عرض مشاركة واحدة
  #6  
قديم 11-22-2015, 08:30 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي يتفاعل وراثي تشنجي البروتين الشلل النصفي spastin مع ESCRT-III-يرتبط بروتين معقد endosomal CHMP1B

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/14/1/19.full

ملخص

يتميز النقي الشلل النصفي التشنجي وراثي عن طريق تعتمد على طول انحطاط الغايات البعيدة من المحاور طويلة. الطفرات في spastin هي السبب الأكثر شيوعا لهذه الحالة. شرعنا في تحقيق وظيفة spastin باستخدام نهج يومين الهجين الخميرة لتحديد البروتينات التفاعل. باستخدام كامل طول spastin كطعم، حددنا CHMP1B، وهو بروتين يرتبط مع ESCRT (endosomal الفرز المعقدة اللازمة لنقل) -III مجمع، كشريك ملزمة. وأكدت عدة طرق مختلفة أهمية الفسيولوجية للتفاعل في خلايا الثدييات. CHMP1B وأظهرت spastin اضح حشوية شارك في التعريب في كوس-7 وPC12 الخلايا الموسومة حاتمة. CHMP1B وspastin تفاعلت بشكل خاص في المختبر والمجراة في β-اكتاماز فحوصات البروتين جزء تكامل، وimmunoprecipitated المشارك spastin مع CHMP1B. تم بوساطة التفاعل من قبل منطقة spastin الواقعة بين بقايا 80 و 196 و تحتوي على أنيبيب التفاعل ومجال الاتجار. التعبير عن CHMP1B الموسومة حاتمة في خلايا الثدييات منع تطور النمط الظاهري أنيبيب غير طبيعي يرتبط التعبير عن أتباز معيب spastin. وتشير هذه البيانات إلى دور للspastin في أحداث المرور غشاء الخلايا وتوفير مزيد من الأدلة لدعم الاعتراف الناشئة التي عيوب في حركة غشاء الخلايا هي سبب كبير من الخلايا العصبية الحركية علم الأمراض.

مقدمة

ويمكن تقسيم الرئيسي مسار السيارات الطوعي إلى مرحلتين. أولا، الخلايا العصبية الحركية العليا (UMNs) في القشرة الحركية في الدماغ الاتصال عبر مساحات القشري للخلايا في المادة الرمادية للنخاع الشوكي. ثانيا، وانخفاض الخلايا العصبية الحركية (LMNs) في القرن الأمامي للنخاع الشوكي تتصل عضلات الهيكل العظمي في الوصل العصبي العضلي (1). المحاور من UMNs وLMNs طويلة للغاية، مع وحدات التخزين حشوية أكبر بكثير من خلايا الجسم. وبالتالي فإنها توفر بيئة متطرفة للعديد من العمليات الخلوية، مثل الاتجار داخل الخلايا والنقل والتمثيل الغذائي للطاقة.
بالإضافة إلى أن يكون متصلا تشريحيا، ترتبط UMNs وLMNs التي كتبها علم الأمراض. المرض الأكثر شهرة على نطاق واسع من الخلايا العصبية الحركية هو مرض التصلب الضموري الجانبي (مرض العصبون الحركي)، وهي حالة عادة متقطعة التي تتأثر بها كل من UMNs وLMNs. وبالإضافة إلى ذلك، ترتبط عدة مجموعات من الشروط المحددة وراثيا مع ضعف الخلايا العصبية الحركية. وإن كان نادرا بشكل فردي، هذه الشروط توفر فرصة لتشريح العمليات الخلوية العاملة في صيانة وانحطاط الخلايا العصبية الحركية. وparaplegias تشنجي وراثي (شركائنا HSPs) هي واحدة من هذه المجموعة وتحديد الخصائص التي السريرية هي الشلل التشنجي التدريجي التي تؤثر على الساقين، وعادة ما يحدث ذلك من قبل تعتمد على طول، انحطاط الأعلى من المحاور السبيل القشري (2 - 4).
سريريا، يتم تقسيم شركائنا HSPs إلى أشكال نقية ومعقدة، مع شركائنا HSPs نقية، حيث يحدث التشنج في عزلة نسبية، وتشكيل واحدة أكبر مجموعة فرعية. تم تعيين أكثر من 20 مواضع HSP وتم تحديد 10 من الجينات المرتبطة (إعادة النظر في 2). الجين SPG4، spastin، هو HSP الجينات الأكثر شيوعا، مع الطفرات وجدت في ~40٪ من الأسر نقية المهيمنة مقهورة HSP (5، 6). يتم التعبير عن spastin نسخة كاملة الطول على نطاق واسع داخل الجهاز العصبي والأنسجة في غير العصبية، بما في ذلك مجموعة من الخلايا المتصلة الكريات البيض. يتم التعبير عن ذلك بشدة في الفئات الفرعية من الخلايا العصبية (5، 8). محاضر Spastin تفتقر إما الإكسونات تم العثور على 4 أو 8 أو 15، على الرغم من أن يتم التعبير عن المتغير فقط اكسون 4 حذف في مستويات كبيرة (7، 9).
وكانت البيانات على توطين التحت خلوية من spastin الذاتية المتعارضة. على الرغم من أن الدراسات المناعي في وقت مبكر باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة spastin على الأنسجة الماوس والبيني خلايا هيلا اقترح أن spastin الذاتية المترجمة حصريا في النواة (7)، وقد وجدت الدراسات اللاحقة باستخدام الأجسام المضادة أخرى النووية المختلطة والتوزيعات حشوية في خلايا هيلا (10، 11) وخطوط الخلايا العصبية الحركية الخلية (11) وأنسجة الجهاز العصبي الإنسان (8). في الأنسجة العصبية البشرية، يقع spastin في السيتوبلازم ومتشابك محطات عدة أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية الحركية، على الرغم من أنواع الخلايا العصبية الأخرى التي كانت موجودة في النواة (8).
وتعريب التحت خلوية مختلفة تم تحديدها لspastin تدل على أن البروتين قد يكون له عدة أدوار وظيفية مختلفة، ومجموعة كاملة من التي ليست واضحة حتى الآن. تحليل تسلسل المبكر وضع spastin في AAA (ATPases المرتبطة بالأنشطة الخلوية المتنوعة) أسرة، أسرة متعددة مجموعة كبيرة من البروتينات التي تحتوي على أتباز كاسيت مميزة والمشاركة في العديد من العمليات الخلوية المختلفة (5، 12). Spastin هو عضو في مجموعة فرعية AAA-7 الذي يحتوي على katanin P60، وهو بروتين قطع أنيبيب، وخلية ثقافة والحية وتشير البيانات إلى أن وظيفة واحدة على الأقل من spastin تتضمن تنظيم الأنابيب الدقيقة. في المراحل المبكرة من التعبير في كوس-7 مثقف الخلايا، spastin الموسومة حاتمة المحلية في السيتوبلازم، على مقربة من مركز زهور النجمة أنيبيب. مع التعبير في وقت لاحق، فإنه المترجمة إلى منقط منفصلة الهياكل حشوية لا تقابل العضيات المعروفة (13). وارتبط التعبير البرية من نوع spastin مع حزم أنيبيب مكسورة وعندما أعرب عن أتباز معيب الموسومة حاتمة spastin، اشتركت المترجمة مع حزم محيط بالنواة سميكة بشكل غير طبيعي وطويلة من الأنابيب الدقيقة (13). وقدمت نتائج مماثلة في العصبونات القشرية الفئران مثقف (14). وقد تم مؤخرا تمديد هذه النتائج من خلال دراسة immunolocalization الذي حدد مستويات عالية من spastin الذاتية في المناطق التحت خلوية حيث يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة حيوي. في تقسيم بنشاط خلايا كوس-7 وهيلا، تم العثور spastin على الأنابيب الدقيقة الجسيم المركزي والمغزل خلال الطورية، وعلى المغزل المركزي وأوسط الجذع أثناء الانقسام السيتوبلازمي. في خط الخلية العصبية الحركية، وأعرب عن غاية spastin في نهايات القاصي ملحقات محوار وعند نقاط الفرع. حددت هذه الدراسة أيضا NA14 البروتين centrosomal كشريك ملزم للspastin (11).
بيانات من نماذج ذبابة الفاكهة أيضا دعم دور للspastin في تنظيم أنيبيب (15). ذبابة الفاكهة spastin غير المخصب (D-spastin) ولا سيما في حبات متشابك، وشارك أنك تؤسس-مع متشابك synaptotagmin الحويصلة علامة في المناطق العصبية حيث ميكروتثبول مستقرة عادة ما تكون غائبة. استهداف RNA تدخل ضربة قاضية لل-D spastin في الجهاز العصبي تسبب شجيرات متشابك والحد من مجموع مساحة متشابك، مع تعزيز المقابلة من قبل المشبكي قوة العصبي الذي تم تصحيحه دواء من قبل نوكودازول، وكيل زعزعة استقرار أنيبيب. كانت الحيوانات زيادة في تويولين مستقر من الناحية الهيكلية في الوصل العصبي العضلي محطة قبل المشبكي، مع زحف الأنابيب الدقيقة في حبات قبل المشبكي. على العكس من ذلك، أدى overexpression من D-spastin إلى انخفاض في كمية تويولين مستقر من الناحية الهيكلية في الوصل العصبي العضلي محطة قبل المشبكي وانخفاض في قوة العصبي الذي تم تصحيحه من قبل أنيبيب استقرار وكيل التاكسول. هذه البيانات متسقة مع فرضية أن D-spastin يمكن أن ينظم مباشرة أو غير مباشرة الاستقرار أنيبيب ويمكن أن تقيد مكانيا الأنابيب الدقيقة استقرت في حبات قبل المشبكي (15).
على الرغم من كل البيانات لافتا نحو وظيفة أنيبيب تنظيم لspastin، كون انها وجدت في منقط أو أنبوبي الهياكل حشوية عندما أعرب في خلايا الثدييات، وأنه يختلف مكانيا من الأنابيب الدقيقة مستقرة في المحاور ذبابة الفاكهة يشير إلى أنه قد يكون أدوار أخرى . ومن بين الاقتراحات التي spastin قد يكون متورطا في أحداث المرور غشاء الخلايا. Spastin ديه N-محطة المتفاعل أنيبيب والاتجار (MIT) المجال. ويشترك في هذا المجال مع العديد من البروتينات التي حددت الأدوار في حركة الغشاء، بما في ذلك VPS4، وهو AAA (ATPases المرتبطة بالأنشطة الخلوية المتنوعة) بروتين من نفس فرعية كما spastin والفرز نيكسين 15 و calpain-7 / PalB (16، 17) . ومن المثير للاهتمام، وجدت المجال MIT أيضا في spartin، وهو بروتين تحور في متلازمة تروير، جسمية متنحية HSP تعقيدا بسبب التلفظ، ضمور عضلي القاصي وتأخر في النمو المعتدل (16).
وتنقسم الخلايا مسارات حركة الغشاء إلى مكونات الإفرازية والتقامي (18). في مسار التقامي، يتم تسليم مستقبلات المنضوية والبروتينات عبر الغشاء من غشاء البلازما لالإندوسومات في وقت مبكر، من حيث أنها قد تكون إعادة تدويرها إلى غشاء البلازما، تستهدف جولجي، وسلمت إلى الإندوسومات المتأخرة والجسيمات الحالة لتدهور أو، في خلايا الاستقطاب، transcytosed (18). كما الإندوسومات تربط إفرازية، واستيعاب والعمليات الهادمة، أنها تعمل كمواقع الفرز الهامة. وقد تم تحديد المكونات الجزيئية الرئيسية للمسار التقامي من خلال تحليل الخميرة المسوخ VPS، مقسمة إلى فئات A-F اعتمادا على الموقع من تأثير (19). المسوخ VPS فئة E هي ذات أهمية خاصة لهذه الدراسة. ومن المعروف المسوخ لا يقل عن 17 فئة الخميرة E VPS ولكل منها نديد بشري واحد على الأقل. وهي ضرورية لتشكيل الجسم عديد الحويصلات، هيكل endosomal أواخر شكلتها انغلاف والناشئين من الغشاء المحدد في تجويف الحويصلة (19). جسم عديد الحويصلات الصمامات مع يحلول، مع ما يترتب على التعرض للأغشية المنضوية إلى المقصورة الهادمة lumenal (19). وقد حددت الدراسات الأخيرة ثلاثة مجمعات البروتين غشاء المرتبطة ذات الصلة، ووصف ESCRT (endosomal الفرز المجمعات المطلوبة للنقل) من أنا، و-III-II، والتي تتكون من بروتينات الطبقة E VPS (20 - +22). هذه المجمعات يجوز توظيف بالتسلسل من السلائف حشوية والتوسط فرز الشحنات إلى الجسم عديد الحويصلات. ويعتقد مجمع ESCRT-III ليكون مسؤولا عن الفرز النهائي والتركيز البضائع إلى مجموعة فرعية من أغشية الجسم عديد الحويصلات (22). يتكون هذا المجمع من أربعة على الأقل من الدرجة E VPS البروتينات التي تعتبر جميع أفراد الأسرة البروتين نفسه، Chm2p، Chm3p، Chm4p وChm6p (وتسمى أيضا Vps2p، Vps24p، Vps32p / Snf7 وVps20p على التوالي في الخميرة، الموافق CHMP2A و2B، CHMP3، CHMP4A، 4B و 4C وCHMP6 في البشر) (+22 - +24). وقد تم تحديد اثنين آخرين من أعضاء الأسرة آلية تبادل المعلومات، Chm1p / Did2p (الموافق CHMP1A وCHMP1B في البشر) وChm5p / Vps60p (الموافق CHMP5 في البشر) (+22 - 24)، على الرغم من أنه ليس من الواضح ما إذا كانت تشكل جزءا من مجمع ESCRT-III أم أنها تنظيم وظيفة ESCRT-III (22). يتم تنظيم جمعية غشاء من البروتينات آلية تبادل المعلومات من قبل الطبقة E المبادئ الطوعية البروتين Vps4p (التي نوقشت في وقت سابق)، والذي قد يحفز تفكيك مجمع ESCRT-III (19، +22 - +25). VPS4 موجود في شكلين في البشر، VPS4A وVPS4B (23، 24، 26). بالإضافة إلى دورها في حركة الغشاء، المترجمة إلى الإسوي من CHMP1A الإنسان إلى النواة (27).
في هذه الدراسة، شرعنا في اكتساب رؤى جديدة في وظيفة spastin، باستخدام نهج يومين الهجين الخميرة لتحديد الشركاء ملزم للبروتين. باستخدام كامل طول spastin كطعم حددنا اثنين من البروتينات المشاركة في حركة الغشاء، CHMP1B وgp25L2، كشركاء محددة ملزمة. نظرا للتشابه بين spastin وVPS4 ومع الأخذ في الاعتبار القوة النسبية للتفاعلات الخميرة اثنين الهجين التي تم الحصول عليها مع اثنين من الشركاء ملزم المفترضة، اخترنا لتحديد أولويات التفاعل مع CHMP1B للدراسة. لقد أكدنا على أهمية الفسيولوجية للتفاعل في خلايا الثدييات من الدراسات التحت خلوية شارك في التعريب، وتقسيم β-اكتاماز البروتين جزء المقايسات تكامل والدراسات المشارك مناعي. ونظرا للدور CHMP1B في الاتجار غشاء endosomal، وتشير هذه البيانات إلى أن spastin، مثل الجينات HSP أخرى، قد تلعب دورا في أحداث المرور الغشاء.

النتائج

خميرة التجارب يومين الهجينة تحديد CHMP1B وgp25L2 كشركاء ملزم المحتمل لspastin

استخدمنا كامل طول spastin البروتين ك "الطعم" لفحص الخميرة الإنسان يومين الهجين مكتبة erythroleukaemia كدنا] عالية التعقيد، كما هو موضح سابقا (28). هذه الشاشة ولدت 16 استنساخ مضاعفا الإيجابية التي نمت على انتقائية وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الأدينين وكانت ايجابية للنشاط β غالاكتوزيداز. عندما تم اختبار هذه التفاعلات الأساسية في الخميرة الطازجة تم العثور على اثنين فقط على حد سواء استنساخه والطعم محددة. الى رموز اثنين إيجابية "فريسة" استنساخ البروتين gp25L2 (NM_017510)، التي أظهرت ضعف ملحوظ بعد النشاط β غالاكتوزيداز والنمو يقتصر على وسائل الإعلام انتقائية تفتقر التربتوفان، ليسين والأدينين (-W / L / A)، وCHMP1B (NM_020412 ، المعروف أيضا باسم CHMP1.5)، التي عرضت قوي النشاط β غالاكتوزيداز والنمو القوي على انتقائية (-W / L / A) وسائل الاعلام (الشكل 1 A و B). كما ظهرت spastin للتفاعل بقوة أكبر مع استنساخ CHMP1B فريسة، اخترنا لتحليل خصوصية وأهمية الفسيولوجية لهذا التفاعل في خلايا الثدييات.

يتفاعل الشكل 1. Spastin مع gp25L وCHMP1B في الخميرة نظام هجين اثنين. (A) الإيجابية مستعمرات الخميرة مضاعفا معزولة من الخميرة شاشة يومين الهجين التي بالطول spastin كان يستخدم تم نقل البروتين الطعم لالفلاتر واختبار لتفعيل β غالاكتوزيداز مراسل الجينات. الخلايا مضاعفا تحتوي على spastin واحد من اثنين من البروتينات المختلفة فريسة غير محددة (NSP1 وNSP2) لا تظهر أي تلون أزرق بعد فحص β غالاكتوزيداز، في حين أن الخلايا مضاعفا تحتوي على spastin وgp25L2 أو spastin وCHMP1B تظهر ضعيفة أو قوية النشاط β غالاكتوزيداز، على التوالي. (B) إعادة تأكيد التفاعل الملحوظ بين spastin وgp25L2 أو CHMP1B في الخميرة الطازجة. العمود 1 يبين نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر اليوراسيل ويسين (-U / L) لتحديد وجود كل من الطعم وفريسة ناقلات، في حين يبين العمود 2 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر اليوراسيل، ليسين والحامض الاميني، الأمر الذي يتطلب تفعيل صاحب مراسل الجينات. في كل spastin حال تم استخدامها باسم "الطعم"، في حين استخدمت gp25L2 أو CHMP1B كما بروتينات "فريسة".

توزيع الخلايا من spastin الموسومة حاتمة وCHMP1B

البيانات الموجودة على توطين التحت خلوية من spastin متضاربة ولم يتم الإبلاغ عن توطين التحت خلوية من CHMP1B سابقا، لذلك علينا أولا إجراء الدراسات المناعي لدراسة التوزيع التحت خلوية من الموسومة حاتمة spastin البشرية والبروتينات CHMP1B. لتجنب سوء الفهم وتقييم المحتملة للتغيرات الناجمة عن العلامة في توزيع البروتين، وقارنا توطين التحت خلوية النسبي من ثلاث نسخ الموسومة المختلفة لكل من البروتين. تم الموسومة البروتينات في إما N أو C-محطة مع GFP (GFP-Spastin، Spastin-GFP، GFP-CHMP1B وCHMP1B-GFP) أو في N-محطة مع ج myc حاتمة (MYC-Spastin وmyc- CHMP1B). للمساعدة في تقييم ما إذا كان السبب في اختلاف في توطين التحت خلوية من spastin في خلية ثقافة تجارب ترنسفكأيشن مقابل الدراسات باستخدام أجسام مضادة ضد بروتين الأصلي عن طريق توطين التفاضلية من اكسون 4 حذف وكامل طول إيسفورمس من spastin، قدمنا ​​C-محطة بناء الموسومة GFP تحتوي على النموذج اكسون 4 حذفها من spastin (SpastinΔex4-GFP، الشكل 2). وأعرب عن بنيات عابر في كوس-7 وPC12 الخلايا، وجرى تقييم توزيع فرعية الخلوية النسبي لكل بروتين بواسطة المجهر مضان.

الشكل 2. رسم تخطيطي من كامل طول spastin وأربعة أشكال أخرى من تحور spastin المستخدمة في هذه الدراسة. معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، والتفاعل أنيبيب ومجال الاتجار؛ AAA، أتباز المرتبطة متنوعة الأنشطة الخلوية المجال.

Spastin.

أعطى التعبير عن GFP-Spastin، Spastin-GFP أو MYC-Spastin نتائج مماثلة. وأعرب عن الثلاثة داخل سيتوبلازم خلايا كوس-7 (لا تظهر البيانات) وغير متمايز (الشكل 3 أ) أو الخلايا PC12 متباينة (الشكل 3 B و C)، بما يتفق مع الملاحظات السابقة (13، 14). تم المترجمة Spastin في الغالب إلى هياكل إما منقط أو أنبوبي التي لوحظت في البداية في منطقة محيط بالنواة. في نقطة زمنية لاحقة (48 ساعة أو أكثر)، لوحظت منقط والهياكل الأنبوبية أكثر اتساعا أيضا في المناطق الأكثر هامشية للخلية. في الخلايا PC12 متمايزة لديها ملحقات محوار، كان ينظر التعبير spastin منقط في سوما وأيضا داخل neurites التي. ضمن neurites التي كانت في كثير من الأحيان التعبير الأبرز في نهايات البعيدة (الشكل 3 B و C). التعبير عن SpastinΔex4-GFP بناء في كوس-7 أعطت خلايا نتائج متطابقة إلى التعبير عن كامل طول spastin، مع عدم وجود توطين النووية (لا تظهر البيانات).

الشكل 3. توزيع التحت خلوية من spastin وCHMP1B البروتينات الموسومة حاتمة في كوس-7 وPC12 الخلايا. (A-C و G-I) خلايا PC12، (D-F) كوس-7 الخلايا. (A-C) تبين توزيع spastin تنصهر إلى GFP في دورته N-محطة (A)، C-محطة (B)، أو لحاتمة ج myc في دورته N-محطة (C). (D-I) تبين توزيع CHMP1B تنصهر إلى GFP في دورته N-محطة (D و G) أو C-محطة (E و H)، أو لحاتمة ج myc في دورته N-محطة (F و I) . في كوس-7 الخلايا، وكانت الهياكل النووية منقط أكثر بروزا وتلطيخ محيط بالنواة أقل وضوحا مع البروتين GFP-CHMP1B الانصهار (D) بالمقارنة مع غيرها من اثنين من البروتينات CHMP1B الانصهار. وشوهدت المصفوفات الخطية من حين لآخر نقاط والمسمى (أقحم في F). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وPC12 الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

CHMP1B.

وكان توزيع التحت خلوية من MYC-CHMP1B والبروتينات الانصهار CHMP1B-GFP في عابر. كوس-7 مماثل على نطاق واسع. وقد لوحظت في كل من النواة والسيتوبلازم (الشكل 3 E و F). داخل النواة CHMP1B عرضت في الغالب توزيع منتشر / الحبيبية، على الرغم من أن الخلايا عرضية أظهرت منقط إضافي وضع العلامات النووي. داخل السيتوبلازم البروتينات الانصهار كانت محلية في الغالب إلى العديد جدا، والهياكل منقط الصغيرة التي كانت موجودة في جميع أنحاء السيتوبلازم. بالإضافة إلى ذلك، كتل من هياكل دائرية أكبر، تذكرنا جدا من حويصلات بغشاء، كانوا حاضرين، ومعظمها في قبعة محيط بالنواة البؤري. في نسبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع CHMP1B-GFP، ولكن ليس MYC-CHMP1B، غطاء محيط بالنواة حويصلات يرد، والهياكل حويصلي المسمى تضخم غير طبيعي. عموما، هذا التوزيع الخلوي مماثلة لتلك التي سبق وصفها للبروتين CHMP1A ترتبط ارتباطا وثيقا (24). على الرغم من أن العديد من الهياكل منقط وصفت أيضا في جميع أنحاء السيتوبلازم في بعض الخلايا معربا عن GFP-CHMP1B، كانت هناك اختلافات مقابل البروتينات الانصهار الأخرى. وكان العديد من الخلايا تنتشر العلامات حشوية، وحيث لم يكن منتشر وضع العلامات، ونادرا ما يلاحظ الغطاء محيط بالنواة هياكل حويصلي ينظر مع البروتينات الانصهار الأخرى. بدلا من ذلك، تميل منقط وصفت والهياكل الأنبوبية أن يكون حاضرا في السيتوبلازم في جميع أنحاء النواة، ولا سيما في الخلايا معربا عن أعلى. بالإضافة إلى ذلك، كان تلطيخ النووي منقط أكثر شيوعا بكثير من مع بنيات أخرى (الشكل 3 D).
في الخلايا PC12، وكان كل من يبني CHMP1B ثلاثة الموسومة حاتمة توزيع التحت خلوية مماثل (الشكل 3 G-I). وكان معظم الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل العديد من حويصلي المسمى الهياكل حشوية دائرية / على خلفية من تلطيخ حشوية منتشر. في الخلايا تبين وجود نمط تمايز الخلايا العصبية أكثر، كان ينظر CHMP1B في عمليات محوار وفي بعض خلايا نهايات البعيدة من neurites التي كانت ملطخة بشدة بشكل خاص. بالإضافة إلى تلطيخ حشوية، أظهرت العديد من الخلايا منتشر تلطيخ النووي، مع عدد قليل من الخلايا وجود منقط تلطيخ النووي.

الموسومة حاتمة CHMP1B المشارك يموضع مع علامات endosomal

وكان جميع أفراد الأسرة CHMP من البروتينات درس حتى الآن على توطين التحت خلوية endosomal. درسنا ما إذا كان هذا صحيحا من CHMP1B من قبل المشترك، معربا عن عابر MYC-CHMP1B مع علامة endosomal، BD الألوان المعيشة ™ الموسومة GFP RhoB. شاهدنا ضرب شارك في توطين هذه العلامة وCHMP1B في الخلايا PC12 (الشكل 4 A-C) وكوس-7 الخلايا (لا تظهر البيانات). أكدنا على موقع endosomal من CHMP1B باستخدام علامات الأجسام المضادة لالإندوسومات في وقت مبكر (EEA1)، الإندوسومات في وقت متأخر (المانوز 6 فوسفات مستقبلات، M6PR) والجسيمات الحالة (مصباح 1)، في كوس-7 الخلايا. عابر. CHMP1B-GFP جزئيا شارك المترجمة مع M6PR (الشكل 4 D-F) وEEA1 (الشكل 4 G-I)، ولكن لم تظهر أي اضح المشارك التعريب مع Lamp1 (لا تظهر البيانات)، مشيرا إلى أن CHMP1B موجود على الإندوسومات المبكرة والمتأخرة، ولكن ليس الجسيمات الحالة.

الرقم 4. حاتمة الموسومة CHMP1B المشارك يموضع مع علامات endosomal. (A-C) تظهر شارك في التعريب في متباينة جزئيا خلية PC12 transfected المشترك مع علامة endosomal RhoB-GFP (A) وMYC-CHMP1B (B). ملاحظة قوي شارك في التعريب في نهايات القاصي ملحقات محوار وفي منطقة محيط بالنواة (C). (D-L) تظهر خلايا كوس-7. (D-F) تظهر شارك في التعريب بين CHMP1B-GFP (D) ومستقبلات المانوز 6 فوسفات (M6PR) (E)، وهو علامة من الإندوسومات في وقت متأخر. للتوطين المشترك هو الجزئي (F). (G-I) تظهر شارك في التعريب بين CHMP1B-GFP (G) والاندوسوم أوائل مستضد 1 (EEA1) (H)، وهو علامة من الإندوسومات مبكرة. مرة أخرى، وشارك في توطين جزئية (I). (J-L) تظهر خلية كوس-7 مع transfected CHMP1B-GFP (J) وملطخة علامة فيليبين الكولسترول مجانا (K). وينظر تلطيخ فيليبين داخل الحويصلات CHMP1B-GFP المغلفة (L). الساحات ملونة يظهر في الزاوية اليمنى السفلي من كل صورة على نطاق والرمادي تشير إلى لون من تلك الصورة في الصورة اندمجت المقابلة (C، F، I و L). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وPC12 الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

يتم نقل الكوليسترول أسترته تناولها عن طريق مستقبلات LDL إلى المقصورة التقامي في وقت متأخر، حيث يتحلل إلى إطلاق سراح الكوليسترول مجانا. overexpression من بعض أفراد الأسرة CHMP في خلايا الثدييات يمكن أن تؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالكولسترول مجانا في مقصورات endosomal (29). درسنا ما إذا كان هذا هو الحال عندما أعرب عن CHMP1B-GFP في كوس-7 الخلايا، وذلك باستخدام الكوليسترول محددة علامة فيليبين. كان هناك تلطيخ فيليبين من مجموعة فرعية من الحويصلات CHMP1B-GFP المسمى، على الرغم من أن قوة العلامات فيليبين في هذه الحويصلات لم تظهر زيادة بالمقارنة مع حويصلات إيجابية فيليبين في الخلايا untransfected (الشكل 4 J-L).

spastin الموسومة حاتمة المشارك يموضع مع البروتين endosomal RhoB

التفاعل المحتمل بين spastin وCHMP1B قادنا التحقيق في ما إذا spastin يمكن أن تكون أيضا موجودة على الإندوسومات. درسنا خلايا المشترك معربا عن RhoB الموسومة GFP-BD الألوان المعيشة مع MYC-Spastin ورأى مرة أخرى ضرب شارك في التعريب في كوس-7 (الشكل 5 A-C) والخلايا PC12 (الشكل 5 D-F). في الخلايا PC12، كان ينظر قوي شارك في التعريب في نهايات القاصي ملحقات محوار فضلا عن جسم الخلية (الشكل 5 D-F). في كل أنواع الخلايا، وأوضح الفحص أعداد كبيرة من الخلايا التي الرئيسين توطين كان مستقلة عن مرحلة دورة الخلية. أظهر تلوين الأجسام المضادة لا شارك في التعريب بين transfected منفردة، spastin الموسومة حاتمة وEEA1، M6PR أو مصباح 1 في كوس-7 الخلايا (لا تظهر البيانات).

الرقم 5. حاتمة الموسومة المشارك يموضع spastin مع RhoB-GFP في كوس-7 وPC12 الخلايا. في (A-C)، واشترك في مع transfected RhoB-GFP (A) وMYC-Spastin (B) كوس-7 الخلايا. وينظر قوي شارك في التعريب بين RhoB وMYC-Spastin (C). (D-F) تظهر متباينة الخلايا PC12 transfected بالاشتراك مع RhoB-GFP (D) وMYC-Spastin (E). مرة أخرى، قوي شارك في التعريب واضح، سواء في خلايا الجسم وفي بؤر على طول امتدادات محوار (F، السهام). وكانت نهايات البعيدة من neurites التي كثيرا ما شارك الملطخة بشدة (السهم طويلة). الساحات ملونة يظهر في الزاوية اليمنى السفلي من كل صورة على نطاق والرمادي تشير إلى لون من تلك الصورة في المقابلة الصورة المدمجة (C و F). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وPC12 الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

، حاتمة الموسومة spastin المشارك يموضع مع CHMP1B الموسومة حاتمة في كوس-7 والخلايا PC12

قمنا بتحليل المقبل إلى أي مدى مترجمة شارك spastin وCHMP1B داخل خلايا الثدييات. درسنا، مع التجارب المناعي في عابر. كوس-7 وPC12 الخلايا، ما إذا كان هناك أي توطين المشترك بين spastin الموسومة حاتمة وحاتمة الموسومة CHMP1B. قارنا MYC-Spastin مع GFP-CHMP1B وCHMP1B-GFP، وMYC-CHMP1B مع GFP-Spastin وSpastin-GFP. في كل حالة spastin وCHMP1B البروتينات وبوضوح شارك المترجمة إلى منقط صغير أو هياكل حشوية أنبوبي (الشكل 6). على الرغم من ضرب، وكان لوحظ المشارك توطين بوضوح لم يكتمل، كما لوحظ spastin لربط مع مجموعة فرعية فقط من الهياكل إيجابية CHMP1B. ومن المثير للاهتمام، وتم ترتيب هياكل منقط اظهار spastin-CHMP1B شارك في توطين بعض الأحيان في المصفوفات الخطية، تذكرنا حويصلات النقل يصطفون على عناصر هيكل الخلية (المواد التكميلية، الشكل S1). وكانت هناك بعض الاختلافات في نمط شارك في توطين شهدت مع مجموعات مختلفة من البروتينات الانصهار، ولا سيما في كوس-7 الخلايا. في دراسات شارك في التعريب التي كانت MYC-CHMP1B مقابل البروتينات الانصهار spastin، كان معظم المشاركين في التعريب في الهياكل منقط والأنبوبية التي وزعت في السيتوبلازم محيط بالنواة وأكثر الطرفية (الشكل 6 A-F). وكان الحد الأقصى للمحيط بالنواة هياكل حويصلي ينظر عادة مع MYC-CHMP1B التعبير وحدها عادة غائبة. في دراسات شارك في توطين باستخدام CHMP1B-GFP، على الرغم من أن عثر منقط الطرفية شارك في الترجمة، وكان أقوى شارك في توطين عادة موجودة داخل الغطاء محيط بالنواة هياكل حويصلي (الشكل 6 G-I). في دراسات شارك في التعريب التي كانت GFP-CHMP1B، كان معظم المشاركين في توطين مرة أخرى في هياكل منقط والأنبوبية التي وزعت في السيتوبلازم محيط بالنواة وأكثر الطرفية (الشكل 6 J-L).

الرقم 6. Spastin وCHMP1B البروتينات شارك توطين في خلايا الثدييات. و transfected خلايا كوس-7 عابر مع Spastin-GFP وMYC-CHMP1B (A-C)، GFP-Spastin وMYC-CHMP1B (D-F)، CHMP1B-GFP وMYC-Spastin (G-I) أو GFP-CHMP1B وMYC-Spastin (J-L). و transfected الخلايا PC12 عابر مع GFP-CHMP1B وMYC-Spastin (M-O). يشير السهم إلى المنطقة من شارك في التعريب في تمديد محوار. في كل transfections هناك شارك في توطين البروتينات اثنين. الساحات ملونة يظهر في الزاوية اليمنى السفلي من كل صورة على نطاق والرمادي تشير إلى لون من تلك الصورة في الصورة اندمجت المقابلة (C، F، I، L و O). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وPC12 الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

في الخلايا PC12، كانت spastin الموسومة حاتمة وCHMP1B شارك المترجمة في الهياكل منقط في إطار عمليات محوار، فضلا عن كونه في الهياكل منقط وأنبوبي في السيتوبلازم خلايا الجسم المترجمة المشترك (الشكل 6 M-O).

في المختبر والمجراة β-اكتاماز فحوصات البروتين جزء تكامل تدعم التفاعل الجسدي بين spastin وCHMP1B في خلايا الثدييات

درسنا كذلك أهمية الفسيولوجية للتفاعل الملحوظ بين spastin وCHMP1B باستخدام سلسلة من فحوصات البروتين β-اكتاماز جزء تكامل (PCAs). ويوفر هذا النهج طريقة محددة وحساسة مستقل لتقييم صلاحية الخميرة الأولية التفاعلات يومين الهجينة في نظام خلايا الثدييات (30 - 32). لأداء PCAs، وتفتيت البروتين β-اكتاماز في مجالين متكاملين وصف BLF1 (الأحماض الأمينية 24-197) وBLF2 (الأحماض الأمينية 198-288)، كما هو موضح سابقا (30، 31). عندما أعرب في عزلة هذه المجالات اثنين لا إعادة النشاط بيتا لاكتاماز بكفاءة. ومع ذلك، عندما يتم التعبير عن شظايا مكملة منفصلة اندماج في الإطار مع اثنين من البروتينات التفاعل يتم جلب اثنين من الأجزاء المكونة للانزيم β-اكتاماز الى مقربة، وتعزيز للطي المجال الصحيح وإعادة نشاط انزيم. وخلافا للنهج الخميرة اثنين الهجين، من المرجح أن تتفاعل في مكان التحت خلوية المعتاد شظايا البروتين.
وتنصهر البروتين CHMP1B المنبع من جزء BLF1 (CHMP1B-BLF1)، في حين أن تنصهر spastin المنبع من جزء BLF2 التكميلي (Spastin-BLF2). كما تحكم إيجابية ولدت لنا اثنين من بنيات أخرى في اثنين من مفارز (ATP6E وATP6G) للمضخة فجوي أتباز H + وتنصهر (V-أتباز) بروتين معقد المنبع من BLF1 وBLF2 شظايا، على التوالي (الشكل 7 A). وقد تم اختيار هذه البروتينات لأن هناك أدلة على أن تتفاعل جسديا في الجسم الحي (33)، وأنها تظهر ملامح التفاعل محددة للغاية في الخميرة المقايسات يومين الهجينة (28).

الرقم 7. البروتين المقايسات تكامل. (A) تمثيل تخطيطي لستة بنيات استخدامها لتنفيذ بيتا لاكتاماز فحوصات البروتين جزء تكامل. BLF1 هو جزء N-محطة للانزيم β-اكتاماز ترميز الأحماض الأمينية 24-197، في حين BFL2 يتوافق مع المجال C النهائي للβ-اكتاماز الأحماض الأمينية الترميز 198-288. (B) بيانات من فحص PCA مقارنة النسبي أعيد النشاط β-اكتاماز مراعاتها عند و transfected الخلايا HEK293T عابر مع أي BLF1 + BLF2، CHMP1B-BLF1 + ATP6G-BLF2، ATP6E-BLF1 + ATP6G-BLF2 أو CHMP1B-BLF1 + Spastin البروتينات الانصهار -BLF2. تظهر أشرطة البيانات متوسط ​​ثلاثة قياسات مستقلة من كل من تجربتين شارك في ترنسفكأيشن منفصلة. (C) البيانات من فحص PCA مقارنة النسبي أعيد النشاط β-اكتاماز مراعاتها عند و transfected الخلايا HEK293T عابر مع أي ATP6E-BLF1 + ATP6G-BLF2، ATP6E-BLF1 + Spastin-BLF2، أو CHMP1B-BFL1 + Spastin-BLF2 الانصهار البروتينات. في كل حالة تم تحديد النشاط β-اكتاماز 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.تظهر أشرطة البيانات متوسط ​​ثلاثة قياسات مستقلة من كل من تجربتين شارك في ترنسفكأيشن منفصلة. (D-H) تظهر النتائج وجود في الجسم الحي β-اكتاماز البروتين جزء تكامل الفحص. خلايا HEK293T تم عابر شارك transfected مع BLF1 وBLF2 اندماج هو مبين في (A) وتفاعلات البروتين البروتين تم الكشف عن استخدام الجينات السترة ™ المقابلة في فيفو الكشف كيت (إينفيتروجن). ثمانية وأربعون ساعة بعد خلايا ترنسفكأيشن كانت محملة الخلية نفاذية الفلورسنت الركيزة CCF2 / AM تحتوي على اثنين fluorophores، الكومارين وفلوريسئين. في غياب أعيد النشاط β-اكتاماز تبقى الركيزة سليمة والإثارة من الكومارين في 409 نانومتر يؤدي إلى الحنق وانبعاث الضوء الأخضر من فلوريسئين في 520 نانومتر. في ظل وجود المعاد النشاط β-اكتاماز CCF2 / AM والمشقوق وتعطل الحنق مما يؤدي إلى انبعاث الضوء الأزرق من الكومارين في 447 نانومتر. الخلايا التي تحتوي إيجابي تفاعل البروتين البروتين يتألق الزرقاء، وتلك التي لا يتألق الأخضر. (I) النشاط β-اكتاماز وكميا في الجسم الحي عن طريق حساب العدد الكلي للخلايا الأخضر والأزرق في 10 مجالات مختلفة من الرأي في ترنسفكأيشن. (J) التمثيل البياني للنسبة المئوية من مجموع الخلايا إيجابية للنشاط β-اكتاماز من 10 حقول نظر.

في ثماني تجارب مستقلة لاحظنا باستمرار زيادة كبيرة في النشاط β-اكتاماز عندما كان CHMP1B-BLF1 والبروتينات الانصهار Spastin-BLF2 المشارك أعرب، بالمقارنة مع مستويات النشاط احظ عندما أعرب عن BLF1 غير مدمجة وشظايا BLF2 معا (الشكل 7 B). لاحظ مستوى النشاط β-اكتاماز عندما كان CHMP1B-BLF1 والبروتينات الانصهار Spastin-BLF2 المشارك أعرب كانت قابلة للمقارنة على نطاق واسع لتلك التي لوحظت عندما استخدمت السيطرة الإيجابية ATP6E-BLF1 وATP6G-BLF2 شظايا معا (الشكل 7 B وC). لاختبار خصوصية التفاعل CHMP1B spastin في هذا النظام، لاحظ النشاط β-اكتاماز النسبي عندما كانت CHMP1B-BLF1 وSpastin-BLF2 ومقارنة مع تلك التي يحصل عليها عندما إما CHMP1B-BLF1 أو Spastin-BLF2 بناء أعرب المشترك استعيض عن المقابلة ATP6E-BLF1 أو ATP6G-BLF2 بناء (الشكل 7 B و C). في كل حالة لاحظت مستوى النشاط β-اكتاماز تم تخفيض ملحوظ عندما تم استبدال شريك معين. وقد لوحظ نفس النمط من خصوصية في مكررات متعددة من هذه التجارب.
كنا بجوار أحد في الجسم الحي β-اكتاماز البروتين جزء تكامل فحص للتحقق من النتائج التي تم الحصول عليها من في المختبر الكلي المحللة الخلية β-اكتاماز الفحص. لفي الجسم الحي ويتم فحص في الخلايا الحية وحتى يوفر نهجا أكثر الفسيولوجية لاستكشاف البروتين البروتين التفاعلات (30، 31). و transfected الخلايا HEK293T على الشرائح غرفة زجاجية والنشاط β-اكتاماز وتصور في الجسم الحي باستخدام مجهر epifluorescence مقلوب. β-اكتاماز تم الكشف عن النشاط انبعاث مضان الأزرق، والذي يحدث في التحلل من الفلورة الركيزة CCF2 / AM، وتم تقييمها من قبل احتساب العدد الكلي للخلايا الزرقاء والخضراء في 10 حقول نظر. وكانت النتائج مشابهة جدا لتلك التي حصلت مع في المختبر فحص. مرة أخرى، لاحظنا باستمرار زيادة في النشاط β-اكتاماز عندما كان CHMP1B-BLF1 والبروتينات الانصهار Spastin-BLF2 المشارك أعرب، بالمقارنة مع مستويات النشاط احظ عندما أعرب عن BLF1 غير مدمجة وشظايا BLF2 معا (الشكل. 7 D، H-J). لاحظ مستوى النشاط β-اكتاماز عندما كان CHMP1B-BLF1 والبروتينات الانصهار Spastin-BLF2 المشارك أعرب كانت قابلة للمقارنة على نطاق واسع لتلك التي لوحظت عندما استخدمت السيطرة الإيجابية ATP6E-BLF1 وATP6G-BLF2 شظايا معا (الشكل 7 E ، وأنا وJ). تم تخفيض النشاط β-اكتاماز عندما تم استبدال إما CHMP1B-BLF1 أو بناء Spastin-BLF2 قبل المقابلة ATP6E-BLF1 أو ATP6G-BLF2 بناء (الشكل 7 F، G، I و J). تم نسخ هذه النتائج في ثلاث تجارب مستقلة. معا، في المختبر والمجراة β-اكتاماز فحوصات البروتين جزء تكامل تشير بقوة إلى أن التفاعل بين spastin وCHMP1B هو ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

المقايسات المشترك مناعي دعم التفاعل بين spastin وCHMP1B في خلايا الثدييات

أجرينا التجارب المشتركة مناعي لمزيد من التحقق من أهمية الفسيولوجية للتفاعل بين spastin وCHMP1B. قمنا أولا بدراسات تجزيء التحت خلوية لتحديد ما إذا كان من الممكن أن تشارك في immunoprecipitate spastin وCHMP1B من الكسور الخلوية الذائبة. وأشارت تجزيء التحت خلوية من MYC-Spastin transfected كوس-7 الخلايا التي spastin موجود في عصاري خلوي، غشاء، النووي، في الغالب، في هيكل الخلية / الكسور التحت خلوية غير قابلة للذوبان (الشكل 8 A). كان CHMP1B-GFP توزيع التحت خلوية مماثل (الشكل 8 B)، ولم تغير توزيع التحت خلوية من البروتين إما بشكل ملحوظ عن طريق المشاركة في التعبير مع الآخرين (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن التعبير عن كل بروتين كان أقوى في جزء غير قابلة للذوبان، بسبب الصعوبات التقنية المشترك مناعي من بيليه غير قابلة للذوبان، حاولنا شارك في مناعي من spastin وCHMP1B من الكسر للذوبان. نحن عابر شارك في اعرب Spastin MYC وCHMP1B-GFP أو MYC-Spastin وGFP ناقلات فارغة في الخلايا HEK293T. انفصلنا في MYC-Spastin / CHMP1B-GFP أو MYC-Spastin / خالي GFP لست] خلية كاملة إلى أجزاء قابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي. أكدنا أن البروتينات من الفائدة كانت موجودة في كل من اثنين من كسور القابلة للذوبان التي كتبها immunoblotting مع مكافحة MYC ومكافحة GFP الأضداد (الشكل 8 C و D)، ثم immunoprecipitated من الكسر للذوبان باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP. لاحقا غرب النشاف مع الأجسام المضادة لمكافحة MYC أظهرت أن MYC-Spastin كان شارك immunoprecipitated مع CHMP1B-GFP (الشكل 8 E)، ولكن هذا لا MYC-Spastin وشارك immunoprecipitated-من MYC-Spastin / خالي GFP ناقلات المشترك -transfection (الشكل 8 F). لم يتم الكشف عن MYC-Spastin في وهمية شارك في immunoprecipitations التي نفذت دون GFP الأضداد (الشكل 8 E و F).

الرقم 8. MYC-Spastin هي في الغالب موجودة في جزء التحت خلوية غير قابلة للذوبان وشارك في immunoprecipitates مع CHMP1B. (A و B) Immunoblotting الكسور التحت خلوية من كوس-7 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع MYC-Spastin (A) أو CHMP1B-GFP (B)، وذلك باستخدام مكافحة MYC ومكافحة GFP الأجسام المضادة، على التوالي. ترتيب حارة في (B) كما هو مبين في الفقرة (أ). تقع عصابات المقابلة لأحجام المتوقعة لكلا البروتينات في جميع الكسور الخلوية الأربع، مع أسمى تعبير في جزء التحت خلوية تحتوي على عناصر هيكل الخلية ومكونات غير قابلة للذوبان الأخرى. وقد تم الحصول على الكسور التحت خلوية استخدام عدة بروتيوم التحت خلوية استخراج (Calbiochem)، بعد 48 ساعة ترنسفكأيشن الخلية. (C-F)، MYC Spastin المشارك immunoprecipitates مع CHMP1B-GFP. خلايا HEK293T وقد شارك transfected مع-MYC spastin وCHMP1B-GFP، أو كما تحكم، MYC-Spastin وفارغ ناقلات EGFP. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت تحصد الخلايا في عازلة تحلل وتفصل إلى أجزاء قابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي. ويظهر التعبير عن البروتينات من حجم المتوقع في نسبة ذوبان من كل شارك في ترنسفكأيشن في (C) (MYC-Spastin / CHMP1B-GFP شارك في ترنسفكأيشن) و (D) (MYC-Spastin / فارغة ناقلات EGFP شارك في ترنسفكأيشن) . تم immunoprecipitated الصورتين القابلة للذوبان باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP، تم فصل البروتينات immunoprecipitated بواسطة SDS-PAGE ثم immunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة MYC. لMYC-Spastin / CHMP1B-GFP شارك في ترنسفكأيشن،-Spastin MYC وشهدت الفرقة المقابلة لفي immunoprecipitate (E). لم يكن حاضرا هذه الفرقة عندما تم حذف الأجسام المضادة لمكافحة GFP من مناعي (E). في السيطرة MYC-Spastin / فارغ ناقلات EGFP مناعي، لم تكن هناك عصابات MYC Spastin الحالية (F).

تم بوساطة التفاعل بين spastin وCHMP1B من المنطقة N-الطرفية من spastin

درسنا التي كانت متواليات من الجزيء spastin المسؤولة عن التفاعل مع CHMP1B، وذلك باستخدام الخميرة اثنين الهجين الفحص. التي قطعناها على أنفسنا الخميرة اثنين الهجين "الطعم" التي تحتوي على كامل طول spastin، spastin مع حذف-C محطة إزالة المجال AAA كامل (spastinΔAAA)، spastin مع حذف N-محطة إزالة أول 194 الأحماض الأمينية من البروتين، بما في ذلك مجال MIT (spastinΔN1) وspastin مع الحذف-N محطة إزالة أول 80 الأحماض الأمينية وترك المجال MIT سليمة (spastinΔN2) (الشكل 2). على الرغم من أن فريسة CHMP1B تفاعلت بقوة مع من النوع البري spastin، spastinΔAAA وspastinΔN2 الطعم، فشل الطعم spastinΔN1 للتفاعل (الشكل 9).

الرقم 9. يتم بوساطة التفاعل بين spastin وCHMP1B من منطقة spastin الذي يحتوي على مجال MIT. وأجري التحقيق في المجالات المسؤولة عن التفاعل بين spastin وCHMP1B خارج باستخدام الخميرة اثنين الهجين. العمود 1 يبين نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان ويسين (-U / L) لتحديد وجود كل من الطعم وناقلات فريسة. ويبين العمود 2 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان، ليسين والحامض الاميني، الأمر الذي يتطلب تفعيل صاحب مراسل الجينات، في حين يبين العمود 3 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان، ليسين والأدنين، الأمر الذي يتطلب تفعيل مراسل الجين أدي. في كل spastin قضية أو متحولة spastin كان يستخدم البروتين "الطعم"، في حين كان يستخدم CHMP1B باسم 'فريسة'. كامل طول spastin، spastinΔAAA وspastinΔN2 عن التفاعل مع CHMP1B، ولكن spastinΔN1 لا.

التعبير عن-حاتمة الموسومة CHMP1B يمنع تطوير microtubular النمط الظاهري الخلوية الشاذ المرتبطة أتباز معيب spastin

درسنا القادم تأثير التعبير عن CHMP1B على النمط الظاهري الخلوية microtubular الشاذة التي وصفت مع التعبير عن أتباز معيب spastin (13). ولدت لنا لبناء N-محطة الموسومة MYC التي تم حذف-C محطة نهاية تحتوي AAA-المجال كاملة من spastin (MYC-SpastinΔAAA، الشكل 2). ونحن أيضا بنيات الموسومة MYC N-الطرفية التي تحتوي على ثلاثة الطفرات مغلطة مختلفة، S362C، K388R وT615I. الطفرات S362C وK388R هي في الكاسيت أتباز وكما هو معروف الطفرة K388R لمنع وظيفة أتباز العادية. طفرة T615I هي في نهاية C-محطة القصوى من البروتين، خارج نطاق AAA. عندما عبرنا عن عابر هذه التركيبات في كوس-7 الخلايا، وجدنا العلامات المترجمة إلى منقط، والهياكل محيط بالنواة في الخلايا مع مستويات التعبير منخفضة (الشكل 10 A). ومع ذلك، مع المعتدلين (الشكل 10 ب) ارتفاع (الشكل 10 مستويات التعبير C)، وجدنا الهياكل الخيطية المسمى بارزة في جميع الخلايا تقريبا. هذه النتائج هي مشابهة جدا لأوصاف السابقة من النمط الظاهري الخلوية الناتجة عن التعبير عن spastin مع وظيفة أتباز المعيبة، واتسمت خيوط حزم كما ممدود بشكل غير طبيعي وسميكة من الأنابيب الدقيقة (13). التي قطعناها على أنفسنا أيضا بناء الموسومة MYC تحتوي على التغيير تسلسل S44L التي تم العثور عليها في ولاية متماثل في مريض واحد مع الشلل النصفي التشنجي، على الرغم من أنه ليس من الواضح ما إذا كانت الطفرة المسببة للمرض في هذه الحالة. كما ذكرت سابقا، فإن نمط التعبير عن هذا التصور لا يختلف عن النوع البري spastin (13).

الرقم 10. المشارك التعبير مع CHMP1B عكس النمط الظاهري الخلوية التي تسببها أتباز معيب spastin. (A-C) تظهر ثلاث خلايا منفصلة تبين مظاهر مختلفة من MYC-SpastinΔAAA transfected كوس-7 الخلايا. مع مستويات التعبير منخفضة، ويتركز MYC-Spastin في منطقة محيط بالنواة (A). مع زيادة مستويات التعبير، والخلايا لديها مختلطة الخيطية توزيع / منقط التسمية (B). مع ارتفاع التعبير، وهناك العديد من الهياكل الخيطية في السيتوبلازم (C). (D-F) تظهر مظهر نموذجي لكوس-7 transfected المشترك مع خلية CHMP1B-GFP (D) وMYC-SpastinΔAAA (E). ظهور الخيطية غير موجود وبقوة شارك المترجمة SpastinΔAAA وCHMP1B في هياكل دائرية. في بعض الأحيان، كانت الحويصلات حشوية أكبر ينظر أحيانا مع CHMP1B-GFP التعبير شارك الملطخة (السهم). تم العثور على نتائج مماثلة عندما أعرب عن نفس متحولة spastin مع GFP-CHMP1B وعندما أعرب عن MYC-SpastinK338R مع GFP-CHMP1B أو CHMP1B-GFP. وهناك نسبة صغيرة من الخلايا transfected شارك الإبقاء على النمط الظاهري الخيطية، وأظهرت مظهر نموذجي واحدة من هذه الخلايا في (G-I). نمط العلامات CHMP1B-GFP (G) وغيرت تماما عن تلك الموجودة عادة، وبدلا من ذلك بشدة شارك يموضع مع MYC-SpastinΔAAA المسمى خيوط (H وI). كان CHMP1B-GFP التعبير وحدها أي تأثير الإجمالي على الأنابيب الدقيقة بلمرة (J-L). الساحات ملونة يظهر في الزاوية اليمنى السفلي من كل صورة على نطاق والرمادي تشير إلى لون من تلك الصورة في الصورة اندمجت المقابلة (C، F، I و L). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

لتقييم ما إذا CHMP1B التعبير تعديل النمط الظاهري الخلوية الشاذ المرتبطة المسوخ spastin، شاركنا اعرب GFP-CHMP1B أو CHMP1B-GFP مع كل بناء متحولة. في حالة MYC-SpastinΔAAA، MYC-SpastinK388R، MYC-SpastinS362C أو MYC-SpastinT615I يبني، أسفرت شاركت في التعبير مع أي CHMP1B بناء في خسارة كاملة من النمط الظاهري الخيطية تقريبا في جميع الخلايا التي كانت المشترك transfected. وقد شارك بقوة المترجمة للspastin متحولة مع CHMP1B في السيتوبلازم. في حالة CHMP1B-GFP، وكان هذا التعاون التعريب على هياكل دائرية بأحجام مختلفة داخل السيتوبلازم (الشكل 10 D-F). كان أقوى شارك في التعريب في الهياكل منقط الصغيرة، على الرغم من أن نسبة من الحويصلات أكبر ينظر أحيانا مع CHMP1B-GFP التعبير المزدوج المسمى أيضا. هذه الحويصلات أكبر ملطخة إيجابية مع فيليبين، مشيرة إلى أنها كانت الغنية بالكوليسترول ويعني أنهم كانوا من أصل endosomal (لا تظهر البيانات). في أقلية صغيرة من الخلايا transfected المشترك التي لم يكن لها ظهور الخيطية (~5٪ مقابل> 60٪ من الخلايا عندما أعرب عن متحولة spastin مستقل)، تم توزيعها CHMP1B ومترجمة شارك مع spastin متحولة على خيوط (الشكل. 10 G-I). المظاهر مع زملاء التعبير عن MYC-SpastinS44L مقابل GFP-CHMP1B أو CHMP1B-GFP لم تختلف عن المشاركة في التعبير عن CHMP1B يبني مع من النوع البري الموسومة حاتمة spastin (لا تظهر البيانات). وشوهد العديد من حزم أنيبيب من طول ما يبدو العادي وقطر عندما أبديت بنيات CHMP1B وحدها (الشكل 10 J-L).

وأعرب عن CHMP1B في دماغ الجنين وتعليم الكبار

ومن المتوقع CHMP1B أن تكون موجودة في أنسجة الجهاز العصبي المركزي، وإذا كانت التفاعلات بينه وبين spastin لها علاقة كبيرة في التنكس العصبي ينظر في HSP. حددنا به تسلسل أعرب (التكنولوجيات السليمة بيئيا) الموافق CHMP1B من خلال تنفيذ عملية بحث BLAST ضد قواعد البيانات EST الإنسان (34). وقد استمدت العديد من التكنولوجيات السليمة بيئيا، بما في ذلك طول كامل أو شبه cDNAs كامل طول (على سبيل المثال BX418704، BI596792) من الكبار أو مكتبات [كدنا مخ الجنين، مما يدل على أن يتم التعبير عن CHMP1B في الجهاز العصبي المركزي.

طفرة فحص CHMP1B في الأسر HSP

كما وجدنا دليلا قويا على أن CHMP1B شريك ملزم المحتمل لspastin، رأيناها CHMP1B وHSP مرشح الجينات المرض. لذا قمنا بها طفرة فحص الجينات في مجموعة من العائلات HSP. وCHMP1B كدنا] لديه تسلسل الترميز من 600 سنة مضت الموجه على الحمض النووي الجيني في اكسون واحد. لقد قمنا بتصميم الاشعال PCR لتضخيم التسلسل الجيني الترميز من الجينات، جنبا إلى جنب مع المرافقة DNA غير المشفر، في اثنين من شظايا متداخلة. وتضخمت هذه الشظايا من عينات الحمض النووي الجيني من أحد الأعضاء المتضررين من 25 عائلة مع HSP (في 23 منها نمط الميراث كان متوافق مع راثي الميراث المهيمنة، في اثنين متوافق مع الميراث مقهورة). تسعة عشر من هذه الأسر قد تم فرزهم لspastin الطفرات و 24 تم فرزهم لatlastin الطفرات، وكانت النتائج سلبية. تسلسل CHMP1B تضخيم شظايا كشف أي تغييرات تسلسل الترميز.

نقاش

شرعنا في التبصر وظيفة spastin، وهو بروتين تحور في HSP، من خلال تحديد الشركاء المحتملين ملزم. باستخدام نهج يومين الهجين الخميرة، حددنا تفاعل معين بين spastin وCHMP1B، وهو بروتين endosomal تشارك في أحداث المرور الغشاء. وقد دعمت أهمية فسيولوجية لهذا التفاعل في خلايا الثدييات بقوة من خلال ضرب شارك في توطين الموسومة حاتمة spastin مع CHMP1B، من خلال النتائج الإيجابية ومحددة في المختبر والمجراة β-اكتاماز البروتين جزء المقايسات تكامل والتعاون مناعي الدراسات. وبالإضافة إلى ذلك، شاهدنا آثار على توزيع التحت خلوية من الموسومة حاتمة من النوع البري وspastin متحولة مع التعبير عن CHMP1B. معا، تعطي هذه البيانات دعما قويا للتفاعل الفسيولوجية بين spastin وCHMP1B في خلايا الثدييات، مع التحذير من أن جميع التجارب التأكيدية تستخدم أنظمة overexpression. وهذا يعني أنه من الممكن أن بعض النتائج الإيجابية قد يكون الإفراط في التعبير القطع الأثرية والدراسات التي تهدف إلى إيجاد دليل على أهمية الذاتية للتفاعل spastin-CHMP1B أن تكون مفيدة.
وتدعم دراسة ملاحظاتنا السابقة بشأن توزيع الموسومة حاتمة من النوع البري spastin في كوس-7 الخلايا، مع الحاضر spastin في منقط أو الهياكل الأنبوبية داخل سيتوبلازم الخلية (13). بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم البيانات على توطين التحت خلوية من الموسومة حاتمة spastin في خط الخلية PC12 الفئران، خط خلية من خلايا ورم القواتم مشتق التي يمكن أن تكون متباينة في النمط الظاهري العصبية باستخدام عامل نمو الأعصاب (NGF). في الخلايا PC12 غير متمايزة، كان spastin الحاضر عن الهياكل منقط داخل السيتوبلازم. في الخلايا أكثر متباينة، كان spastin الحاضر مرة أخرى كما في نقاط وسوما، ولكن كان حاضرا في ملحقات محوار، مع أقوى تعبير غالبا في نهاية البعيدة للمحوار. هذا التوزيع هو مماثلة لتلك التي وصفها لspastin الذاتية في خط الخلية العصبية الحركية، حيث تم إثراء التعبير في المحور العصبي البعيدة والمناطق المتفرعة (11). ومع ذلك، فإنه يختلف عن نمط التعبير عن الموسومة FLAG من النوع البري spastin في العصبونات القشرية الفئران، حيث اقتصر التعبير إلى سوما ولم تمتد إلى محور عصبي أو التشعبات (14). أسباب هذا التباين ليست واضحة، ولكن يمكن أن تشمل آثار الخلية من نوع أو العلامة حاتمة معينة المستخدمة.
يميز هذه الدراسة أيضا للمرة الأولى توزيع التحت خلوية من CHMP1B ونحن نبين أن لديها نمط التعبير النووي وحشوية مختلطة في كوس-7 والخلايا PC12. في الخلايا PC12، تم العثور حشوية التعبير CHMP1B في الهياكل منقط في سوما الخلية، وأيضا في ملحقات محوار، مع نهايات البعيدة من neurites التي وصفت تظهر في كثير من الأحيان تعبير قوي. داخل سيتوبلازم كوس-7 الخلايا، وCHMP1B عادة موجودة في قبعة محيط بالنواة البؤري من الحويصلات وأكثر الطرفية، والهياكل منقط أصغر. وكانت حويصلات محيط بالنواة إيجابية على الأقل نسبة من CHMP1B الإندوسومات، لأنها تشارك الملون مع علامات الإندوسومات المبكرة والمتأخرة والكولسترول الوارد. وقد لوحظت بعض الاختلافات التي تعتمد على بناء في توزيع التحت خلوية من CHMP1B في كوس-7 الخلايا. وشوهدت القبعات محيط بالنواة هياكل حويصلي عادة مع MYC-CHMP1B وCHMP1B-GFP، ولكن ليس GFP-CHMP1B، في حين شوهدت الهياكل حويصلي حشوية تضخم غير طبيعي فقط مع CHMP1B-GFP. ومن المرجح أن تكون ثانوية بالنسبة للآثار الموقع وطبيعة العلامة حاتمة هذه الآثار. أحد التفسيرات المحتملة لهذه الملاحظات هو أن (ط) العلامة GFP N-محطة تعوق ملزمة لأغشية حويصلي، لذلك GFP-CHMP1B لا تسمية الهياكل حويصلي محيط بالنواة ينظر مع البروتينات الانصهار أخرى، (ب) علامة GFP-C محطة يسمح ملزمة لأغشية حويصلي ولكن يسبب تضخم غير طبيعي للالإندوسومات عن طريق منع إزالة CHMP1B، (ج) يسمح للN-محطة العلامة ج-MYC الظروف العادية ملزمة والعزل من الأغشية، مما أدى إلى حويصلات محيط بالنواة المسمى التي لم يتم الموسع. يمكن هذا التفسير أيضا شرح بعض الاختلافات التي تعتمد على بناء وجدنا في منطقتنا spastin-CHMP1B دراسات شارك في التعريب. في دراسات شارك في التعريب التي كانت MYC-CHMP1B مقابل البروتينات الانصهار spastin، كان معظم المشاركين في التعريب في الهياكل منقط والأنبوبية التي وزعت في السيتوبلازم محيط بالنواة وأكثر هامشية. وكانت مباراة محيط بالنواة هياكل حويصلي ينظر عادة مع MYC-CHMP1B عادة غائبة، مما يشير إلى أن التعبير spastin تسبب CHMP1B لتعبئتها من هذه البؤر الحويصلي. ومع ذلك، في دراسات شارك في توطين باستخدام CHMP1B-GFP، على الرغم من أن عثر منقط الطرفية شارك في الترجمة، وكان أقوى شارك في توطين الحالي عادة في الحد الأقصى محيط بالنواة هياكل حويصلي، مما يشير إلى أنه في هذه الحالة هو spastin التي يعاد توزيعها إلى غير متحرك CHMP1B. وقد وصفت آثار علامات حاتمة على وظيفة البروتينات CHMP (23). هذه الآثار يمكن أن تعتمد على طبيعة ومكانة العلامة، على الرغم من عدم قاعدة واضحة على النحو الذي به يكون لها تأثير سلبي المهيمن على وظيفة CHMP برزت حتى الآن.
عندما عبرنا عن مجموعة متنوعة من بنيات spastin أتباز معيبة في كوس-7 الخلايا، وجدنا نمط التعبير مطابقة لتلك التي سبق وصفها. وspastin متحولة أصبحت مرتبطة مع الهياكل الخيطية غير طبيعية، والتي تتكون من خيوط سميكة وممدود من الأنابيب الدقيقة (13). إلى حد كبير، وتبين لنا أن CHMP1B التعبير له آثار وخيمة على نمط التعبير عن أتباز معيب الموسومة حاتمة spastin. اختفت الهياكل الخيطية المسمى spastin من الخلايا، معربا عن المشترك فقط تقريبا، وبدلا من ذلك spastin متحولة بقوة شارك المترجمة مع CHMP1B. هذه الملاحظات، التي اتخذت مع حقيقة أن الخلايا معربا عن مستويات منخفضة من spastin أتباز معيب لا تظهر النمط الظاهري الخيطية، تشير إلى أن في هذه النماذج خلية spastin متحولة قد ربط الأنابيب الدقيقة مرة واحدة فقط مواقع ملزم للبروتينات أخرى، بما في ذلك CHMP1B، والمشبعة . التعبير عن CHMP1B خارجية المنشأ قد تزيد من مواقع الربط المتاحة، ومنع النمط الظاهري الخيطية من البلدان النامية. على الرغم من أن من غير المحتمل، لا يمكننا استبعاد تماما على إمكانية البديلة التي CHMP1B التعبير في حد ذاته يسبب أنيبيب إعادة التنظيم التي بدورها يمكن أن يكون لها تأثير غير مباشر على توزيع spastin.
رسمناها منطقة spastin التي تتفاعل مع CHMP1B كما الواقعة بين بقايا 80 و 196. Spastin معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا النطاق تقع بين بقايا 116 و 194، التي تشكل أكثر من CHMP1B التفاعل المنطقة، ويبدو من المرجح أن المجال MIT هو المسؤول عن التفاعل بين spastin وCHMP1B. وهذا يتفق مع البيانات على ربط Vps4p إلى الإندوسومات في الخميرة، والذي يحدث عبر مجال MIT ويعتمد على وجود Vps2 وVps24، المتماثلات من CHMP2 البشرية وCHMP3 (22، 25). ولذلك يبدو أنه في حالتين على الأقل، spastin وVPS4، ملزمة لأحد أفراد الأسرة CHMP بوساطة المجال MIT. يبقى أن نرى ما إذا كان غيرها من البروتينات التي تحتوي على مجال MIT تتفاعل أيضا مع أفراد الأسرة CHMP، وإذا كان الأمر كذلك، ما إذا كان الفرق أو التفاعل عدائية من البروتينات التي تحتوي على مجال MIT مختلف مع البروتينات CHMP يمكن أن تكون آلية هامة لتنظيم المسار. منطقة التفاعل spastin مع CHMP1B منفصلة عن تلك المطلوبة للتفاعل مع الأنابيب الدقيقة، والتي تمت مؤخرا تم تحديدها على أنها واقعة بين بقايا 50 و 87 (11). وجود مواقع متميزة ملزمة لCHMP1B والتفاعل أنيبيب يتفق مع الحقائق التي لدينا CHMP1B لا يزال شارك توطين مع أتباز معيب spastin على خيوط، في تلك الخلايا نادرة المشترك معربا على حد سواء البروتينات التي تطور النمط الظاهري الخيطية.
الأسرة CHMP من البروتينات وتشارك كلها في أحداث المرور غشاء الخلايا، على الأقل، ولكن ربما ليس على سبيل الحصر، على مستوى الإندوسومات (24). الخميرة البروتينات آلية تبادل المعلومات والمتماثلات CHMP الإنسان تشكل، أو ترتبط ارتباطا وثيقا، ومجمع ESCRT-III، والتي قد تشكل العنصر الأخير من سلسلة من ثلاثة أجزاء التي تستهدف شحنات غشاء المرتبطة للجسم عديد الحويصلات (22). وليس من الواضح ما إذا كان CHMP1B هو جزء من مجمع ESCRT-III، أو ما إذا كان يلعب دور تنظيمي على وظيفة معقدة. في الوقت الحاضر، يمكننا التكهن فقط على دور وظيفي أن التفاعل spastin مع CHMP1B قد يستغرق. يتم تنظيم جمعية غشاء ESCRT-III CHMPs، بما في ذلك CHMP1B، من خلال VPS4، وهو بروتين AAA التي لديها أوجه التشابه مع spastin، لأن كلاهما يحتوي على مجال MIT وأعضاء من نفس AAA فرعية الأسرة (+22 - 25). كما يرتبط spastin هيكليا لVPS4، فمن الممكن أن تفاعلها مع CHMP1B قد تتخذ شكل تنظيم جمعية غشاء من هذا الجزيء بالمثل. في هذا السياق، من المثير للاهتمام أن وجدنا شارك التعبير من spastin مع MYC-CHMP1B بدا لتعبئة البروتين CHMP1B من توزيع حويصلي محيط بالنواة. بديل وإمكانية ربما أكثر بعد أن CHMP1B قد يكون لها وظائف المرتبطة تفاعله مع spastin التي تختلف عن دورها في حركة الغشاء.
وجدنا بعض التعبير CHMP1B في النواة. هذا النووية / نمط التعبير حشوية المختلط مماثلة لتلك التي وصفها لجزيء CHMP1A ترتبط ارتباطا وثيقا، والتي قد يكون لها شكل الإسوي النووي دورا في استقرار إسكات الجينات (27). على أساس نتائج هذه الدراسة، والعديد من الدراسات التي بحثت في توزيع التحت خلوية من spastin (7، 8، 10، 11)، يبدو من المرجح أن لديها أيضا النووي / توزيع هيولي مختلطة. وهكذا CHMP1B وspastin قد تقع في مجموعة من الجزيئات (التي استعرضت في 27) التي لها وظائف منفصلة في مسارات حركة الغشاء وفي النواة.
وهناك دور للspastin في الاتجار غشاء متوافق مع اقتراح أن spastin قد يكون لها دور في تنظيم أنيبيب (11، 13، 15). وبالنظر إلى الترابط الوثيق بين حركة البضائع متجهة الحويصلة والنقل بواسطة جزيئات السيارات على خيوط هيكل الخلية، فمن المتصور أن جزيء يشارك في أحداث المرور غشاء الخلايا قد تتفاعل أيضا مع الأنابيب الدقيقة أو يكون لها تأثيرات الثانوية على ديناميات أنيبيب، وبالفعل عدد قليل من هذه وقد وصفت جزيئات (إعادة النظر في 17). على هذه الخلفية، فمن المثير للاهتمام أن رأينا بؤر منقط من CHMP1B مترجمة شارك وspastin المنظمة على المصفوفات الخطية، تذكرنا الحويصلات التي يجري نقلها على الأنابيب الدقيقة. بل هو أيضا الجدير بالذكر أنه على الرغم من ذبابة الفاكهة spastin كان لها آثار على الأنابيب الدقيقة محور عصبي، كان نمط التعبير التحت خلوية من الأنابيب الدقيقة مستقرة وD-spastin متميزة، مع-D spastin بدلا شارك توطين-مع متشابك تجمع حويصلة علامة synaptotagmin (15). هذا ربما يشير إلى أن D-spastin قد يكون لها وظائف أخرى التي تختلف لتنظيم أنيبيب. سوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتشريح هذه القضايا.
إذا spastin لها دور في مسار التقامي، وهذا يثير مسألة كيفية خلل في هذه العملية قد تؤدي إلى HSP النمط الظاهري الاعصاب. مسار التقامي دورا هاما في تنظيم غشاء المرتبطة المستقبلات، مع تنظيم مستقبلات أن تعتمد على التوازن بين تدهور في المقصورة lumenal للعديد الحويصلات الجسم / يحلول مقابل إعادة التدوير إلى غشاء البلازما (19). شذوذ الفرز في مسار التقامي قد يؤدي في المستقبل حتى- أو لأسفل التنظيم. ولذلك يمكن خلل في مسار التقامي يسبب تشوهات متعددة في مستويات مستقبلات غشاء البلازما ويترتب على ذلك خلل في الإشارات، وربما بما في ذلك تفعيل مسارات أفكارك، أو قمع مسارات البقاء على قيد الحياة. نهايات البعيدة من المحاور طويلة جدا قد تكون عرضة بشكل خاص لهذه العملية، لأن مسارات المصب قد يكون بالفعل تعمل على المستويات الدنيا تقريبا في مثل هذه البيئة القاسية. والاحتمال الآخر هو أن الشذوذ في حركة endosomal قد التشويش على إشارات مباشرة المصب، بغض النظر عن مستويات مستقبلات غشاء البلازما. صيانة الخلايا العصبية تعتمد على عوامل بقاء عصبية الصادرة عن أهداف تعصيب. هذه العوامل بقاء إشارة من قبل تنشيط مستقبلات وما شابه ذلك على الغشاء قبل المشبكي الخلايا العصبية (35). على الأقل في بعض الخلايا العصبية NGF إشارات يمكن نقلها في الإندوسومات المتخصصة الأولى التي يتم نقلها إلى جسم الخلية العصبية بواسطة وسائل النقل محور عصبي الوراء (35، 36). وبالتالي يمكن أن فشل الاتجار الاندوسوم يشير تؤدي إلى تنكس عصبي، والخلايا العصبية مرة أخرى مع محاور عصبية طويلة جدا يمكن أن تكون عرضة لتشوهات من هذا النوع من العمليات.
هناك أدلة متزايدة على أن العيوب في وظائف ذات الصلة النقل داخل الخلايا وحركة الغشاء قد تكون آليات مشتركة لالتنكس العصبي ينظر في HSP. قد تورطت عدة بروتينات HSP في النقل الجزيئي، بما في ذلك الخلايا العصبية محددة كينيسين السلسلة الثقيلة KIF5A (37 - 39)، أو أحداث المرور الغشاء، بما في ذلك alsin، atlastin، maspardin، spartin وNIPA1 (غير مطبوع في Angelman's1) (16 ، +40 - 46). على نطاق أوسع، وتحليل أسباب الأمراض الوراثية من LMNs يشير إلى أنها هي أيضا عرضة للعيوب في النقل داخل الخلايا أو حركة الغشاء، مع المحرك كينيسين KIF1Bbeta، خيط عصبي ضوء سلسلة، المتعلقة myotubularin 2 بروتين الفوسفاتيز، gigaxonin والبروتينات Rab7 يجري كل المتورطين في هذه العمليات (+47 - +52).
وباختصار، فإننا نقدم البيانات التي نقترح بقوة على التفاعل في خلايا الثدييات بين spastin وCHMP1B. هذه النتائج تدعم فكرة أن spastin يلعب دورا في حركة الغشاء، وتسهم في اعتراف الناشئة التي عيوب في آليات النقل والمرور غشاء الخلايا هي سبب كبير من الخلايا العصبية الحركية علم الأمراض.

المواد والأساليب

بناء الخميرة اثنين الهجين والمناعي ناقلات

وتضخمت الإطارات القراءة مفتوحة كاملة من spastin وCHMP1B كل قراءة دليل PFX البلمرة (إينفيتروجن) PCR من الحيوانات المستنسخة IMAGE 4829087 و3928338، على التوالي، وذلك باستخدام بوابة ™ (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المتوافقة مع نظام مصمم من تسلسل [كدنا مرجعية لكل جين. لتوليد spastinΔAAA، spastinΔN1 وspastinΔN2 المسوخ، PFX أجريت PCR خارج باستخدام المناسبة عبارة (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المتوافقة مع نظام مصمم من داخل كدنا] إشارة. ولدت متحولة spastin T615I بواسطة PCR باستخدام التمهيدي العكسي الذي تضمن تغيير تسلسل المناسب. تم إنشاء أشكال متحولة أخرى من spastin باستخدام الربط عن طريق التداخل منهج الإرشاد، كما هو موضح سابقا، مرة أخرى باستخدام عبارة (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المرافقة المتوافقة مع نظام (53). تم بناء ناقلات دخول بوابة نظام إعادة التركيب استنساخ pENTR201 و / أو pENTR207 تحتوي على cDNAs تضخيم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم التحقق من تسلسل الدخول يبني ناقلات بواسطة التسلسل على ABI377 أو 3700 المنظم، وذلك باستخدام BigDyeDT الكيمياء (النظم البيولوجية التطبيقية).
ثم تم subcloned وspastin وCHMP1B من النوع البري محاضر في ناقلات بوابة المتوافقة مع pcDNA3-NG-MYC، PE-GFP-N وPE-GFP-C، الذي تضمن 5'-MYC، 3'-GFP أو 5'-GFP الحواتم، على التوالي. تم subcloned بنيات متحولة Spastin في ناقلات بوابة متوافق مع pcDNA3-NG-MYC. تم التحقق من التوجه للتسلسل spastin وCHMP1B داخل بنيات بواسطة التسلسل المباشر على ABI377 أو 3700 المنظم، أو عن طريق PCR مع تركيبات مناسبة للناقلات وإدراج بادئات محددة التسلسل.
لخميرة التجارب يومين الهجينة، وsubcloned والتي تحتوي على spastin pENTR201 دخول المتجه إلى ناقلات الطعم بوابة متوافق مع pGBDU-G، والتي تم بناؤها من قبل استنساخ قراءة بوابة إطار كاسيت B إلى pGBDU-C1 (54) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة .

الخميرة يومين الهجينة فحص مكتبة ومراسل المقايسات

PJ69-4A سلالة الخميرة (حصيرة على trp1-901 leu2-3، 112 ura3-52، his3-200 gal4Δ gal80Δ LYS2 :: GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2 :: GAL7-lacZ (54)) تحولت بواسطة الصعق الكهربائي (55 ) مع البلازميد الطعم، والتي تحمل URA3 علامة. لم يتم الحصول على تنشيط الذاتي للجينات مراسل سلالة الطعم على الاصطناعية التسرب (SD) -Ura / أدي وSD -Ura / صاحب. تم عرض الطعم spastin ضد K562 erythroleukaemia مكتبة كدنا] صانع عيدان الثقاب (Clontech)، الذي يحتوي على LEU2 علامة، وتتضخم وتتحول إلى نوع التزاوج تحول، MAT α مشتق من سلالة PJ69-4A الخميرة. وتمثل هذه المكتبة 3.5 × 10 6 استنساخ مستقلة مع الحجم المقدر إدراج [كدنا تتراوح 0،4-3،8 كيلو بايت، مع متوسط ​​حجم إدراج 1.9 كيلوبايت.
الخميرة الطعم (~10 9 وت) وتزاوج بشكل فردي إلى المكتبة فريسة الخميرة (~6 × 10 8 كفو) باستخدام إجراء لوحة التزاوج معدلة من طريقة موضح سابقا (56). أعطى هذا التزاوج من الكفاءة> 2٪، مما يتيح تغطية ~4 أضعاف من المكتبة. وقد نمت خليط من التزاوج على 16 × 150 مم SD لوحات -Ura / لوي / أدي لمدة تصل الى 2 أسابيع لاختيار من الحيوانات المستنسخة معربا عن ADE2 المراسل. تم القبض على المستعمرات في شكل 96-الشبكة على لوحات SD -Ura / لوي / آدي هذه أن كل معالجة لاحقة يمكن أن يؤديها باستخدام المكرر 96 دبوس. تفعيل lacZ كان يعاير مراسل التي تنمو الخميرة على ورق الترشيح على لوحات YPAD بين عشية وضحاها، الناشر الخلايا في النيتروجين السائل ثم يحتضنها المرشحات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على مرشحات مسبقا غارقة في 6 مل Z العازلة (100 متر م نا 2 هبو 4، 40 م م ناه 2 PO 4، 10 م م بوكل، 1 م م MgSO 4، ص 7)، و 100 ميكرولتر 4٪ X-غال و 11 ميكرولتر β المركابتويثانول. وسجل المستعمرات بأنها إيجابية لتفعيل lacZ إذا كان التلون أكبر من أن الخميرة التي تحتوي على ناقل الطعم وحده. نحن لم يسجل لتفعيل HIS3 الجينات لأنه في تجربتنا> 99٪ من المستعمرات التي تنشط ADE2 أيضا تفعيل HIS3، كما ذكرت سابقا (54).

تحديد البروتينات التفاعل في الخميرة الشاشتين الهجين

وتضخمت إدراج فريسة مباشرة من الخميرة باستخدام بادئات ناقلات محددة. تم القبض على مستعمرات الخميرة إلى 20 م م هيدروكسيد الصوديوم و lysed لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمت إضافة قسامة 1.5 ميكرولتر من مزيج تحلل لمعيار 25 ميكرولتر PCR رد فعل تحتوي على الاشعال ناقلات محددة. كانت ساخنة تفاعل PCR لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية تليها 35 دورات من 1 دقيقة تمسخ في 95 ° C، 1 دقيقة الصلب في 58 ° C و 3.5 دقيقة التمديد في 72 ° C. تم تشغيل أربعة microlitres من كل تفاعل PCR على 0.8٪ هلام الاغاروز لتقدير حجم إدراج. للتعرف على إدراج فريسة، والتسلسل 3-5 ميكرولتر من كل منتج PCR كما هو موضح أعلاه.

إعادة تأكيد وخصوصية اختبار الخميرة المقايسات يومين الهجينة

لإعادة اختبار كل تفاعل في الخميرة الطازجة، تم استنساخ كل منتج PCR فريسة باستخدام بوابة نظام إعادة التركيب الاستنساخ في بوابة متوافق pGAD-G ناقلات، كما هو موضح أعلاه. المختصة MAT تحولت α خلايا الخميرة PJ69-4A بواسطة الصعق الكهربائي (55) مع كل من هذه فريسة متجه تحتوي على البلازميدات ومطلي مباشرة على SD -Leu لوحات. بعد النمو عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام، وكانوا تزاوج بواسطة الطلاء طبق على حشيش MAT الخميرة التي تحتوي إما على الطعم ذات الصلة، واثنين من الطعوم ذات صلة مختلفة أو الطعم متجه فارغة، ثم حضنت ل> 5 ساعات على لوحات YPAD. وقد تم اختيار Diploids على SD -Ura / لوي قبل الاختبار لتفعيل مراسل عن طريق تكرار على SD -Ura / لوي / آدي.

التحليل الحسابي

كما تم البحث في تسلسل فريسة ضد الإصدارات التي تعقد محليا من الانسان العاقل Unigene وقواعد البيانات EMBLminus باستخدام BLAST الآلي (34) الخوارزمية. استخدمت بنيت خصيصا حدات بيرل والكتابات على prefilter وتنسيق الإخراج BLAST الخام، وتحديد ما إذا كان تسلسل 5 'قراءة تتداخل مع منطقة ترميز البروتين من الجين. مباريات فقط لمناطق ترميز البروتين المعروف والتكنولوجيات السليمة بيئيا التي لم تدرج إطار القراءة المفتوح الذي يعرف بأنه ايجابيات. تم استبعاد مباريات ل3 'UTRs والحمض النووي الجيني مع عدم وجود التنبؤ الجينات المرتبطة بها. مفرد، استبعدت التكنولوجيات السليمة بيئيا unspliced ​​التي لم تتوافق مع أي توقعات الجينات أيضا، لأنها ربما تمثل التلوث الجيني للمكتبات كدنا].

الأجسام المضادة

تم الحصول على الأجسام المضادة الأولية لمكافحة MYC وحيدة النسيلة (الماوس استنساخ 4A6) من Clontech. وقد تم الحصول على وحيدة النسيلة الأجسام المضادة لمكافحة أنيبيب (الفئران استنساخ YL1 / 2) ومكافحة GFP الأضداد الأرنب بولكلونل من abcam (كامبردج). EEA1، كانت M6PR وLamp1 الأجسام المضادة هدية عينية من بول Luzio (كامبردج). تم الحصول على الأجسام المضادة الثانوية مترافق البيروكسيد عن النشاف الغربي من سيجما. تم الحصول على الأجسام المضادة الثانوية للالمناعي من جاكسون ImmunoResearch، وشركة

زراعة الخلايا، وترنسفكأيشن المناعي

وكانت المصنفة خلايا كوس-7 على coverslips زجاجية معقمة في ست لوحات جيدة (~2.5 × 10 5 خلايا / جيد). بعد 24 ساعة و transfected الخلايا مع ~400 نانوغرام من الحمض النووي ناقلات، وذلك باستخدام Effectene ® كاشف ترنسفكأيشن (QIAGEN)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد ترنسفكأيشن، وحضنت الخلايا لمدة 24 أو 48 ساعة في المعدل المتوسط ​​النسر Dulbecco و(DMEM) (لايف تكنولوجيز) التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) (LABTECH الدولية)، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (الحياة تكنولوجيز). كانت خلايا غير متمايزة PC12 مثقف في DMEM تحتوي على 10٪ مصل الحصان (HS)، و 5٪ FBS و 1٪ البنسلين والستربتومايسين (لايف تكنولوجيز). وكانت المصنفة الخلايا في 1 × 10 5 إلى ست لوحات جيدة تحتوي على coverslips الزجاج المطلي مسبقا مع بولي د -Lysine (سيغما). كانت خلايا غير متمايزة ثم إما عابر مع transfected Effectene ® ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمدة 48 ساعة أو عابر transfected تليها التمايز مع 50 نانوغرام / مل NGF (سيغما) في انخفاض DMEM مصل يحتوي على 1٪ HS و 0.5٪ FBS. كانت خلايا متباينة مثقف في NGF تحتوي على وسائل الإعلام لمدة 48 ساعة على الأقل بعد ترنسفكأيشن.
بعد ترنسفكأيشن، وكانت تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني (الحياة تكنولوجيز) وثابت مع 3.8٪ امتصاص العرق و 4٪ السكروز في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وجرفت المياه خلايا ثابتة في برنامج تلفزيوني قبل permeabilized في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (سيغما) أو 0.05٪ سابونين (سيغما) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. خلايا Permeabilized ثم تم غسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني، المحتضنة لمدة 15 دقيقة في عرقلة الحل (PBS، و 10٪ FBS، ± 0.05٪ سابونين) ومن ثم نقلها إلى عرقلة الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة حاتمة محددة المناسب في التخفيف المناسبة. بعد 60 دقيقة الحضانة، وكانت تغسل coverslips ثلاث مرات في عرقلة الحل ثم تم حضنت لمدة 60 دقيقة في عرقلة العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، بتركيز 1/100. تم زلات غطاء ثم يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ومرة واحدة في H المقطر 2 O، وبعد ذلك تم تركيبه في Vectorshield ™ (ناقلات مختبرات شركة) المتوسطة على شريحة زجاجية. وقد تم تحليل عينات الملون على المجهر نيكون الكسوف E800 وبيو راد microradience معدات تحليل متحد البؤر. وسجلت الصور باستخدام برنامج الليزر-حاد OS2 وتمت معالجة البيانات في وقت لاحق باستخدام برامج أدوبي فوتوشوب و Microsoft PowerPoint.

بيتا لاكتاماز البروتين جزء تكامل فحص

بيتا لاكتاماز كدنا] يبني.

الجينات المقاومة الأمبيسلين (بلوخ كانت تستخدم) كهدف لPCR اثنين شظايا β-اكتاماز، BLF1 (الأحماض الأمينية 24-197) وBLF2 (الأحماض الأمينية 198-288)، وذلك باستخدام الأمام وعكس الاشعال تحتوي على تقييد مواقع التوقيت الصيفي الباسفيكي الأول وXho I ، على التوالي. [أليغنوكليوتيد التكميلية التي تحتوي على العديد من المواقع الفريدة تقييد (هند III، هبانالباسيفيكي الأول وXho I) والترميز في إطار ل15 الأمينية الحمضية ببتيد مرونة رابط (GGGGS) 3 تم تهجين معا وligated إلى pcDNA3.1 / زيو (+ ) خطي مع هند الثالث وXho I. تم ligated BLF1 وBLF2 شظايا β-اكتاماز بين التوقيت الصيفي الباسفيكي الأول وXho المواقع أنا المصب وفي الإطار مع (GGGGS) 3 رابط لإعطاء متجهين منفصلة معربا عن شظايا مختلفة من الجين β-اكتاماز (pcDNA3.1 / زيو (+ ) (GGGGS) 3 BLF1 وpcDNA3.1 / زيو (+) (GGGGS) 3 BLF2). والمنبع هبان كان يستخدم موقع I إلى ligate بوابة القراءة إطار كاسيت (RF B). واستخدمت هذه العبارة القراءة إطار كاسيت لligate إما بالطول CHMP1B الإنسان أو المنبع spastin من BLF1 في pcDNA3.1 / زيو (+) (GGGGS) 3 أو BLF2 في pcDNA3.1 / زيو (+) (GGGGS) 3. وتم التحقق من جميع البناءات في إطار وأكد من تسلسل الحمض النووي.

β-اكتاماز بمساعدة بروتين تكامل فحص اللونية.

واستند الفحص على الطريقة الموصوفة سابقا (30، 31)، مع تعديلات طفيفة. تم تقسيم الخلايا HEK293T 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن والمصنف عند 2.5 × 10 5 في 12 لوحات جيدة (نونك ™) في DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين والستربتومايسين. و transfected خلايا عابر مع 300 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد باستخدام Effectene® ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم غسلها ثمانية وأربعين ساعة بعد خلايا ترنسفكأيشن مرتين مع برنامج تلفزيوني وإعادة علقت في 100 ميكرولتر من 100 م م الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 ثم هي lysed من قبل ثلاث دورات تجميد ذوبان الجليد من خلال تجميد في الثلج الجاف / الإيثانول لمدة 10 دقيقة والذوبان في 37 ° C حمام الماء لمدة 10 دقيقة. وبعد ذلك تستخدم الكلي المحللة خلية لاختبار النشاط β-اكتاماز في 96 لوحات جيدة (الصقر ®). مائة microlitres 100 م م العازلة أضيف الفوسفات 7.4 درجة الحموضة إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا لتركيز النهائي من 60 ملم تحتوي على 20 ميكرولتر من مجموع الخلايا المحللة و2 ميكرولتر 10 م م Nitrocefin (بيكتون ديكنسون والشركة، سباركس، MD؛ النهائي تركيز 100 μ م) والمخفف إلى 200 ميكرولتر مع الماء منزوع الأيونات. ويعاير عينات في ثلاث نسخ باستخدام قارئ لوحة فيوجن ™ ألفا العالمي (بيركن إلمر الآلات ™) مزودة 485 نانومتر (20 نانومتر عرض النطاق الترددي) مرشح في وضع الامتصاص.
تم حساب معدلات التحلل Nitrocefin من كيد مجموعة خطية من زيادة امتصاص رصدت أكثر من 60 دقيقة. تم تطبيع البيانات من محتوى البروتين الكلي المحللة الخلية التي يحددها بيو راد فحص البروتين (بيو راد) استنادا إلى طريقة برادفورد (57).

في الجسم الحي β-اكتاماز البروتين مضان جزء تكامل الفحص.

تم تقسيم الخلايا HEK293T 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن والمصنف عند 2.5 × 10 5 لكل بئر في 2 جيدا الشرائح غرفة زجاجية (نونك ® مختبر التكنولوجيا II نظام الشرائح غرفة) في DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين والستربتومايسين. و transfected خلايا عابر مع DNA البلازميد 300 نانوغرام باستخدام Effectene ® ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وبعد مرور ثمانية وأربعين ساعة تم غسلها خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومعلق في 750 ميكرولتر هانك محلول ملحي متوازن (HBSS) (لايف تكنولوجيز). β-اكتاماز النشاط ثم تم الكشف باستخدام أدوات الكشف GeneBLAzer ™ (إينفيتروجن) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد إضافة الخلية الفلورة الركيزة منفذة CCF2 / AM، حضنت الشرائح الغرفة لمدة 1 ساعة محمية من الضوء ومن ثم تصور لمضان. تم إجراء الفحص المجهري مضان من الخلايا HEK293T الحية على الشرائح الزجاجية الغرفة باستخدام أوليمبوس IX81 مجهر مقلوب برنامج التحصين الموسع ومضان مع 40 × موضوعي (أوليمبوس). تم تنفيذ الاستحواذ في وقت واحد من مضان اللونين في الوقت الحقيقي باستخدام 400DF15 مرشح الإثارة والمزدوجة عرض نظام التصوير ™ (رؤى بصرية)، التي تحتوي على مكعب التصفية التي كان 450DF65 و535DF35 المرشحات الانبعاثات (OMEGA الضوئية). خلية ∧ تم استخدام برامج التصوير R (أوليمبوس) لتحليل الصور متعدد الألوان. تقدير حجم النشاط β-اكتاماز في الجسم الحي أجري عن طريق حساب عدد الخلايا الزرقاء والخضراء في 10 حقول نظر من كل المفترض البروتين البروتين التفاعل الاقتران.

التحليل المشترك مناعي من Spastin CHMP1B التفاعلات

خلايا HEK293T مع transfected spastin. Myc على وCHMP1B-GFP وحده أو شارك في transfected مع spastin. Myc على وCHMP1B أو spastin. Myc على وEGFP-C1 تم غسلها مرتين مع PBS و lysed في 600 ميكرولتر المنظفات NP40 العازلة التي تحتوي على 1٪ (ت / ت ) NP-40، 150 م م كلوريد الصوديوم، و 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (pH7.5)، 0.02٪ أزيد الصوديوم، 1 ملغ / مل BSA و 0.5٪ مثبط البروتياز كوكتيل. تم إزالة أحد aliquote من 100 ميكرولتر من كله جزء المحللة الخلية وال 500 ميكرولتر المتبقية طرد في 000 13 غرام لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. ثم إزالة جزء القابلة للذوبان وحضنت مقتطفات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية الأرنب بولكلونل مكافحة GFP (abcam) بتركيز 1: 250. خمسون microlitres من 50٪ بروتين الخرز A-سيفاروز ثم أضاف وحضنت مع مجمعات للبروتين الأجسام المضادة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. والخرز ثم عزل عن طريق الطرد المركزي وجيزة وغسلها ثلاث مرات في NP-40 العازلة التي تحتوي على BSA مع غسل النهائي في NP-40 العازلة دون BSA. ثم تم معلق حبات في 5 × SDS-PAGE العازلة عينة ويسخن لمدة 5 دقائق عند 95 ° C. تم حل البروتينات ملزمة SDS-PAGE وimmunoblotted مع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للMyc على استنساخ 4A6 الأجسام المضادة الأولية بتركيز 1: 250 (ريف).

تجزيء التحت خلوية

تم تقسيم خلايا كوس-7 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن والمصنف في 0.75 × 10 6 لكل لوحة في 10 سم أطباق الثقافة. بعد مرور أربع وعشرين ساعة أنهم و transfected باستخدام Effectene® ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN). بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، تم تنفيذ تجزئة التحت خلوية من استخدام عدة استخراج بروتيوم التحت خلوية (Calbiochem)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للخلايا ملتصقة. حيث أصبحت بعض الخلايا غير ملتصقة خلال البروتوكول، ونسج عصاري خلوي، الغشاء والكسور النووية في 750 غرام، 5500 ز و6800 غرام، على التوالي، لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، لإزالة أي تلوث من الكسور في وقت لاحق. تم حل البروتينات بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotted مع الأجسام المضادة المناسبة.

PCR وتسلسل الحمض النووي الجيني

منحت الموافقة الأخلاقية من قبل لجنة أخلاقية نفيو أدينبروكس. تم تضخيمه تسلسل الترميز، مع المرافقة تسلسل الجينوم، من اكسون CHMP1B واحد عن طريق PCR والتسلسل في اثنين من شظايا متداخلة. وقد أجريت PCR وتسلسلها من كما هو موضح سابقا (37). وكانت تسلسل التمهيدي تستخدم لتضخيم اثنين شظايا CHMP1B من الحمض النووي الجيني: F1: GCTCTGACGTCACCACCTG، R1: CGAATTTGTCCATCAAAGCA، F2: AACATGGAAGTTGCGAGGAT، R2: GGTAGAAGGGCATTTCAGCA.

المواد التكميلية

المواد التكميلية متوفرة في HMG على الانترنت.

شكر وتقدير

نشكر العائلات الذين وافقوا التكرم المشاركة في بحثنا على HSP. نشكر بول Luzio لإجراء مناقشات مفيدة. سلسلة pGBDU-C النواقل وPJ69-4A MAT على وMAT α سلالات الخميرة قدمت التفضل الدكتور فيليب جيمس (قسم الكيمياء الجزيئية البيولوجية، جامعة ويسكونسن في ماديسون، WI 53706-1532، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد تم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة ويلكوم ترست وبحوث العمل لER، وهو زميل السريرية يلكوم ترست المتقدم.

ملاحظات

  • † الكتاب أتمنى أن يكون معروفا أنه، ينبغي أن ينظر إلى الكتاب الأولين في رأيهم كما المؤلف الأول المشترك.
  • علم الوراثة الجزيئية البشرية، المجلد. 14، رقم (1) © جامعة أكسفورد 2005؛ جميع الحقوق محفوظة
المراجع

  • بار، ML و كيرنان، JA (1983) بالجهاز العصبي للانسان. هاربر والصف، فيلادلفيا، PA.
  • ريد، E. (2003) العلوم في الحركة: مواضيع المرضية الجزيئية مشتركة تظهر في paraplegias تشنجي وراثي. J. ميد. جينيه.، 40، 35 -39.
  • فينك، JK (2002) الشلل النصفي التشنجي وراثي. في Rimoin، DL، Pyeritz، RE، كونور، JM وKORF، BR (محرران) إيموري والمبادئ وRimoin وممارسة الطب الوراثي، EDN 4TH. هاركورت، لندن، المملكة المتحدة، 3124 -3145.
  • هاردينغ، AE (1984) وراثي الترنحات والاضطرابات ذات الصلة. تشرشل ليفينغستون، أدنبره.
  • حزان، J.، Fonknechten، N.، MAVEL، D.، Paternotte، C.، شمشون، D.، Artiguenave، F.، Davoine، CS، Cruaud، C.، Dürr ألف، A.، Wincker، P. وآخرون . (1999) Spastin، وهو بروتين AAA جديد، يتم تبديل في الشكل الأكثر شيوعا من راثي الشلل النصفي التشنجي المهيمن. نات. جينيه.، 23، 296 -303.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • سوتر، S.، Miterski، B.، Klimpe، S.، Bonsch، D.، Schols، L.، Visbeck، A.، بابكي، T.، هوبف، HC، إنجل، W.، Deufel، T. وآخرون . (2002) تحليل الطفرة من الجين spastin (SPG4) في المرضى الذين يعانون في ألمانيا مع مرض وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي وراثي. همهمة. Mutat.، 20، 127 -132.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • Charvin، D.، سيفوينتس-دياز، C.، Fonknechten، N.، جوشي، V.، حزان، J.، ملكي، J. وBetuing، S. (2003) الطفرات من SPG4 هي مسؤولة عن فقدان وظيفة spastin، وهو بروتين الخلايا العصبية وفيرة المحلية في النواة. همهمة. مول. جينيه.، 12، 71 -78.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • وارتون، SB، ماكديرموت، CJ، غريرسون، AJ، الخشب، JD، Gelsthorpe، C.، اينس، PG وشو، PJ (2003) وعلم الأمراض الخلوي والجزيئي للنظام المحرك في خزل سفلي تشنجي وراثي نتيجة لطفرة من spastin الجينات. J. Neuropathol. إكسب. Neurol.، 62، 1166 -1177.
    ميدلاين ويب للعلوم
  • Svenson، IK، اشلي، كوخ. AE، جاسكل، PC، Riney، TJ، كومينغ، WJ، كينغستون، HM، هوجان، EL، بستاني، RM، فانس، JM، نانس، MA آخرون (2001) تحديد والتعبير تحليل الطفرات الجينية spastin في راثية تشنجي الشلل النصفي. آم. J. هوم. جينيه.، 68،

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس