تم التحقيق العوامل التي تسهم في خفض الناجم عن المغنيسيوم عمل الخلايا العصبية انفجار محتمل في زراعة الخلايا الحصين الابتدائية في ارتفاع وانخفاض كثافة الثقافة. في أبعاده صفر المتوسطة المغنيسيوم الخارجي، الخلايا العصبية الهرمية من ثقافات عالية الكثافة أنتجت العمل من تلقاء أنفسهم رشقات نارية المحتملة المتكررة فرضه على اللاإستقطابات depolarizations لفترات طويلة. قلصت هذه رشقات نارية جزئيا NMDA مستقبلات د -APV. وكشف التحليل الدوائي من مصغرة التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) 2 المكونات: واحدة حساسة للد -APV وآخر إلى أمبا مستقبلات DNQX. وكانت عناصر متميزة حركيا. وأيد مشاركة مستقبلات NMDA في خفض الأحداث متشابك التي يسببها المغنيسيوم توطين الوحيدات NR1 من مستقبلات NMDA مع قبل المشبكي الحويصلي بروتين synaptophysin. Presynaptically، يتسبب المغنيسيوم الصفر زيادة كبيرة في وتيرة EPSC يعزى على الأرجح إلى زيادة فرط الاستثارية العصبية الناجمة عن انخفاض غشاء تهمة سطح الفرز. وزاد محتوى كمي يعني إلى حد كبير في المغنيسيوم الصفر. لم الخلايا من الثقافات منخفض الكثافة لا يحمل العمل انفجار محتمل في المغنيسيوم الصفر ولكن زاد العرض فعلت تردد EPSC. كانت الخلايا العصبية منخفض الكثافة أقل المناعي synaptophysin ونقاط الاشتباك العصبي النشطة أقل على النحو الذي يحدده FM1-43 التحليل. وتبين هذه النتائج أن هناك عوامل متعددة في انفجار الشبكة. زيادة احتمال إطلاق سراح الارسال presynaptically، وتعزيز NMDA مستقبلات بوساطة استثارة postsynaptically، ومدى الترابط الخلايا العصبية يساهم في بدء وصيانة مرتفعة استثارة الشبكة.
وتوسط العصبي مثير سريع في قرن آمون المقام الأول الغلوتامات بناء على 3 أنواع من المستقبلات ionotropic اسمه لمنبهات المفضل لديهم: kainate، α-الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic حمض (أمبا)،
وN -methyl - د -aspartate (NMDA)
(Dingledine وآخرون 1990.). كل 3 أنواع من مستقبلات تتضمن القنوات الأيونية التي عند تفعيلها، تصبح الموجبة قابلة للاختراق. يتم الاحتفاظ مثير التفاعلات متشابك glutamatergic في المختبر في التحضيرات للشريحة الحصين
(بارفيت وماديسون 1993) والهرمية ثقافة الخلية. الثقافات العصبية قرن آمون إنشاء شبكات التهاب الأعصاب كثيفة مع جهات الاتصال متشابك متعددة
(بانكر وكوان 1977؛ فليتشر وآخرون 1991.؛ حوش وDingledine 1986؛ مولر وسيفرت 1982). وأعرب متزايد أمبا ومستقبلات NMDA والمترجمة إلى مواقع متشابك مع مرور الوقت
(Bekkers وستيفنز 1989؛ راو وآخرون 1998.). وقد عززت هذه الدراسات التشريحية التي كتبها النتائج الفسيولوجية سليمة وظيفيا التفاعلات متشابك مثير
(كامينغز وآخرون 1996.، ويلكوكس وآخرون 1994.).
على مدى عدة سنوات، أدى دراسة النواحي الفسيولوجية والمرضية للالعصبي glutamatergic في تطوير التقنيات التي يمكن التضمين مستوى استثارة التفاعلات متشابك. واحدة من هذه التقنية تنطوي على تلاعب من الأيونات ثنائية التكافؤ. وقد تم توثيق دور الكالسيوم في الافراج عن ناقل عصبي exocytotic جيدا (انظر
Poage لوMeriney 2002 لاستعراض حديث). وقد استخدمت انخفاض الكالسيوم خارج الخلية لسنوات عديدة بوصفها أداة موحدة لمنع انتقال متشابك. المغنيسيوم أيضا اتسم الآثار على التفاعلات متشابك. دودج وRahamimoff
(1967 أظهرت) أولا ان الافراج كمي عند تقاطع الضفدع العصبي العضلي انخفض بشكل حاد حيث ارتفع المغنيسيوم 2+ التركيز. في قرن آمون، وقد تم العثور على المغنيسيوم مرتفع للتخفيف أو إلغاء اللاإستقطابات depolarizations العصبية طويلة والعمل و synchonized رشقات نارية المحتملة رمزا للنشاط صرعي
(Schwartzkroin والأمير 1978). على العكس، والحد من المغنيسيوم أقل من المستويات الفسيولوجية تحرض على تعزيز excitabilty في كل شريحة الحصين
(والثر وآخرون 1986) والثقافات
(Sombati وديلورنزو 1995).
وقد يفترض آلية تخفيض تعزيز المغنيسيوم العصبي مثير يجب أن تكون متصلة الحصار أيونات 'الفسيولوجية للقنوات مستقبلات NMDA. منذ فترة طويلة من المسلم به أن يوفر المغنيسيوم الفسيولوجية والفراغية الحصار التي تعتمد على التيار الكهربائي من الأيونات الموجبة المسام قابلة للاختراق من المستقبلات NMDA وبالتالي يجعلها غير نشطة إلى حد كبير في إمكانات غشاء العادية
(Coan وCollingridge 1985؛ Collingridge وآخرون عام 1983.؛ Hablitz وLangmoen 1986؛ ماير ويستبروك 1984). وقد أثبتت العديد من الدراسات أن تزامن نشاط الخلايا العصبية عفوية الناجم عن القضاء على المغنيسيوم خارج الخلية يتم تخفيض أو إلغاء من قبل NMDA مستقبلات
(Albowitz وآخرون 1997.؛ Coan وCollingridge 1987؛ Collingridge وآخرون 1988؛.
Gulyas-كوفاتش وآخرون 2002.؛ جوتيريز وآخرون آل 1999.؛ تانكريدي وآخرون 1990.). وأشارت هذه الدراسات أن زيادة excitabilty الناجم عن انخفاض المغنيسيوم في المقام الأول ظاهرة بعد المشبكي، والناجمة عن زيادة تدفق depolarizing الأيونات، معظمهم من الكالسيوم من خلال قنوات مستقبلات NMDA.
وأشارت دراسات أخرى آليات مثير الإضافية المرتبطة تخفيض المغنيسيوم خارج الخلية. انخفاض المغنيسيوم (مقابل إزالة) يسببها الردود مثير المعزز في المنطقة CA1 من الحصين التي لم تنقضها NMDA مستقبلات
(هامون وآخرون 1987). دراسة متأنية من قبل مودي وزملاؤه
(1987 اقترحت) أن الحد من المغنيسيوم قد ينتج انخفاض في الحقل الكهربائي عبر الغشاء الخلايا العصبية التي كتبها انخفاض سطح تهمة التسبب في فحص ما هو، في جوهره، وهو الاستقطاب الغشاء.
ومع ذلك، فقد أشارت دراسات النمذجة في الحصين أن استثارة المعززة، رغم أنه ضروري، ليس كافيا لحدوث انفجار في شبكة من الخلايا العصبية الهرمية. أظهرت محاكاة شبكة نموذجية من انفجار الحصين الذي يمكن أن يحدث انفجار، حتى في وجود تثبيط الخلايا العصبية، إلا إذا الاتصال بين الخلايا العصبية في الدائرة كثيفة على نحو كاف. الربط المنخفض يمنع تطوير انفجار (تروب وآخرون
1984، 1987).
وقد استخدمنا تقنيات الكهربية وimmunocytochemical لدراسة العوامل التي تؤثر في انخفاض انفجار الناجم عن المغنيسيوم في شبكات مثقف الخلايا العصبية الهرمية قرن آمون. على وجه التحديد، سعينا إلى تحديد مساهمات العمليات قبل المشبكي وبعد المشبكي لتعزيز استثارة الشبكة واختبار الفرضيات نموذج يحركها الربط الكافي اللازم لانفجار متزامن.
وجاءت معاملة الحيوانات المبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة فيرجينيا للعلوم الصحية مركز البحوث الحيوانية اللجنة. تم بذل كل الجهود للحد من التوتر الحيوان وعدم الراحة.
ثقافات الحصين
تم إعداد الخلايا العصبية cocultures الحصين / الدبقية وفقا لطريقة Goslin وآخرون. (1998). وكانت الخلايا العصبية والخلايا الدبقية مثقف على ثم الجمع بين الأسطح منفصلة لتشكيل الأنسجة الثقافة "ساندويتش". يسمح هذا النهج إعداد كثافة منخفضة نسبيا الثقافات قرن آمون في حين لا يزال يسمح بالوصول من الخلايا العصبية الحصين للمواد عصبية المشتقة من الخلايا الدبقية. ويلخص كل جزء من التحضير.
إعداد coverslips
وضعت في حامض النيتريك 10٪ لل≥18 ح؛ coverslips FisherBrand (25 ملم 12-545-86-1D). وثم تشطف Coverslips في 6 تغييرات من الماء المقطر (20 دقيقة لكل شطف) وتعقيمها مع الحرارة الجافة (225 درجة لمدة 6 ساعات). بعد التبريد، والمغلفة coverslips مع بولي ل -lysine (1 ملغ / مل في المخزن بورات)، وضعت في 37 درجة الحاضنة بين عشية وضحاها، ثم تشطف مرتين بالماء المقطر المعقم (30 دقيقة لكل منهما شطف). وكانت Coverslips من الطبقات مع الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM)، بالإضافة إلى 10٪ مصل الحصان (HS: انظر Goslin آخرون للمكونات مفصلة) وضعت في 37 درجة الحاضنة. MEM جديدة / تم إضافة HS يوم من إجراء coculture (انظر النص التالي).
إعداد ثقافة الدبقية الأساسي
تم إعداد مزارع الخلايا الدبقية 10 أيام قبل coculturing مع الخلايا العصبية قرن آمون. قبل العزلة الدبقية، طبقت 3 قطرات من معقم، البارافين ذاب في القمم من مثلث متساوي الأضلاع في عدة العقيمة 60 ملم أطباق الأنسجة الثقافة. قدم البارافين التباعد الضروري للحفاظ لل coverslips التي تحتوي على الخلايا العصبية قرن آمون من الاتصال مباشرة الخلايا الدبقية خلال coculturing (انظر النص التالي). بدلا من ذلك، تم تقديم تباعد عن طريق خفض longitidinally تفلون O-خواتم (عرض 3 مم، 22 مم ID؛ أجزاء صغيرة، ميامي البحيرات، FL). في غطاء تدفق الصفحي، تم قطع رأس الأطفال حديثي الولادة الفئران الوليدة سبراغ داولي بعد وضعه على الجليد لمدة 2-3 دقيقة. أزيلت العقول في محلول ملحي متوازن الباردة HEPES مخزنة هانك (HEPES / HBSS). تم عزل نصفي الكرة المخية وإزالة السحايا. تمت إزالة الزائدة HEPES / HBSS والأنسجة المفروم ناعما كما ممكن مع مقص. وضعت الأنسجة في 12 مل HEPES جديدة / HBSS التي أضيفت 1.5 مل التربسين 2.5٪ و 1.5 مل الدناز (1٪). تم تحضين الأنسجة عند 37 درجة لمدة 15 دقيقة مع التحريك المستمر بطيئة السرعة. تم تمرير طاف من خلال معقمة شبكة من النايلون (215 م)، وتضعف مع حجم مساو من 10٪ HS في MEM. تم طرد تعليق خلية في 800-1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. ومعلق الكريات في 10 مل MEM / 10٪ HS. احصي الخلايا مع عدادة الكريات. كان العائد عموما 6 × 10 6 -1 × 10 7 خلايا في الدماغ. وكانت مخففة الخلايا لحوالي 30000 خلية / مل في 10٪ HS / MEM. وضعت 3 مل في كل عدة 60 ملم أطباق الأنسجة الثقافة. تم المتوسطة استبدال تماما اليوم بعد الطلاء. بعد ذلك، تم استبدال المتوسط كل 4 أيام مع 10٪ HS / MEM.
الحصين إعداد ثقافة العصبية
تم إعداد الثقافات من E-18 سبراغ داولي أجنة الفئران. كانت مقطوعة الرأس الأجنة والعقول إزالة ووضعها في HEPESHBSS. تم إزالة الحصين تحت المجهر تشريح وجمع في طبق بتري صغيرة في HEPES-HBSS. وضعت الحصين من القمامة واحدة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. ويستنشق HEPES-HBSS قبالة واستبدالها مع 5 مل من 0.25٪ التربسين. وقد حضنت إعداد عند 37 درجة لمدة 15 دقيقة. تم استبدال الحل التربسين مع 5 مل HEPES-HBSS. الشطف مع HEPES-HBSS تكررت مرتين أكثر في 5 دقائق فترات. تم triturated الحصين حتى لا تظل أجزاء من الأنسجة. وتم تحديد كثافة الخلايا مع عدادة الكريات وكان عادة حوالي 5 × 10 5 خلايا / الحصين. أعدت اثنين من كثافة الخلايا العصبية قرن آمون. للثقافات عالية الكثافة، وأضيفت 100،000 الخلايا لكل من الأطباق التي تحتوي لل coverslips المغلفة متعدد الليزين معدة مسبقا. للثقافات منخفض الكثافة، وأضيفت 10،000 الخلايا. بعد 3-4 ساعات، تم نقل coverslips إلى أطباق تحتوي على الطبقات الوحيدة الخلية الدبقية في المصل خالية MEM مع N2 الملحق. تحولت Coverslips ذلك أن الخلايا العصبية قرن آمون واجهت الخلايا الدبقية ووضعها على البارافين أو تفلون الفواصل. كان تباعد حوالي 2 ملم بين طبقات الخلايا. تمت إضافة N2 ملحق (1 مل) كل 10 يوما.
الكهربية
وتم سحب أقطاب التصحيح من 1.5 مم (OD) × 1.1 مم بال micropipettes (ID) البورسليكات على الأفقي يلهب براون مسرى مكروي مجتذب (نموذج P-97، الآلات سوتر) باستخدام بروتوكول سحب 2-المرحلة. وكانت المقاومة القطب 5-8 MΩ. امتلأت نصائح القطب مع الحل تسجيل الأسهم الداخلي يتكون من (مم) CSCL 153.3، MgCl 2 1.0، 10.0 HEPES، وجلايكول الإثيلين مكرر (الأثير β-aminoethyl)
N، N، N '، N' حمض -tetraacetic ( EGTA) 5.0، ودرجة الحموضة 7.3 (مع العقيمة التي تمت تصفيتها CsOH)، الأسمولية 275-280 الميلي أسمول. وكان الحل الداخلي العقيمة التي تمت تصفيتها قبل الاستخدام. الحل الكهربائي عرقوب احتوى على تجديد ATP يتألف من 3 ملي ATP (الصوديوم الملح)، 19 ملي فسفوكرياتين، و 50 U / مل فسفوكيناز الكرياتين.
قبل التجريب الكهربية، وإزالة coverslips تحتوي على الخلايا العصبية قرن آمون من مستنبت، ووضعها في 30 × 10 ملم صحن الثقافة البوليسترين تحتوي على تسجيل خارجي يتكون من كلوريد الصوديوم (142)، CaCl 2 (1.0)، CSCL (8.1)، MgCl 2 (2.1 ) والجلوكوز (10.0)، وHEPES (10.0)، ودرجة الحموضة 7.4 (هيدروكسيد الصوديوم). تم تعديل الأسمولية إلى 320-325 الميلي أسمول مع السكروز. وكان الحل تسجيل خارجي العقيمة التي تمت تصفيتها قبل الاستخدام. لاسميا الصفر التجارب المغنيسيوم، MgCl 2 محله تركيز يعادل osmotically من كلوريد الصوديوم. تجارب في شرائح قرن آمون قد تورط السيزيوم الخارجي مرتفعة في تحريض عفوية النشاط انفجار المتكررة في CA3 والتلفيف المسنن ولكن فقط في وجود الكادميوم مانع قناة الكالسيوم
(شيونغ وسترينجر 2001). لتحديد ما إذا كان السيزيوم مرتفعة في حل خارجي لدينا أسهم في انفجار الخلايا العصبية في الثقافة وتكرار حل خارجي يستخدم من قبل Sombati وديلورنزو
(1995) في دراسة النشاط الكهربية للخلايا العصبية مثقف يتعرض إلى الصفر المغنيسيوم، بوكل (2.5 ملم) محل CSCL في بعض التجارب. وزادت كلوريد الصوديوم إلى 145 ملم في هذه التجارب. لاحظنا أي اختلاف في وتيرة انفجار المتكررة في هذه الحلول الخارجية (2)؛ تم الجمع بين النتائج التي تم الحصول عليها في ظل الظروف 2. كان ينظر إلى الخلايا العصبية مثقف على مرحلة مجهر نيكون مقلوب. تم ربطه الميكروية مع مكبر للصوت من قبل أكسون الآلات CV-4 headstage ومناورة في موضع التسجيل مع PCS 5000 سلسلة micromanipulator (بيرلي الآلات، الصيادون، NY).
وقدمت تسجيلات خلية كاملة في درجة حرارة الغرفة مع Axopatch 1-D المشبك التصحيح مكبر للصوت (أكسون الآلات، يونيون سيتي، كاليفورنيا) والمنخفضة تمرير تصفيتها في 2 كيلو هرتز مع 8 القطب بسل تصفية قبل الرقمنة. وسجلت البيانات إلى جهاز كمبيوتر شخصي مع Axoscope البيانات 7.0 برنامج الحصول باستخدام واجهة Digidata 1200 (الصكوك أكسون). تم ترقيم تسجيلات الجهد المشبك التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) في 10-20 هرتز، تم رقمنة تسجيلات المشبك الحالي من إمكانات غشاء الخلايا العصبية في 20 كيلوهرتز. وقد تم تحليل EPSCs باستخدام برنامج MiniAnalysis (Synaptosoft، ديكاتور، GA).
كانت ثابتة Coverslips تستخدم لNMDA مستقبلات الوحيدات NR1، أمبا مستقبلات الوحيدات GluR1، أو synaptophysin المناعية مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) / 4٪ السكروز في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ذكرت راو وكريج (1998) أن NR1 مستقبلات الوحيدات تلطيخ المطلوب الميثانول التثبيت. ومع ذلك، كنا قادرين على تحقيق تلطيخ مرضية مع PFA. تم permeabilized الخلايا العصبية مع 0.25٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. تم غسلها Coverslips مرتين مع PBS، سدت مع 10٪ مصل الأرنب في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة، ويتعرض لالأجسام المضادة الأولية في 3٪ مصل الأرنب في برنامج تلفزيوني.
تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس 54.1 إلى NR1 (PharMingen، سان دييغو، CA) بتركيز 2 ميكروغرام / مل والأرنب بولكلونل الأجسام المضادة لGluR1 (Chemicon الدولية، تيميكولا، كاليفورنيا) كانت تستخدم في 1 ميكروغرام / مل. إما الماوس مكافحة synaptophysin (Chemicon؛ لاستخدامها في التجارب المزدوج وضع العلامات مع GluR1) أو أرنب مكافحة synaptophysin (مختبرات Zymed، سان فرانسيسكو، CA، للاستخدام مع NR1) كانت تستخدم بتركيز 2.5 ميكروغرام / مل.
وتصور الأجسام المضادة الأولية مع الأجسام المضادة تألقي مترافق الثانوية (3-4 ميكروغرام / مل، المسابر الجزيئية، يوجين، OR). كانت fluorochromes المستخدمة اليكسا فلور 488 (GluR1) واليكسا فلور 594 (NR1). وصفت Synaptophysin الأجسام المضادة الأولية مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق إما اليكسا فلور 488 أو فلور اليكسا 594. Coverslips تم تركيبه في الجلسرين. تم القبض على الصور الفلورسنت على نيكون مقلوب الكسوف TE 200 المجهر مزودة بكاميرا رقمية CF Photometrics CoolSnap باستخدام الهدف غمر 40 × النفط (1.0 الفتحة العددية). تم القبض على الصور باستخدام برنامج التصوير Metamorph وإعدادها للطباعة مع AdobePhotoshop 6.0.
لرؤية خلية كاملة، امتلأت الخلايا العصبية لأول مرة مع البيوتين (مختبرات المتجهات؛ 0.5 ملغ / مل في حل ماصة الداخلية)، ثم حضنت مع strepatavidin مترافق مع فلور اليكسا 350 (المسابر الجزيئية).
FM1-43 التصور
تم تحميل الخلايا عن طريق التعرض ل10 ملي البوتاسيوم حل خارجي (الأسمولية التي تحتفظ بها انخفاض يصاحب ذلك في تركيز الصوديوم) مع 8 ميكرومتر FM1-43 لمدة 10 دقيقة. والخلايا ثم يغسل 3-4 مرات مع الحل الخارجي العادي. لdestaining والتصور، تعرضت الخلايا لاسميا صفر المغنيسيوم الخارجية.
تحليل البيانات
وتعرض البيانات كوسيلة + SE ما لم يذكر خلاف ذلك في النص.
خصائص الخلايا العصبية
حدد الخلايا العصبية الهرمية شكليا على شكل في ثقافة درست 13-17 يوما من قبل بأكملها تقنية خلية التصحيح، المشبك. في التجارب الأولية، وقد شغل في الخلايا الهرمية وعملياتها مع biocytin خلال تسجيل الكهربية وتصور مع صبغة الفلورسنت بعد التثبيت. ظهرت الكبيرة والتشعبات ذات القطر الصغير من قمة وقاعدة من الخلايا العصبية الهرمية وتتفرع إلى التشعبات الثانوية والثالثية
(الشكل 1). جذع شجيري معقدة من الخلايا العصبية الهرمية امتدت عدة مئات من ميكرون من سوما الخلية. وقد أظهرت دراسات سابقة أن interneurons nonpyramidal هم شكليا الخلايا العصبية بين القطبين أو متعدد الأقطاب المتميزة التي الخلية سوما البقع بشكل مكثف مع الاصطناعية حمض الغاما γ انزيم كربوكسيل حمض الجلوتاميك (GAD؛
Esclapez وهاوزر 1999). تم فحص خصائص الغشاء السلبية والإيجابية من هذه الخلايا العصبية الهرمية في وضع المشبك الحالي في المحتوية على المغنيسيوم الوسط الخارجي لإثبات أن خصائص الخلايا العصبية تتفق مع تلك التي ل، خلايا قابلة للحياة صحية. وكان يعني غشاء المحتملة الراحة -58.3 ± 2.4 بالسيارات
(ن = 23)، في اتفاق جيد مع الدراسات السابقة على الخلايا العصبية الهرمية مثقف
(كولتر وآخرون 1992).
التين. 1.
الحصين الهرمية الخلايا العصبية مثقف لمدة 16 يوما. وقد شغل الخلية مع البيوتين عن طريق تسجيل ماصة ثم حضنت مع streptavidin مترافق إلى التحقيق الفلورسنت (انظر طرق). ملاحظة الخطوط العريضة لسوما الخلية متعدد الأقطاب في يمين الوسط الشديد من الصورة.
وقد تم قياس مقاومة المدخلات العصبية في عينة من الخلايا
(ن = 7) عن طريق حقن 2-الصورة البقول الحالية (-1.0 إلى 0.3 غ بزيادات 0.1 غ). أعطيت R في قبل المنحدر من مؤامرة التيار مقابل تغيير الجهد
(مانجان وبيرترام 1998). وR في كان 71.3 ± 4.2 MS، وهي نسبة أعلى من تلك التي سجلت في الخلايا العصبية الهرمية مع الميكروية حادة في دراساتنا السابقة
(مانجان وبيرترام 1998؛ مانجان وLothman 1996؛. Rempe وآخرون 1995)، ولكن في اتفاق مع دراسات أخرى باستخدام أقطاب التصحيح
(Spruston وجونستون 1992؛. Spruston وآخرون 1994). وتم تحديد أيضا العمل المحتملة (ا ف ب) الخصائص كمؤشر النشطة، التي تعتمد على الجهد وظيفة الغشاء. وقد تباينت غشاء المحتملة عن طريق الحقن الحالي. وكانت عتبة AP اطلاق -59.4 ± 2.2 بالسيارات
(ن = 24). عقد غشاء المحتملة في -58 بالسيارات عن طريق الحقن الحالي (عادة <100 باسكال) أسفرت في بعض الأحيان الجزائرية تجاوزت عفوية مع السعة 77.2 ± 3.4 بالسيارات. وكانت هذه الخصائص AP وفقا للنتائج السابقة
(Rempe وآخرون 1995). نادرا (4 من 36 الخلايا العصبية اختبار)، أدى الاستقطاب (حوالي -50 بالسيارات) في العمل رشقات نارية المحتملة لفترات طويلة. في 3/4 الخلايا، وكانت هذه رشقات نارية لا المتكررة؛ في انفجار خلية واحدة واصل مع فاصل interburst عدم انتظام لمدة الاستقطاب (حوالي 3 دقائق).
في أبعاده المغنيسيوم 2+ خالية من الوسط الخارجي (0 [مغ 2+] س)، معظم الخلايا عرضت انفجار المستدام المتكررة التي تتكون من عدة (≥) 3 نقاط وصول مع فترات interspike من <200 مللي فرضه على فترات طويلة (500-2،000 مللي ثانية) الاستقطاب
(الشكل 2 B). واقترح قطعتين من الأدلة على أن ارتفاع انفجار كان بدلا من خاصية الخلايا العصبية الذاتية يحركها الشبكة. أولا، كان نشاط مماثل غائبا عن الخلايا في الثقافات منخفض الكثافة (انظر
الشكل 7 أدناه). ثانيا، فرط لتصل الى -90 بالسيارات التي كتبها DC حقن الحالي في كثير من الأحيان لم إنهاء انفجار. وقع انفجار في 38/43 الخلايا فحص ويستمر لمدة تسجيل (≤20 دقيقة). التعرض ل0 [مغ 2+] س لم يغير كثيرا يستريح غشاء المحتملة (RMP) (-57.6 ± 3.1 بالسيارات، وقعت فترة من 2-10 ق بين رشقات نارية في جميع الخلايا، تم احتساب متوسط RMP من هذا الفاصل الزمني interburst) ، R في (67.7 ± 3.3
MS، ن = 7)، أو العمل ارتفاع محتمل سجلت في إمكانية عقد -58 بالسيارات (79.6 ± 2.1
بالسيارات، ن = 21). ومع ذلك، فقد تحول عتبة اطلاق AP بشكل كبير في -77.7 ± 4.5 بالسيارات بعد 0 [مغ 2+] س التعرض. بالإضافة إلى ذلك، أدت المعاملة في نمط تغير من AP اطلاق النار. بدلا من التي تحدث بشكل فردي المسامير، الجزائرية في 0 [مغ 2+] س تميل إلى الجماعة في العهود تكرار منفصلة
(الشكل 2 B). انفجار السلوك في 0 [مغ 2+] س يتناقض مع إجراءات إطلاق محتمل في المجموعة الاستشارية للألغام العادية حيث لم 32/36 الخلايا تنفجر
(الشكل 2 A).
التين. 2.
. التسجيلات المشبك الحالية من مثقف الخلايا العصبية الهرمية قرن آمون في وضعها الطبيعي وأبعاده صفر المغنيسيوم الخارجي (0 [مغ 2+] س): تسجيل من خلية هرمي 16 يوما في الثقافة. الوسط الخارجي يتضمن 2.1 ملي المغنيسيوم 2+. عقدت غشاء المحتملة في -58 بالسيارات التي كتبها DC حقن الحالي B: التسجيل من الخلايا العصبية 15 يوما في الثقافة. تم استبدال المغنيسيوم في الحل الخارجي من قبل equiosmolar نا +. عقدت غشاء المحتملة في -58 بالسيارات C: الصيدلة الخلايا الهرمية انفجار في 0 [مغ 2+] س تتبع أعلى: التسجيل من الخلايا الهرمية 14 يوما في الثقافة تتعرض ل0 [مغ 2+] س أثر الأوسط: تسجيل من نفس الخلية 25 دقيقة بعد إضافة 40 ميكرومتر د -APV، وهي مستقبلات NMDA. . انفجار النشاط الموهن ولكن لم تلغ أثر القول: النشاط مثير الخلايا العصبية توقف 15 دقيقة بعد مزيد من إضافة 20 ميكرومتر DNQX، وهو خصم أمبا مستقبلات. التسجيلات في A، B، C وهي من خلايا مختلفة.
التين. 7.
الخلية التسجيلات الحالية والجهد المشبك كلها، في الحالات العادية و0 [مغ 2+] س، من الخلايا العصبية الهرمية الحصين مثقف في منخفض الكثافة. 0 [مغ 2+] س العلاج لم تسفر عن العمل انفجار محتمل (A)؛ لم تردد sEPSC تظهر زيادة طفيفة، ولكنها مهمة (B) C: جزء التراكمي فترة interevent الرسم البياني للخلايا هو مبين في B. 0 [مغ 2+] أسفرت س الشرط في تغيير كبير في توزيع الفاصل (كولموجوروف-سميرنوف 2 عينة الاختبار؛ د = 0.31، P = 0.04). كانت طبيعية و0 [مغ 2+] س تسجيلات من خلايا مختلفة.
إزالة المغنيسيوم يعزز النشاط مثير في الشبكات العصبية من خلال إلغاء الحصار التي تعتمد على الجهد NMDA مستقبلات الغلوتامات من نوع
(آشر وآخرون 1988.؛. مودي وآخرون 1988؛
تانكريدي وآخرون 1988.؛ يستبروك 1994). نحن اختبار ما إذا كان 0 [مغ 2+] س يسببها رشقات نارية يمكن أن يكون قد تم حظره من قبل NMDA مستقبلات حمض د -2-الأمينية-5-phosphonovaleric (د -APV؛
الشكل 2 C). فالعصبون 17 DIV عرضت العمل من تلقاء أنفسهم رشقات نارية المحتملة المتكررة في 0 [مغ 2+] س حل خارجي. إضافة د -APV (40 ميكرومتر) خفضت متوسط عدد إمكانات العمل في انفجار وزيادة الفاصل الزمني interburst ولكنهم لم يعودوا الخلية لاطلاق النار متقطعا من إمكانات العمل واحدة لوحظ في المغنيسيوم العادي. فقط على مزيد إضافة dinitroquinoxaline أمبا مستقبلات مانع (DNQX، و 20 ميكرومتر) كان الانفجار السلوك القضاء عليها. وتكررت هذه الملاحظة في 14 خلايا من 8 الاستعدادات ثقافة منفصلة (كل ثقافة المحضرة من الأجنة مختلفة). في المغنيسيوم الخارجي العادي، ألغيت مدفوعة synaptically عمل اطلاق محتمل من قبل DNQX وحده (لا تظهر البيانات)؛ ما زالت خلايا قادرة على ارتفاعه إذا استقطابها من قبل DC حقن الحالي. وأظهرت هذه الدراسات أن APV فقط الموهن جزئيا 0 [مغ 2+] س يسببها الانفجار.
وكان أحد التفسيرات المحتملة لفشل د -APV لمنع تماما 0 [مغ 2+] س يسببها رشقات نارية أن مستقبلات NMDA لم تكن موجودة في نقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية الحصين مثقف وهذه لم تشارك في النقل العصبي مثير. بالتناوب، 40 ميكرومتر د -APV قد يكون insuffi-cient لمنع التيارات NMDA مستقبلات في 0 [مغ 2+] س الشرط. وأخيرا، فمن الممكن أن آليات متعددة تعزز انتقال متشابك في 0 [مغ 2+] س المتوسطة. لتقييم هذه الإمكانيات، وأجريت تسجيلات الجهد المشبك من العفوية التيارات بعد المشبكي مثير (sEPSCs) في -50 بالسيارات في وجود 5 ميكرومتر bicuculline methiodide لمنع GABA A الأحداث بوساطة مستقبلات. في بعض التجارب، تم استخدام 1 ميكرومتر سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX) للقضاء على إطلاق سراح عفوية حويصلات متعددة العصبي وإنتاج واحدة أحداث كمي بعد المشبكي [أي EPSCs مصغرة (mEPSCs).]
الرقم 3 يظهر mEPSC متوسط يتكون من ≥1،000 الأحداث من 10 الخلايا تحت 0 [مغ 2+] س الظروف. كان الحدث متوسط ومتوسط 10-90٪ زمن صعود 2.2 ± 0.3 مللي وتسوس biexponential مع τ 1 و τ 2 من 16.2 ± 1.4 و 80.8 ± 3.2 مللي ثانية، على التوالي. بعد إضافة د -APV
(3 الشكل، السهم العلوي)، الخلايا العصبية المنتجة mEPSCs مع ارتفاع متوسط قدره 1.2 ± 0.3 مللي وتسوس monoexponential مع τ 33.3 ± 2.2 مللي ثانية (5 خلايا، 612 الأحداث). إذا، بدلا من عرقلة NMDA الأحداث بوساطة مستقبلات، تعرض خلايا TTX المعاملة إلى أمبا مستقبلات مانع DNQX
(الشكل 3، السهم السفلي)، وكانت mEPSCs الناتجة أبطأ بكثير حركيا، مع فترة ارتفاع 4.4 ± 0.9 مللي و تسوس τ من 64.1 ± 3.7 مللي ثانية (373 الأحداث، 5 خلايا). وأشارت هذه التجارب أن مستقبلات NMDA كانت موجودة ونشطة في نقاط الاشتباك العصبي في 0 [مغ 2+] س الشرط. واقترحوا أيضا أن جميع التيارات بوساطة مستقبلات NMDA تم حظره من قبل 40 ميكرومتر د -APV.
التين. 3.
الصيدلة من مصغرة التيارات بعد المشبكي مثير (mEPSCs) في الخلايا الهرمية تتعرض ل0 [مغ 2+] يا أقصى اليسار التتبع: كان متوسط mEPSC مع حركية تسوس biexponential. التعرض لد -APV (السهم العلوي) أنتج mEPSC متوسط مع أسرع 10-90٪ الوقت ارتفاع (1.2 ± 0.3 مللي ثانية مقابل 2.2 ± 0.3 مللي ثانية) والاضمحلال monoexponential مع تسوس τ 33.3 ± 2.2 مللي ثانية. إذا تعرضت لDNQX (بدلا من د -APV؛ السهم السفلي)، وmEPSCs مما أدى لديهم ارتفاع أبطأ بكثير (4.4 ± 0.9 مللي ثانية) وتسوس τ (64.1 ± 3.7 مللي ثانية).
أكدنا أيضا وجود مستقبلات NMDA في نقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية الهرمية في الثقافة في 13-17 أيام عن طريق تلطيخ المناعى. تم فحص تلزم NMDA مستقبلات الوحيدات NR1 فيما يتعلق قبل المشبكي الحويصلي بروتين synaptophysin. في الخلية هو موضح في
الشكل. 4، وكانت مجموعات synaptophysin (مخضر) واضحة في جميع العمليات الخلوية داخل مجال الرؤية
(من اليسار
لوحات، لوحة أسفل هو وجهة نظر تضخم أعلى من المنطقة محاصر
في لوحة
العليا). كان NR1 تلطيخ أكثر منفصلة (أحمر مضان) ولكن كان على نطاق واسع في هذه الخلايا العصبية
(لوحات المتوسطة). وكشف غطاء من synaptophysin وNR1 مضان أن معظم مجموعات NR1 colocalized مع synaptophysin
(لوحات اليمين، مجموعات البرتقال)، مما يشير إلى موضع بعد المشبكي لمستقبلات NMDA في هذه المرحلة من تطور الخلايا العصبية.
التين. 4.
الخلايا العصبية الحصين 14 يوما في الثقافة المسمى مع الأجسام المضادة مناعي لsynaptophysin (الخضراء) والوحيدات NR1 من مستقبلات NMDA. وضع العلامات من كل هو الأقرب واسعة والقاصي إلى خلايا الجسم داخل مجال الرؤية (الصف العلوي، واليسار والوسط). تراكب الصور 2 يكشف colocalization من synaptophysin وNR1 (أعلى يمين، بونتا البرتقالي). يتم تكبير مربع المبينة في أعلى يسار الصورة في الصف السفلي من الصور.
بالإضافة إلى رفع الحظر مستقبلات NMDA، خفضت المغنيسيوم يمكن أن تحدث زيادة استثارة بآليات قبل المشبكي. على سبيل المثال، نزوح المغنيسيوم الكالسيوم في طبقة سطح الغشاء قبل المشبكي
(ماكلولين وآخرون 1978)، وبالتالي تقليل كمية الكالسيوم المتوفرة لدخول محطات قبل المشبكي. ومن ثم فإن إزالة المغنيسيوم تعزيز الإفراج قبل المشبكي من خلال تسهيل تدفق الكالسيوم إلى المحطة قبل المشبكي. ولذلك درسنا تأثير انخفاض المغنيسيوم على وتيرة الافراج عن جهاز الإرسال.
الشكل 5، A و B يوضح sEPSCs المسجلة في المغنيسيوم الطبيعي وانخفاض.وزادت وتيرة sEPSC بشكل ملحوظ في الخلايا العصبية المسجلة في 0 [مغ 2+] س. وقعت 90٪ من الأحداث مع فترات interevent <800 مللي ثانية
(الشكل 5 C). في المغنيسيوم العادي، وكان الفاصل الزمني مقارنة 5200 مللي ثانية
(الشكل 5 C). التحول في فترة interevent للخلية المصورة في
الشكل. 5 كان كبيرا [كولموجوروف-سميرنوف 2-عينة الاختبار؛
د = 0.58،
P <0.001]. وكشف تحليل 8 خلايا في كل من المغنيسيوم الطبيعي وتقليل زيادة مماثلة في التردد. في كل خلية، انخفضت 90٪ interevent قيمة قطع الفاصلة التي كتبها ≥3 أضعاف.
التين. 5.
عفوية التيارات بعد المشبكي مثير (sEPSCs) في الخلايا الهرمية hiipocampal مثقف. تردد sEPSC، وسجلت في العادي المغنيسيوم الخارجي (A يتم زيادة)، بشكل ملحوظ في صفر المتوسطة المغنيسيوم (B). C: المتراكمة المؤامرة جزء من الرسم البياني فترات interevent للتسجيلات كاملة 4-مين من الخلايا هو مبين في A و B. وكانت فترات أقصر بكثير في صفر المغنيسيوم (كولموجوروف-سميرنوف 2-عينة الاختبار؛ د = 0.58، P <0.001). التسجيلات في A و B هي من 2 خلايا مختلفة.
أظهرت هذه البيانات زيادة وتيرة التيارات متشابك سجلت postsynaptically، يعزى على الأرجح في جزء منه إلى زيادة استثارة الدوائر العصبية. ومع ذلك، فإنها لم توضح ما إذا كانت إزالة المغنيسيوم تتأثر أيضا آليات الإفراج الغلوتامات قبل المشبكي. درسنا أولا النشاط متشابك قبل وبعد تطبيق 1 ميكرومتر TTX لتقييم أثر 0 [مغ 2+] س بشأن الإجراءات المحتملة التي تعتمد على إطلاق جهاز الإرسال.
الشكل 6، AوB يظهر أمثلة من sEPSC (لا TTX) وmEPSC (بعد تطبيق TTX) في خلايا 16 DIV في الحالات العادية و0 [مغ 2+] س الظروف. عن النشاط الخلوي هو مبين، وزادت وتيرة mEPSC بشكل كبير في 0 [مغ 2+] س حالة
(الشكل 6. C؛ كولموجوروف-سميرنوف 2-عينة الاختبار؛ د = 0.26،
P <0.001). وكان عدد من mEPSCs سجلت في فترة 4 دقيقة 188 في المغنيسيوم العادي و 331 في 0 [مغ 2+] س. في 6 أزواج من الخلايا المعرضة أو لم تتعرض لالمغنيسيوم، كان عدد mEPSCs أعلى 57.6 + 12.9٪ في 0 [مغ 2+] س الشروط مقابل المغنيسيوم العادي. تشير هذه النتيجة إلى أن تم تعزيز الإجراءات المحتملة مستقل الافراج عن ناقل عصبي في 0 [مغ 2+] س الشرط.
التين. 6.
تأثير سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX) على توزيع السعة EPSC. سجلت الخلايا لمدة 4 دقائق. ثم أضاف 1 ميكرومتر TTX إلى الوسط الخارجي. بعد 10 دقيقة، وسجلت EPSCs لفترة 4 دقيقة أخرى. A: مثال sEPSCs في الحالات العادية (اليسار) وصفر (الحق) المغنيسيوم الخارجي من خلية 16 يوما في الثقافة. تسببت إضافة TTX تخفيض شامل في EPSC السعة، وإنتاج mEPSCs (B). C: المتراكمة المؤامرة جزء من الرسم البياني فترات interevent للخلايا هو مبين في A و B. وكانت فترات أقصر بكثير في الصفر 0 [مغ 2+] س (كولموجوروف-سميرنوف 2-عينة الاختبار؛ د = 0.26، P <0.001). D: توزيع السعة من التسجيلات كاملة 4-مين من الخلايا هو مبين في A و B . وكان الأكثر انتشارا EPSC السعة حوالي 50 باسكال (المسجلة في -50 باسكال) بغض النظر عن مستوى المغنيسيوم أو وجود TTX. ملاحظة ذيل الأحداث عالية السعة في 0 المغنيسيوم 2+ حالة قبل TTX بالإضافة إلى ذلك. تم استخدام نسبة sEPSC وmEPSC سعة لحساب محتوى كمي يعني الإفراج الغلوتامات (انظر النص).
درسنا أيضا ما إذا كان محتوى كمي، وبالتالي فإن السعة، من sEPSCs تم تعديلها من قبل 0 [مغ 2+] س. وعلى الرغم من إجراء أي تحليل كمي الرسمي، تم حساب متوسط عدد العصبي الكميات صدر في إمكانات العمل قبل المشبكي بواسطة الأسلوب المباشر في السيطرة و0 [مغ 2+] س الظروف. كانت سعة sEPSC الأكثر شيوعا 50-60 السلطة الفلسطينية، بغض النظر عن حالة المغنيسيوم
(الشكل 6 D والحانات مفتوحة). وقد مال وتوزيع السعة sEPSC تجاه التيارات السعة العالي في وضعها الطبيعي و0 [مغ 2+] س. ومع ذلك، كانت أحداث المرتفعة السعة أكثر تواترا في 0 [مغ 2+] س وصلت إلى الحد الأقصى من حوالي 400 السلطة الفلسطينية للأحداث واحدة مقابل 150 للسلطة الفلسطينية في المغنيسيوم العادي. هذه الأحداث السعة أعلى ممثلة يفترض أن الغلوتامات من عدة كمات صدر في وقت واحد. بعد TTX، كانت 50-60 سعة السلطة الفلسطينية mEPSC الأكثر انتشارا ولكن تم القضاء ذيل التيارات متشابك أعلى-السعة (المغنيسيوم العادي) أو خفضها بصورة كبيرة في عدد من الأحداث (0 [مغ 2+] س). تم حساب محتوى كمي متر من نسبة متوسط sEPSC السعة أن يعني mEPSC السعة. في هذا المثال، كانت القيم 1.41 في المغنيسيوم العادي و2.40 ل0 [مغ 2+] س. تم إجراء الحساب المباشر للمتر في 6 خلايا في كل من المغنيسيوم الطبيعي وانخفاض. يعني المحتوى كمي في المغنيسيوم العادي كان 1.36 + 0.05 وارتفع بشكل ملحوظ في 0 [مغ 2+] س إلى 2.09 + 0.15
(P <0.01،
ر -test).
أثبتت التجارب السابقة أن 0 [مغ 2+] س العلاج عززت انتقال متشابك مثير من قبل كل من وسائل قبل المشبكي وبعد المشبكي. ومع ذلك، فإنه من غير الواضح ما إذا كان 0 [مغ 2+] س زيادة قوة autapses (المشابك المتكررة من الخلايا العصبية على نفسه) أو أن من الترابط بين الخلايا العصبية الهرمية. في الماضي، وقد تجلى انفجار المتكررة في microcultures تحتوي على عدد قليل من 2 الخلايا العصبية الحصين مثير
(سيجال وFurshpan 1990). ومع ذلك، قد لا تكون هذه النتائج تنطبق على إعداد ثقافة المستخدمة في تجاربنا في أن الخلايا تعرضوا لحاصرات النشاط متشابك (kynurenate ورفع المغنيسيوم 2+) لعدة أسابيع وأظهرت انفجار السلوك فقط عندما كانت تغسل الثقافات خالية من هذه حاصرات . وقد تجلى المزمن NMDA مستقبلات الحصار إلى زيادة ملحوظة تجميع مستقبلات NMDA وتعزيز التحول إلى توزيع أكثر متشابك
(راو وكريغ 1997). وعلى النقيض من هذا النموذج microculture، تم العثور على الترابط بين الخلايا العصبية متعددة ضرورية لانفجار المتكررة الناجمة عن البنسلين، بيكروتوكسين، أو البيريدين 4-الأمينية في شرائح قرن آمون
(Hablitz 1984؛
Schwartzkroin والأمير 1978). لاختبار ما إذا كانت الوصلات بين الخلايا العصبية الحصين اللازمة لانفجار المتكررة، التي كانت تزرع في منخفض الكثافة (10 4 الخلايا العصبية / ساترة). الردود على مراقبة و0 [مغ 2+] س الظروف كانت مقارنة مع تلك التي تزرع في كثافة عالية (10 5 الخلايا العصبية / ساترة) بعد 13-17 يوما في الثقافة.
الشكل 7 يبين التسجيلات current- والجهد المشبك من الخلايا العصبية الهرمية مثقف من نفس الخلايا الجنينية الحصين التي تم تقسيمها إلى مجموعات المنخفضة والعالية الكثافة. في الثقافات منخفض الكثافة، وكانت قادرة على توليد إمكانات العمل عفوية الخلايا العصبية. التعرض ل0 [مغ 2+] س لم تسفر المتكررة انفجار (0/18 الخلايا) ولكن لم زيادة وتيرة التيارات بعد المشبكي مثير
(الشكل 7 A). زادت وتيرة sEPSC بشكل ملحوظ مع 0 [مغ 2+] س العلاج في 13/9 الخلايا
(الشكل 7،. B و C، كولموجوروف-سميرنوف 2 عينة الاختبار؛ د = 0.31،
P = 0.04).
على الرغم من استثارة الشبكة كانت لم تتغير في 0 [مغ 2+] س في الثقافات منخفض الكثافة، ينبغي أن لا يزال قد تعززت تغييرات في nonaction الإمكانات التي تعتمد على الغلوتامات قبل المشبكي الإفراج الاحتمالات. درسنا هذا الاحتمال بمقارنة تردد mEPSC في الثقافات منخفض الكثافة تحت العادي و0 [مغ 2+] س الظروف.
الشكل 8 A يدل على سبيل المثال من mEPSCs المسجلة من الخلايا 14 DIV. في المغنيسيوم العادي، كانت mEPSCs نادرة. في 0 [مغ 2+] س، زاد التردد mEPSC بشكل ملحوظ. وقعت ثمانين في المئة من الأحداث مع فاصل interevent أقل من حوالي 4000 مللي ثانية. في 0 [مغ 2+] س، وكان الفاصل الزمني أقصر بكثير في 1550 مللي ثانية (كولموجوروف-سميرنوف الاختبار؛
د = 0.35،
P <0.001).
التين. 8.
EPSCs مصغرة المسجلة في الخلايا من الثقافات منخفض الكثافة في الحالات العادية و0 [مغ 2+] س. A: مقتطفات من تسجيلات 4 دقيقة من 2 خلايا مختلفة B: تحليل التسجيلات كاملة من الخلايا هو مبين في A كشف أقصر بكثير توزيع interevent الفاصل في 0 [مغ 2+] س (كولموجوروف-سميرنوف 2-عينة الاختبار؛ DF = 0.35، P <0.001).
النتيجة أن الخلايا العصبية من الثقافات منخفض الكثافة لا يمكن أن يكون ذلك حافزا لانفجار اقترح أنها تشكل نقاط الاشتباك العصبي النشطة أقل أن تلك مثقف أكثر كثافة. تم اختبار هذا مباشرة. ومقارنة وجود اتصالات متشابك في الخلايا من lowand ثقافات عالية الكثافة النوعية التي تلطيخ للتوزيع synaptophysin. في الخلايا العصبية من ثقافة عالية الكثافة في الصورة في
الشكل. 9 A، كانت مجموعات synaptophysin في كل مكان على كل العمليات العصبية. في العديد من المناطق، لا يمكن تمييز نقاط والفردية بسبب الكثافة العالية. في المقابل، كان توزيع synaptophysin أكثر متفرق في المثال منخفض الكثافة. الفردية نقاط وsynaptophysin كانت متميزة بسهولة على جميع العمليات، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية في الثقافة منخفض الكثافة تقديم وتلقي الاتصالات متشابك أقل.
التين. 9.
مقارنة synaptophysin (A) وFM1-43 (B) مضان في عالية مقابل منخفض الكثافة الثقافات الحصين. تلطيخ لsynaptophysin علامة قبل المشبكي والإلتقام الحويصلي هو أعلى بشكل ملحوظ في الثقافات أكثر كثافة.
لدراسة النشاط متشابك نشط، تم علاج الخلايا العصبية من الثقافات العالية والمنخفضة الكثافة مع صبغة الفلورسنت FM1-43، الذي ارتفع في الحويصلات المشبكية endocytosed وغير قابلة للكشف على الحويصلة إيماس، وبالتالي وضع العلامات نقاط الاشتباك العصبي التي تمر بنشاط exocytotic / دورة endocytotic
(Cochilla وآخرون 1999).
الشكل 9 B يظهر الخلايا العصبية من الثقافات العالية والمنخفضة الكثافة تتعرض لFM1-43. وكان عدد من نقاط والفلورسنت أعلى بشكل ملحوظ في الخلايا العصبية ذات الكثافة السكانية العالية. تم إجراء التحليل الكمي للنقاط و5 في خلايا كل من ثقافات عالية ومنخفضة الكثافة عن طريق عد نقاط وعلى مساحة حوالي 30 × 30 ميكرون. تم إحصاء نقاط ومناطق في 2 لكل خلية تظهر أعظم النشاط متشابك. في الخلايا العصبية منخفض الكثافة، وكان متوسط عدد FM1-43 نقاط والفلورسنت 48.7 ± 5.1. لالخلايا العصبية ذات الكثافة السكانية العالية، وكان النشاط أعلى بكثير، 177.2 ± 25.1
(P <0.001،
ر -test). تدل هذه البيانات على أن الربط الوظيفي بين الخلايا، مقاسا الاتصالات متشابك نشطة، يتم تخفيض كثيرا في الثقافات منخفض الكثافة.
النتائج الرئيسية لهذه الدراسة هي
1 كانت) شبكات الخلايا العصبية الحصين مثقف قادرة على توليد العمل من تلقاء أنفسهم رشقات نارية المحتملة المتكررة مشابهة جدا لتلك التي لوحظت في سليمة الاستعدادات شريحة الحصين عندما تتعرض لاسميا صفر المغنيسيوم؛
2) postsynaptically، وقلصت السلوك الانفجار، ولكن لم تلغ، من قبل د -APV، مما يشير إلى أن إلغاء الحصار المغنيسيوم القنوات مستقبلات NMDA ساهمت في انفجار بداية وصيانتها؛
3) presynaptically، 0 [مغ 2+] س تسبب في زيادة احتمال الإفراج الغلوتامات (تحليل اقترح زيادة مصاحبة في يعني المحتوى كمي)؛
4) خفضت التعديلات التي يسببها المغنيسيوم في خصائص الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي كافية لإحداث انفجار في الثقافات الكثافة أقل مع الاتصالات المشبكية متفرق، مشيرا إلى أن الانفجار كان الشبكة، بدلا من الذاتية الخلوية، الظاهرة. ومع ذلك، 0 [مغ 2+] س فعل إحداث زيادة في كل من النشاط sEPSC وmEPSC في الثقافات منخفض الكثافة.
الخلايا العصبية الحصين مثقف كنموذج للانفجار
مؤخرا أصبحت ثقافة الخلية أداة لدراسة التفاعلات متشابك واللدونة (انظر
سالتر 2001 للمراجعة). وسعت الكهربية والخصائص المورفولوجية المعلومات على وظيفة المشبك يست قابلة لأنواع أخرى من التحضيرات
(Gomperts وآخرون 2000.؛
ستيفنز وWesseling 1999). وقد تم زراعة الخلايا أيضا أداة قيمة للتحقيق في الحالات المرضية المتعلقة تغيير وظيفة متشابك العادية
(ديلورنزو وآخرون 1998.؛
Furshpan 1991).
النتائج التي توصلنا إليها بشأن خفض تحريض المغنيسيوم النشاط انفجار عفوي في الخلايا العصبية الحصين مثقف إضافة إلى هذا الفهم. انهم متفقون مع النتائج طويلة الأمد للانفجار بتخفيض المغنيسيوم في شريحة
(أندرسون وآخرون 1986.؛
Avoli وآخرون 1987.)، ثقافة شريحة
(جوتيريز وآخرون 1999.، والاستعدادات الثقافة ()
Sombati وديلورنزو 1995).
النتائج التي توصلنا إليها تشير بقوة إلى أن الانفجار النشاط في نتائج إعداد لدينا من التفاعلات متشابك بدلا من خصائص الخلايا العصبية الذاتية. ومع ذلك، البيانات المتوفرة لدينا لا يستبعد الأخير. السلوك انفجار وقع في بعض الأحيان في المغنيسيوم الخارجي العادي. فمن غير المرجح أن فرط الاستثارية الخلايا العصبية في هذه الحالات كانت نتيجة لنقص الأكسجة
(Rubaj وآخرون 2003) أو درجة الحموضة التغيير. وشملت الثقافات على حد سواء CA1 CA3 والهرمية الخلايا العصبية. خصائص pacemaking الجوهرية لهذه الأخيرة قد وصفت بشكل جيد وعلى غرار
(تروب وآخرون 1991). فمن الممكن أنه نظرا كثافة كافية والترابط بين منطقة خلايا غنية الهرمية CA3 بشكل خاص من الثقافة والنشاط العفوي يمكن ان تحدث. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن يحركها شبكة تصريف الشديدة الاستثارة المتكررة في قرن آمون سليمة تنشأ في CA3 وتنتشر إلى CA1
(Hablitz 1984؛ مودي وآخرون 1988).
ويدعم أهمية التفاعلات الشبكة في تمكين النشاط انفجار عدة خطوط من الأدلة. أولا، لم فرط العصبية من 10-20 بالسيارات من إمكانات يستريح لن تقضي انفجار، رغم أنه تم تخفيض مدة انفجر والتردد. ثانيا، لم الخلايا العصبية من الثقافات منخفض الكثافة لا تنفجر تحت إما عادية أو 0 [مغ 2+] س الظروف. الثالث والحصار الدوائي من الإثارة القضاء رشقات نارية متشابك في 0 [مغ 2+] س. سوف تكون هناك حاجة التسجيلات المزدوجة في وقت واحد لمعالجة نهائيا مسألة ما إذا كانت الخلايا العصبية يتلقون تزامن القصف مثير.
وقد لوحظ فرط الاستثارية الحصين الناجم عن انخفاض المغنيسيوم أو إزالة لعدة سنوات. هو واضح بما فيه الكفاية أن تأثير نقص المغنيسيوم قد استخدمت كنموذج للنوبات الفص الصدغي منذ أواخر 1970s
(باك وآخرون 1978). وقد لاحظ العديد من التقارير التبعية انخفاض المغنيسيوم انفجار على وظيفية NMDA مستقبلات / قنوات
(Albowitz وآخرون 1997.؛ Collingridge وآخرون 1988؛.
Gulyas-كوفاتش وآخرون 2002.؛.
جوتيريز وآخرون 1999؛
هامون وآخرون 1987.؛
. Quilichini وآخرون 2002؛
تانكريدي وآخرون 1988.). وربما يعزى ذلك إلى تأثير بعد المشبكي موثقة جيدا من المغنيسيوم في عرقلة كهربية مستقبلات NMDA / قنوات من خارج الخلية في الغشاء يستريح المحتملة
(Dingledine وآخرون 1990). نتائجنا تدعم هذه الدراسات السابقة. أولا، أظهرت الدراسات المناعي مستقبلات NMDA كانت محلية (وتلزم NMDA مستقبلات الوحيدات NR1) مع synaptophysin في ثقافات انفجار قادر، مما يدل على موضع متشابك. ثانيا، إن إزالة المغنيسيوم شرطا للانفجار في كل ما يقرب من التجارب، في حين كان الموهن الانفجار من قبل محددة NMDA مستقبلات د -APV. وهكذا NMDA تنشيط مستقبلات التي كتبها انخفاض المغنيسيوم يبدو بالغ الأهمية لبدء وصيانة انفجار الخلايا العصبية في إعداد لدينا.
ومع ذلك، تشير البيانات المتوفرة لدينا يمكن أن تكون آليات بعد المشبكي مثير إضافية المنطوق. لم المفرطة نشاط الخلايا العصبية (رشقات نارية من EPSCs عالية التردد) الناجم عن انخفاض المغنيسيوم لن تعود إلى وضعها الطبيعي بعد تثبيط مستقبلات NMDA مع د -APV. EPSC انفجار وقع تزال، على الرغم من فترات interburst وزادت وقلل مدة تنفجر. كان الحصار من أمبا مستقبلات الغلوتامات من نوع ضروري للقضاء على النشاط. وتشير هذه الملاحظات أن زيادة نشاط مستقبلات أمبا وكذلك تنشيط مستقبلات NMDA يمكن أن تسهم في فرط الاستثارية العصبية في 0 [مغ 2+] س. أحد التفسيرات المحتملة لهذه الملاحظة قد تكون الفرضية الأخيرة الركيزة الفسيولوجية للالتقوية على المدى الطويل، وهو شكل من اللدونة متشابك التي قد تكمن وراء التعلم والذاكرة. ياو وآخرون. (2001) أثبتت أن تنشيط مستقبلات NMDA في نتائج ثقافة في التعيين السريع (في غضون دقائق) مستقبلات أمبا إلى مواقع متشابك NMDA مستقبلات مع زيادة موازية في وتيرة mEPSC. وقع تعزيز مماثل من mEPSCs بعد وجيزة، وتطبيق التنسيق من الجلايسين لتنشيط مستقبلات NMDA
(لو وآخرون 2001). كان زيادة انتقال مثير إيماس الدراجات التابعة والمعنية يفترض أن مستقبلات أمبا من أماكن بعيدة لموقع تفعيل NMDA
(ليانغ وHuganir 2001؛
Luscher وFrerking 2001؛.
Luscher وآخرون 1999). هذا التدفق من مستقبلات أمبا إلى مواقع متشابك يمكن أن يؤدي إلى د مقاومة لل-APV استثارة لاحظنا.
وعلى الرغم من تظاهر تعزيز NMDA بوساطة مستقبلات excitabilty أن تلعب دورا في خفض المغنيسيوم الناجم عن انفجار، فإنه من غير المحتمل أن تلعب دورا هاما في التعديلات قبل المشبكي لاحظناه في المغنيسيوم صفر: زيادة وتيرة sEPSC وزيادة واضحة في متوسط كمومي محتوى. وتشير هذه التغيرات أن احتمال الافراج عن الغلوتامات وبنسبة انخفاض المغنيسيوم.
واقترح أحد آلية محتملة لأول مرة Frankenhauser وهودجكين (1957). ففكروا أن التخفيضات في الكاتيونات ثنائي التكافؤ يمكن أن يزيد excitabilty العصبية عن طريق خفض تهمة الفحص على سطح الغشاء. وهذا من شأنه أن يسبب جزء أصغر من إمكانات عبر الغشاء في الانخفاض عبر طبقة ثنائية المادة الدهنية
(ماكلولين وآخرون 1971)، مما أدى إلى خفض الحقل الكهربائي لمست من قبل المواصلة تعتمد على الجهد مثل قنوات الكالسيوم في محطة متشابك. مولر وفنكلستين
(1974) المقترح في وقت لاحق نموذجا على مزيد من الماغنسيوم محددة. أنها افترضت أن زيادة المغنيسيوم 2+ التركيز يزيح الكالسيوم في السطح تهمة طبقة المتاخمة للغشاء سالبة الشحنة، وبالتالي خفض كمية الكالسيوم المتوفرة للتدفق إلى محطات متشابك. خفض أو القضاء على المغنيسيوم 2+ سوف يكون له تأثير عكسي، وزيادة فعالية الكالسيوم 2+ التركيز عند مصب قبل المشبكي الكالسيوم 2+ القنوات. هذه الآلية قد يفسر زيادة في الكالسيوم داخل الخلايا لوحظ في معزولة تماما الخلايا العصبية CA1 الهرمية في وجود انخفاض المغنيسيوم خارج الخلية، تدفق بوساطة قنوات الكالسيوم التي تعتمد على الجهد
(تشانغ وآخرون 1996). وبالتالي أثر واحد قبل المشبكي للحد من المغنيسيوم 2+ سيكون لزيادة احتمال الإفراج على النحو المقترح في نموذج كاتز العصبي
(كاتز 1971). احتمال الافراج يعكس ما إذا كان احتلت موقع الإطلاق وتوافر الارسال
(Dobrunz وستيفنز 1997؛
هانس وGustaffson، 2002؛ ستالي وآخرون 1998،
2001)، ولكن يمكن عن طريق التضمين الكالسيوم والمغنيسيوم (Bouron 2001). المغنيسيوم انخفاض قد يؤدي أيضا إلى زيادة إطلاق الغلوتامات من خلال تسهيل خروج الكالسيوم من مخازن داخل الخلايا عن طريق تثبيط انخفاض المغنيسيوم ryanodine المستقبلات
(Masumiya وآخرون 2001). سواء تحدث هذه العملية هي إشكالية بالنظر إلى أن التقلبات في تركيز المغنيسيوم خارج الخلية لا تظهر لتغيير مستويات داخل الخلايا
(تشانغ وآخرون 1996).
ويمكن لهذه الآليات شرح ملحوظة زيادة في وتيرة sEPSC، مما يعكس زيادة الافراج عن الغلوتامات قبل المشبكي، لوحظ انخفاض في المغنيسيوم. ويمكن أيضا أن تفسر الزيادة تحسب في المحتوى كمي يعني. على الرغم من أننا لم تحاول تحليل كمي الرسمي لهذه الدراسة، ونحن لم تستخدم 2 أساليب مختلفة لتحديد محتوى كمي. لم هذه الأساليب لا نوافق على مدى هذه الزيادة، ولكن في كلتا الحالتين، كان الزيادة الكبيرة.
وقد اقترحت الدراسات الفسيولوجية والنمذجة في الحصين أن تزامن الانفجار في بعض النظم من الخلايا العصبية الهرمية قد تتطلب الربط بين الحد الأدنى الحرج من الخلايا وكافية قوة متشابك مثير لدفع شبكة
(باين وآخرون 1999.؛
تروب وونغ 1983؛
تروب وآخرون آل 1995). أظهرت محاكاة شبكة نموذجية من الحصين انفجار الخلايا العصبية التي يمكن أن يحدث انفجار، حتى في وجود تثبيط الخلايا العصبية، إلا إذا الاتصال بين الخلايا العصبية في الدائرة كثيفة على نحو كاف. الربط المنخفض يمنع تطوير انفجار
(تروب وآخرون 1987). في دراسات مختبرية في الحصين والقشرة المخية الحديثة تشير إلى أن الندرة النسبية للاتصالات متشابك مثير المرجح يساهم في الوليد مقاومة القوارض مصادرة
(سوان وHablitz 2000).
اختبرنا هذه الفكرة عن طريق إخضاع الثقافات منخفض الكثافة لنفس الشروط التي أنتجت انفجار السلوك في الثقافات ذات الكثافة السكانية العالية. التناقض بين الاستعدادات 2 عندما تتعرض ل0 [مغ 2+] س كان واضحا في 2 التحيات. لم يلاحظ أي عمل عدة رشقات نارية محتملة في أي الخلايا العصبية منخفض الكثافة اختبار بغض النظر عن عدد الأيام التي تزرع في الثقافة ومناعي لوسم synaptophysin أشار عدد أقل بكثير من المواقع متشابك المحتملة. وقد تأكدت هذه النتيجة الأخير قبل وضع العلامات من نقاط الاشتباك العصبي مع FM1-43. وكان عدد من نقاط الاشتباك العصبي exocytosing بنشاط أقل بكثير في الثقافات منخفض الكثافة. وكانت الزيادة في كل من sEPSC وmEPSC تردد واضح في 0 [مغ 2+] س، مشيرا إلى أن الآليات قبل المشبكي ليزيد من افراز الصوديوم تعمل في منخفض الكثافة وكذلك الثقافات ذات الكثافة السكانية العالية.
أهمية الاتصال في توليد الشاذة نشاط الخلايا العصبية مثير يمكن تقديره من خلال دراسة نماذج حيوانية من نوبات الفص الصدغي. نشاط الخلايا العصبية وصفها في هذه الدراسة (إمكانات العمل متعددة فرضه على اللاإستقطابات depolarizations لفترات طويلة) مماثلة لتلك التي لوحظت في هذه النماذج. على المستوى الخلوي، ويتجلى النشاط الاستيلاء في نشاط مثير متزامن بين عدد كبير من الخلايا العصبية
(دوديك وآخرون 1999). وهناك ميزة التشريحية بارزة في العديد من النماذج الحيوانية من نوبات الفص الصدغي المزمنة هي تنتشر من العمليات العصبية وتشكيل لاحق من شاذ، ويفترض أن الغلوتامات بوساطة التفاعلات متشابك مثير
(ليمان وآخرون 2001.؛
Sutula وآخرون 1996.؛
Wuarin ودوديك 1996 )، على الرغم من أن تنتشر ليست سمة عالمية من هذه النماذج
(سوان وآخرون 2001). في الآونة الأخيرة، لينش وSutula
(2000 أظهرت) الشاذة، على ما يبدو الأحادي المشبك الدوائر مثير المتكررة التي من المرجح يكمن وراء نشاط الخلايا العصبية غير طبيعي في هذا النموذج.