عرض مشاركة واحدة
  #23  
قديم 11-23-2015, 09:54 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي استهداف التسلسل الإنتاجية العالية لتشخيص الأمراض غير المتجانسة وراثيا: الكشف عن الطفرات كفاءة في بارديه-بيدل وAlström المتلازمات

 

http://jmg.bmj.com/content/early/201...12-100875.full


لخص

خلفية متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب المتنحية عديد المظاهر التي تنتمي إلى العائلة المتنامية بسرعة من ciliopathies. وتشترك في الصفات المظهرية مع ciliopathies أخرى، مثل متلازمة Alström (زكاة المال)، سحاف الكلية (NPHP) أو متلازمة جوبير. وقد تم الكشف عن الطفرات BBS في 16 جينات مختلفة (BBS1 - BBS16) دون ارتباط واضح التركيب الوراثي إلى النمط الظاهري. هذا التغاير الجيني واسع هو مصدر قلق كبير للتشخيص الجزيئي والاستشارة الوراثية. في حين استراتيجيات مختلفة وقد اقترحت مؤخرا لتحسين الكشف عن الطفرات، فإنها إما تفشل في الكشف عن الطفرات في الغالبية العظمى من المرضى أو هي مضيعة للوقت ومكلفة.

طريقة نحن اختبار استراتيجية اكسون التقاط المستهدفة إلى جانب مضاعفة وعالية الإنتاجية تسلسل على 52 مريضا: 14 مع الطفرات المعروفة باسم إثبات صحة المبدأ و38 بدون الكشف عنها من قبل الطفرة. واستهدفت ثلاثين الجينات في المجموع بما في ذلك 16 الجينات BBS، 12 الجينات NPHP المعروف، واحد صدقات ALMS1 الجينات وCCDC28B التعديل المقترح.

النتائج سمحت هذه الاستراتيجية موثوقية الكشف عن الطفرات المسببة (بما في ذلك متماثل / الحذف اكسون متخالف) في 68٪ من المرضى BBS دون التشخيص الجزيئي السابق وفي جميع العينات إثبات صحة المبدأ. قامت ثلاث probands الطفرات اقتطاع متماثل في ALMS1 يؤكد التداخل المظهري كبير بين كل من الاضطرابات. ارتبط كفاءة الكشف عن الطفرات في المرضى بشكل إيجابي مع امتثالها لBBS النمط الظاهري الكلاسيكية (تم تحديد الطفرات في 81٪ من BBS 'الكلاسيكية' المرضى) مما يدل على أن تبقى سوى عدد قليل من الجينات BBS الحقيقية الكشف عن هويته. نحن لتوضيح بعض المشاكل التي تواجهها التفسير نظرا لتعدد المتغيرات التي تم تحديدها.

ختام هذه الاستراتيجية هي ذات كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة للأمراض مع عدم التجانس الوراثي عالية، ويضمن جودة التغطية في الترميز تسلسل الجينات المستهدفة مناسبة لأغراض التشخيص.

مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS؛ OMIM # 209900) هو اضطراب المتنحية عديد المظاهر مع ارتفاع التباين الوراثي غير أليلية. حدوثه يختلف من يقدر ب 1: 160 000 في شمال أوروبا إلى 1:13 500-17 000 في البدو وNewfoundlanders على التوالي 1 BBS ينتمي إلى عائلة كبيرة ومتزايدة من ciliopathies، وبالتالي، والصفات المظهرية أسهم مع جوبير (JBTS )، Alström (زكاة المال) وميكل (MKS) المتلازمات. 2 وبالتالي قد يكون التفاضلية التشخيص السريري صعبا، خصوصا في probands الشباب الذين لا يظهرون إلا أن بعض مظاهر بداية محددة في وقت لاحق. 4 على وجه الخصوص، وتبرز التقارير الأخيرة تداخل سريري كبير بين BBS وصدقات. 5
الميزات المظهرية الرئيسية للBBS تشمل ضمور شبكية العين، polydactyly، والسمنة، وتأخر في النمو المعتدل، الكلى المتعدد الكيسات ونقص الأعضاء التناسلية. ويمكن ملاحظة ملامح أخرى ثانوية في المرضى، مثل تشوهات القلب، وغيرها من أرقام أو العين الشاذة، ومرض السكري وارتفاع ضغط الدم، وعيوب السمع، الشم. 7 وحتى الآن، تم اكتشاف الطفرات في 16 جينات مختلفة (BBS1 - BBS16) ، ولكن لا علاقة واضحة التركيب الوراثي إلى النمط الظاهري ويمكن ملاحظة، إلى جانب استثناء المقترح BBS16. 8
وذكر متلازمة Alström (OMIM # 203800) لتكون أقل بكثير انتشارا من BBS، مع حدوث قدر من 1: 1 000 000. سماته المظهرية تتداخل مع تلك BBS في مرحلة الطفولة المبكرة، وتشمل: مخروط قضيب ضمور، والسمنة، ونوع السكري، وفقدان ولكن أيضا زيادة شحوم الدم، تمدد عضلة القلب، والرئة التدريجي، والكبد، أو الفشل الكلوي. السمع السكري 2 9 وحتى الآن، تم التعرف فقط جين واحد (ALMS1)، ولكن أظهرت التقارير الأخيرة بعض الأسر التي لديها موحية صدقات-تحمل طفرات في الجينات BBS. 5 الحجم الكبير من ALMS1 تسلسل الترميز يبدو أن انخفاض قيمة الاختبارات التشخيصية واسع النطاق للصدقات.
شامل التقليدي التسلسل سانجر لBBS التشخيص باهظة التكاليف نظرا لوجود عدد كبير من الجينات المعنية، وذلك أيضا للصدقات نظرا لحجم كبير من ALMS1 الترميز تسلسل (12 كيلو بايت، 24 الإكسونات؛ الجدول 1). لقد تم اقتراح استراتيجيات واعية التكلفة البديلة لBBS التشخيص، مثل: الفحص الأولي من الطفرات المتكررة والجينات الطافرة في كثير من الأحيان (BBS1، BBS10، BBS12) جنبا إلى جنب مع رسم الخرائط جود زيجوت متماثلة الألائل للعائلات الأقارب 10، 11؛ أو صفائف تمديد التمهيدي لاختبار سلسلة من الطفرات BBS المعروفة. 5 نهج آخر اقترحت مؤخرا هو تجميع السلطات الوطنية المعينة المرضى مع احق PCR التضخيم وresequencing مواز الهائل من BBS1-12 الإكسونات الترميز، تليها الفرز مضاعف متغاير لتحديد الناقل الطفرة . 12 ويعرض هذا الأسلوب بعض القيود كما سيغيب الحذف اكسون وربما لا تكون مناسبة لأغراض التشخيص. وبالنظر إلى التداخل السريري مع ciliopathies الآخر، فإن نهج آخر يتمثل في اختبار بشكل منهجي في وقت واحد، كل الجينات المقابلة لهذه المتلازمات المتداخلة، والتي ستكون ذات أهمية خاصة للمرضى الذين يعانون من الظواهر السريرية شاذة أو غير كاملة. وصفنا هنا نتائج هذا النهج، استنادا إلى التقاط اكسون المستهدفة من 30 الجينات بالإضافة إلى الجيل المقبل من التسلسل (خ ع).

الجدول 1
الجينات المتضمنة في استراتيجية تخصيب المستهدفة والاضطرابات المرتبطة بها

المواضيع والأساليب

تتوفر في طرق التكميلية بروتوكولات مفصلة.
المواضيع

تم جمع عينات من الحمض النووي من 52 مريضا غير ذات صلة. وقد تم تناول معظم المرضى إلى مختبر التشخيص، أو إلى المركز الوطني المرجعي للأمراض النادرة ophtalmogenetic في ستراسبورغ. تنبع عينات من الحمض النووي من أحد عشر مريضا التونسي تضمينها في دراسة علم الأوبئة BBS مستقلة.
وتضمنت الفوج إثبات صحة المبدأ 14 مريضا غير التونسي مع BBS التشخيص الجزيئي وأكد (التي تم اكتشافها قبل هذه الدراسة من خلال سانجر تسلسل). دون الطفرات المعروفة، جندت في ستراسبورغ ستة وعشرين من 38 مريضا، وكان قد تم فرزهم مبدئيا لBBS1 وBBS10 الطفرات المتكررة، بالإضافة إلى تسلسل الترميز كامل BBS12.
لجميع المرضى، تم الحصول على موافقة خطية من أجل الاختبارات الجينية، سواء من الكبار أو probands من الممثل القانوني في حالة القصر.

إعداد مكتبة، والتقاط المستهدفة وتسلسلها

تم إعداد عينات من الحمض النووي والتحكم فقا للإجراءات العادية.
تم تنفيذ تصميم التقاط مع eArray باتباع إرشادات الشركة المصنعة (اجيلنت).
تم المنفصمة السلطات الوطنية المعينة (3 ميكروغرام) ميكانيكيا باستخدام Covaris E220 (دورة العمل: 10٪؛ شدة: 5؛ دورة في انفجار: 200؛ وقت: 300 ق).
للتجربة إثبات صحة المبدأ، تم إضافة محولات التسلسل على 500 نانوغرام من الحمض النووي المنفصمة باستخدام SPRIworks جزء مكتبة النظام الأول (بيكمان كولتر). بعد تقييم التضخيم والجودة، تم إجراء القبض المستهدفة على عينات فردية باستخدام SureSelect في حل الهدف إثراء نظام (اجيلنت) على 500 نانوغرام من مكتبة هيأهم DNA. تم تنفيذ خطوات إضافية من غسل وتنقية وشطف، وأضيفت محولات المتنوعة (الأرقام القياسية DNA TruSeq البورشيد) بواسطة PCR خلال خطوة التضخيم بعد القبض.
لجميع التجارب التالية، تم إضافة محولات مضاعفة في وقت واحد لمحولات التسلسل باستخدام نظام SPRIworks. المبالغ متساوي المولية للمكتبتين الموسومة كان يتم تجميع ثم مسبق للتفاعل الالتقاط. وظلت جميع الخطوات الأخرى التالية قبل التسلسل متطابقة. تم إجراء تسلسل واحد يقرأ 72-BP على الجينوم محلل منظمة شات (GAIIx، البورشيد).

خط أنابيب بيوينفورمتيك

قراءة أجريت رسم الخرائط والدعوة البديل فقا للإجراءات العادية. تم إجراء تصفية متغير باستخدام VaRank، وهو برنامج في المنزل الذي يجمع معلومات البديل محددة لتصنيفها وفقا لالإمراضية تنبأ بها (الشكل 1، طرق التكميلية).

الشكل 1
مخطط عالمي خط أنابيب بيوينفورمتيك تنفيذها للكشف عن الطفرات. اختصارات البرنامج: BWA، الجحور-ويلر أليجنر. SVA، تسلسل متغير محلل. فرزت؛ Polyphen2. HSF، الإنسان الربط الباحث. MaxEntScan، الحد الأقصى لالانتروبيا الضوئي. NNSplice. طفرة المتذوق. IGV، التكاملية الجينوم عارض.

تباين نسخ رقم (CNV) طريقة الكشف

وقد تم تحديد التنوعات في عدد النسخ باستخدام طريقة العمق من التغطية. 13، 14 بالنسبة لكل مريض، وقراءة التهم في ويندوز من 20 النيوكليوتيدات غير متداخلة محسوبة، تطبيع ثم مقارنة عشوائيا مع ثماني عينات أخرى من نفس التجربة (تعتبر يعيد) باستخدام حزمة DEseq Bioconductor (مصممة في البداية لبيانات RNA يليها). 15 مناطق المرشح لالتنوعات تم انتشال عندما كانت نسب log2 (الضوابط / عينة) إما ≥0.84 (أضعاف تغيير> 1.8، حذف المحتملين) أو ≤-0.51 (أضعاف التغيير <0.7، الازدواجية المحتملة)، وإذا القيم ص تعديل لاختبار متعددة (Benjamini وهوشبرج الداخلي) 16 وكان أصغر من 0.1.

الأساليب الإحصائية

تم احتساب فترات الثقة للتقديرات نسبة وأشار بين قوسين. تم حساب اختبار فيشر الدقيق للمقارنة بين توزيع السكان صغيرة. ونظرا لاحقة قيمة ص في α = 0.05.

النتائج والمناقشة

المناطق المستهدفة: استراتيجية التصميم

كان هدفنا الأساسي لوضع استراتيجية الطفرة الفرز فعالة لتشخيص المرضى الذين يعانون من الظواهر المثيرة للBBS، أو من ciliopathies تداخل سريريا. اخترنا نهج تخصيب الهدف إلى جانب NGS من أجل التركيز على التسلسل في المناطق الجينومية من الفائدة. نحن المستهدفة بكل exons (بما في ذلك 5 'و 3' UTRs) من 16 جينات BBS المعروفة (الجدول 1). بسبب تداخل طبي معروف، ونحن شملت أيضا الترميز الإكسونات من ALMS1، وكل 12 الجينات سحاف الكلية المعروفة. (NPHP1 - 12)، منذ تنكس الشبكية كثيرا ما يمكن لوحظ في هذا المرض الكلى محددة 17 متواليات الترميز من AHI1 / JBTS3، TMEM216 / MKS2 / JBTS2، والمقترح BBS-معدل CCDC28B / MGC1203، واستهدفت أيضا. 18 لأن بعض هذه الجينات ترتبط مع الظواهر المتعددة، لدينا تصميم ويشمل 6 MKS، 7 JBTS و 4 متلازمة العليا-لوكن ( SLSN) الجينات (انظر الجدول 1).
مع هذا التصميم الأول، أردنا أن التحقيق ما إذا كان بما في ذلك سلاسل intron يمكن صلاحا، والكشف عن والتحجيم من الحذف اكسون. لذا أدرجنا سلاسل intron من BBS1 وBBS4 استهداف الطعم. وقد أملى هذا الاختيار من قبل اثنين من الملاحظات: وجود فائض واضح من المرضى متخالف لطفرة M390R-BBS1 المتكررة مع عدم وجود الطفرة الثانية الكشف، 11 وعدة تقارير BBS4 الحذف اكسون في المرضى. 11، 19 A العتبة القصوى 200 كيلو بايت ل تم تعيين المناطق المستهدفة المتراكمة بسبب حدود تسعير الشركة المصنعة.
وجود تسلسل المتكررة يمنع الطعم تبليط في 19.7٪ من المناطق المستهدفة في البداية. هذا القلق، على وجه الحصر تقريبا، إنترونات من BBS1 وBBS4، إلى جانب عدد قليل من 3'UTRs، وفقط 128 سنة مضت من مناطق ترميز البروتين (داخل الإكسونات الأولى من ALMS1 وNPHP3؛ الجدول S1).

إثبات صحة المبدأ والنتائج الفنية

في تجربتنا إثبات صحة المبدأ، اخترنا 16 عينات من الحمض النووي، منها 14 مع الطفرات BBS المعروفة. في هذه التجربة الأولى، بعد المتوازية المكتبات التخصيب الهدف، ونحن التسلسل برك من أربع أو ثماني مكتبات في حارة من GAIIx (انظر طرق التكميلية). وأجري هذا إثبات لمبدأ تحليل أعمى، وهذا هو، من دون معرفة الجينات BBS المتورطين والطفرات المرتبطة بها. تم اختبار كوكبة من جميع أنواع الطفرات (missenses، nonsenses، والطفرات لصق، حذف الكبيرة وإعادة ترتيب معقدة) على مختلف جرعة أليلية (الشكل S1). كل 14 الطفرات التي تم تحديدها مسبقا، من بينهم اثنان من -deletions BBS1 متخالف (الشكل 2A)، تم الكشف في متخالف الصحيح على / الدولة متماثل (الجدول S2). على وجه الخصوص، في AKE12 المريض، يمكننا الكشف عن انخفاض المحلية غير طبيعي للتغطية في BBS12 بسبب نوع نادر طفرة (إدراج تسلسل ألو، الرقم S1A) على الرغم من أن الطبيعة الدقيقة للطفرة يمكن أن تحدده فقط سانجر التسلسل. ولوحظ وجود انخفاض مماثل في التغطية للمريض الثاني، AHX91، مع طفرة معقدة آخر الكشف من قبل سانجر تسلسل (الإدراج / انقلاب في BBS5).

الرقم 2
الكشف عن الحذف كبيرة في ثلاثة مرضى باستخدام طريقة العمق من التغطية. قمم سوداء: عمق تطبيع التغطية من عينات DNA المرضى. قمم فارغة: عمق يعني تطبيع التغطية عبر عينات من نفس التسلسل حارة. الساحات الرمادية: المناطق المغطاة الطعم. قمم سوداء: عمق تطبيع التغطية من عينات DNA المرضى. قمم فارغة: عمق يعني تطبيع التغطية عبر عينات من نفس التسلسل حارة. الساحات الرمادية: المناطق المغطاة الطعم. الساحات الضوء: المناطق حذفها. تمثيل الجينات: المربعات السوداء: الإكسونات، الخطوط المتقطعة: إنترونات. يتم إعطاء مناصب الجينومية وفقا للجينوم البشري إشارة hg19 / GRCh37. (A) حذف متخالف من BBS1 (اكسون رقم 10، 11) في AMV5 المريض. المقابلة نسب Log2 بين كل من أعماق التغطية (يعني تطبيع وAMV5 المريض) مزيد من تسليط الضوء على وجود الحذف. (B) الحذف متماثل الجينات من BBS3 (اكسون # 1، 2A، 2B، 3) في ALG42 المريض. (C) الحذف متماثل الجينات من BBS4 (اكسون # 4، 5، 6) في P3 المريض. (A و C): استهداف سلاسل intron يسمح بتقييد نقاط التوقف الحذف. (B) وC): قم بتسجيل 2 النسب بين كل من أعماق التغطية (يعني تطبيع والمرضى المقابلة) يمكن أن تسمح أيضا الكشف عن كل من الحذف ولكن لا تظهر (التكميلي الرقم S2).

في هذه التجربة الأولى، وصلنا بشكل شبه منتظم التغطية النظرية القصوى ل144x يتضح من تغطية متوسط ​​127 ± 4X بعد إزالة مكررة يقرأ (الجدول 2). ونظرا لهذه التغطية تشبع العالمية عندما يقرأ النظر فريدة من نوعها، وكنا كل يقرأ، بما في ذلك التكرارات، عند تطبيق أسلوب قائم على عمق دينا للكشف عن التنوعات.

الجدول 2
إحصاءات التسلسل كل من التغطية (في المناطق القبض) وكفاءة التقاط

هذه الواعدة العمق من التغطية النتائج (الجدول 2، الجدول S3) شجعنا على زيادة عدد العينات المجمعة. في التجارب القادمة استخدمنا التقاط رد فعل واحد لمدة المكتبات barcoded، مما يسمح كل من وفورات في التكاليف ومقاعد البدلاء في الوقت المحدد، والمجمعة 12 مكتبات في حارة التسلسل (اقترح الحد الأقصى لعدد الباركود في ذلك الوقت البورشيد).
تم تنفيذ هذا البروتوكول الجديد على الدفعة الثانية من 36 مريضا مع الطفرات غير معروفة. أدى التسلسل في تغطية متوسط ​​78 ± 17 × (283 ± 153x قبل رميه يقرأ مكررة) مع 91.4 ± 6.4٪ من المناطق المستهدفة التي تغطي أكثر من 40X (الجدول 2). هذا الانخفاض النسبي للتغطية على ما يبدو نتيجة لانخفاض كفاءة التقاط قد يكون راجعا إلى: (1) مبلغ مساهمة مكتبة الفردية بمقدار النصف، ويرجع ذلك إلى تجميع ما قبل القبض على و(2) إضافة الباركود قبل القبض، مما يؤدي إلى حجب أقل كفاءة وتهجين غير محددة. التغطية الناتجة عنها ما زالت يضمن موثوقية الكشف عن المتغيرات ومتماثل / دولتهم متخالف.
وتمت تغطية نسبة صغيرة من المناطق المستهدفة ضعيفة في بعض المرضى (أي عمق <10X بعد التكرارات تصفية)، مع عدد قليل جدا منهم بطريقة منهجية في المرضى الآخرين (الجدول S4). هذا المعنية فقط 0.63 ± 0.68٪ من مناطق ترميز البروتين، وتضمنت معظمها متواليات GC الغنية intronic (GC المحتوى: 68.3 ± 5٪ مقابل 40.2 ± 10٪ في جميع المناطق المستهدفة)، أو بعض الإكسونات الأولى (الجداول S3 و S4).

تصفية متغير: أهمية قواعد البيانات والبيانات التردد

في المناطق المستهدفة، اكتشفنا، في المتوسط، 170 المتغيرات (واحدة النكليوتيد المتغيرات (SNVs) وindels) لكل مريض. وقد تم تحليل جميع منهجي لتأثير المفترض على بنية البروتين والمواقع لصق باستخدام VaRank (الشكل 1، طرق التكميلية). حوالي 130 من هذه المتغيرات سجلت في dbSNP134 (الجدول S5)، ولكن تم التحقق من 20 فقط مع اثنين على الاقل من وسائل مستقلة، وبالتالي تخرج. في الواقع، في سياق اضطراب المتنحية النادرة، يمكن لبعض الطفرات الحقيقية تكون موجودة في التردد المنخفض جدا في حالة متخالف في الضوابط.
تم تقييم المرضية المحتملة من 150 المتغيرات المتبقية باستخدام أدوات بيوينفورمتيك والنظر في تواتر الصبغيات في عدد السكان الأوروبي الأمريكية، كما ورد في قاعدة البيانات Exome البديل خادم (EVSdb). ونتجت عن ذلك من صفر إلى ستة متغيرات مثيرة للاهتمام لكل عينة، كان من بينها مقطوعة واضح أو الطفرات المعروفة في بعض المرضى.
حقل "الأهمية السريرية" الجديد الذي بدأ العمل في dbSNP134 لابد من النظر بحذر منذ تأسيسها الطفرات يمكن الآن عنها في قاعدة البيانات ولكن لم يتم وضع علامة بشكل منتظم كما الإمراض (على سبيل المثال: rs179363897، p.R138H) طفرة في BBS5). على العكس من ذلك، اكتشفنا بعض الشروح إيجابية كاذبة: rs4784677 (p.N70S) في BBS2 ذكرت -initially كما أليل الثالث حسب hypothesis- triallelic 20 يتم الإشارة إليها العدوى، ولكن غير متكررة جدا ليكون طفرة توغل بالكامل (0.77٪ في EVSdb). مرشحات يجب أن تتكيف بعناية إلى اضطراب في المصالح، والتحديثات في تطور مستمر من قواعد البيانات.

الكشف عن الحذف اكسون

ميزة واحدة من الاستراتيجيات القائمة NGS، في مقابل سانجر تسلسل، هو فرصة للكشف، بالإضافة إلى SNVs وindels-التنوعات الصغيرة التي تؤثر على واحد أو أكثر من الإكسونات (الشكل 2 وS2). في التجربة إثبات صحة المبدأ، يمكن أن يتم الكشف عن اثنين من الحذف متخالف في BBS1. بين عينات غير معروفة، تم التعرف على اثنين الحذف متماثل في BBS3 / ARL6 وBBS4. على حد علمنا، ونحن نقدم هنا أول تقرير من الحذف كبيرة في BBS1 وBBS3 / ARL6، في حين أن العديد من عمليات الحذف التي تؤثر BBS4 وقد لوحظ سابقا. 11، 19 وبما أننا استهدفت أيضا سلاسل intron من BBS1 وBBS4، كنا قادرين على تضييق حدود الحذف الكشف اللاحقة (الشكل 2). لAMV5 المريض، باستخدام إحداثيات الإكسونات المتضررين، ويقدر حجم BBS1 حذف سيكون بين 466 و 4707 سنة مضت، بينما مع دينا تصميم، ونحن يمكن حصرها في 1862-3841 سنة مضت (الشكل 2A، الجدول S2). في P3 المريض، ونحن يمكن أن تقلل من حجم مماثل المقدرة للحذف BBS4 4626-12 975 نقطة أساس على أساس مواقف اكسون وصولا الى 9376-10 469 سنة مضت (الشكل 2C، الجدول 3A). وأخيرا، لأن الحذف BBS3 / ARL6 في المريض ALG42 يشمل الإكسونات الثلاثة الأولى من هذا الجين (الشكل 2B)، ونحن اختبار ما إذا كان قد تمتد وتؤثر EPHA6 يقع المنبع، ترميز مستقبلات ephrin. اختبار PCR المباشر استبعاد هذا الحذف الموسعة (لا تظهر البيانات).

الجدول 3
الطفرات التي تم تحديدها وغيرها من المتغيرات المحرضة في 38 المرضى الذين يعانون من النمط الجيني لم تكن معروفة سابقا. A) المرضى الذين يعانون من الخيارين المسببة للأمراض بشكل واضح في جين واحد. B) المرضى الذين يعانون من واحد أو أي متغير الإمراض واضح في جين واحد. ووصف الطفرات وفقا لأحدث الاتفاقيات التسميات وصفها في HGVS

وبفضل هذه الطريقة، في ستة المرضى الذين اكتشفنا متخالف واحد يحتمل أن تكون الطفرة المسببة للأمراض، يمكننا التأكد من أن أي حذف متخالف موجود في العابرة، أو على الأقل لا تشمل تسلسل exonic.

توزيع الطفرات BBS الكشف عنها في 38 مريضا غير معروف

من 38 عينة الطفرات BBS غير معروفة (36 + 2 من التجربة إثبات صحة المبدأ) ونحن الكشف عن الطفرات المسببة للأمراض بوضوح biallelic في 26 حالة (68.4٪، الجدول 3A). على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن سبعة عشر من هذه الطفرات في السابق، مشيرا إلى أن الطفرة الطيف BBS هو أبعد ما يكون عن المشبعة على الرغم من العديد من التقارير طفرة BBS. تم العثور على طفرات متماثل في 88٪ (23/26) من المرضى تحور ومتماسكة مع عدد كبير من الأقارب probands المدرجة في الفوج (75٪، 25/33). في اثنين من المرضى من أصل الأقارب، ويقع طفرة BBS خارج المناطق متماثل الكشف عنها بواسطة SNP تحليل مجموعة مسبق، وسوف، وبالتالي، قد غاب باستخدام استراتيجية رسم الخرائط جود زيجوت متماثلة الألائل (المرضى AGL23، AKX44؛ الجدول 3A).
من بين 12 مريضا المتبقية مع عدم وجود الطفرات biallelic تم تحديدها (الجدول 3B)، وكان مريض واحد (AHR2) ومتخالف بشكل واضح طفرة الربط المسببة للأمراض في BBS3. وكان خمسة مرضى توقع missenses متخالف أن تكون ضارة عن طريق التدقيق، Polyphen2 و / أو الطفرة T @ ster يسود (AIY87، AIX45، AMO77، AMA28، AHL86) مع الأخيران تحمل هذه المتغيرات في اثنين من الجينات المختلفة. مريض واحد الأقارب ميلانيزيا، AKE98، قدم مع الكلاسيكية ميزات BBS-إدراج، بما في ذلك polydactyly. كان يحمل نوعين مختلفين متماثل التي ظهرت في البداية على أنها المحرضة: لانزياح الإطار البعيدة في INVS / NPHP2 توقع لإضافة 14 الأحماض الأمينية إلى C-محطة لأطول البروتين الإسوي، وP2679L غير المبلغ عنها مغلطة التي تؤثر على بقايا الحفظ في ALMS1 (الشكل S3). استبعد تحليل الفصل اللاحق من ضلوعهم في المرض منذ كانت كلا الخيارين متخالف في أخ تتأثر بشكل مماثل.
في خمسة مرضى، يمكن تحديد أي البديل المحتمل الإمراض في أي من 30 الجينات المستهدفة. هؤلاء المرضى هم بالتالي مرشح لexome التسلسل الذي قد إما مساعدة في تحديد جينات جديدة أو إعادة النظر في التشخيص السريري.

تحميل طفرة في BBS والجينات المستهدفة الأخرى: أهمية ALMS1

الحمل تحور الجينات بين BBS في فوج لدينا يبدو متسقا مع تقارير سابقة. 11 الحوادث المرصودة لBBS1 (7/38، 18.4٪) والطفرات BBS2 (5/38، 13.2٪)، والأكثر تحور الجينات كثيرا في دراستنا ، وعلى غرار فيما يخصه ذكرت الأرقام من 16.9٪ و 12٪. 7 بالنظر الجينات الطافرة في كثير من الأحيان، كان منحازا دراستنا بقوة ضد BBS1، BBS10 وBBS12، لأن ثلثي السلطات الوطنية المعينة المرضى تم اختبارها سابقا سلبية لBBS1 وBB S 10 الطفرات المتكررة، بالإضافة إلى كل تسلسل الترميز BBS12 البروتين. وهذا ما يفسر الغياب التام للطفرات BBS12 في فوج لدينا، ومساهمة منخفضة نسبيا من BBS10 (5/38، 13.2٪) مقارنة مع الأدب (≥20٪). 11 وكانت مساهمة الجينات BBS أخرى منخفضة، مع كثير من الأحيان المستلفت واحد فقط المعنية.
لم نجد أي تحور في الجينات BBS "الجديدة" (BBS13 - 16) مما يدل على أن، بشكل تراكمي، لديهم مساهمة صغيرة في مجموع الحمل طفرة تبين BBS13 / MKS1 الواقع أن تورط معظمهم في MKS منذ BBS واحد فقط. وذكر المريض مع اثنين من الطفرات متخالف ص [C492W]؛ [F371del] حمل آخرون فقط missenses متخالف، وأحيانا بالإضافة إلى متماثل اقتطاع الطفرات BBS1. 21 وبالمثل، لBBS14 / CEP290، طفرة اقتطاع متماثل (p.E1903 *) تم العثور عليها في BBS مريض واحد، 21 في حين الطفرات الأخرى بكثير في كثير من الأحيان المتورطين في جوبير، كبير وكن، ليبر الخلقي الكمنة أو متلازمات ميكل. ويمكن ملاحظات مماثلة لBBS15 / WDPCP وBBS16 / SDCCAG8 22، 23 كما هو الحال في جميع الدراسات الأخرى الأفواج BBS، تم تحديد أية طفرة في BBS11 / TRIM32 رفع قضية تورط الحقيقي في BBS: كان واحد فقط الطفرة مغلطة متماثل هو موضح في عائلة الأقارب واحدة، في حين تم تحديد عدة طفرات أخرى في أشكال المتنحية من طرف الزنار ضمور العضلات. 24
نتيجة واحدة جديرة بالذكر هي العثور على متماثل اقتطاع الطفرات ALMS1 في 3/38 مريضا (AIA84، AKO26، ALB64؛ 7.9٪). على وجه الخصوص، وهراء وجدت في AKO26 p.R3629 المريض * ويبدو أن طفرة ALMS1 المتكررة، منذ نشرت بالفعل في خمسة مرضى صدقات الآخرين. 25-27 ويبدو أن التداخل المظهري بين BBS وصدقات إلى أن تكون أكبر مما كان يعتقد سابقا، ومؤخرا اقترح مع أمثلة من المرضى Alström مع طفرات في الجينات BBS، 5 والوضع العكسي، كما هو الحال في دراستنا، من الطفرات ALMS1 في المريض مع المشتبه BBS. 3
وأخيرا، تم العثور على طفرة لا المسببة للأمراض بشكل واضح في أي الجينات NPHP أو JBTS في الفوج.

العلاقة بين الكفاءة والكشف عن الطفرات والنمط الظاهري السريرية

وأظهرت المقارنة بين النمط الظاهري السريرية بين المرضى الذين يعانون من أليلين المسببة للأمراض بوضوح متحولة (ن = 26) والذين يعانون إما البديل الإمراض ممكن واحد أو أي متغير المشبوهة الكشف عن (ن = 12) وجود علاقة واضحة بين عدد من المظاهر السريرية الرئيسية BBS و احتمال الكشف عن أليلين BBS تحور في المرضى (الشكل 3). تم الكشف عن الطفرات Biallelic في 81٪ (CI (60٪ إلى 92٪)) من المرضى تلبية معايير الاشتمال BBS. على وجه الخصوص، في المرضى التونسي المعينين على المعايير السريرية الصارمة، تم العثور على الطفرات في 11/11 الحالات وسبعة جينات مختلفة BBS، مستبعدا تأثير مؤسس المحتملين. على العكس من ذلك، بالنسبة لبعض من 12 مريضا دون طفرات واضحة، كان BBS واحد فقط تشخيص يشتبه غيرها. وعلاوة على ذلك، لدينا الاختيار المبدئي للمرضى دون الطفرات المتكررة في BBS1 أو BBS10، ودون أي طفرة في BBS12 قد أغنت فوج لدينا في المرضى الذين يعانون من الظواهر BBS غير نموذجي. تقدير الحالي نقلت على نطاق واسع أن تشكل الجينات BBS المعروف٪ فقط 70-75 من الحمل طفرة الإجمالي في المرضى BBS وبالتالي يمكن الاستهانة إذا النظر في المرضى فقط مع محددة بدقة BBS النمط الظاهري.

الشكل (3)
يرتبط الامتثال الكلاسيكية BBS النمط الظاهري بشكل إيجابي في الكفاءة للكشف عن الطفرات الرئيسية في الجينات BBS. (A) عدد BBS التشخيص معايير الاشتمال الرئيسية 6 يرتبط في المرضى الذين لكشف كفاءة من الطفرات BBS. (B) الكفاءة للكشف عن طفرة في المرضى الذين يعانون الوفاء BBS معايير الاشتمال المظهرية أو لا. . BBS معايير الاشتمال عرض مع ثلاث سمات رئيسية بالإضافة إلى اثنين على الأقل من القصر، أو تقديم أربع ميزات رئيسية وأكثر من 6 معايير رئيسية تشمل: ضمور قضيب مخروط، polydactyly، والسمنة، وصعوبات التعلم، قصور الغدد التناسلية والشذوذ الكلوي. وتشمل الميزات الثانوية تأخير الكلام والشذوذ العين الأخرى، قصر الأصابع أو ارتفاق الأصابع، وترنح، ومرض السكري، وتأخر في النمو، وتشوهات الأسنان، وتشوهات القلب والتليف الكبدي. 6

يظهر التوزيع من الميزات إدراج BBS مختلفة بين المرضى الذين يعانون من الطفرات BBS اثنين، واثنين من الطفرات ALMS1 أو أية طفرة biallelic المحددة (الجدول 4). المرضى الذين يعانون من أية طفرة الكشف قدمت مع أقل بكثير polydactyly، وهو BBS علامات سريرية رئيسية هي: فقط 25٪ مقابل 70٪ في المرضى الذين يعانون من الطفرات BBS الكشف عن (P = 0.029 *). يبدو أن المظاهر السريرية الأخرى على أن تحذو اتجاه المرضى BBS الكلاسيكية.

الجدول 4
تقرير الملامح الرئيسية BBS السريرية في 38 مريضا دون التشخيص الجزيئي معروفة سابقا، مع أو من دون الكشف عن الطفرات

وفيما يتعلق -mutated ALMS1 probands، 03/02 قد أرسلت للاشتباه BBS (برادر ويلي أو صدقات اعتبرت أيضا لAIA84 وAKO26، على التوالي)، ومعايير التشخيص BBS راضية. وتناول آخر واحد (ALB64) لضمور شبكية العين المتلازمة (جدول 4). 6 AIA84 يقدم BBS الكلاسيكية مع ضمور شبكية العين، والسمنة، وعيوب المعرفية، وقصور الغدد التناسلية وقصر الأصابع. AKO26 يعرض على BBS شاذة مع نفس الميزات جنبا إلى جنب مع الصمم الشديد غير الطبيعي، محددة للصدقات. وأخيرا، ALB64 يقدم صدقات نموذجية مع الصمم الشديد وضمور الشبكية. يقدم اي منهم مع polydactyly. كما اقترح سابقا، 3 على حد سواء، وغياب polydactyly وانتشار الصمم في ALMS1 -mutated المرضى، هي مفاتيح للتمييز الوراثي، النمط الظاهري بين زكاة المال والمرضى BBS تحور.

تقييم oligogenism في BBS

وقد نوقشت على نطاق واسع وجود وتأثير المحتمل لtriallelism أو oligogenism في BBS ويبدو المثير للجدل (18، 20، 28، 29 مقابل 30-32). في نهجنا، والتسلسل في وقت واحد من كل 16 الجينات BBS، و14 جينات أخرى تشارك في ciliopathies متداخلة، يسمح للكشف المنتظم من المتغيرات المحرضة الأكثر إضافية في هذه الجينات، وبالتالي تقييم غير متحيز للoligogenism.
من 52 مريضا تحليلها، وجدنا متخالف واحد فقط اقتطاع طفرة (p.K1870Nfs * 4)، وأليل الثالث في BBS14 / CEP290 في AKR68 المريض الذي يحمل طفرة مغلطة المسببة للأمراض في BBS10. مثل هذا التردد هو في الواقع في نطاق ما يمكن توقعه من قبيل الصدفة. . حسبنا سابقا من احتمال يحمل طفرة BBS الممرضة الحقيقية أن يكون حوالي 1:50 31 وبما أننا وشملت أيضا في التصميم لدينا جينات ciliopathy أخرى، واحتمال أن تحمل الطفرة المسببة للأمراض في واحدة من 30 الجينات هي بالأحرى بين 1: 20 و01:30 (حساب على أساس كل حالات المرض والإبلاغ عن أي مساهمات من الجينات المستهدفة في الحمل طفرة). يحتمل، تم العثور على missenses متخالف الإمراض (لم يبلغ عنها سابقا في المرضى أو في EVSdb) أيضا في ثمانية مرضى (ثلاثة من إثبات صحة المبدأ، الجدول S2، وخمسة من جماعة 'مجهولة'، الجدول 3).هذه المتغيرات قد يكون بمثابة المعدلات، ولكن من غير المرجح أن يطلب منهم للتعبير الكامل لBBS النمط الظاهري الكلاسيكية. على العكس من ذلك، في بعض المرضى حيث تم العثور على الطفرة المسببة للمرض بشكل واضح واحدة، والمتغيرات في جينات أخرى من نفس الطريق (وخاصة تلك البروتينات ترميز من نفس المجمع، مثل BBSome أو مجمع BBS-chaperonin) 33، 34 قد تسهم في الدولة المرض في وضع digenic الميراث المقترحة في عدد قليل من العائلات BBS. 20، 35، 36
ويتضح حالة محتملة من triallelism التي كتبها AIZ62 المريض، الذي هو متخالف مركب أو p.E191 هراء * وp.A242S مغلطة في BBS6 / MKKS. وكانت تسببها A242S البديل موضوعا للمناقشة. 37-39 تحليل في الزرد أشار إلى أنه يؤثر BBS6 / وظيفة MKKS واقترح لها تأثير سلبي المهيمن. 40 EVSdb يسمح للاستدلال ترددها عند 0.59٪ (CI (0،43-0،80٪ ))، أعلى من الطفرات الأكثر شيوعا BBS، M390R في BBS1 (0.24٪ CI (0،15-0،39٪)). A242S لا يمكن بالتالي أن تكون طفرة توغل للغاية لأنه ينبغي بعد ذلك وجدت بشكل متكرر أكثر في المرضى الذين يعانون من طفرة M390R، وهو ليس كذلك. في AIZ62 المريض، وقد تم تحديد متغير متخالف الثالث في BBS12 (p.Q620R، بقايا الحفظ في الثدييات، ولكن ليس في الفقاريات أكثر بعدا) مما يؤثر فرعية أخرى من مجمع BBS-chaperonin. 34 ونقترح أن A242S هو الأليل hypomorphic أن قد يؤدي إلى النمط الظاهري في حين عبر، مع طفرة اغية كاملة، ويمكن potentiated مزيدا من أليل hypomorphic تؤثر فرعية أخرى من نفس المجمع. لا يمكن إجراء تحليل الفصل في الأسرة AIZ62 لاختبار هذه الفرضية.
وأخيرا، ونحن ننظر في فوج لدينا لتردد أليلية من المقترح سابقا BBS-معدل متغير c.330C → T في CCDC28B / MGC1203، 18 والعثور على وتيرة بنسبة 3.85٪ (CI (1،56-9،47٪))، وهي ليست تختلف اختلافا كبيرا (ع = 0.17) من 2.07٪ (CI (1،76-2،43٪)) لاحظ في EVSdb.

النتائج

كان التباين الوراثي غير أليلية واسعة من متلازمة بارديه-بيدل مشكلة كبيرة للتطبيقات المشورة التشخيصية والوراثية الجزيئية. وقد تم اقتراح استراتيجيات مختلفة في السنوات الأخيرة لتحسين الكشف عن الطفرات، 5، 10-12 ولكن لديها إما منخفضة حساسية أو أيضا مضيعة للوقت ومكلفة في إعدادات التشخيص. وتتقاسم هذه المشكلة عن طريق كيانات أمراض أخرى مثل اعتلال عضلة القلب، وفقدان السمع، ومتلازمة آشر أو شاركو ماري الأعصاب الأسنان. ويمكن تقسيم الاستراتيجيات البديلة تلك القائمة NGS في كامل الجينوم / exome التسلسل، 41-43 أو التسلسل المستهدف، إما عن طريق استخدام متعدد PCR، 12 متعددة singleplex PCR 44-46 أو تخصيب القبض على النهج.
نحن نفذت في حل استراتيجية تستهدف القبض على 16 الجينات المعروفة BBS و 14 جينات أخرى متورطة في ciliopathies التي تشترك في السمات السريرية متداخلة مع BBS. نعرض هنا أن هذا هو فعالة جدا لأنه في ممر تسلسل واحد من واحد البورشيد GAIIx يمكن تحليل في وقت واحد أكثر من 99.4٪ من المستهدف ترميز البروتين متواليات من هذه الجينات في 12 مريضا، مع تغطية كافية لضمان موثوقية الكشف عن المتغيرات متخالف، صغيرة indels والحذف اكسون. في تشغيل لمدة أسبوع، يمكن للمرء أن يحتمل بالتالي تحليل 96 مريضا. التحقيق في 36 مريضا يمكن أن تكتمل في حوالي 3 أسابيع عندما بما في ذلك إعداد العينات وتحليلها بيوينفورمتيك الأولي. تحليل البيانات وزيادة التحقق من صحة طفرة وقتا أطول للحالات حيث لا يوجد سوى المتغيرات المرضية غير مؤكد موجودة. قدرنا تكاليف استهلاك الشاملة في إعدادات لدينا حوالي 600 $. هذا ويمكن حتى انخفض كذلك من خلال استخدام أحدث التعاقب أكثر قوة، مما يسمح للتحليل برك كبيرة من عينات barcoded مع الحفاظ على عمق عالية من التغطية. في الواقع، نحن التسلسل مؤخرا مجموعة جديدة من 24 مريضا (12 باستخدام ردود الفعل القبض) في حارة واحدة من البورشيد HiSeq2000 مع تغطية أعلى من تلك التي تم الحصول عليها في التجارب السابقة مع GAIIx (لا تظهر البيانات). في حين exome التسلسل هو واضح أكثر شاملة، من حيث التغطية الجينات في التطبيقات الحالية، لا تغطي 20-30٪ من الإكسونات المستهدفة بما فيه الكفاية لدقة التشخيص، وهذا هو، لضمان انخفاض معدلات نتائج إيجابية كاذبة / السلبية الكاذبة وموثوق بها الكشف عن الطفرات متخالف أو الحذف اكسون. وعلاوة على ذلك، فإن الموارد المعلوماتية اللازمة لexome / الجينوم تحليل تسلسل البيانات وتخزينها أهم بكثير من لتسلسل المستهدفة، وكثيرا ما يمكن وجود قيود.
هذه الاستراتيجية، ومع ذلك، ويعرض بعض العثرات محدودة. كانت مناطق قليلة البروتين الترميز لا تغطيها جيدا، إما بسبب الفشل في تصميم الطعم (وجود تكرار الأشكال) أو ضعف كفاءة القبض على (تسلسل معظمهم GC-الغنية والإكسونات الأولى). ثم، لدينا بروتوكول مع المتوازية الأولية المكتبات تليها القبض على العينات المجمعة قد تكون فعالة من حيث التكلفة، ولكن في الوقت الحاضر، يحد من كفاءة التقاط ويحتاج إلى مزيد من التحسين، وخصوصا إذا ما طبق على مجموعات الجينات أكبر. وأخيرا، مثل لجميع الاستراتيجيات اكسون المستهدفة، سيتم غاب عن الطفرات intronic عميقة. أما البديل لاستهداف الجينات كلها لا تزال تفوت على نسبة عالية من المناطق intronic تحتوي على تسلسل المتكررة، وسوف تزيد أيضا بصورة غير متناسبة على عدد من المتغيرات نادرة للتحليل مع لصق التنبؤ أدوات بيوينفورمتيك التي هي حاليا لا يمكن الاعتماد عليها بدرجة كبيرة. تسلسل الحمض النووي الريبي للجينات التي أعرب عنها في كريات الدم البيضاء أو الخلايا الليفية، سيتم اختيار بديل آخر (المخصب في محاضر الجينات وما شابه ذلك).
في حين استراتيجيات القبض مماثلة تم تطويرها مؤخرا لأمراض أخرى، معظمهم شملت مجموعة أصغر من ذلك بكثير، وذكرت الوحيد إثبات صحة مبدأ التحليل، 47-49 باستثناء والش وآخرون. 50 قد يكون النهج متعددة PCR الإمكانات تغطية الإكسونات أكثر باستفاضة، 46 بالنظر إلى أن التصميم التمهيدي هو أكثر مرونة من الطعم تهجين تبليط، ولكن يقتصر على لوحات الجين أصغر من لالتقاط اكسون. وقد استخدمت PCR تجميع دون المتوازية لBBS وNPHP، 12، 51 استراتيجية التي قد تكون فعالة من حيث التكلفة لتحليل عدد كبير من العينات في الدراسات الوبائية، ولكن يبدو غير مناسبة لأغراض التشخيص حيث الشغل الشاغل الرئيسي هو الحد / معدلات سلبية كاذبة إيجابية .
بشأن قضية محددة من BBS، تقترح دراستنا أنه عندما يتم الامتثال المعايير السريرية صارمة مع وتيرة الطفرات الكشف عن أعلى من نقلت عموما الرقم 70٪. 7، 11 وبالتالي قد يكون هناك سوى عدد قليل من الجينات BBS صارمة المتبقية الكشف عن هويته ، ولا سيما بالنظر إلى أنه مع معظم الاستراتيجيات، باستثناء تسلسل كامل الجينات، واحد سيغيب عن الطفرات المسببة للأمراض intronic عميقة. جينات إضافية ليتم اكتشاف قد تتوافق إلى حد ما البديل الظواهر BBS مثل من لBBS محددة بدقة. ، في الواقع لمرضى BBS16 / SDCCAG8، أظهر الطفرات التحليل الوراثي، النمط الظاهري للمرة الأولى خروجا واضحا من النمط الظاهري BBS نموذجي مع غياب polydactyly ومظاهره الكلى منهجية وخطيرة (عادة موجودة في 30٪ فقط من المرضى BBS). 7 ، 8 اكتشافنا من ALMS1 الطفرات في ثلاثة مرضى يؤكد تداخل سريري كبير مع BBS. وأخيرا، لم نعثر على أي دليل على triallelism لدينا في فوج من المرضى BBS.
الموارد على شبكة الإنترنت

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس