDS-PAGE باستخدام المواد الهلامية امختزل، وimmunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. يتم تحديد ثلاثة منتجات الدرجة الأعلى (السهام 2-4)، بالإضافة إلى مونومر (السهم 1). D، هلام استبعاد FPLC. تم immunoblotted aliquots من كل جزء مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. وأظهرت حجم وشطف قمم الفراغ للبروتينات علامة (في kilodaltons) في أعلى. يشار إلى أرقام جزء على طول الجزء السفلي. على الرغم من Myc على-atlastin-1- (1-558) وMyc على-atlastin-1- (1-516) coeluted في ذروة جزء واحد، وكان Myc على-atlastin-1- (1-447) نمط شطف أوسع.

Atlastin-1 هو GTPase- عن طريق تنقية البروتينات CBP-atlastin-1 الانصهار، درسنا ما إذا atlastin-1 تمتلك النشاط GTPase. كميات متزايدة من atlastin-1 البروتين زاد تباعا نسبة GTP المائي (الشكل 9). وهكذا، atlastin-1 يرتبط ليس فقط GTP، كما هو مبين في الدراسات السابقة (32)، ولكن أيضا يعمل بمثابة GTPase (الشكل 9).

F IG. 9.
Atlastin-1 هو GTPase. وحات العليا، تنقية CBP-atlastin-1 انصهار بروتين (1،1-4،4 μ م، كما هو مبين) أو ألبومين المصل البقري (السيطرة) وحضنت مع [α- 32 P] GTP ل0-60 دقيقة . [32 P] الناتج المحلي الإجمالي و[32 تم حلها P] GTP من قبل الانفصال على لوحات TLC. اللوحة السفلى، [32 ف] الناتج المحلي الإجمالي و[32 وتم قياس كمية P] GTP، وتم احتساب النسبة المئوية للGTP المائي كما هو موضح تحت عنوان "الإجراءات التجريبية ".

نقاش

الطفرات في SPG3A الجين يسبب الاصابة المبكرة جدا النقي HSP (2 - 5). في هذه الدراسة، وجدنا أن SPG3A منتج الجين atlastin-1 هو GTPase بلازميدة قليلة القسيمات تتألف من وحدات فرعية التي هي بروتينات الغشاء لا يتجزأ، مع كل من C و N تيرميني يتعرض إلى السيتوبلازم. حددنا أيضا عضوين آخرين من الأسرة atlastin من GTPases التي تشترك تشابه تسلسل كبير مع atlastin-1 وعلى الأرجح نفس السمات الهيكلية: atlastin-2 وatlastin-3 (الشكل 1). هذه البروتينات هي مشابهة من حيث الحجم ولها نفس الحفظ جدا الزخارف ملزم GTP فضلا عن توقع اثنين من المجالات عبر الغشاء. ومن المثير للاهتمام، وخرائط atlastin-3 الجين إلى منطقة داخل SPG17 (متلازمة فضة، MIM 270685) موضع (33)، وبالتالي قد يكون الجين مرشح لSPG17. الجين atlastin-2 في محيط SPG4 spastin الجينات على الكروموسوم 2.
هيكل الغشاء نقترح لatlastin-1 (الشكل 7 C) ليست نموذجية من جيجابايت في الثانية، والأسرة من GTPases الكبيرة التي وatlastins هي الأكثر مثلي (11، 12، 30). ومع ذلك، على الرغم من أن atlastins وجيجابايت في الثانية كل حصة حلقة RD بدلا من (N / T) K X D في عزر الثالث ضمن الكلاسيكية ملزم guanylate ثالوث، وهناك العديد من الاختلافات البنيوية بين atlastin والأسر GBP (12، 13، 32). أولا، على عكس atlastins، جيجابت في الثانية لديها محطة C-α حلزونية مجال إضافية أن تطوي إلى التفاعل مع المزيد من المناطق القريبة (12). ثانيا، الكثير جيجابت في الثانية لديها C-C محطة AAX (حيث A يمثل الأحماض الأمينية الأليفاتية) عزر لisoprenylation، وكلها من atlastins تفتقر (الشكل 1). ثالثا، لقد أظهرت دراستنا أن atlastin-1، ومن المرجح atlastin-2 وatlastin-3 هي البروتينات الغشاء لا يتجزأ مع اثنين من المجالات عبر الغشاء المفترضة. على النقيض من ذلك، جيجابت في الثانية ليست بروتينات الغشاء لا يتجزأ. في هذا الصدد، وatlastins أكثر تذكرنا FZO / mitofusins، GTPases الكبيرة التي تمتد غشاء الميتوكوندريا الخارجي مرتين، مع كل من N و C تيرميني التي تواجه السيتوبلازم (34، 35). لأن FZO / mitofusins ​​تعتبر بالغة الأهمية لالانصهار الميتوكوندريا السليم، قد يكون atlastin-1 أيضا دورا في الأحداث الانصهار هومو أو غيروي. وأخيرا، مثل العديد من dynamin / MX / GBP الفصيلة (أعضاء 12، 30، 31، 36)، atlastin-1-أشكال وطي oligomers. على الرغم من أن دراستنا تشير إلى أن atlastin-1 على الأرجح تجمع باعتباره homotetramer، فإنه ليس من الواضح ما إذا كان يمكن أن تشكل أيضا مجمعات مغايرة التغصن مع atlastin-2 وatlastin-3. ومن غير الواضح أيضا ما إذا كان atlastins تكون قادرة على تشكيل هياكل النظام أعلى، كما تبين لأعضاء آخرين في dynamin / MX / GBP الفصيلة (12، 31، 36).
على الرغم من وظائف البروتينات atlastin غير معروفة، وقد حددت عدة مجموعات البروتينات التفاعل atlastin بواسطة الخميرة فحص اثنين من الهجين (32، 37). وقد تبين Atlastin-1 / GBP3 البشري إلى التفاعل مع الإنسان NIK / HGK، التي تعد واحدة من المجموعة الأولى جرثومي تحركات مركز، مجموعة من MAPK تحركات كيناز كيناز الذي ينشط شلال SAPK / JNK في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا (32 ). التفاعل مع atlastin-1 يحدث عن طريق يسين الغنية CHN مجال NIK / HGK. تظهر بقايا 1-129 من atlastin-1 أن تكون كافية للتفاعل (32). وقد تبين Atlastin-2 / ARL-6-التفاعل البروتين 2 للتفاعل مع ARL-6، وA DP- ص ibosylation factor- ل آيك البروتين الذي هو في الغالب عصاري خلوي، ولكن الزميلة مع الأغشية ردا على GTPγS (37). الثالث-C النهائي للatlastin-2 (بما في ذلك اثنين من المجالات عبر الغشاء المقترحة) كافية لهذا التفاعل. ومن المثير للاهتمام، العديد من العوامل ADP-ribosylation وADP-ribosylation عامل مثل البروتينات مهمة لتجنيد البروتينات مثل golgins وCOPI إلى جهاز جولجي (38، 39). الآثار الوظيفية لهذه التفاعلات التي تم تحديدها atlastin البروتين غير معروفة، ولكن.
كيف الطفرات في الجين atlastin-1 تغير البروتين atlastin-1؟ لكن كل واحد من التقارير atlastin-1 الطفرات في المرضى الذين يعانون من SPG3A تمثل الطفرات مغلطة. والآخر هو الإدراج النوكليوتيدات مما أدى إلى الإنهاء المبكر في المجال محطة C (13 - 16). طفرة مغلطة واحد (R217Q) تغير بقايا الحفظ جدا في حلقة RD داخل جيب ملزم GTP من atlastin-1، وبالتالي قد يغير GTP ملزمة أو النشاط GTPase (14). على الرغم من أن الطفرات مغلطة أخرى تحدث في بقايا الحفظ جدا بين الأسرة atlastin، آثارها لا تزال غير واضحة. ومن المثير للاهتمام، وتقع هذه الطفرات في كل N- والمناطق C-الطرفية، مما يشير إلى أن التغيرات الطفيفة حتى في التسلسل الأساسي في مناطق مختلفة متعددة قد تكون لها آثار هيكلية أو وظيفية عميقة. يمكن لهذه التغيرات تسلسل يحتمل أن تتداخل مع oligomerization وتكوين الجمعيات غشاء المناسبة، توطين الخلوية، والنشاط GTPase، وتفاعلات atlastin-1 مع بروتينات أخرى.
البروتين atlastin-1 هو الأكثر وفرة في الدماغ، على الرغم من أنه موجود أيضا في مستويات أقل من ذلك بكثير في الأنسجة الأخرى، بما في ذلك الرئة، العضلات الملساء، الغدة الكظرية والكلى، والخصية. داخل الدماغ، وأثرى atlastin-1 بارز في الصفيحة V الخلايا العصبية الهرمية في قشرة الدماغ، جزء من السكان من التي تظهر على axonopathy البعيدة في المرضى الذين يعانون من SPG3A. هذه الخلايا العصبية الحركية العليا مشروع لخفض الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي القطني، والنتائج خلل في وخزل سفلي تشنجي، ميزة الكاردينال شركائنا HSPs. لأن هذه الخلايا العصبية لها بين أطول المحاور في النظام العصبي المركزي، واختلال وظيفي في المرضى SPG3A قد يعكس دورا حاسما في المناسبة atlastin-1 وظيفة في هذه الفئة من القطعان من "محور عصبي طويل" الخلايا العصبية الحركية العليا. بناء على توطين التحت خلوية من atlastin-1 إلى جهاز جولجي والتشابه الهيكلي لأعضاء dynamin / MX / GBP الفصيلة من GTPases، قد يكون atlastin-1 المهم لديناميات غشاء جولجي المناسبة أو الاتجار حويصلة.
كيف يمكن المعيبة جولجي هيكل الغشاء أو الاتجار حويصلة يسبب axonopathy البعيدة في الخلايا العصبية الحركية العليا مع محاور عصبية طويلة؟ النقل عيب على طول المحاور التي تورطت مباشرة في عدد من axonopathies طويلة وراثي، بما في ذلك HSP SPG10 (طفرات في كينيسين KIF5A العصبية) (8) والاعتلال العصبي وراثي شاركو ماري توث نوع 2A (طفرات في بروتين السيارات KIF1Bβ) (40)، وكذلك في شكل جسمية مهيمنة انخفاض مرض العصبون الحركي (طفرات في P150 فرعية من dynactin) (41). على الرغم من أن هذه البروتينات الحركية تؤثر بشكل مباشر على النقل، تشكيل السليم للبضائع داخل الخلايا مهم كذلك. ونظرا للوقت مبكر من بداية SPG3A والاقتراحات التي قد يكون بسبب تشوهات للتنمية الخلايا العصبية (3، 4)، فمن المثير للاهتمام أن علاج الخلايا العصبية قرن آمون مع brefeldin A، المستقلب الفطرية أن يعطل جهاز جولجي، ويحول دون نمو محور عصبي (42 ). وبالتالي، مطلوب جهاز جولجي سليمة للنمو محور عصبي (42)، والتي قد تكون ذات أهمية خاصة لتشكيل محور عصبي طويل خلال تطوير النظام العصبي المركزي. تصور، قد الطفرات من atlastin-1 في المرضى الذين يعانون من وظيفة SPG3A يؤدي إلى هيكل جولجي أو ضعف وظائف، مما يؤدي إلى نمو محور عصبي ضعف. الدراسات المستقبلية من آثار الطفرات المريض SPG3A على هيكل جولجي وظيفة وكذلك نقل محور عصبي والنمو قد توضح المرضية الخلوية من HSP SPG3A

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس