عرض مشاركة واحدة
  #5  
قديم 11-23-2015, 08:11 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي فقدان بارديه-بيدل البروتينات يسبب متلازمة خلل في تعصيب الحسي المحيطي وظيفة

 

http://www.pnas.org/content/104/44/17524.full

ستقبال وتفسير المحفزات البيئية هو أمر حاسم لبقاء جميع الكائنات الحية. هنا، وتبين لنا أن الاجتثاث من BBS1 وBBS4، اثنين من الجينات الطافرة في متلازمة بارديه-بيدل وأن البروتينات ترميز أن توطين بالقرب من centrioles من الخلايا العصبية الحسية، يؤدي إلى تغيرات في تعصيب الحسي SC والاتجار في TRPV1 قناة thermosensory وميكانيكية حسية قناة STOML3، مع ما يصاحب ذلك من العيوب في thermosensation الطرفية وmechanosensation. ولخص النمط الظاهري thermosensory في ايليجانس انواع معينة، لأن ردود thermosensory نقص المسوخ BBS اضح في كل من درجات الحرارة الفسيولوجية ومسبب للألم وخلل الاتجار OSM-9، وهو بروتين قناة الحسي polymodal وhomolog الوظيفي للTRPV1 أو TRPV4. وتشير النتائج التي توصلنا إليها وغير معترف بها حتى الآن، ولكن من الضروري، دور الثدييات بروتينات الجسم القاعدية في الحصول على المحفزات mechano- وthermosensory وتسليط الضوء على الميزات يحتمل السريرية للciliopathies في البشر.

كشفت دراسة الحواس في كل من الفقاريات واللافقاريات دور للأهداب في chemosensation، mechanosensation، وphotosensation. في ذبابة الفاكهة، chemosensation وmechanosensation تعتمد بشكل خاص على الخلايا العصبية التي مهدبة (1). وبالمثل، راسخة دور للأهداب في chemosensation في ايليجانس انواع معينة، حيث المسوخ مع وظيفة للخطر أو هيكل من العيوب عرض أهداب في الاستشعار عن عطر أو الاختلافات في الأسمولية (+2 - 4). في الثدييات، مستقبلات الرائحة توطين لأهداب الشم (5)، وأجهزة phototransduction الخلايا قضيب ومخروط في الفقاريات يموضع إلى الجزء الخارجي، وهدب المعدلة (6). وأخيرا، فإن الهدب المحرك شرط أساسي للتنمية القوقعة، وبالتالي السمع بسبب دورها في stereociliary التشكل حزمة (7).
نحن وغيرنا قد أظهرت أن الخسارة من وظيفة الطفرات في الجينات الكامنة وراء عديد المظاهر بارديه-بيدل النمط الظاهري (8) تسبب العجز الحسية التي تشمل فقدان الرؤية، الشم، السمع ومعيب (5، 10). جميع البروتينات BBS تتسم حتى الآن توطين بالقرب أو داخل الهيئات القاعدية وأهداب في كل خلايا الثدييات (11 - 13) وفي C. ايليجانس الخلايا العصبية الحسية (+14 - 16).
هنا، وتبين لنا أن الثدييات الخلايا العصبية الحسية المحيطية ومهدبة وأن المسوخ الماوس مع المستهدفة الخسارة من وظيفة الطفرات في أي Bbs1 أو Bbs4 المعرض thermosensory الظواهر التي تتميز زيادات كبيرة في الإختفاء استجابة سلوكية. من غير المرجح أن يكون سبب العليا القشرية أو اختلال وظيفي محرك هذه العيوب ولكن ترافقها تغيرات في تعصيب الحسي الجلدي وخلل توزيع الجزيئات المستجيب في سوما الخلايا العصبية الحسية. هذه الظواهر ليست فريدة من نوعها للثدييات، لأن BBS الخيطية المسوخ هي أيضا thermosensory معيب. وأخيرا، والبشر مع BBS أيضا البيان بعض أعراض مشابهة لتلك التي لوحظت في الفئران، مثل انخفاض درجة الحرارة والاهتزاز الإحساس. وتشير دراساتنا دورا حاسما من الجسم الهدبي والقاعدية البروتينات عن وظيفة الثدييات الخلايا العصبية الحسية الطرفية وتنبيغ كفاءة من المحفزات extraorganismal.
النتائج

الظهرية جذر العقد هي مهدبة.

في الثدييات، وقد لوحظ أهداب الابتدائي في معظم الخلايا تالية للتفتل. ومع ذلك، فإنها لم يتم الإبلاغ عنها في الخلايا العصبية الحسية الطرفية. وبالنظر إلى أن أهداب الابتدائية أداء المهام الحيوية في الخلايا العصبية الحسية اللافقارية، ونحن التحقيق ما إذا كانت هذه الخلايا يمكن أيضا المهدبة في الثدييات. تلطيخ العقد الجذرية الظهرية (DRG) المقاطع مع الأجسام المضادة ضد IFT88 البروتين axonemal (بولاريس) (17 اقترح) وجود أهداب (لا تظهر البيانات)، الذي كان مدعوما من جراء انتقال المجهر الإلكتروني (الشكل 1 A، F، وG). لتحقيق هذا الاحتمال أكثر شمولا، وخصوصا بسبب أقسام DRG تحتوي على السكان غير متجانسة من أنواع الخلايا، ونحن مثقف الخلايا العصبية DRG من الفئران البالغة WT وخلايا ملطخة أجسام مضادة ضد سلسلة من البروتينات axonemal المعروفة ومكافحة NeuN لتمييز الخلايا العصبية من أنواع الخلايا الأخرى . لاحظنا تلطيخ محددة على طول أهداب الخلايا العصبية لIFT88 (الشكل 1 B)، وكذلك IFT57 (لا تظهر البيانات). لنؤكد أيضا أن هذه ليست قطعة أثرية عبر التفاعل، ونحن transfected الثقافات DRG مع ترميز البلازميد و(V5) البروتين الموسومة حاتمة axonemal، IFT81 (18). Costaining مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للV5، وكذلك المرتبطة أنيبيب بروتين 2 (MAP2؛ الشكل 1 C)، علامة الجذعية العصبية، أيد كذلك وجود هدب على سوما الخلايا العصبية DRG.

تين. 1.
الخلايا العصبية DRG لها أهداب الابتدائي. (A،G و) الفئران DRGs الموافق قطني المناطق تم تشريح L3-L5 وتعرض لالمجهر الإلكتروني. التكبير، × 60000 (يسار)؛ × 8000 (مركز)؛ × 15000 (يمين). كانت تزرع (B و C) DRGs الفئران فصل، في الثقافة لمدة 3-7 أيام، تليها مناعية باستخدام علامة النقل intraflagellar بولاريس (IFT88) (B) جنبا إلى جنب مع علامة العصبية NeuN. كانت ملطخة A 72-ح ترنسفكأيشن من IFT81 الموسومة ب V5 أيضا مع الأجسام المضادة لمكافحة V5 وMAP2 (C)، علامة الجذعية. تشير الأسهم الصفراء للأهداب. عرض (أقحم) التكبير من هدب تلطيخ الخلايا العصبية. (D و E) سيتولوجية مناعية من الخلايا العصبية DRG مثقف مع الأجسام المضادة ضد BBS1 (D) وBBS4 (E)، costained مع علامة العصبية NeuN. السهام الخضراء تشير إلى إيجابي توطين الجسم القاعدية.
الفئران BBS المسخ وقد حراري وميكانيكية حسية المعيبة الظواهر.

وقد ارتبطت طفرات فارغة في البروتينات BBS مع عيوب وظيفية، ولكن ليس الهيكلية، من هدب سواء بصورة مباشرة، كما يتضح من تنكس الشبكية (9، 10) والشم (5)، وبشكل غير مباشر، من خلال نقل عيب محتمل للإشارة WNT (7). لذا تساءلنا عما إذا كان وجود أهداب في الخلايا العصبية الحسية التي يعصب الجلد قد تؤكد أخرى، تأخذ حقها حتى الآن، والعجز الحسي في المسوخ ciliopathy.
أولا، لإقامة وجود هدب في DRGs من BBS فئرانا معدلة وراثيا، أجرينا مناعية على DRGs فصلها نمت في الثقافة التي تم الحصول عليها من Bbs1 - / - وBbs4 - / - الفئران. Costaining مع أي أدينيليل محلقة 3 (AC3) أو أظهر IFT88 وNeuN أهداب العادي بشكل صارخ في كل من سلالات متحولة [المعلومات الداعمة (SI) الشكل. 6 A]، في حين أن توزيع γ تويولين كان تمييزه عن الضوابط WT، مما يشير إلى أن العمارة الإجمالية من الجسم القاعدية هي أيضا طبيعية (SI الشكل 6 B). ثم لإنشاء توزيع البروتينات في الخلايا العصبية DRG BBS، أجرينا مناعية على DRGs فصلها من فئران بالغة. والجدير بالذكر أن هذه الخلايا العصبية تبدي الهيئات القاعدية التي هي منفصلة مكانيا من centrosomes، وكما يتضح من تلطيخ مع MAP-2 و γ تويولين (19) (SI الشكل 6 B)، وهو نمط تذكرنا IMCD3 خلايا القناة جمع الكلوي (11) ربما كان هذا هو انعكاس للدولة تالية للتفتل الاستقطاب من هذه الخلايا. وكان توزيع البروتينات BBS في WT أيضا مطابقة للأنماط المحددة سابقا في هذه الخلايا (+11 - 13)، مع كل من BBS1 وBBS4 توطين بالقرب centrosomal منفصلة أزواج (محيط بالمريكز أو مريكزي) من النقاط في كل عصبون (الشكل 1 D وE).
ونظرا لهذه الملاحظات، أجرينا فحوصات السلوكية على Bbs1 - / - الفئران كوسيلة أولية لاستكشاف دور (ق) من هذه البروتينات في وظيفة الخلايا العصبية الحسية. وكان أول اختبار الغمر فحص الذيل، الذي قمنا بقياس الكمون الانسحاب ذيل عبر مجموعة من درجات الحرارة. في مجموعة من التجارب أجريت في ثلاث نسخ والطرف عن التركيب الوراثي، وجدنا أن Bbs1 - / - كان المسوخ يعد الإختفاء مقارنة مع تتزاحم WT، مما يشير إلى أن هذا المسخ كان له المعيبة، ولكن لا تضيع والاستجابة thermosensory (الشكل 2. أ) .

تين. 2.
Bbs1 - / - الفئران لها ردود ناقصة للمؤثرات الحرارية والميكانيكية وكذلك تقليل نقل الإشارة إلى الحبل الشوكي ردا على التحفيز الحراري. (A) نتائج من فحص ذيل الغمر التي المستمر التحفيز في 46 ° C، +48 ° C، 50 درجة مئوية، أو 52 ° C يطبق، ويتم تسجيل الوقت للرد. عموما، Bbs1 - / - فى الحيوانات الإختفاء أكبر من نظرائهم WT. (ب) فحص فون فراي على Bbs1 - / - أظهرت الفئران قدرا أكبر من القوة اللازمة للحث على الاستجابة الميكانيكية مقارنة مع WT. (C) أقسام التمثيلية للL3 / L4 / L5 الظهرية منطقة القرن Bbs1 + / + وBbs1 - / - الفئران ملطخة المضادة للج-FOS بعد التحفيز من واحد مخلب هند في 48 ° C أو 52 ° C حمام الماء . (D) قطعة أرض لعدد من ج-فو نوى -positive في القرن الظهري المماثل مقابل القرن الظهري المقابل بعد التحفيز من واحد مخلب هند في 48 ° C أو 52 ° C حمام الماء = 4 الفئران في التركيب الوراثي). (التكبير، × 10).

تساءلنا المقبل ما إذا كانت هذه المسوخ قد يكون أيضا العيوب الحسية الأخرى. وبالتالي فإننا اختبار لنقص محتمل في mechanoception مع اختبار فون فراي، الذي وكميا الحواس من حيث استجابة لضغوط عبر مجموعة من القوى الميكانيكية التطبيقية. وجدنا أن Bbs1 - / - فى الحيوانات عتبة استجابة انخفضت إلى نقط المحفزات تطبيقها على قوات أقل مقارنة مع الفئران WT (الشكل 2 B). الأهم من ذلك، لم يكونوا على thermosensory ولا الظواهر ميكانيكية حسية فريدة من نوعها لBbs1 - / - الفئران، لأن التحاليل متطابقة من Bbs4 - / - كشفت المسوخ نفس العيوب (لا تظهر البيانات).
لتفسير هذه الظواهر، رأيناها ثلاثة احتمالات: أن الحيوانات كانت الاستجابات الحركية المعيبة، أن الحيوانات قد يثير الشبهة أعلى وظيفة القشرية وبالتالي فقد تحدت لتفسير الإشارات الحسية. أو أن العيب نشأ في تعصيب لها الطرفية. كما استبعدت الاحتمال الأول عن طريق اختبار التنسيق الحركي مع rotarod متسارع. على الرغم من أن بعض المسوخ BBS كانت أثقل من تتزاحم WT، وعدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين Bbs1 - / - الفئران وWT عبر أربع التجارب التي أجريت أعمى إلى التركيب الوراثي (P = 0.13؛ SI الشكل 7.).
المقبل، للتمييز بين العيوب الطرفية وتشوهات في أعلى وظيفة القشرية، درسنا قراءات thermosensory دون مستوى الدماغ، وهي الاستقراء أثار حرارة فوري الجيني المبكر ج-فو في الدرجة الثانية الخلايا العصبية الحسية من النخاع الشوكي القرن الظهري (20). A تخفيض يسببها حراريا ج-فو في القرن الظهري، كما تم قياسها عن طريق حساب عدد من نوى ج-فو-إيجابية، تشير إلى أن وجود خلل ما لا يقل يحدث في تعصيب الطرفية أو تفعيل الخلايا العصبية من الدرجة الثانية. إذا يبقى ج-فو الاستقراء العادي في القرن الظهري، ثم عيب يمكن أن تحدث في مراكز المعالجة CNS أعلى (20). نحن حفز مخلب واحد من ثلاثة المسوخ وثلاثة تتزاحم WT إما في 48 ° C أو 52 ° C وكميا النووي التعبير ج-فو في القرن الظهري المماثل عبر المقاطع المسلسل الى منطقة أسفل الظهر (L3-L5)، أعمى إلى التركيب الوراثي. وعلى النقيض من تفعيل قوي من الظهرية الخلايا العصبية قرن في الحيوانات WT تتعرض ل48 ° C التحفيز، لاحظنا تفعيل ضئيلة أو معدومة من ج-فو في الخلايا العصبية القرن الظهري المسوخ Bbs1 "في نفس درجة الحرارة (الشكل 2 C و D). ظلت استجابة من المسوخ والحيوانات WT مختلفة إلى حد كبير عند 52 ° C، على الرغم من درجة الحرارة هذه، المسوخ تظهر بعض الاستجابة، مما يشير إلى وجود الشذوذ الحسي المحيطي.
العيوب التشريحية في التعصيب الشوري في الفئران BBS المسخ.

لتحديد ما إذا كانت التغيرات في الغدد العرقية الطرفية قد تساهم في العجز الحسي المرصودة، قمنا بتحليل المشعر هند مخلب (GHP) أقسام الجلد immunolabeled لPGP 9.5، علامة panneuronal، وCGRP، علامة من تعصيب ببتيدي المفعول (الشكل 3، SI الجدول 2 ). وكشف التحليل النوعي تخفيضات في CGRP مناعية (IR) بين ألياف داخل الجلد الحلمية كل المسوخ BBS (الشكل 3 أ و ب). كريات ميسنر، التي تعبر عادة عن انخفاض مستويات CGRP-IR (21)، لم تتأثر بشكل ملحوظ. تم تغيير توزيع النهايات الحسية داخل البشرة وحجم الجلد الحلمية أيضا في كل من المسوخ BBS. في منصات WT، تعصيب لديه توزيع موحد نسبيا في جميع أنحاء البشرة بينما في المسوخ BBS، فهي تتركز بشكل غير متناسب في الجلد الحليمات (الشكل 3 C). الكمي التي أجريت على GHP الأنسجة المسمى لPGP 9.5 والفأر مكافحة Cy2 لترسيم الحدود بين الجلد ابيديرمي epidermal أكد أن كلا من المسوخ BBS زادت النهايات الحسية أعلاه وعلى الحدود بين الحليمات، والتي كانت أيضا أوسع من WT (الشكل 3 F وH). لم يتم تغيير كثافة البشرة إنهاء الشاملة عبر لوحة بالكامل انخفض بدرجة كبيرة في أي من المسوخ BBS.

تين. 3.
الاختلافات في بنية البشرة والغدد العرقية في BBS - / - الفئران. (A و B) صور منصات البعيدة من الكفوف الخلفيتين المشعر تظهر CGRP (الحمراء) مع PGP (الأخضر) (A) وCGRP (B) immunolabeling وحده BBS - / - قد الحيوانات خفضت مناعية CGRP في الألياف العصبية داخل الجلد الحليمات ( الأسهم الصفراء)، في حين لم تكن هناك اختلافات واضحة في نسبة-CGRP إيجابي النهايات البشرة (النجوم الصفراء). الأسهم الخضراء والنجوم تشير ألياف الجلد العصبي PGP الإيجابي والنهايات البشرة، على التوالي. يشار إلى الحدود البشرة الجلدية خط متقطع. (C) الصور من منصات البعيدة من WT وBBS - / - الفئران المسمى لPGP 9.5. ومتباعدة تعصيب بالتساوي في جميع أنحاء البشرة لوحة WT ولكنها تتركز في الحليمات الجلدية في المسوخ BBS. (D) عن قرب من منطقة لوحة البعيدة اختيارها يدل على تصنيف شخصي من النهايات الحسية على أساس موقفهم في البشرة قريبة الحليمات الجلدية (بين أعلاه، أو على الحدود بين حليمة). وصفت النهايات التي تغطي مناطق متعددة في كل منطقة مروا من خلال (على سبيل المثال، النهايات interpapilla الحدود). (E) صور منصات البعيدة المسمى مع مكافحة فأر Cy2 لترسيم الحدود بين الجلد ابيديرمي epidermal تبين أن المسوخ BBS لها كبير، شوه الحليمات الجلدية (السهام البيضاء). الحليمات (خطوط بيضاء صلبة) والأمثلة على المناطق تحديدها بشكل غير موضوعي أعلاه (تبددت خطوط بيضاء) وعلى الحدود بين حليمة (منقط خطوط بيضاء) وتتبع. (F-H) الكمي لتعصيب البشرة وهيكل حليمة الجلد أجريت على أقسام الأنسجة المسمى مع PGP 9.5 والفأر مكافحة Cy2. (F) كل BBS - / - المسوخ كان أكثر بكثير النهايات أعلاه وعلى الحدود بين الحليمات مقارنة مع WT، وBbs1 - / - الفئران كان أكثر بكثير مجموع النهايات الحليمات من Bbs4 - / - الفئران. وبلغ مجموع النهايات الحليمات مجموع كل النهايات التي مرت عبر المناطق المذكورة أعلاه أو على الحدود بين الحليمات. (G) Bbs1 - / - زيارتها الفئران كثافة أكبر بكثير من النهايات فوق الحلمية الخاصة بهم، وBbs4 - / - زيارتها الفئران أقل بكثير النهايات بين الحليمات بهم، مشيرا إلى أن عددا أكبر من النهايات المرتبطة الحليمات في هذه الحيوانات لم يكن بسبب مجرد التغيرات في حجم الحليمات. لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية لإنهاء الكثافة خارج المنطقة الحلمية (من بداية ونهاية لوحة لحليمة الأولى) أو على لوحة كاملة. حسبت البشرة الكثافة إنهاء بقسمة عدد من النهايات في المنطقة من خلال طوله. كان المسوخ (H) كل من BBS لفترة أطول كثيرا الحليمات الاعراض لكن ليس المرتفعات. وقد تم قياس ارتفاع حليمة من قاعدتها المقدرة على الارتفاع ذروته في البشرة، وحسبت عرض بتقسيم منطقة الحليمة التي كتبها ذروتها. موانئ دبي، حليمة الجلد، سان جرمان، الغدد العرقية. ه، البشرة. د، الأدمة.
C. ايليجانس BBS المسوخ هل Thermosensory المعيبة.

على الرغم من أن البيانات الثدييات دينا أنشأت الظواهر thermodefective عن المسوخ لدينا، تعصيب الثدييات معقدة بطبيعتها، ويمكن أن الظواهر الحسية تكون متغيرة. علاوة على ذلك، الخلايا العصبية الحسية الثدييات أيضا التفاعلات المعقدة مع أنواع الخلايا الأخرى التي مهدبة أيضا، مثل خلايا شوان والخلايا الكيراتينية (22، 23). لهذه الأسباب، لجأنا إلى كائن مهدبة بساطة، C. ايليجانس، حيث يمكننا أن التحقيق في عواقب القاعدية ضعف الجسم / الهدبية في thermosensory استجابة حصرا في الخلايا العصبية الحسية المهدبة.
لاختبار الدور المحتمل للC. البروتينات ايليجانس BBS في thermosensation، ونحن أول مقارنة سلوك اثنين وصفت سابقا BBS المسوخ (14)، (المعروف أيضا باسم OSM-12) BBS-7 و BBS-8، مع أن من نظرائهم WT في مقايسة تكيف حراري (24) . عند وضعه على التدرج الحراري الطولي الضحلة تتراوح ما بين 18.5 درجة مئوية إلى 21.5 درجة مئوية (في 8 سم)، انتقلت الحيوانات WT بشكل فعال في درجة الحرارة تربية الخاصة من 20 درجة مئوية خلال مدة 1 ساعة (الشكل 4 A). على النقيض من ذلك، BBS-7 و BBS-8 المسوخ عرض عيوب كبيرة إحصائيا (P <0.00001) في تكيف حراري لمنطقة C 20 ° (الشكل 4 A). وقد أجريت على عدد متساو من تكيف حراري فحوصات عن طريق وضع الحيوانات على الجانب الساخن أو البارد من بلاطة آغار، وضمنا النتائج التي المسوخ الهدبية كانت معيبة في thermosensation العام، تبين عدم وجود تفضيل لدرجات حرارة دافئة أو باردة. لا يمكن أن يعزى هذا النمط الظاهري لالحركي العيوب، لأن عرض حركة الحيوانات متحولة (أي الانحناءات في الدقيقة) لا يمكن تمييزها من WT (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت BBS-7 و BBS-8 سلالات متحولة انقاذ مع الجينات WT كل منها استعادة تكيف حراري السلوكيات (الشكل 4. A؛ BBS-7 الإنقاذ = 0.5307 ± 0.073؛ BBS-8 الإنقاذ = 0.4925 ± 0.063). الأهم من ذلك، وهذه العيوب لا يقتصر على المسوخ BBS، لأن المسوخ الهدبية الأخرى، بما في ذلك OSM-5، والتي بترميز ortholog من IFT52 (25)، وOSM-3، الذي يشفر كينيسين homodimeric اللازمة لبناء الجزء الأعلى من C . ايليجانس أهداب (26)، عرض أيضا تكيف حراري العيوب (P <0.00001) التي كانت قابلة للمقارنة مع تلك التي BBS المسوخ (الشكل 4 A). أيضا من الفائدة، كان التشكل العام للتزيين زغيبات AFD thermosensory الخلايا العصبية هدب سليمة، مما يوحي بأن العيوب فقط في هدب الأساسي تسببت في النمط الظاهري (لا تظهر البيانات).

تين. 4.
C. ايليجانس تظهر طفرات الهدبية تكيف حراري والعيوب تجنب الحرارية وكذلك mislocalized OSM-9. (A) تكيف حراري وتجنب الحراري للWT (N2)، BBS المسوخ، وOSM-3 كينيسين المسوخ. تكيف حراري يتصل جيدا كيف تتحرك الديدان لمن منطقة درجة الحرارة تربية (20 ° C). (B) تجنب Nonthermal هي نسبة الديدان التي لا تجنب درجات الحرارة الضارة قدم بالقرب من رأس الحيوان. لA و B، *، P <0.00001. (C) GFP الموسومة OSM-9 mislocalizes في BBS-8 الحيوانات متحولة. TZ، منطقة انتقالية / الجسم القاعدية. *، تراكمات غير طبيعية لم تشهدها من النوع البري الحيوانات.

المقبل، لاختبار ما إذا كانت العيوب thermosensory تمتد إلى درجات الحرارة الضارة، أجرينا فحص تجنب الحراري، والتي تم قياس استجابة الديدان الفردية إلى درجة حرارة مسبب للألم (≈50 ° C) وضعها مباشرة في مسار حركتهم قرب رؤوسهم ( 27). الحيوانات WT (ن> 400) تتوقف حركتها إلى الأمام وبدء متميزة، عكس انعكاسية استنساخه في 94.9٪ من الحالات (الشكل 4. انظر أيضا المرجع 27). على النقيض من ذلك، BBS-7 و BBS-8 المسوخ (ن> 400) على حد سواء أظهر الظواهر تجنب الفقيرة (P <0.00001)، مع تجنب الاستجابات المناسبة لوحظ في فقط 73.1٪ و 73.3٪ من الحالات، على التوالي. وبالمثل، عرض على OSM-3 وOSM-5 المسوخ تجنب في 78.3٪ و 73.4٪ من الحالات (P <0.00001)، على التوالي (الشكل 4 A). للتأكد من أن الظواهر التي تعاني من نقص الحرارية على وجه التحديد بسبب طفرات في BBS، أكدنا أن BBS-7 و BBS-8 المسوخ التعبير عن الجينات المحورة WT كانوا قد الردود تجنب الحرارية مقارنة مع تلك الحيوانات WT (BBS-7 الإنقاذ = 95.0٪ ± 3.2 ٪، BBS-8 الإنقاذ = 94.5٪ ± 0.4٪، الشكل 4 B).
سعينا المقبل لمواصلة التحقيق الأساس الكيميائي الحيوي لهذا النمط الظاهري. وكان أحد الاحتمالات أن وظيفة الهدبية المعيبة قد التشويش على حركة الجزيئات المستجيب، منها مستقبلات TRP سيمثل المرشحين المثالي. ولذلك درسنا حركة OSM-9 في المسوخ لدينا. لأنه لا يوجد C. وحتى الآن تم ربط قناة ايليجانس TRP خصيصا لthermosensation، ركزنا على OSM-9، وهو بروتين axonemal يعرف ما هو مطلوب لالكيميائي ويمثل homolog الوظيفي المحتمل للTRPV1 الثدييات أو TRPV4 (28، 29). وجدنا أن إصدار GFP الموسومة من OSM-9، والذي يموضع بشكل صحيح إلى الخيط المحوري الهدبية في الحيوانات WT، يظهر mislocalization متغير ولكن ثابت في خلفية BBS متحولة. على وجه التحديد، عرض BBS-8 الحيوانات تراكمات / mislocalization لم أر في الحيوانات WT أو في BBS-8 الحيوانات الإنقاذ، على طول التغصنات، داخل أو على مقربة من الجسم القاعدية، وعلى طول الخيط المحوري الهدبية (الشكل 4 C). على الرغم من أن OSM-9 ليس C. ايليجانس thermosensory مستقبلات في حد ذاته، وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن التفسير الجزيئي واحدة على الأقل في النمط الظاهري thermosensory هو أن جهاز thermosensory القائم على هدب (على سبيل المثال، TRP-نوع مستقبلات) mislocalizes أو غير فعال عندما تتعطل BBS ظيفة البروتين.
عيب توزيع مستقبلات الخلايا العصبية في الفئران DRG.

على الرغم من أن تشريح C. ايليجانس الخلايا العصبية الحسية تختلف بشكل ملحوظ عن تلك الخلايا العصبية الحسية الطرفية في الثدييات (لأسباب ليس أقلها الموقف من هدب النسبي لموقع المدخلات الحسية)، أثارت بيانات دينا إمكانية المتميزة التي mistrafficking أو misregulation من حراري والبروتينات قناة ميكانيكية حسية قد تسهم في الظواهر التي لوحظت في الماوس. لدراسة هذا الاحتمال، ركزنا على TRPV1 مستقبلات الثدييات، ينشط في نطاق حيث لوحظ أن النمط الظاهري في المقام الأول (30) وSTOML3، وهو بروتين مثل stomatin أن ثبت مؤخرا أنها ضرورية لmechanosensation (31)، والتي لقد وجدنا سابقا أن mislocalized في الظهارة الشمية من BBS المسوخ الماوس (5).
نحن تقييمها أولا توزيع TRPV1 في أقسام GHP من كل بلد من بلداننا المسوخ وتتزاحم WT. نحن لم نلاحظ أي اختلافات ملحوظة بين تلطيخ النهايات (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، عند اختبار مقصورة آخر من هذه الخلايا العصبية، ونحن لم نلاحظ تغير TRPV1 مناعية في سوما على النحو الذي يحدده التهديف أعمى من أقسام متتالية عبر DRG. أربعة من ستة Bbs1 - / - الحيوانات قد الاكتئاب إشارة TRPV1 كما تقرره متوسط ​​كثافة الخلايا العصبية الملون بشكل إيجابي، في حين أن Bbs4 - / - أظهرت الحيوانات زيادة في كثافة-TRPV1 إيجابي somata (SI الشكل 8 A و B.). كان هذا يذكرنا العيوب وحظ سابقا من الخلايا العصبية الشمية، حيث Bbs1 - / - وBbs4 - / - أظهرت الحيوانات الظواهر الخلوية متناقضة، وكلاهما توج في نفس الخلل الوظيفي (32). نحن لا نعرف ما إذا كان هذا الاكتشاف يعكس مواصفات العصبية غير الطبيعية (يحتمل أن تكون نتيجة لهدب عيب) أو ما إذا كان أقلقت الاتجار مستقبلات.
وجدنا اضطرابات مماثلة في توزيع STOML3. في حين تم الكشف عن كميات متواضعة في السيتوبلازم (وربما غشاء البلازما) من الخلايا في الفروع عبر DRG في الحيوانات WT، لاحظنا وضوحا تراكم STOML3 في نوى على حد سواء Bbs1 - / - وBbs4 - / - الحيوانات (الشكل 5 )، والتنبؤية توزيع عيب ميكانيكية حسية.

تين. 5.
توزيع STOML3 في الخلايا العصبية DRG. وعلى النقيض من الحيوانات WT، وزعزع STOML3 تلطيخ في المسوخ BBS، حيث يبدو أن mistrafficked إلى النواة. الصور هي في التكبير، × 40.
العيوب الحسية في BBS المرضى.

إنشاء thermosensory المعيبة / ردود مسبب للألم في الجسم الهدبي والقاعدية المسوخ في الماوس وC. أثار ايليجانس إمكانية واضحة أن المرضى BBS قد أيضا يحمل أوجه القصور الحسية غير معروف حتى الآن. لاختبار هذه الفرضية مباشرة، قمنا بتعيين تسعة مرضى BBS لا علاقة لها فوق سن ال 17، وبناء على موافقة مستنيرة، يعاير عليهم سبع لطرائق الحسية باستخدام اختبار عصبي القياسية. كان جميع المرضى تناقص ملحوظ في قدرتها على كشف الاهتزاز عندما تم تطبيق الشوكة إلى اللقم الإنسي والجانبية على ظهر المعصم وكل عرض الفقراء التمييز بفارق نقطتين على النخيل وظهر اليد. سبعة من التسعة (78٪) لديهم الحس العميق تضاءلت (الشعور موقف مشترك)، وأربعة من تسعة (44٪) قد تضاءلت حساسية درجة الحرارة، وسبعة من تسعة (78٪) لم يتمكنوا من تحديد دقيق لوزن أو شكل الجسم وضعها في كف (الجدول 1).

الجدول 1.
الظواهر الحسية في المرضى الذين لا علاقة BBS

نقاش

هنا، لقد أظهرنا أن somata من الخلايا العصبية الحسية الثدييات ومهدبة وأن الخسارة من وظيفة الطفرات في الهدبية والبروتينات الجسم القاعدية تؤثر على وظيفة هذه الخلايا، التي تترجم إلى عيوب في تصور thermosensation في الماوس، واسعة الظواهر الحسية لدى البشر. على حد علمنا، هذا الارتباط في الثدييات بين الجسم القاعدية / البروتينات الهدبية وthermosensation هي غير المبلغ عنها سابقا، ويحتمل أن تكون لها آثار كبيرة على فهمنا لتطور وظيفة الخلايا العصبية الحسية الطرفية.
على الرغم من أن الأساس الخلوي الدقيق لهذا النمط الظاهري سوف تحتاج إلى مزيد من التحقيق، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن اضطراب الجسم القاعدية يمكن ربما يؤدي إلى mislocalization يصاحب ذلك من TRPV1 وSTOML3 في العقد الجذرية الظهرية، ملمحا إلى أن الاتجار معيب والتعبير، أو توطين الخلوية من هذه القناة البروتينات، أو في الواقع مواصفات العصبية، قد تساهم في الظواهر المرصودة. اكتشافنا أن C. ايليجانس OSM-9 جزئيا mislocalizes في BBS المسوخ تدعم هذه الفرضية. يتسق أيضا مع نموذج النقل، وأشارت بيانات حديثة أن PKD2 heterodimerizes مع واحد على الأقل من قنوات thermoTRP، TRPV4، ويبدو أن هناك حاجة لوظيفة الصحيحة لها (M. Köttgen وG. والز، اتصال شخصي)، وتقدم ميكانيكي الصلة بين البروتينات الهدبية والعجز thermosensory. ومع ذلك، العيوب التخلق إضافية قد تسهم أيضا، كما يتضح من تعصيب الجلدي الشاذة من كل من المسوخ ciliopathy فحصها. تم ترجمة مستقبلات مثل SSTR3 و 5 HT6 لأهداب الابتدائي الخلايا العصبية في الدماغ (33، 34)، وعلى الرغم من أنها لم أظهر في DRG أهداب، وأعربت SSTR3 مرنا في الخلايا DRG (35). ومن الملاحظ أيضا أن بعض الناقلات العصبية ونيوروببتيد ويعتقد أن يصدر من سوما DRG (36، 37). أخذت معا، هذه الملاحظات تؤدي بنا إلى التكهن قد يكون متورطا أن أهداب DRG في العوامل الإنمائية الرئيسية الاستشعار، التي يمكن بدورها تنظيم توطين وظيفة تعصيب الحسي المحيطي.
في الوقت نفسه، فمن الممكن أن اختلال وظيفي الهدبي على الخلايا nonneuronal في محيط يمكن أن تسهم في هذه التغيرات في الغدد العرقية. على سبيل المثال، ومن المعروف أن الخلايا الكيراتينية أن مهدبة (22)، وكذلك خلايا شوان (23). وبالتالي يمكن لمزيج من العيوب الهدبية في كل من هذين النوعين من الخلايا يساهم في موقعنا thermosensory وحظ والظواهر ميكانيكية حسية. وبالتالي تكون هناك حاجة الاجتثاث المشروط من البروتينات الهدبية في الخلايا العصبية الحسية، طبقات الخلايا الكيراتينية منفصلة والخلايا الدبقية فضلا عن المسوخ الكبار محددة لتشريح المساهمة النسبية الزمانية المكانية لكل الأنسجة.
وأخيرا، تشير البيانات المتوفرة لدينا مريض BBS أن اضطراب الخلايا العصبية الحسية المحيطية قد لا تقتصر على thermosensation لكن قد عقد ينطبق أيضا على طرائق أخرى. وسيكون من المهم لتحديد مدى وطبيعة هذه العيوب، وما إذا كانت تقتصر على الجلد. في موازاة ذلك، فإنه من الأهمية بمكان لتحديد ما إذا كانت هذه الظواهر موجودة في متلازمات الهدبية أخرى. وقد أبرز الأعمال الأخيرة للciliopathies كمجموعة من الاضطرابات مع تداخل، وإن كان، الخصائص السريرية متغير مثل تنكس الشبكية وأمراض الكلى الكيسي، والشم (38). فمن المعقول أن نفترض أن العجز الحسي المحيطي قد تمثل بعد آخر، مكون underrecognized هذه الاضطرابات السريرية.

إجراءات تجريبية

الماوس السلوكية طرق التجريبية.

ذيل غمر الفحص.

تم مغمورة الثلث الأعلى من ذيل فأر في حمام الماء الساخن الذي عقد في 46 ° C، +48 ° C، 50 درجة مئوية، و 52 درجة مئوية. وكان مقدار الوقت اللازم لذيل الماوس للنقر على استجابة المسجلة. وضعت قطع مرات في كل درجة حرارة (1 دقيقة 46 ° C و 48 ° C، و 10 ثانية لمدة 50 ° C و 52 ° C) لمنع الضرر للحيوان. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت ثلاث تجارب في درجة الحرارة.

فون فراي الفحص.

وقد تأقلم الفئران لمدة 30 دقيقة على الأقل في غرف زجاجي قمة سلكية. تم تطبيق القوة الميكانيكية منقط إلى مخلب هند الصحيح باستخدام الإلكترونية فون فراي anesthesiometer (IITC، وودلاند هيلز، كاليفورنيا). كانت القوات التي انسحبت الحيوان مخلب الذي اتخذته ثلاث مرات حيث بلغ متوسط ​​الاستجابة. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت ثلاث تجارب.

فحص Rotarod.

وبدأ العمل في فترة التدريب حيث وضعت الفئران على rotarod تسريع (كولومبوس الآلات، كولومبوس، OH) بسرعة ثابتة من 4 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق متتالية. إذا سقط الماوس، وضعت مرة أخرى على rotarod حتى 5 دقائق قد انقضت. ثم سمح الفئران للراحة في أقفاصها الفردية لا يقل عن 1 ساعة. تم الفئران ثم توضع مرة أخرى على rotarod في سرعة التعجيل من 4-40 دورة في الدقيقة مع التسارع التدريجي الذي يحدث كل 30 ثانية. وسجلت الوقت اللازم للماوس لتسقط على rotarod كرد. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت أربع تجارب.

الماوس تشريحية طرق التجريبية.

Immunolabeling من الماوس GHP أقسام الأنسجة باستخدام مكافحة PGP 9.5 (1: 800؛ Ultraclone) ومكافحة CGRP (1: 400؛ حدة طرفية مختبرات)، الأجسام المضادة الأولية مع المضادة للأرنب اليكسا فلور 488 (1: 500؛ المسابر الجزيئية)، ومكافحة -guinea pig Cy3 (1:500; Jackson ImmunoResearch) secondary antibodies was conducted as previously described ( 21 ).من أجل ترسيم واضح البشرة من الأدمة، ومكافحة فأر Cy2 (1: 250؛ جاكسون InnumoResearch) تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية لتسمية المناعية الذاتية التي تتركز بشكل تفضيلي في الأدمة. كان إعداد الأنسجة من القرن الظهري DRG وفقا لبروتوكولات موحدة، كما تلطيخ وتقدير من الظواهر. للحصول على طرق مفصلة، ​​انظر طرق SI.

C. ايليجانس التحليلات.

جيل من الحيوانات والإنقاذ المعدلة وراثيا وكما وصفها (14). أجريت فحوصات السلوكية كما هو مفصل سابقا؛ لمزيد من التفاصيل التجريبية، انظر طرق SI.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس