عرض مشاركة واحدة
  #24  
قديم 11-23-2015, 10:00 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Mkks فارغة الفئران لديها النمط الظاهري تشبه متلازمة بارديه-بيدل

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/14/9/1109.full




متلازمة McKusick-كوفمان (MKS) هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز polydactyly بعد المحوري، وعيوب خلقية في القلب وموه رحمي مهبلي، شذوذ خلقي الهيكلي من الأعضاء التناسلية للإناث. وقد تبين أيضا طفرات في الجين MKKS أن يسبب بعض حالات متلازمة بارديه-بيدل (BBS) التي تتميز البدانة، اعتلال الشبكية الصباغي، polydactyly، تشوهات الكلى ونقص الأعضاء التناسلية مع ميزات الثانوية من ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري. على الرغم من أن هناك تداخل في المظاهر السريرية بين MKS وBBS، والمرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة MKS ليست ولا تتطور اعتلال الشبكية أو لديك صعوبات التعلم. لمواصلة استكشاف الفيزيولوجيا المرضية لBBS وMKS اضطراب ذات الصلة، قمنا بتطوير Mkks - / - نموذج الفأر. يظهر هذا النموذج أن غياب Mkks يؤدي إلى تنكس الشبكية من خلال موت الخلايا المبرمج، فشل تشكيل الحيوانات المنوية سياط، ارتفاع ضغط الدم والسمنة. ويرتبط بالسمنة مع فرط الأكل وانخفاض النشاط. وبالإضافة إلى ذلك، وفحص عصبي يكشف عجز في الشم والهيمنة الاجتماعية. الفئران لا تملك polydactyly أو تشوهات المهبل. النمط الظاهري للMkks - / - الفئران يشبه النمط الظاهري من نماذج الماوس الأخرى من BBS (Bbs2 - / - وBbs4 - / -). وتشير هذه الملاحظات أن الغياب الكامل للMKKS يؤدي إلى BBS حين من المرجح أن يكون راجعا إلى حدوث طفرات محددة النمط الظاهري MKS.
مقدمة

متلازمة McKusick-كوفمان (MKS) هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز polydactyly بعد المحوري، عيوب القلب الخلقية وموه رحمي مهبلي، شذوذ خلقي الهيكلي من الأعضاء التناسلية الأنثوية (1، 2). تم تعيين في البداية الجين MKKS وحددت بشكل كبير طائفة الأميش المشابهة. يظهر البروتين MKKS توقع التماثل إلى الوحيدات ألفا من Thermoplasma acidophilum thermosome (1، 3)، مجمع chaperonin بدائيات النواة مع التشابه الهيكلي لchaperonin حقيقية النواة يسمى "مجمع مجمع خاتم ببتيد العديم الذيل" (TRIC)، وهو chaperonin-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات تشارك في للطي من العديد من البروتينات بما في ذلك تويولين والأكتين (4). وقد تبين أيضا طفرات في الجين MKKS أن يسبب بعض حالات متلازمة بارديه-بيدل (BBS) التي تتميز البدانة، اعتلال الشبكية الصباغي، polydactyly، والتشوهات الكلى، والتشوهات الوظيفية ونقص الأعضاء التناسلية مع ميزات الثانوية من ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري (5 - 9 ). على الرغم من أن هناك تداخل كبير في المظاهر السريرية بين MKS وBBS، ومرضى متلازمة MKS لا يعانون من السمنة المفرطة وعدم تطوير اعتلال الشبكية أو التعلم الإعاقة.
حتى الآن، تم تعيين ثمانية BBS المكاني وتم التعرف على الجين BBS في كل من هذه الامكنه بما في ذلك الجين MKKS (كما يشار إلى BBS6) (3، 10 - +18). باستثناء MKKS، وغيرها من البروتينات المعروفة BBS ليس لديهم تشابه كبير لchaperonins. ومع ذلك، BBS4 وBBS8 يحتوي على تكرار المجالات tetratricopeptide مما يشير إلى أنها قد تتفاعل مع بروتينات أخرى. الجين BBS3 حددت مؤخرا هو ADP-ribosylation عامل مثل الجين (17، 18).
وتشير البيانات الأخيرة التي تشارك الجينات BBS في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا، ويتم حفظها الجينات BBS في الكائنات مهدبة، ولكن ليس في الكائنات غير مهدبة (16، 17). وقد ثبت أن بعض البروتينات BBS في توطين إلى الجسم القاعدية من الخلايا المهدبة وأن تشارك في نقل intraflagellar (15، 19). نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن Bbs4- وBbs2 خروج المغلوب الفئران لها ملامح الفوضى البشري وأن غياب هذه البروتينات يؤدي إلى فشل تشكيل الحيوانات المنوية سياط، ولكن ليس تشكيل أهداب بشكل عام. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن غياب Bbs2 أو البروتينات Bbs4 لا يعطل تماما تطوير خلية مستقبلة للضوء الأولية، على الرغم من أن الشاذة التشكل القرص هو واضح. ربط أهداب موجودة أيضا في الحيوانات ناقصة لBbs2 أو Bbs4. ولكن المستقبلات الضوئية تخضع لموت الخلايا بسبب موت الخلايا المبرمج (20، 21). لمواصلة استكشاف الفيزيولوجيا المرضية لBBS وMKS اضطراب ذات الصلة، وقد وضعنا الآن وتتميز وMkks - / - نموذج الفأر.

النتائج

جيل من الفئران Mkks خروج المغلوب

تم إنشاء Mkks الفئران -deficient باستخدام بناء استهداف الجين مصممة لإزالة اكسون 3 من الجين Mkks في مجملها (الشكل 1 A). تم transfected في بناء الاستهداف إلى الجذعية الجنينية (ES) الخلايا وتم التنميط الجيني ل~1000 خطوط الخلايا ES لتحديد خمسة (0.5٪) recombinants مثلي. تم حقن اثنين من الحيوانات المستنسخة المستهدفة في الكيسات الأريمية والوهم التي تنتج كل. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Mkks متخالف (Mkks +/-) الفئران على خلفيات وراثية مختلطة والفطرية التي التزاوج مع C57BL / 6J و 129 الفئران / SvEv، على التوالي. تم مرمزة الفئران باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (الشكل 1 Mkks B) - / - ولدت الفئران أقل كثيرا مما كان متوقعا من قبل الميراث مندلية (P <0.05). 600 مرمزة الفئران، فإن نسبة من Mkks + / +، Mkks +/- وMkks - / - كان 26.5، 54.4 و 19.1٪ على التوالي. الندرة النسبية للMkks - / - من المرجح إما بسبب وفاة داخل الرحم للأجنة خروج المغلوب متماثل أو موت الحيوانات خروج المغلوب متماثل بعد فترة قصيرة من الولادة الفئران. لقد رصدها بعناية الفئران حديثي الولادة، وقد وجدت تسع حالات وفاة بعد الولادة، حيث تمكنا من استعادة الحيوان لالتنميط الجيني. وكان اثنان من هذه الفئران تسعة Mkks - / -، ثلاثة كانت متماثل وضعها الطبيعي وأربعة كانوا الزيجوت، والتوزيع التي لا تختلف كثيرا عن النسب المندلية. لقد ضحى أيضا ثلاثة الفئران الحوامل الإناث في 14 أيام الحمل ومرمزة الأجنة. وكانت ثلاثة أجنة متماثل وضعها الطبيعي، وتسعة كانت الزيجوت وستة كانوا Mkks - / -. وكانت جميع الأجنة الطبيعية بشكل صارخ على الفحص باستثناء واحد Mkks - / - الجنين الذي كان أصغر بكثير من الأجنة الأخرى. وتشير هذه البيانات إلى أن بعض Mkks - / - الفئران تموت في وقت متأخر من الحمل.

الشكل 1. تمثيل تخطيطي للMKKS استهدفت استراتيجية التعطيل. (A) خريطة للمكان MKKS (أعلى)؛ استهداف ناقلات الجينات (وسط). هيكل المتوقعة من مكان تحور (القاع). السهام تشير الاشعال المستخدمة لاختبار إعادة التركيب 5'- و3'-مثلي واختبار خروج المغلوب الداخلي. (B) PCR التنميط الجيني من النوع البري، متخالف (+/-) وBBS فارغة (- / -) الفئران. وamplimers أعلى ومنتصف تتوافق مع 5'- و3'مناطق من الجينات المقاومة بالنيوميسين. مشتق الفرقة السفلي من التضخيم باستخدام MKKS اكسون 3 الاشعال الداخلية. (C) تحليل الشمالي لطخة من Mkks التعبير في الكلى مجموع RNA الخلوية من النوع البري (+ / +)، متخالف (+/-) ومتماثل (- / -) الحيوانات. وهذا التحقيق هو Mkks كدنا] جزئي. (القاع) نفس وصمة عار إعادة بحثها مع β - الأكتين كعنصر تحكم التحميل.

Mkks الاستهداف أسفر عن أليل باطل كما يتبين من غياب Mkks مرنا عن طريق تحليل لطخة الشمالي (الشكل 1 C).

Mkks - / - الفئران تصبح بدينة ولديها مستويات اللبتين عالية

وكانت Mkks الفئران -deficient الطبيعية بشكل صارخ فيما يتعلق التشكل، على الرغم من أنها ظهرت لتكون أصغر عند الولادة من تتزاحم بهم. في وقت الفطام (3 اسابيع من العمر)، Mkks - / - وزن الفئران أقل بكثير من نظرائهم من النوع البري وتتزاحم متخالف. بواسطة ~8-12 أسابيع من العمر، الفئران Mkks -null وزن نفس Mkks + / + وMkks +/- الحيوانات. بعد 28 أسبوعا، Mkks - / - كانت الفئران أكبر بكثير من كل من البرية من نوع والزيجوت (الشكل 2 A). كان والضوابط أكبر في الإناث منها في ذكور الفئران - الفرق في الوزن بين Mkks - /.

الشكل 2. زيادة الوزن واستهلاك الأغذية البرية من نوع، Mkks +/- وMkks - / - الفئران. (A) زيادة الوزن في الفئران الإناث والذكور مقابل العمر. أدرج ما لا يقل عن سبعة حيوانات في كل مجموعة. كانت الفئران انخفاض وزن المواليد من Mkks +/- أو Mkks + / + الفئران ولكن بحلول الاسبوع 16 وكانت أثقل بكثير - MKKS - /. (B) استهلاك الغذاء بالنسبة للفئران الذكور والإناث، وبلغ متوسط ​​كل 7 أيام. أدرج ما لا يقل عن ستة حيوانات في كل مجموعة Mkks - / - الفئران تستهلك أكثر بكثير من الغذاء Mkks + / + وMkks +/- الفئران. (C) أربعة وعشرون بيانات النشاط ساعة مقاسا القياس Mkks - / - الفئران تبدي أقل بكثير الحركة بالمقارنة مع من النوع البري.

وأشارت دراسات التغذية الطولية التي Mkks - / - الفئران تأكل أكثر من متخالف والنوع البري تتزاحم (الشكل 2 وتظهر انخفاضا كبيرا في النشاط كما تقاس 24 ساعة القياس بالمقارنة مع من النوع البري الفئران (الشكل B). 2 C) Mkks - / - الفئران كان أعلى متوسط ​​مستويات اللبتين في الدم من النوع البري الضوابط (27 ± 15.3 SD و 2.3 ± 2.6 SD نانوغرام / مل على التوالي، N = 4).

Mkks - / - قد عزز الفئران ضغط الدم

Mkks - / - الفئران كانت أعلى بكثير الانبساطي، يعني وضغط الدم الانقباضي من الضوابط على النحو الذي يحدده 24 ساعة القياس عن بعد. كان متوسط ​​الفرق في الضغط الشرياني يعني بين خروج المغلوب ومراقبة الحيوانات 12 مم زئبق (الجدول 1).

الجدول 1.
ضغط الدم (مم زئبق) ومعدل ضربات القلب (نبضة في الدقيقة) من Mkks - / - الفئران والضوابط

Mkks - / - الفئران لا يحمل polydactyly

على الرغم من polydactyly هو سمة مشتركة لكلا MKS وBBS في البشر، لا Mkks - زيارتها الفئران polydactyly أو غيرها من تشوهات الأطراف البارزة - /. تم تحديد هذا عن طريق عد الأرقام من جميع الأطراف الأربعة 115 Mkks - / - الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل الأشعة السينية في 20 الكبار Mkks - / - الفئران. وكشف تحليل الأشعة السينية لهذه الحيوانات أن أيا كان الشذوذ الأطراف بما في ذلك polydactyly، ارتفاق الأصابع، قصر الأصابع والمفقودين أو العظام تتكرر في الأطراف.

Mkks - / - الفئران تمتلك العصبي الحسي والسلوكية الظواهر

تم تقييم التحليلات السلوكية والوظيفية من الفئران باستخدام بروتوكول SHIRPA المعدلة (22). وتمت مقارنة البيانات من 38 قياسات الرصد منفصلة بين Mkks + / +، Mkks +/- وMkks - / - الفئران. وتتلخص تلك التجارب تظهر فروق ذات دلالة إحصائية بين الأنماط الجينية في الجدول 1. وكان متوسط ​​عمر الفئران في وقت التقييم 23 أسبوعا. والفئة العمرية 16-34 أسابيع. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية عند مقارنة البيانات من Mkks +/- مع Mkks + / + الفئران من كلا الجنسين. وبالمثل، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين خروج المغلوب والسيطرة الفئران في العضلات وانخفاض وظائف الخلايا العصبية الحركية مثل وضع الجسم والتوازن والتنسيق، والمشية والسلبية الموضعية، وذيل الارتفاع، وقوة قبضة أو لهجة الجسم، ولا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في وظائف الحسية مثل قرصة اصبع القدم وردود الفعل. وأخيرا، لم يكن هناك تأثير كبير من النمط الجيني على وضع البصري (P = 0.43)، لوحظ الاختبار الذي يخفض الماوس لأسفل على شبكة الأسلاك وتمديد الذراعين.
/ - - كانت الفئران الإناث أقل صخبا أثناء المناولة بالمقارنة مع الضوابط (P <0.05) Mkks - Mkks. / - أظهرت الفئران الشم تتضاءل إذا ما قيست القدرة على الحصول على الغذاء مخفي (الجدول 2).

الجدول 2.
ملخص فروق ذات دلالة إحصائية بين MKKS-، Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة مقارنة مع هم تتزاحم من النوع البري في SHIRPA الشاشة الرئيسية الملاحظات السلوكية

كما Mkks - / - لوحظت الفئران أن تكون أكثر منصاع لمعالجة، تم إجراء اختبار الهيمنة الاجتماعية. في 33/46 تجارب (72٪؛ P <0.05)، وMkks + / + تم العثور على الفئران أن تكون مهيمنة على Mkks - / - في اختبار الهيمنة الاجتماعية المقترنة. عندما تم اختبار الفئران متخالف ضد Mkks - / - الفئران، كانت الفئران متخالف أيضا المهيمنة (35/46 المحاكمات؛ 76٪؛ P <0.05). كان هذا الاستنتاج صحيحا بالنسبة لكل من الحيوانات من الذكور والإناث. لم يكن هناك اختلاف في الهيمنة الاجتماعية بين النوع البري والحيوانات متخالف (P> 0.05).

Mkks - / - عرض الفئران انحطاط مبصرة

Mkks - / - ظهرت الفئران لشبكية العين الطبيعية في وقت مبكر من الحياة ولكن في وقت لاحق الخضوع تنكس الشبكية. عيون من Mkks - / - الفئران من مختلف الأعمار قيمت 2-11 أشهر تشريحيا (الشكل 3). في 2-3 أشهر من العمر، تم التفريق بين قطاعات الداخلية والخارجية بشكل واضح، تم تخفيض طبقة النووية الخارجي قليلا، وكانت نواة الخلية موجودة في الفضاء تحت الشبكية. تم تخفيض شرائح الداخلية والخارجية في الارتفاع (الشكل 3 A). في 4-5 أشهر من العمر، وأظهرت طبقة النووية الخارجي انخفاضا معتدلا وتضمنت 3-7 صفوف من النوى. وكان من بقايا المواد المقابلة لقطاعات الداخلية والخارجية سيئة متباينة لا تزال موجودة في هذا العصر بين طبقة النووية الخارجي وRPE (الشكل 3 B). في 6 أشهر من العمر، تم تخفيض طبقة النووية الخارجي إلى حد كبير، مع 1-2 فقط صفوف من نوى المتبقية وكميات متفاوتة من المواد الداخلية / الجزء الخارجي؛ كانت خلايا عديدة موجودة في الفضاء تحت الشبكية (الشكل 3 C). قبل 8 أشهر، وطبقة النووية الخارجي المتخلفة تماما ولا بقايا من قطاعات الداخلية أو الخارجية قابلة للكشف (لا تظهر البيانات).

الشكل 3. الهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ Mkks - شبكية العين الماوس / - - (C A). تم فحص الفئران في 2-3 أشهر من العمر (A)، 4-5 أشهر (B) و 6 أشهر (C). بعض التغيرات التنكسية في طبقة النووية الخارجي (ONL) واضحة في فئران عمرها 3 أشهر 2- ل، على الرغم من قطاعات الداخلية والخارجية يمكن تمييزها بوضوح. قبل 5 أشهر من العمر (B)، والتمييز بين القطاعات الداخلية والخارجية هو أقل وضوحا وطبقة النووية الخارجي هو أرق بكثير مما كانت عليه في Mkks + / + العينين. في 6 أشهر من العمر (C)، وطبقة النووية الخارجي قد تدهورت إلى حد كبير وليس قطاعات الداخلية أو الخارجية موجودة. تلطيخ المضادة للرودوبسين موجود في الجزء الخارجي من قبل 2 أشهر من العمر (D). IS، قطاعات الداخلية، OS، شرائح الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية. GCL، طبقة الخلايا العقدية.

تلطيخ المضادة للرودوبسين من شبكية العين من Mkks - / - الحيوانات مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة RetP1 قبل إكمال فقدان المستقبلات الضوئية كشفت مناعية أوبسين الطبيعي في قطاعات الخارجي في 2 أشهر من العمر. بالإضافة إلى ذلك، كان مترجم بعض رودوبسين إلى الخلية الهيئات في طبقة النووية الخارجي في Mkks - / - الفئران (الشكل 3 D).

Mkks - / - فشلت الفئران لتشكيل الحيوانات المنوية سياط

Mkks - / - فشل الفئران الذكور في تلقيح متخالف أو من النوع البري إناث الحيوانات. من أجل التحقيق في أسباب العقم، ونحن فحص الخصيتين من Mkks - / -. ولوحظ غياب الأسواط في شمعة أنبوب صغير المنوية في الخصيتين من Mkks - / - الفئران (الشكل 4 أ و ب). ولوحظ غياب الأسواط في Mkks - / - الفئران من جميع الأعمار فحص. كان نوى مع لونين مكثف للغاية تشبه رؤوس الحيوانات المنوية الحالي، ولكن سياط كانت غائبة.

الرقم 4. سيليا التي تحتوي على هياكل في Mkks - / - الفئران. أقسام من خلال الأنابيب المنوية البرية من نوع (A) وMkks - / - (B) الفئران تكشف عن أن الفئران تعاني من نقص في الجين MKKS تفشل في إنتاج سياط العادي (الهيماتوكسيلين يوزين وصمة عار، على نطاق وبار = 90 ميكرون). المجهر الإلكتروني للنبيب القاصي الكلوي (C) من Mkks - / - الفئران يكشف عن تشكيل طبيعي من أهداب الكلوي. مقياس شريط = 2 ميكرون. المتوقع Z-سلسلة من الخلايا الظهارية القصبة الهوائية مثقف البرية من نوع (D) وMkks - / - (E) الفئران التمايز التالية مع واجهة الهواء السائل. مورفولوجية أهداب في Mkks - / - الفئران مماثلة لتلك التي البرية من نوع الفئران. وصفت الخلايا مع أجسام مضادة موجهة ضد β تويولين-IV لتصور أنيبيب (الخضراء). نوى كانت ملطخة مكافحة مع TO PRO3 (الحمراء).

خلايا من Mkks - / - الفئران تطوير أهداب

تم فحص الكلى من الفئران الشابة التي كتبها المجهر الإلكتروني لتقييم الكلوي التشكل الهدبية الابتدائية في Mkks - / - الفئران. أهداب في Mkks - / - ظهرت العينات أن تكون من الحجم العادي والكثافة (الشكل 4 C). لمزيد من التحقيق ما إذا كان المنتج الجين MKKS يلعب دورا في نشوء حيوي أهداب، ونحن مثقف الخلايا الظهارية القصبة الهوائية من الصغار والكبار من النوع البري وMkks - / - الفئران. بعد الغرس، الخلايا الظهارية الماوس القصبة الهوائية (MTEC) انتشرت بسرعة وأصبح الاستقطاب. بعض الخلايا الظهارية القصبة الهوائية المتقدمة إلى خلايا مهدبة في ظل ظروف الثقافة التي تتعرض الخلايا إلى واجهة الهواء السائل (23). تم تقييم أهداب التي وصفها مناعي مع الأجسام المضادة لمكافحة β تويولين-IV. الخلايا الظهارية المستمدة من كلا البرية من نوع وMkks - / - الفئران طورت عددا مماثلا من أهداب والتشكل من أهداب يبدو طبيعيا عندما تصور مع المجهر متحد البؤر (الشكل 4 C).

نقاش

وتبين لنا أن MKKS الفئران -deficient تطوير السمنة وتنكس الشبكية وأن الذكور تفشل في تشكيل سياط. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الحيوانات لديها زيادة الضغط الشرياني، ضعف حاسة الشم والنمط الظاهري السلوكية مما يشير إلى التفاعل الاجتماعي الشاذ. نتائج السمنة، وتنكس الشبكية وفشل تشكيل سياط تشبه ملامح Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة، ولكن تنكس الشبكية لديه بداية لاحق من ذلك ينظر في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (20 ، 21).
النتائج المعلنة هنا لMkks - / - الحيوانات وسبق لBbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران تشير إلى أن البروتينات BBS لا حاجة على الاطلاق لتشكيل إما أهداب متحركة أو الأساسي. ويتضح ذلك من حقيقة أن الشباب Mkks-، Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة إنتاج خلايا مستقبلة للضوء التي هي بشكل صارخ طبيعية شكليا ولكن في وقت لاحق الخضوع انحطاط كاملة. في الدراسة الحالية، ونحن نقدم أدلة على أن القصبة الهوائية الخلايا الظهارية من Mkks - / - الفئران قادرة على توليد أهداب العادي شكليا في الثقافة. ومع ذلك، في كل من نماذج الماوس ثلاثة قمنا بحثت حتى الآن (Mkks - / -، Bbs4 - / - وBbs2 - / -)، للخطر تجميع الحيوانات المنوية سياط. عدم وحظ من سياط في الأنابيب المنوية قد يكون راجعا إلى الفشل الكامل لتشكيل هذه الهياكل، أو بدلا من ذلك، قد تنتج عن تحلل السريع لسياط التالية تأليفهم. ومع ذلك، في الحيوانات درسناه، ونحن لم يلاحظ أي الحيوانات المنوية مع الأسواط، مشيرا إلى أن سياط تتشكل أبدا. فشل تشكيل الأسواط أو صيانة خلال النطاف يشير إلى أن هناك اختلافات بين عمليات أهداب مقارنة مع الجمعية سياط.
تم الإبلاغ عن موه رحمي مهبلي، لاتكون المهبلي والتشوهات البولي التناسلي أخرى في كل من MKS والمرضى BBS (24). ولادة قدموا ما يقرب من 3٪ من المرضى BBS (24). وقد لوحظت حالات شاذة لا المهبلية في Mkks - / - الفئران، على الرغم من أنها على ما يبدو الخصوبة انخفضت. ثلاثة من خمسة Mkks - / - الإناث تزاوج أصبحت حاملا.
وعلى الرغم من التجمع العادي الأول من أهداب في Mkks الفئران -deficient، دليل على وظيفة الأهداب غير طبيعية موجودا. على سبيل المثال، على الرغم من أن قطاعات الخارجية للخلايا مستقبلة للضوء يبدو أن تتطور بشكل طبيعي، فإنها تصبح غير منظمة، وفي نهاية المطاف خلايا مستقبلة للضوء الخضوع انحطاط. ومواصلة دراسة هذه النماذج الحيوانية تساعد على توضيح الدور الدقيق للبروتينات BBS في هذه العمليات داخل الخلايا. الملاحظة أن مجموعة فرعية من أجسام الخلايا طبقة النووية الخارجي ظهرت لديك أوبسين mislocalized تتفق مع فكرة أن وظيفة الأهداب قد تنخفض قيمتها في خلايا مستقبلة للضوء. الملاحظة أن Mkks - / - الفئران تطوير تنكس الشبكية مما يؤدي إلى عمى الكامل يعني أيضا أن الدولة فارغة أكثر شبها الطفرات BBS المصاحب في الجين MKS من الطفرات مغلطة في MKS.
وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الفئران Mkks فارغة تطوير البدانة ترتبط بزيادة استهلاك الغذاء مماثلة للنتائج في Bbs2- وBbs4 خروج المغلوب الفئران. الزيادة في استهلاك الطعام تبدأ قبل بداية السمنة خلال فترة النمو اللحاق بالركب وتستمر بعد Mkks - / - الفئران تزن أكثر بكثير من النوع البري تتزاحم Mkks - / - لدى الفئران أيضا انخفاض في النشاط كما تقاس 24 ساعة القياس عن بعد. على أساس هذه المعطيات، يبدو أن البدانة الناجمة عن مزيج من فرط الأكل وانخفاض النشاط.
يتم إنتاج هرمون الليبتين الهرمون في الأنسجة الدهنية ويدور إلى ما تحت المهاد حيث يعمل على مستقبله. اللبتين هو عنصر هام في تنظيم الوزن على المدى الطويل. عندما نشط، فإنه يشير إلى انخفاض في الاستهلاك الغذائي وزيادة في استقلاب الطاقة مما يحد من درجة زيادة الوزن (25). ترتبط إلى حد كبير مستويات اللبتين مع BMI من الفئران والبشر (26). ويطلق على حالة من مستويات اللبتين مرتفعة الذي يحدث مع السمنة مقاومة اللبتين. وقد تم تحديد مقاومة اللبتين في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس السمنة (27). عند مقارنة تتزاحم طبيعية مع أربعة نماذج من الفئران من زيادة الوزن وراثيا، مافيي وآخرون. (26) وجدت ان مستويات هرمون الليبتين 10 أضعاف في فئرانا معدلة وراثيا آغوطي السكري والأصفر، 5 أضعاف أكثر في فئرانا معدلة وراثيا الدهون و 2 أضعاف يصل في فئرانا معدلة وراثيا بدين. في نموذج الفأر السمنة أخرى تفتقر إلى الببتيد neuromedin U، ومستويات هرمون الليبتين هي <2 أضعاف أعلى من التحكم من النوع البري (28). وقد تبين هذا النموذج لتكون مستقلة عن طريق اللبتين الإشارات. Mkks لدينا - / - الفئران لديها مستويات اللبتين في الدم 10 مرة من مستوى التحكم. وقد أفيد أن الشيخوخة النتائج في حالة مقاومة اللبتين في القوارض يعانون من السمنة المفرطة (29)، ولكن في Mkks لدينا -null الفئران، ونرى مستويات اللبتين مرتفعة في الفئران لا تتجاوز أعمارهم 9-12 أسابيع من العمر، قبل ظهور السمنة. ويبدو أن هذا يشير إلى أن مقاومة اللبتين تطور قبل السمنة.
زيادة ضغط الدم لوحظ في Mkks - / - الفئران يتسق مع التقارير السريرية لارتفاع ضغط الدم في المرضى الذين يعانون BBS (9، 30)، وكذلك مع رابطة قوية بين السمنة وارتفاع ضغط الدم (30). ارتفاع مستويات هرمون الليبتين تعميم يمكن أن تسهم في زيادة ضغط الدم لوحظ في Mkks السمنة - / - الفئران. في الواقع، إلى جانب تأثيره على الشهية والتمثيل الغذائي، ليبتين تعمل في منطقة ما تحت المهاد إلى زيادة ضغط الدم من خلال تفعيل الجهاز العصبي الودي (31).
وMkks -null سهم الماوس العديد من النتائج السريرية وجدت في المرضى الذين يعانون BBS البشري (الجدول 3). وMkks - / - نموذج الفأر يلخص النمط الظاهري لوحظ في نماذج الماوس BBS2- وBBS4 خروج المغلوب، على الرغم من بعض جوانب النمط الظاهري قد تكون أقل حدة. وتشير هذه الملاحظات أن الغياب الكامل للMKKS يؤدي إلى BBS، في حين من المرجح أن يكون النمط الظاهري MKS بسبب نتيجة الوظيفية للمركب His84Tyr / Ala24Ser أليل ذكرت في المرضى الذين يعانون MKS. (3). لقد تم الافتراض بأن الطفرة MKS هو ناقص المفعول، في حين أن الطفرات في MKKS تسبب BBS تمثل خسارة كاملة وظيفة (24). على الرغم من أن النتائج التي لوحظت في نموذجنا MKKS الماوس تتفق مع هذه الفرضية، والحالة الوظيفية للالمفترضة العديد من الطفرات BBS6 مغلطة لا يزال يتسم. وسوف تكون ذات فائدة لتحديد كيف تؤدي بعض الطفرات Mkks إلى انحطاط مبصرة والسمنة حين أن البعض الآخر لا يؤدي إلى هذه الظواهر.

الجدول 3.
مقارنة Mkks الماوس النمط الظاهري لBbs2 وBbs4 KO الفئران وMKS الإنسان وBBS الظواهر المرضى

المواد والأساليب

جيل من الفئران MKKS -knockout

تم استخدام 129 / SVJ الحمض النووي الجيني كقالب لاستنساخ شظايا PCR المشتقة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استنساخ A جزء 3.6 كيلوبايت تمتد الإكسونات 2-3 من الجين MKKS في الموقع كبن I / سال الأول، تليها الجينات المقاومة بالنيوميسين يحيط بها مواقع LoxP لاختيار إيجابية. كانت المنطقة المحيطة 3 "1.9 كيلوبايت NHE I / القانون المدني I تفتيت تمتد الإكسونات 3-4. تم استخدام كاسيت القاصي ثيميدين كيناز إلى 3'ذراع لاختيار السلبية. تم خطي متجه مع عدم I و electroporated إلى خلايا ES R1 (129X1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). وقد تم تحديد استنساخ مقاومة G418، والذي ناقلات تستهدف قد انضما إلى الجين MKKS، وذلك باستخدام تحليل PCR مع الاشعال تقع خارج المنطقتين 5'- والتي تستهدف 3'وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES لتوليد خطوط الماوس على C57BL / 6 الخلفية.

التنميط الجيني لفئران

تم مرمزة الفئران عن طريق PCR باستخدام الحمض النووي الجيني الذي أعد من الخزعات الذيل أو الأنسجة الجنينية. ولدت لنا 4.1 كيلوبايت 5'-جزء محدد لخروج المغلوب الفئران متخالف ومتماثل باستخدام التمهيدي خارج المنطقة المستهدفة (5'-TGCAGTTTTCAGGTAAGTTCCA-3 ') وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين (5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3). تم إنشاء A جزء 2.9 كيلوبايت مع التمهيدي خارج المنطقة المستهدفة 3'(5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 ') وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين (5'-AGCCAACGCTATGTCCTGAT-3). وقد تم تحديد الفئران خروج المغلوب متماثل باستخدام اثنين من أزواج التمهيدي في المنطقة المحذوفة (بمعنى 5'-TCGAAACCTTTCAGTCACCC-3 "، العقاقير 5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 '؛ والشعور 5'-TTCGAATCCCAGTTGACTTCAG-3"، العقاقير 5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 " ). وقد تم قالب طويل PCR في 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها 35 دورة في 94 مئوية لمدة 15 ثانية، 60 مئوية لمدة 30 ق، 68 C لمدة 5 دقائق والنهائي تمديد 7 دقيقة في 68 C.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل لطخة الشمالي

الأنسجة من فئران بالغة تم تجميد بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. أجريت مجموع استخراج الحمض النووي الريبي الخلوية، هلام الكهربائي، النشاف والتهجين وتصوير الإشعاع الذاتي خارج كما هو موضح سابقا (32). ولدت فأر الجزئي Mkks [كدنا التحقيق والمهجنة مع وصمة عار الشمالية. تم تجريده من لطخة من النشاط الإشعاعي وإعادة تهجين مع التحقيق [كدنا لβ -actin للتحقق من التحميل على قدم المساواة من الحمض النووي الريبي.

دراسات الوزن

لتقييم أوزان الأولية وزيادة الوزن، وتم وزن الحيوانات في 3 و 4 أسابيع من العمر، وعلى أساس شهري بعد ذلك. للدراسات الاستهلاك الغذائي، وأضيف على وزن ثابت من المواد الغذائية إلى كل قفص يحتوي على حيوان واحد، وكان وزنه الطعام المتبقية في 5 أيام من كل أسبوع. ثم تم حساب متوسط ​​الاستهلاك الغذائي للكل أسبوع.

مصل مستويات هرمون الليبتين

وقد تم جمع المصل من Mkks أنثى - / - الفئران (اثنان في 11 أسبوعا ويومين في 26 أسبوعا) والضوابط المطابقة سنهم. تم قياس مستويات اللبتين في الدم باستخدام متعدد تحليلها الشخصي (لاب نهر تشارلز).

شاشة المراقبة السلوكية الأولية

شاشة المراقبة الأولية هو تعديل لبروتوكول SHIRPA (22). التفاصيل الكاملة لإجراء التجارب ويمكن الاطلاع على الموقع الإلكتروني لشركاء الائتلاف الماوس الطفرات: لجنة نهر الميكونج الثدييات علم الوراثة وحدة هارويل، سميثكلاين بيتشام الصيدلة، كلية امبريال في لندن والملكة ماري ويستفيلد كلية، لندن، المملكة المتحدة (HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية. mgc.har.mrc.ac.uk/mutabase/). وتم قياس كمية البيانات من 38 ملاحظات منفصلة، ​​وسجل لكل حيوان. بدأ تقييم كل حيوان مع ملاحظة السلوك دون عائق في أسطواني واضحة جرة العرض (ارتفاع 20 سم، وقطره 11 سم). ثم تم نقل الفئران إلى الساحة (45 × 25 سم 2) لمراقبة السلوك الحركي. وأعقب ذلك سلسلة من التلاعبات التي قيمت رؤية، قوة قبضة، المنعكس التقويمي، انجذاب بالجاذبية السلبية، لهجة الجسم، وردود الفعل، أطرافهم لهجة، وأثار العض واللعاب. طوال هذا الإجراء، وسجلت حالات شاذة السلوك، والخوف، والتهيج، والعدوان أو النطق. ومتشكلة الإجراء على ما مجموعه 57 فئران بالغة، 10 من الذكور والإناث تسع الفئران Mkks خروج المغلوب ومتغايرة والنوع البري في العمر كعينة ضابطة بهم. تم تقييم عدد مماثل من Bbs4 فارغة، وBbs2-اغية والفئران متخالف والنوع البري. كانوا ملثمين المراقبين الأساسي للبيانات التنميط الجيني.

هيمنة الاجتماعية أنبوب الاختبار

تم اختبار (14 ذكرا وتسع إناث لكل منهما) ثلاثة وعشرين Mkks البرية من نوع، متغايرة وخروج المغلوب الفئران كما هو موضح سابقا (33) في 30 سم × 3.5 سم القطر (3.0 سم قطر للفئران الأصغر، 4.5 سم القطر للحصول على أكبر الفئران) أنبوب. اثنين من الفئران نفس الجنس العمر المتطابقة، من نوع البرية، ومتغايرة أو بالضربة القاضية وضعت، على طرفي نقيض من الأنبوب وأفرج عنه. أعلن وهناك موضوع ل"الفائز" عند خصمه المدعوم من الأنبوب. تم تنفيذ كل الاقتران مرتين في ترتيب عشوائي لما مجموعه 138 مباراة الصعود. تم اختبار ثلاثين الفئران Bbs4 و 33 الفئران Bbs2 بطريقة مماثلة.

اختبار حاسة الشم

تم اختبار اثني عشر من النوع البري، متغايرة وخروج المغلوب الفئران (خمسة ذكور وسبع إناث لكل منهما) كما هو موضح سابقا (34). تم تقييم قدرة حاسة الشم مباشرة بعد فترة 3 ساعات من الحرمان من الطعام. كانت مخبأة قطعة صغيرة من دوريتوس ناتشو الذرة رقاقة تحت 1-3 سم من الفراش في قفص الماوس نظيفة. وأطلق سراح كل الماوس في قفص وسجلت الوقت اللازم لتحديد موقع رقاقة لمدة أقصاها 20 دقيقة. وبالمثل، تم اختبار 16 الفئران Bbs4 فارغة (10 إناث وستة ذكور) و 13 الفئران Bbs2 (ستة من الذكور والإناث سبعة) مع وجود ضوابط متغايرة والبرية من نوع الخاصة بهم.

ضغط الدم والنشاط

تم استخدام نظام راديو القياس عن بعد لتسجيل الضغط الشرياني ومعدل ضربات القلب والنشاط. تم تخدير الفئران مع الكيتامين (91 ملغ) وزيلازين (9.1 ملغم) كوكتيل البريتونى. تم عزل الشريان السباتي المشترك اليسار وتم إدراج القسطرة وتعادل بشكل آمن باستخدام الحرير. وقد تراجع الارسال تحت الجلد وصولا إلى 'جيب' الحرة تشريح على طول الجهة أقرب إلى hindlimb الصحيح ممكن. تم إغلاق شق الرقبة باستخدام الحرير وزيادة مختومة مع لاصق الأنسجة. بعد أن سجلت 1 أسبوع للتعافي من الجراحة، والضغط الشرياني ومعدل ضربات القلب والنشاط في الدولة غير المقيد واعية لمدة 5 أيام.

التحليل الصرفي من Mkks - / - الفئران

أجريت الدراسات المورفولوجية كما هو موضح سابقا (19، 20). تم فحص المقاطع من اثنين على الأقل خروج المغلوب والبرية من نوع الحيوانات في نقطة زمنية. وتشمل الأنسجة فحص العيون، والخصيتين والكلى. كانت ملطخة الأكريلاميد أقسام جزءا لا يتجزأ مع الهيماتوكسيلين يوزين وصمة عار وجمعت photomicrographs باستخدام أوليمبوس BX-41 المجهر مع الكاميرا الرقمية SPOT-RT. تم إصلاح الكلى من الشباب الفئران خروج المغلوب القديمة 2-أسابيع عن طريق الغمر في نصف قوة تثبيتي Karnovsky بين عشية وضحاها، وكانت شظايا القشرية نقطة حرجة المجفف وتفل المغلفة قبل تصوير مجهري باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح هيتاشي S4000 (مرفق المركزية المجهر البحوث، جامعة ولاية ايوا ).

ثقافة MTEC

تم إجراء ثقافة MTEC (22). لفترة وجيزة، كان المثقف خلايا القصبة الهوائية إما من عمره 6 أسبوع أو 8 أشهر من العمر من النوع البري وBbs6 خروج المغلوب الفئران عند 37 مئوية مع CO 2 5٪ في المعدل المتوسط ​​النسر Dulbecco و(DMEM) / هام في F12 المتوسطة تستكمل مع 4 m m glutamine, 10 U/ml penicillin, 10 µg/ml streptomycin, 5% fetal bovine serum (all Gibco BRL), 10 µg/ml insulin (Roche), 5 µg/ml human transferrin, 62 µg/ml cholera toxin, 10 n m retinoic acid (all Sigma), 5 ng/ml epidermal growth factor and 0.03 mg/ml bovine pituitary extract (both BD Biosciences), on rat-tail-collagen (BD Biosciences) coated Transwell-membranes (CoStar).مرة واحدة وصلت إلى ثقافة confluency، تم إنشاء واجهة الهواء السائل عن طريق إزالة المتوسطة من المقصورة العلوية وإضافة DMEM / F12 المتوسطة مع 2٪ فقط NuSerum (BD) و 10 ن م حمض الريتينويك إلى انخفاض المقصورة. تم تغيير مستنبت في مجلس النواب مرتين في الأسبوع. لتصور ميكروتثبول الهدبية، وخلايا ثابتة في وقت واحد وpermeabilized لمدة 5 دقائق في المخزن PHEM (60 م م أنابيب، 25 م م HEPES، 10 م م EGTA، 2 م م MgSO 4، ودرجة الحموضة 7.0) تحتوي على 0.5٪ الفورمالديهايد، 0.1٪ غلوتارالدهيد و 0.5٪ تريتون X-100، تليها تثبيت لمدة 10 دقيقة في PHEM العازلة التي تحتوي على 1٪ الفورمالديهايد. وتصور أهداب التي وصفها immunocytochemical مع β-IV تويولين الأضداد (Biogenex) وكان ينظر باستخدام مجهر multiphoton بيو راد.

تحليل البيانات

تم تحديد أهمية استخدام الطالب ر -test. عند الاقتضاء، على سبيل المثال مع بيانات المحجمة من الملاحظات السلوكية الأساسية، أجريت تحاليل اللامعلمية باستخدام اختبار فيشر الدقيق.

شكر وتقدير

نشكر P. كارب، K. بوغه، M. Olvera، C. ايستمان، R. سويديرسكي، R. بيرى، A. فيشر وK. فولكن للحصول على المساعدة الفنية وD. أغيار كراوتش للمساعدة الإدارية. علينا أيضا أن نعترف جامعة أيوا، قسم علم الأمراض ومرفق المركزية المجهر الإلكتروني البحوث في جامعة ولاية ايوا للحصول على المساعدة. وأيد هذا العمل من قبل المنح والمنظمات التالية: المنح NIH P50-HL-55006 (VCS) وR01-EY-11298 (VCS وEMS)، كارفر كارنيغي للطب العيون الجزيئية (EMS وVCS) والبحوث للوقاية من العمى، نيو نيويورك، NY (قسم العيون بجامعة أيوا). VCS ونظم الإدارة البيئية المحققين من معهد هوارد هيوز الطبي.
  • © المؤلف 2005. نشرت من قبل مطبعة جامعة أكسفورد. جميع الحقوق محفوظة. لضوابط، يرجى البريد الالكتروني: journals.permissions@oupjournals.org
المراجع

  • الحجر، DL، Slavotinek، A.، بوفارد، GG، بانيرجي-باسو، S.، Baxevanis، AD، بر، M. وBiesecker، LG (2000) تحور الجين ترميز chaperonin المفترض تسبب متلازمة McKusick-كوفمان. نات . جينيه.، 25، 79 -82.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • روبينوف، M. وشو، A. (1979) ومتلازمة McKusick-كوفمان: رتق ورثت مقهور المهبل، موه رحمي مهبلي، الازدواجية رحمي مهبلي، الشذوذ الشرجية، polydactyly خلف المحور، وأمراض القلب الخلقية J. Pediatr.، 94، 776 -778.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • Slavotinek، AM، حجر، EM، Mykytyn، K.، Heckenlively، JR، أخضر، JS، هيون، E.، Musarella، MA، Parfrey، PS، شيفيلد، VC وBiesecker، LG (2000) الطفرات في MKKS تسبب Bardet- متلازمة بيدل. نات. جينيه.، 26، 15 -16.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • فريدمان، J.، Nimmesgern، E.، Erdjument-Bromage، H.، الحائط، JS، Tempst، P. وهارتل، FU (1992) وظيفة في طي البروتين من TRIC، مجمع خاتم عصاري خلوي يحتوي على TCP-1 وما يتصل بها من الناحية الهيكلية مفارز. EMBO J.، 11، 4767 -4778.
    ميدلاين ويب للعلوم
  • أخضر، JS، Parfrey، PS، هارنيت، JD، فريد، NR، كريمر، BC، جونسون، G.، هيث، O.، McManamon، PJ، أوليري، E. وPryse فيليبس، W. (1989) المظاهر الأساسية للمتلازمة بارديه-بيدل، وهو شكل من متلازمة لورنس-مون بيدل. N ENGL. J. ميد.، 321، 1002 -1009.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • بيدل، A. (1922) عين geschwisterpaar معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا adiposo-genitaler dystrofie. Dtsch. ميد. Wochenschr.، 48، 1630.
  • بارديه، G. (1920) سور الامم المتحدة متلازمة دي obesite الطفلي AVEC poldactylie آخرون retinite مصطبغ. أطروحة دكتوراه، جامعة باريس، باريس، ص 479.
  • Elbedour، K.، زوكر، N.، Zalzstein، E.، بركي، Y. وكرمي، R. (1994) تشوهات القلب في متلازمة بارديه-بيدل: دراسات تخطيط صدى القلب من 22 مريضا (انظر التعليق). آم. J. ميد. جينيه.، 52، 164 -169.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • هارنيت، JD، أخضر، JS، كريمر، BC، جونسون، G.، الإنزعاج، L.، McManamon، P.، فريد، NR، Pryse فيليبس، W. وParfrey، PS (1988) الطيف من المرض الكلوي في لورانس-مون بيدل متلازمة. N. ENGL. J. ميد.، 319، 615 -618.
    ميدلاين ويب للعلوم
  • Mykytyn، K.، براون، T.، كرمي، R.، حيدر، NB، Searby، CC، شاستري، M.، بيك، G.، رايت، AF، يناكوني، A.، Elbedour، K. وآخرون. ( 2001) تحديد الجين الذي، عندما تحور، يسبب متلازمة السمنة الإنسان BBS4. نات. جينيه.، 28، 188 -191.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • نيشيمورا، DY، Searby، CC، كرمي، R.، Elbedour، K.، فان Maldergem، L.، فولتون، AB، لام، BL، باول، BR، سويديرسكي، RE، بوغه، KE وآخرون (2001) الموضعية استنساخ الجين الرواية على الصبغي 16q تسبب متلازمة بارديه-بيدل (BBS2). همهمة. مول. جينيه.، 10، 865 -874.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • Katsanis، N.، Beales، PL، وودز، MO، لويس، RA، أخضر، JS، Parfrey، PS، انسلي، SJ، ديفيدسون، WS وLupski، JR (2000) الطفرات في MKKS تسبب السمنة، وضمور الشبكية وتشوهات الكلى المرتبطة متلازمة بارديه-بيدل. نات. جينيه.، 26، 67 -70.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • Mykytyn، K.، نيشيمورا، DY، Searby، CC، شاستري، M.، الين، HJ، بيك، JS، براون، T.، Streb، LM، Cornier، AS، كوكس، GF وآخرون (2002) تحديد الجين (BBS1) تشارك الأكثر شيو

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس